JP2005501543A - 標識ヌクレオシドポリホスフェート - Google Patents

Abstract

本発明は、四つもしくはそれ以上のホスフェートを持つ標識ヌクレオシドポリホスフェートの形にある物質の新しい組成物を説明する。加えて、強化された基質性質をもって核酸ポリメラーゼの基質であるところの四つもしくはそれ以上のホスフェートを持つ標識ヌクレオシドポリホスフェートの組成物ならびに核酸検出、特性化および定量化のためにこれらのヌクレオシドポリホスフェートを使用する方法が説明される。本発明により提供される組成物は末端−ホスフェートに付加した比色性の、化学発光のもしくは蛍光性の部分、質量タグもしくは電気化学的タグを有するところのヌクレオシドポリホスフェート、ジデオキシヌクレオチドポリホスフェート、またはデオキシヌクレオチドポリホスフェート類似体を含む。核酸ポリメラーゼが基質としてこの類似体を用いるときには、酵素で活性化可能な標識は、ホスホリル転移の無機のポリホスフェート副産物の上に存在するであろう。ホスファターゼを介するホスホリル転移のポリホスフェート生成物の開裂は、その上に付加した標識の中における検出可能な変化に至る。ポリメラーゼアッセイをホスファターゼの存在下で実施するときには、ＤＮＡもしくはＲＮＡ合成のリアルタイムモニタリングおよび標的核酸の検出のための便利な方法が提供される。

Description

【０００１】
（技術分野）
本発明は、四つもしくはそれ以上のホスフェートを含む末端−ホスフェート−標識ヌクレオチドの物質の組成物に一般的に関する。末端−ホスフェート−標識ヌクレオシドポリホスフェートのホスフェート単位の数を三つから四つもしくはそれ以上に増加させると、ポリメラーゼによるそれらの組み込み効率を増加させることが本発明者等により見出されている。使用される標識は、化学発光の、蛍光性の、電気化学的なおよび発色性の部分ならびに質量タグであって、そして直接に検出可能であるか、または酵素の活性化もしくは異なるシグナルを作成する他の方法への供給の後で検出可能であるものを含む。また、ＤＮＡもしくはＲＮＡの検出、特性化、または定量化のために核酸ポリメラーゼによりそれらのヌクレオチドを使用する方法が開示される。
【０００２】
（背景技術）
高度の特異性および感度を持って試料中で特異的な核酸もしくはアナライトを検出する方法は公知である。そのような方法は一般的に、特異的な標的配列もしくはアナライトの存在に基づいて核酸配列を先ず増幅することを必要とする。増幅に引き続いて、増幅された配列が検出されて、定量化される。核酸のための従来の検出システムには、蛍光性の標識の検出、着色色素、蛍光性の酵素−結合検出システム、抗体−仲介標識検出および放射性標識の検出が含まれる。
【０００３】
現在広く使用される検出方法の一つの不利点は、最終の標識生成物もしくは副産物から標識出発原料を分離する必要である。そのような分離は一般的に、検出のためにゲル電気泳動もしくは標的配列の膜の上への固定化を必要とする。さらに、そこには、検出のために必要な数多くの試薬および／もしくはインキュベーション工程がしばしばある。
【０００４】
ＤＮＡおよびＲＮＡポリメラーゼは、トリホスフェート部分のガンマ位置におけるかもしくは代わりに修飾を持つヌクレオシドを認識して、利用することができることが知られている。種々のポリメラーゼがガンマ−修飾ヌクレオチド三リン酸(ＮＴＰの)を認識して、利用する能力は、ガンマホスフェートに付加した部分に依存して変わるように見えることがさらに公知である。一般に、ＲＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼよりさらに無差別である。なお、組み込みの効率は、正常のヌクレオチドに比べると顕著に減少される。この制限をもってしても、γ−標識ヌクレオシド三リン酸を用いる数多くの潜在的応用が文献に記載されている。
【０００５】
ガンマ−ホスフェートで修飾したヌクレオチドの存在下でＲＮＡポリメラーゼからＲＮＡ合成をモニターするための比色アッセイは以前に報告されている(Vassiliou W et al., T,「ポリメラーゼ無差別性の利用：簡単な比色性ＲＮＡポリメラーゼアッセイ」、Virology. 2000 Sep 1;274(2):429-37; C. C. Kao et al.、米国特許第６,３９９,３３５ Ｂ１号)。この先行報告においては、ＲＮＡポリメラーゼ反応は、ガンマ−ホスフェートにおいてジニトロフェニル基で修飾した、ガンマ−修飾のアルカリ性ホスファターゼ耐性のヌクレオチド三リン酸の存在下で実施された。ＲＮＡポリメラーゼ反応が、単なるヌクレオチド三リン酸およびホモポリマー性鋳型としてこのガンマ−修飾のＮＴＰの存在下で実施されたときには、ＲＮＡポリメラーゼが修飾ＮＴＰを認識して、利用することができたことが見出された。さらに、ポリメラーゼ反応が、発色性ｐ−ニトロフェニレートへのホスホリル転移のピロリン酸ｐ−ニトロフェニルのアルド−生成物を消化した、アルカリ性ホスファターゼの存在下で実施されたときには、吸光度の増加が報告された。
【０００６】
特許文献において数多くの参考文献が、ＤＮＡの検出およびシークェンシングのためのγ−標識ヌクレオチドの使用を記述する(Hardin et. al., ＷＯ ０２/４４４２５ Ａ２, Williams, J. G. ＷＯ ００/３６１５１ and ＷＯ ００/３６１５２)。Williamsは、ポリメラーゼによる取り込みの後で放出される蛍光的に標識したピロホスフェートの単一分子の検出におけるそれらの使用を記述する。塩基部分への失活剤の付加は、試料中の蛍光の量がガンマ−修飾のヌクレオシド三リン酸の取り込みで増加する、均一のポリメラーゼ拡張を可能とする。Hardin等はさらに、数多くの異なるポリメラーゼによる核酸合成におけるそれらの使用を示す。組み込みの効率は使用するポリメラーゼにより変わる。他の報告(Felicia et. al., Arch. Biochem Biophys, 1986, 246, 564-571)は、大腸菌ＲＮＡポリメラーゼに対する基質としてγ−１,５−ＥＤＡＮＳ−ＡＴＰ誘導体の使用を記述する。これらの参考文献は、末端ホスフェート標識ヌクレオチドの使用について存在する大きい潜在性を明らかに指摘する。不幸にも、既知の潜在的使用にかかわらず、それらはいかなる商業的応用に利用されていない。
【０００７】
上述のように、シークェンシング、ＳＮＰ分析および他のアッセイにおけるγ−標識ヌクレオシド三リン酸の使用についての主な不利点は、ポリメラーゼならびに他のＮＴＰを利用する酵素による不良な受容性である。これに対する理由は多分多種多様であり、酵素のポケット中でガンマ−修飾および特定のアミノ酸残基の間の立体的相互作用、ならびにヌクレオチド上の一つ少ない負電荷に因るヌクレオチドによる減少した金属結合もしくはヌクレオチドおよびポリメラーゼの間の減少した静電的相互作用を含み得る。それ故に、標識がさらに別なホスフェート基の添加によりヌクレオシドからさらに離れていて、また金属結合もしくは静電的相互作用のためのさらに別な電荷を提供するところの末端標識ヌクレオシドポリホスフェートと提供することは恩恵をもたらすであろう。
【０００８】
末端修飾および四個以上のホスフェートを有するヌクレオシドポリホスフェートが文献で公知である。これらは主としてジヌクレオシドポリホスフェートであり(ＷＯ ０１／１２６４４ Ａ１、米国特許第０５６８１８２３号、米国特許第ＵＳ０５６６３３２２号、米国特許第０５０４９５５０号、米国特許第０５６５８８９０号、米国特許第０５３０６６２９号、米国特許第０４８８６７４９号および米国特許第０６１８３９７８号)、そこでは、末端ホスフェート上の修飾はもう一つのヌクレオシドの追加である。これらのいずれも末端ホスフェート上に標識を有しない。検出用にデザインされた末端ホスフェート上の部分を持ちかつ四つのホスフェート単位を有するヌクレオシドポリホスフェートの発明者の知っている唯一の例は、５−ブルモ−４−クロロ−３−インドリルテトラホスホ−５'−アデノシンである。この化合物を発色性基質として使用して、Ａｐ４ＡホスホリラーゼおよびＡｐ４Ａ加水分解酵素を検討している。この場合には、テトラホスフェートの開裂生成物が脱リン酸化されて、インドール部分がニトロブルーテトラゾリウムの存在下で酸化されて、着色二量体を与えた後でのみ検出が可能である。この方法は、シグナルを作成するために少なくとも二分子の５−ブルモ−４−クロロ−３−ヒドロキシインドールを必要とする。非常に低い濃度においてそして特に単一分子の検出のためには、この部分は有用ではない。かくして、容易に検出可能な標識を持って、核酸ポリメラーゼのためのさらに良い基質である、末端ホスフェート標識ヌクレオシドポリホスフェートについての必要がある。
【０００９】
末端−ホスフェート上の標識を、化学発光および蛍光検出、質量もしくは還元電位による分析ならびに改良された比色性の検出を可能とするように変え得て、単に日常的な方法および計測器が検出に必要とされるであろう、ポリメラーゼのための基質であるヌクレオシドポリホスフェートを提供することはさらに恩恵をもたらすであろう。
【００１０】
末端位置における部分の同一性がヌクレオチドに対するＤＮＡポリメラーゼの特異性に大きく影響し得る、末端において修飾したヌクレオチドの認識および利用に関してＤＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡポリメラーゼより少なく無差別であると当分野で公知であるとすると、ＤＮＡポリメラーゼ活性をモニターすることによりＤＮＡを検出するための非−放射性方法を提供することが高度に望まれるであろう。さらに、ＤＮＡの合成および検出がリアルタイムのモニタリングのための単一管アッセイで達成され得ることならびにクレオチド基質の末端−ホスフェートにおける標識が、化学発光の、蛍光性の、および比色性の検出ならびに質量もしくは還元電位による分析を包含し得ることが望まれるであろう。
【００１１】
(発明の概要)
本発明は、四つ以上のホスフェートを持ち、式１の末端ホスフェート標識ヌクレオシドポリホスフェートの形にある物質の新しい組成物を提供し、そこでは、標識は、ヌクレオシドポリホスフェートからの開裂後に分離の有りもしくは無しで検出可能であるところの蛍光性の、化学発光の、着色性の部分または電気化学的タグである。
【化１】

式中、Ｐ＝ホスフェート(ＰＯ_３)およびその誘導体、ｎは３もしくはそれより大であり；Ｙは酸素もしくは硫黄原子であり；Ｂは窒素含有の複素環式塩基であり；Ｓは非環式部分、炭素環式部分もしくは糖部分であり；Ｌは、天然または修飾ヌクレオチドの末端ホスフェートにおいてリン酸エステル、チオエステル、ホスホン酸アルキルもしくはホスホラミデート結合を形成するのに適当なヒドロキシル基、スルフヒドリル基、ハロアルキル基またはアミノ基を含む蛍光性の、化学発光の、着色性のまたは電気化学的な標識であり；Ｐ−Ｌは、ホスフェートが除去されるときに、好ましくは独立して検出可能になるところのリン酸化標識である。
【００１２】
本発明はさらに、核酸ポリメラーゼのための基質であり、そして標識は、蛍光性の、発光の、着色性の色素または電気化学的もしくは質量のタグである、四つ以上のホスフェートを持つ末端ホスフェート標識ヌクレオシドポリホスフェートの形にある物質の組成物を提供する。
【００１３】
本発明は、核酸配列の存在を検出する方法であって、ａ) 核酸ポリメラーゼ反応を実施し、反応が、ホスファターゼに実質的に無反応性である少なくとも一つのヌクレオチドおよび少なくとも一つの現行の発明の末端−ホスフェート−標識ヌクレオチドの反応を含み、その反応は標識ポリホスフェートの生産をもたらす；ｂ)標識ポリホスフェートがホスファターゼまたはホスフェートもしくはポリホスフェートを転移する酵素と反応して、検出可能な種を生産することを可能とすること；およびｃ)検出可能な種の存在を検出すること：の工程を含む、方法を提供する。現行の発明におけるホスファターゼの定義には、リン酸モノエステル、ポリホスフェートおよびヌクレオチドを開裂して、無機のホスフェートを放出するところの任意の酵素が含まれる。ホスフェートもしくはポリホスフェートを転移する酵素は、一つの有機部分からもう一つへホスフェートもしくはポリホスフェート部分を転移するものであって、そしてそれらには、限定するものではないが、ピロホスファターゼ、ホスホラミデートホスホトランスフェラーゼおよびトリホスファターゼが含まれる。本発明の文脈において、これらの酵素は、末端において標識されたヌクレオチドリン酸を開裂しない(即ち、末端−ホスフェート−標識ヌクレオチドはホスファターゼまたはホスフェートもしくはポリホスフェートを転移する酵素に実質的に無反応性である)。本明細書中で提供されるホスファターゼの定義には、限定するものではないが、アルカリ性ホスファターゼ(ＥＣ３.１.３.１)および酸性ホスファターゼ(ＥＣ３.１.３.２)が特異的に含まれる。現行の発明におけるヌクレオチドの定義には、天然もしくは修飾ヌクレオチドリン酸が含まれる。
【００１４】
本発明はさらに、核酸配列の存在を検出する方法であって、ａ) 核酸ポリメラーゼ反応を実施し、反応が少なくとも一つの現行の発明の末端−ホスフェート−標識ヌクレオチドの反応を含み、その反応は標識ポリホスフェートの生産をもたらす；ｂ)標識ポリホスフェートの存在を分離の有りもしくは無しで検出すること：の工程を含む、方法を提供する。
【００１５】
本発明はさらに、ＤＮＡ配列の存在を検出する方法であって、ａ)現行の発明の末端−ホスフェート−標識ヌクレオチドの存在下で、ＤＮＡポリメラーゼ反応を実施し、その反応は標識ポリホスフェートの生産をもたらす；ｂ)標識ポリホスフェートがホスファターゼと反応して、検出可能な種を生産することを可能とすること；およびｃ)検出可能な種の存在を検出すること：の工程を含む、方法を提供する。
【００１６】
本発明は、ＤＮＡ配列の存在を検出する方法であって、ａ) 核酸ポリメラーゼ反応を実施し、反応が少なくとも一つの現行の発明の末端−ホスフェート−標識ヌクレオチドの反応を含み、その反応は標識ポリホスフェートの生産をもたらす；ｂ)標識ポリホスフェートの存在を分離の有りもしくは無しで検出すること：の工程を含む、方法を提供する。
【００１７】
本発明のさらなる態様は、核酸を定量化する方法であって、(ａ) 核酸ポリメラーゼ反応を実施し、反応がホスファターゼに実質的に無反応性であるクレオチドおよび少なくとも一つの現行の発明の末端−ホスフェート−標識ヌクレオチドの反応を含み、その反応は標識ポリホスフェートの生産をもたらす；(ｂ)標識ポリホスフェートがホスファターゼと反応して、検出可能な副産物種を核酸の量に実質的に比例する量で生産することを可能とすること；(ｃ)検出可能な種を測定すること；ならびに(ｄ)測定を既知の標準を用いて比較して、核酸の量を測定すること：の工程を含む、方法に関する。
【００１８】
本発明は、核酸配列を定量化する方法であって、(ａ) 核酸ポリメラーゼ反応を実施し、反応が少なくとも一つの現行の発明の末端−ホスフェート−標識ヌクレオチドの反応を含み、その反応は核酸の量に実質的に比例する量で標識ポリホスフェートの生産をもたらす；(ｂ)標識ポリホスフェートの量を分離の有りもしくは無しで測定すること、および測定を既知の標準を用いて比較して、核酸の量を測定すること：の工程を含む、方法を提供する。
【００１９】
本発明はさらに、ＤＮＡ配列を定量化する方法であって、(ａ) ＤＮＡポリメラーゼ反応を実施し、現行の発明の末端−ホスフェート−標識ヌクレオチドの存在下で、その反応は標識ポリホスフェートの生産をもたらす；(ｂ)標識ポリホスフェートがホスファターゼと反応して、検出可能な副産物種をＤＮＡ配列の量に実質的に比例する量で生産することを可能とすること；(ｃ)検出可能な種を測定すること；および(ｄ)測定を既知の標準を用いて比較して、核酸の量を測定すること：の工程を含む、方法に関する。
【００２０】
本発明は、ＤＮＡ配列を定量化する方法であって、(ａ) 核酸ポリメラーゼ反応を実施し、反応が、少なくとも一つの現行の発明の末端−ホスフェート−標識ヌクレオチドの反応を含み、その反応は核酸の量に実質的に比例する量で標識ポリホスフェートの生産をもたらす；(ｂ)標識ポリホスフェートの量を分離の有りもしくは無しで測定すること、および測定を既知の標準を用いて比較して、ＤＮＡの量を測定すること：の工程を含む、方法を提供する。
【００２１】
本発明のもう一つの態様は、核酸配列中で単一のヌクレオチドの同一性を決定する方法であって、(ａ) 核酸ポリメラーゼ反応を実施し、少なくとも一つの末端ホスフェート−標識ヌクレオチドの存在下で、その反応は標識ポリホスフェートの生産をもたらす；(ｂ)標識ポリホスフェートがホスファターゼと反応して、検出可能な種を生産することを可能とすること；(ｃ)検出可能な種の存在を検出すること；および(ｄ)組み込まれたヌクレオシドを同定すること：の工程を含むところの方法に関する。
【００２２】
本発明のもう一つの態様は、核酸配列中で単一のヌクレオチドの同一性を決定する方法であって、(ａ) 核酸ポリメラーゼ反応を実施し、少なくとも一つの現行の発明の末端ホスフェート−標識ヌクレオチドの存在下で、その反応は標識ポリホスフェートの生産をもたらす；(ｂ)標識ポリホスフェートの存在を検出すること；および(ｄ)組み込まれたヌクレオシドを同定すること：の工程を含むところの方法に関する。
【００２３】
本発明はさらに、核酸検出キットであって、そのキットが、
(ａ)下の式Ｉ：
【化２】

[式中、Ｐ＝ホスフェート(ＰＯ_３)およびその誘導体、ｎは３もしくはそれより大であり；Ｙは酸素もしくは硫黄原子であり；Ｂは窒素含有の複素環式塩基であり；Ｓは非環式部分、炭素環式部分もしくは糖部分であり；Ｌは、天然または修飾ヌクレオチドの末端ホスフェートにおいてリン酸エステル、チオエステル、ホスホン酸アルキル、もしくはホスホラミデート結合を形成するのに適当なヒドロキシル基、スルフヒドリル基、ハロアルキル基またはアミノ基を含む標識であり；Ｐ−Ｌは、ホスフェートが除去されるときに、好ましくは独立して検出可能になるところのリン酸化標識である]
にしたがう少なくとも一つもしくはそれ以上の末端−ホスフェート−標識ヌクレオチド；
(ｂ)少なくとも一つのＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼもしくは逆転転写酵素；
および
(ｃ)ホスファターゼまたは、ホスフェートもしくはポリホスフェートを転移する酵素
を含む、キットをさらに含む。
【００２４】
(発明の詳細な説明)
本明細書中で定義される際には、用語“ヌクレオシド”とは、炭素環式のもしくは非環式の部分のような、糖または糖代用品に結合したプリン、デアザプリン、ピリミジンまたは修飾塩基を、１'位置または同等な位置に含む化合物であって、２'−デオキシおよび２'−ヒドロキシル、ならびに２',３'−ジデオキシ形ならびに他の置換を含む。
【００２５】
本明細書中で使用される際には、用語“ヌクレオチド”とは、エステル化部位がペントース糖のＣ−５位置に付加したヒドロキシル基に典型的には対応する、ヌクレオシドのリン酸エステルを指す。
【００２６】
用語“オリゴヌクレオチド”には、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド等を含む、ヌクレオチドの線状オリゴマーもしくはそれらの誘導体が含まれる。本明細書を通じて、オリゴヌクレオチドが文字の配列により表されるときは何時でも、ヌクレオチドは、左から右に５'→３'の順序にあって、そこでは、別に指示が無い限り、Ａはデオキシアデノシンを意味し、Ｃはデオキシシチジンを意味し、Ｇはデオキシグアノシンを意味し、そしてＴはチミジンを意味する。
【００２７】
用語“プライマー”とは、独特な核酸配列に特異的な方式でアニールして、その独特な配列の増幅を可能とするところの線状オリゴヌクレオチドを指す。
【００２８】
語句“標的核酸配列”等とは、その配列の同一性、またはヌクレオシドの順番もしくは位置が本発明の一つもしくはそれ以上の方法により決定される、核酸を指す。
【００２９】
本発明は、式１の末端ホスフェート標識ヌクレオシドポリホスフェートの形にある物質の新しい組成物を提供し、
【化３】

【００３０】
式中、Ｐ＝ホスフェート(ＰＯ_３)およびその誘導体、ｎは３もしくはそれより大であり；Ｙは酸素もしくは硫黄原子であり；Ｂは窒素含有の複素環式塩基であり；Ｓは非環式部分、炭素環式部分もしくは糖部分であり；Ｌは、天然または修飾ヌクレオチドの末端ホスフェートにおいてリン酸エステル、チオエステル、ホスホン酸アルキルもしくはホスホラミデート結合を形成するのに適当なヒドロキシル基、スルフヒドリル基、ハロアルキル基またはアミノ基を含む蛍光性の、化学発光の、着色性のまたは電気化学的な標識であり；標識は、分離の有りもしくは無しで検出可能であり；Ｐ−Ｌは、ホスフェートが除去されるときに、好ましくは独立して検出可能になるところのリン酸化標識である。ホスホン酸アルキル結合は開裂するのに非常に困難であって、この場合には、標識−ホスフェートもしくは標識−ポリホスフェートが検出されることが注目されるべきである。
【００３１】
特定の実施態様において、式Ｉにおける糖部分は、以下：リボシル、２'−デオキシリボシル、３'−デオキシリボシル、２',３'−ジデヒドロジデオキシリボシル、２',３'−ジデオキシリボシル、２'−もしくは３'−アルコキシリボシル、２'−もしくは３'−アミノリボシル、２'−もしくは３'−フルオロリボシル、２'−もしくは３'−メルカプトリボシル、２'−もしくは３'−アルキルチオリボシル、非環式、炭素環式および他の修飾糖、から選択され得る。
【００３２】
本発明の方法の目的には、有用な炭素環式部分は、Ferraro, M. and Gotor, V. in Chem Rev. 2000, volume 100, 4319-48、により記載されている。適当な糖部分は、Joeng, L.S. et al., in J Med. Chem. 1993, vol. 356, 2627-38; by Kim H.O. et al., in J Med. Chem. 193, vol. 36, 30-7; and by Eschenmosser A., in Science 1999, vol. 284, 2118-2124、により記載されている。さらに、有用な非環式部分は、Martinez, C.I., et al., in Nucleic Acids Research 1999, vol. 27, 1271-1274; by Martinez, C.I., et al., in Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 1997, vol. 7, 3013-3016;およびTrainer, G.Lへの米国特許第５,５５８,９１号、により記載されている。これらの部分の構造は下に示されるが、そこでは、全ての部分について、ＲはＨ、ＯＨ、ＮＨＲ、Ｆ、Ｎ_３、ＳＨ、ＳＲ，ＯＲ、低級アルキルおよびアリ−ルであり得て；糖部分について、ＸおよびＹは独立してＯ、ＳもしくはＮＨであり；そして非環式部分について、Ｘ＝Ｏ、Ｓ、ＮＨ、ＮＲである。
【化４】

炭素環式部分
【化５】

糖部分
【化６】

非環式部分
【００３３】
さらに、式Ｉにおいて、塩基には、ウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、グアニン、７−デアザグアニン、ヒポキサンチン、７−デアザヒポキサンチン、アデニン、７−デアザアデニン、２，６−ジアミノプリンもしくはそれらの類似体が含まれる。
【００３４】
末端−ホスフェート−標識ヌクレオチドにおいて末端−ホスフェート位置に付加した標識は、化学発光化合物、蛍光原色素、発色性色素、および電気化学的タグからなる群から選択され得る。これは、検出可能な種を、色、蛍光放射、化学発光、電気化学的検出もしくはそれらの組み合わせのいずれか一つの存在により、検出可能にさせるであろう。
【００３５】
リンカーから直接にもしくは通してのいずれかで末端ホスフェート基に付加し得る標識の例を下の表１〜２に与え、末端ホスフェート標識ヌクレオシドポリホスフェートの或る例を表３に示す。
表１：ホスフェート残基を除去後に独立して検出可能になるところの検出可能な標識部分の例
【表１】

表２：ヌクレオシドリン酸に付加したときでさえ検出可能であるところの検出可能な部分の例
【表２】

表３：標識ヌクレオシドポリホスフェートの或る例
アデノシン−５'−(δ−７−(９Ｈ−(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン)))四リン酸もしくはＡ４Ｐ−ＤＤＡＯ
グアノシン−５'−(δ−７−(９Ｈ−(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン) ))四リン酸もしくはＧ４Ｐ−ＤＤＡＯ
シチジン−５'−(δ−７−(９Ｈ−(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン) ))四リン酸もしくはＣ４Ｐ−ＤＤＡＯ
チミジン−５'−(δ−７−(９Ｈ−(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン) ))四リン酸もしくはＴ４Ｐ−ＤＤＡＯ
ウリジン−５'−(δ−７−(９Ｈ−(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン)))四リン酸もしくはＵ４Ｐ−ＤＤＡＯ
２'−デオキシアデノシン−５'−(δ−７−(９Ｈ−(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン)))四リン酸もしくはｄＡ４Ｐ−ＤＤＡＯ
２'−デオキシグアノシン−５'−(δ−７−(９Ｈ−(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン)))四リン酸もしくはｄＧ４Ｐ−ＤＤＡＯ
２'−デオキシシチジン−５'−(δ−７−(９Ｈ−(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン)))四リン酸もしくはｄＣ４Ｐ−ＤＤＡＯ
２'−デオキシチミジン−５'−(δ−７−(９Ｈ−(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン)))四リン酸もしくはｄＴ４Ｐ−ＤＤＡＯ
２'−デオキシウリジン−５'−(δ−７−(９Ｈ−(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン)))四リン酸もしくはｄＵ４Ｐ−ＤＤＡＯ
２',３'−ジデオキシアデノシン−５'−(δ−７−(９Ｈ−(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン)))四リン酸もしくはｄｄＡ４Ｐ−ＤＤＡＯ
２',３'−ジデオキシグアノシン−５'−(δ−７−(９Ｈ−(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン)))四リン酸もしくはｄｄＧ４Ｐ−ＤＤＡＯ
２',３'−ジデオキシシチジン−５'−(δ−７−(９Ｈ−(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン)))四リン酸もしくはｄｄＣ４Ｐ−ＤＤＡＯ
２',３'−ジデオキシチミジン−５'−(δ−７−(９Ｈ−(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン)))四リン酸もしくはｄｄＴ４Ｐ−ＤＤＡＯ
２',３'−ジデオキシウリジン−５'−(δ−７−(９Ｈ−(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン)))四リン酸もしくはｄｄＵ４Ｐ−ＤＤＡＯ
３'−デオキシアデノシン−５'−(δ−７−(９Ｈ−(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン)))四リン酸もしくは３'−ｄＡ４Ｐ−ＤＤＡＯ
３'−デオキシグアノシン−５'−(δ−７−(９Ｈ−(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン)))四リン酸もしくは３'−ｄＧ４Ｐ−ＤＤＡＯ
３'−デオキシシチジン−５'−(δ−７−(９Ｈ−(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン)))四リン酸もしくは３'−ｄＣ４Ｐ−ＤＤＡＯ
３'−デオキシチミジン−５'−(δ−７−(９Ｈ−(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン) ))四リン酸もしくは３'−ｄＴ４Ｐ−ＤＤＡＯ
３'−デオキシウリジン−５'−(δ−７−(９Ｈ−(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン)))四リン酸もしくは３'−ｄＵ４Ｐ−ＤＤＡＯ
アデノシン−５'−(ε−７−(９Ｈ−(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン)))五リン酸もしくはＡ５Ｐ−ＤＤＡＯ
グアノシン−５'−(ε−７−(９Ｈ−(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン) ))四リン酸もしくはＧ５Ｐ−ＤＤＡＯ
シチジン−５'−(ε−７−(９Ｈ−(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン) ))四リン酸もしくはＣ５Ｐ−ＤＤＡＯ
チミジン−５'−(ε−７−(９Ｈ−(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン) ))四リン酸もしくはＴ５Ｐ−ＤＤＡＯ
ウリジン−５'−(ε−７−(９Ｈ−(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン)))四リン酸もしくはＵ５Ｐ−ＤＤＡＯ
２'−デオキシアデノシン−５'−(ε−７−(９Ｈ−(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン)))四リン酸もしくはｄＡ５Ｐ−ＤＤＡＯ
２'−デオキシグアノシン−５'−(ε−７−(９Ｈ−(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン)))四リン酸もしくはｄＧ５Ｐ−ＤＤＡＯ
２'−デオキシシチジン−５'−(ε−７−(９Ｈ−(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン)))四リン酸もしくはｄＣ５Ｐ−ＤＤＡＯ
２'−デオキシチミジン−５'−(ε−７−(９Ｈ−(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン) ))四リン酸もしくはｄＴ５Ｐ−ＤＤＡＯ
２'−デオキシウリジン−５'−(ε−７−(９Ｈ−(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン)))四リン酸もしくはｄＵ５Ｐ−ＤＤＡＯ
２',３'−ジデオキシアデノシン−５'−(ε−７−(９Ｈ−(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン)))四リン酸もしくはｄｄＡ５Ｐ−ＤＤＡＯ
２',３'−ジデオキシグアノシン−５'−(ε−７−(９Ｈ−(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン)))四リン酸もしくはｄdＧ５Ｐ−ＤＤＡＯ
２',３'−ジデオキシシチジン−５'−(ε−７−(９Ｈ−(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン)))四リン酸もしくはｄｄＣ５Ｐ−ＤＤＡＯ
２',３'−ジデオキシチミジン−５'−(ε−７−(９Ｈ−(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン)))四リン酸もしくはｄｄＴ５Ｐ−ＤＤＡＯ
２',３'−ジデオキシウリジン−５'−(ε−７−(９Ｈ−(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン)))四リン酸もしくはｄｄＵ５Ｐ−ＤＤＡＯ
３'−デオキシアデノシン−５'−(ε−７−(９Ｈ−(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン)))四リン酸もしくは３'−ｄＡ５Ｐ−ＤＤＡＯ
３'−デオキシグアノシン−５'−(ε−７−(９Ｈ−(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン)))四リン酸もしくは３'−ｄＧ５Ｐ−ＤＤＡＯ
３'−デオキシシチジン−５'−(ε−７−(９Ｈ−(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン)))四リン酸もしくは３'−ｄＣ４Ｐ−ＤＤＡＯ
３'−デオキシチミジン−５'−(ε−７−(９Ｈ−(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン)))四リン酸もしくは３'−ｄＴ５Ｐ−ＤＤＡＯ
３'−デオキシウリジン−５'−(ε−７−(９Ｈ−(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン)))四リン酸もしくは３'−ｄＵ５Ｐ−ＤＤＡＯ
アデノシン−５'−(ζ−７−(９Ｈ−(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン)))五リン酸もしくはＡ６Ｐ−ＤＤＡＯ
グアノシン−５'−(ζ−７−(９Ｈ−(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン) ))四リン酸もしくはＧ６Ｐ−ＤＤＡＯ
シチジン−５'−(ζ−７−(９Ｈ−(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン) ))四リン酸もしくはＣ６Ｐ−ＤＤＡＯ
チミジン−５'−(ζ−７−(９Ｈ−(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン) ))四リン酸もしくはＴ６Ｐ−ＤＤＡＯ
ウリジン−５'−(ζ−７−(９Ｈ−(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン)))四リン酸もしくはＵ６Ｐ−ＤＤＡＯ
２'−デオキシアデノシン−５'−(ζ−７−(９Ｈ−(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン)))四リン酸もしくはｄＡ６Ｐ−ＤＤＡＯ
２'−デオキシグアノシン−５'−(ζ−７−(９Ｈ−(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン)))四リン酸もしくはｄＧ６Ｐ−ＤＤＡＯ
２'−デオキシシチジン−５'−(ζ−７−(９Ｈ−(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン)))四リン酸もしくはｄＣ６Ｐ−ＤＤＡＯ
２'−デオキシチミジン−５'−(ζ−７−(９Ｈ−(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン)))四リン酸もしくはｄＴ６Ｐ−ＤＤＡＯ
２'−デオキシウリジン−５'−(ζ−７−(９Ｈ−(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン)))四リン酸もしくはｄＵ６Ｐ−ＤＤＡＯ
２',３'−ジデオキシアデノシン−５'−(ζ−７−(９Ｈ−(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン)))四リン酸もしくはｄｄＡ６Ｐ−ＤＤＡＯ
２',３'−ジデオキシグアノシン−５'−(ζ−７−(９Ｈ−(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン)))四リン酸もしくはｄdＧ６Ｐ−ＤＤＡＯ
２',３'−ジデオキシシチジン−５'−(ζ−７−(９Ｈ−(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン)))四リン酸もしくはｄｄＣ６Ｐ−ＤＤＡＯ
２',３'−ジデオキシチミジン−５'−(ζ−７−(９Ｈ−(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン)))四リン酸もしくはｄｄＴ６Ｐ−ＤＤＡＯ
２',３'−ジデオキシウリジン−５'−(ζ−７−(９Ｈ−(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン)))四リン酸もしくはｄｄＵ６Ｐ−ＤＤＡＯ
３'−デオキシアデノシン−５'−(ζ−７−(９Ｈ−(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン)))四リン酸もしくは３'−ｄＡ５Ｐ−ＤＤＡＯ
３'−デオキシグアノシン−５'−(ζ−７−(９Ｈ−(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン)))四リン酸もしくは３'−ｄＧ６Ｐ−ＤＤＡＯ
３'−デオキシシチジン−５'−(ζ−７−(９Ｈ−(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン)))四リン酸もしくは３'−ｄＣ６Ｐ−ＤＤＡＯ
３'−デオキシチミジン−５'−(ζ−７−(９Ｈ−(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン)))四リン酸もしくは３'−ｄＴ６Ｐ−ＤＤＡＯ
３'−デオキシウリジン−５'−(ζ−７−(９Ｈ−(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン)))四リン酸もしくは３'−ｄＵ６Ｐ−ＤＤＡＯ
アデノシン−５'−(δ−７−ウンベリフェロン)四リン酸もしくはＡ４Ｐ−Ｕｍｂ
グアノシン−５'−(δ−７−ウンベリフェロン)四リン酸もしくはＧ４Ｐ−Ｕｍｂ
シチジン−５'−(δ−７−ウンベリフェロン)四リン酸もしくはＣ４Ｐ−Ｕｍｂ
チミジン−５'−(δ−７−ウンベリフェロン)四リン酸もしくはＴ４Ｐ−Ｕｍｂ
ウリジン−５'−(δ−７−ウンベリフェロン)四リン酸もしくはＵ４Ｐ−Ｕｍｂ
２'−デオキシアデノシン−５'−(δ−７−ウンベリフェロン)四リン酸もしくはｄＡ４Ｐ−Ｕｍｂ
２'−デオキシグアノシン−５'−(δ−７−ウンベリフェロン)四リン酸もしくはｄＧ４Ｐ−Ｕｍｂ
２'−デオキシシチジン−５'−(δ−７−ウンベリフェロン)四リン酸もしくはｄＣ４Ｐ−Ｕｍｂ
２'−デオキシチミジン−５'−(δ−７−ウンベリフェロン)四リン酸もしくはｄＴ４Ｐ−Ｕｍｂ
２'−デオキシウリジン−５'−(δ−７−ウンベリフェロン)四リン酸もしくはｄＵ４Ｐ−Ｕｍｂ
２',３'−ジデオキシアデノシン−５'−(δ−７−ウンベリフェロン)四リン酸もしくはｄｄＡ４Ｐ−Ｕｍｂ
２',３'−ジデオキシグアノシン−５'−(δ−７−ウンベリフェロン)四リン酸もしくはｄｄＧ４Ｐ−Ｕｍｂ
２',３'−ジデオキシシチジン−５'−(δ−７−ウンベリフェロン)四リン酸もしくはｄｄＣ４Ｐ−Ｕｍｂ
２',３'−ジデオキシチミジン−５'−(δ−７−ウンベリフェロン)四リン酸もしくはｄｄＴ４Ｐ−Ｕｍｂ
２',３'−ジデオキシウリジン−５'−(δ−７−ウンベリフェロン)四リン酸もしくはｄｄＵ４Ｐ−Ｕｍｂ
３'−デオキシアデノシン−５'−(δ−７−ウンベリフェロン)四リン酸もしくは３'−ｄＡ４Ｐ−Ｕｍｂ
３'−デオキシグアノシン−５'−(δ−７−ウンベリフェロン)四リン酸もしくは３'−ｄＧ４Ｐ−Ｕｍｂ
３'−デオキシシチジン−５'−(δ−７−ウンベリフェロン)四リン酸もしくは３'−ｄＣ４Ｐ−Ｕｍｂ
３'−デオキシチミジン−５'−(δ−７−ウンベリフェロン)四リン酸もしくは３'−ｄＴ４Ｐ−Ｕｍｂ
３'−デオキシウリジン−５'−(δ−７−ウンベリフェロン)四リン酸もしくは３'−ｄＵ４Ｐ−Ｕｍｂ
アデノシン−５'−(ε−７−ウンベリフェロン)五リン酸もしくはＡ５Ｐ−Ｕｍｂ
グアノシン−５'−(ε−７−ウンベリフェロン)四リン酸もしくはＧ５Ｐ−Ｕｍｂ
シチジン−５'−(ε−７−ウンベリフェロン)四リン酸もしくはＣ５Ｐ−Ｕｍｂ
チミジン−５'−(ε−７−ウンベリフェロン)四リン酸もしくはＴ５Ｐ−Ｕｍｂ
ウリジン−５'−(ε−７−ウンベリフェロン)四リン酸もしくはＵ５Ｐ−Ｕｍｂ
２'−デオキシアデノシン−５'−(ε−７−ウンベリフェロン)四リン酸もしくはｄＡ５Ｐ−Ｕｍｂ
２'−デオキシグアノシン−５'−(ε−７−ウンベリフェロン)四リン酸もしくはｄＧ５Ｐ−Ｕｍｂ
２'−デオキシシチジン−５'−(ε−７−ウンベリフェロン)四リン酸もしくはｄＣ５Ｐ−Ｕｍｂ
２'−デオキシチミジン−５'−(ε−７−ウンベリフェロン)四リン酸もしくはｄＴ５Ｐ−Ｕｍｂ
２'−デオキシウリジン−５'−(ε−７−ウンベリフェロン)四リン酸もしくはｄＵ５Ｐ−Ｕｍｂ
２',３'−ジデオキシアデノシン−５'−(ε−７−ウンベリフェロン)四リン酸もしくはｄｄＡ５Ｐ−Ｕｍｂ
２',３'−ジデオキシグアノシン−５'−(ε−７−ウンベリフェロン)四リン酸もしくはｄdＧ５Ｐ−Ｕｍｂ
２',３'−ジデオキシシチジン−５'−(ε−７−ウンベリフェロン)四リン酸もしくはｄｄＣ５Ｐ−Ｕｍｂ
２',３'−ジデオキシチミジン−５'−(ε−７−ウンベリフェロン)四リン酸もしくはｄｄＴ５Ｐ−Ｕｍｂ
２',３'−ジデオキシウリジン−５'−(ε−７−ウンベリフェロン)四リン酸もしくはｄｄＵ５Ｐ−Ｕｍｂ
３'−デオキシアデノシン−５'−(ε−７−ウンベリフェロン)四リン酸もしくは３'−ｄＡ５Ｐ−Ｕｍｂ
３'−デオキシグアノシン−５'−(ε−７−ウンベリフェロン)四リン酸もしくは３'−ｄＧ５Ｐ−Ｕｍｂ
３'−デオキシシチジン−５'−(ε−７−ウンベリフェロン)四リン酸もしくは３'−ｄＣ４Ｐ−Ｕｍｂ
３'−デオキシチミジン−５'−(ε−７−ウンベリフェロン)四リン酸もしくは３'−ｄＴ５Ｐ−Ｕｍｂ
３'−デオキシウリジン−５'−(ε−７−ウンベリフェロン)四リン酸もしくは３'−ｄＵ５Ｐ−Ｕｍｂ
アデノシン−５'−(ζ−７−ウンベリフェロン)五リン酸もしくはＡ６Ｐ−Ｕｍｂ
グアノシン−５'−(ζ−７−ウンベリフェロン)四リン酸もしくはＧ６Ｐ−Ｕｍｂ
シチジン−５'−(ζ−７−ウンベリフェロン)四リン酸もしくはＣ６Ｐ−Ｕｍｂ
チミジン−５'−(ζ−７−ウンベリフェロン)四リン酸もしくはＴ６Ｐ−Ｕｍｂ
ウリジン−５'−(ζ−７−ウンベリフェロン)四リン酸もしくはＵ６Ｐ−Ｕｍｂ
２'−デオキシアデノシン−５'−(ζ−７−ウンベリフェロン)四リン酸もしくはｄＡ６Ｐ−Ｕｍｂ
２'−デオキシグアノシン−５'−(ζ−７−ウンベリフェロン)四リン酸もしくはｄＧ６Ｐ−Ｕｍｂ
２'−デオキシシチジン−５'−(ζ−７−ウンベリフェロン)四リン酸もしくはｄＣ６Ｐ−Ｕｍｂ
２'−デオキシチミジン−５'−(ζ−７−ウンベリフェロン)四リン酸もしくはｄＴ６Ｐ−Ｕｍｂ
２'−デオキシウリジン−５'−(ζ−７−ウンベリフェロン)四リン酸もしくはｄＵ６Ｐ−Ｕｍｂ
２',３'−ジデオキシアデノシン−５'−(ζ−７−ウンベリフェロン)四リン酸もしくはｄｄＡ６Ｐ−Ｕｍｂ
２',３'−ジデオキシグアノシン−５'−(ζ−７−ウンベリフェロン)四リン酸もしくはｄdＧ６Ｐ−Ｕｍｂ
２',３'−ジデオキシシチジン−５'−(ζ−７−ウンベリフェロン)四リン酸もしくはｄｄＣ６Ｐ−Ｕｍｂ
２',３'−ジデオキシチミジン−５'−(ζ−７−ウンベリフェロン)四リン酸もしくはｄｄＴ６Ｐ−Ｕｍｂ
２',３'−ジデオキシウリジン−５'−(ζ−７−ウンベリフェロン)四リン酸もしくはｄｄＵ６Ｐ−Ｕｍｂ
３'−デオキシアデノシン−５'−(ζ−７−ウンベリフェロン)四リン酸もしくは３'−ｄＡ５Ｐ−Ｕｍｂ
３'−デオキシグアノシン−５'−(ζ−７−ウンベリフェロン)四リン酸もしくは３'−ｄＧ６Ｐ−Ｕｍｂ
３'−デオキシシチジン−５'−(ζ−７−ウンベリフェロン)四リン酸もしくは３'−ｄＣ６Ｐ−Ｕｍｂ
３'−デオキシチミジン−５'−(ζ−７−ウンベリフェロン)四リン酸もしくは３'−ｄＴ６Ｐ−Ｕｍｂ
３'−デオキシウリジン−５'−(ζ−７−ウンベリフェロン)四リン酸もしくは３'−ｄＵ６Ｐ−Ｕｍｂ
アデノシン−５'−(δ−７−(４−メチルウンベリフェロン))四リン酸もしくはＡ４Ｐ−ＭｅＵｍｂ
グアノシン−５'−(δ−７−(４−メチルウンベリフェロン))四リン酸もしくはＧ４Ｐ−ＭｅＵｍｂ
シチジン−５'−(δ−７−(４−メチルウンベリフェロン))四リン酸もしくはＣ４Ｐ−ＭｅＵｍｂ
チミジン−５'−(δ−７−(４−メチルウンベリフェロン))四リン酸もしくはＴ４Ｐ−ＭｅＵｍｂ
ウリジン−５'−(δ−７−(４−メチルウンベリフェロン))四リン酸もしくはＵ４Ｐ−ＭｅＵｍｂ
２'−デオキシアデノシン−５'−(δ−７−(４−メチルウンベリフェロン))四リン酸もしくはｄＡ４Ｐ−ＭｅＵｍｂ
２'−デオキシグアノシン−５'−(δ−７−(４−メチルウンベリフェロン))四リン酸もしくはｄＧ４Ｐ−ＭｅＵｍｂ
２'−デオキシシチジン−５'−(δ−７−(４−メチルウンベリフェロン))四リン酸もしくはｄＣ４Ｐ−ＭｅＵｍｂ
２'−デオキシチミジン−５'−(δ−７−(４−メチルウンベリフェロン))四リン酸もしくはｄＴ４Ｐ−ＭｅＵｍｂ
２'−デオキシウリジン−５'−(δ−７−(４−メチルウンベリフェロン))四リン酸もしくはｄＵ４Ｐ−ＭｅＵｍｂ
２',３'−ジデオキシアデノシン−５'−(δ−７−(４−メチルウンベリフェロン))四リン酸もしくはｄｄＡ４Ｐ−ＭｅＵｍｂ
２',３'−ジデオキシグアノシン−５'−(δ−７−(４−メチルウンベリフェロン))四リン酸もしくはｄＧ４Ｐ−ＭｅＵｍｂ
２',３'−ジデオキシシチジン−５'−(δ−７−(４−メチルウンベリフェロン))四リン酸もしくはｄｄＣ４Ｐ−ＭｅＵｍｂ
２',３'−ジデオキシチミジン−５'−(δ−７−(４−メチルウンベリフェロン))四リン酸もしくはｄｄＴ４Ｐ−ＭｅＵｍｂ
２',３'−ジデオキシウリジン−５'−(δ−７−(４−メチルウンベリフェロン))四リン酸もしくはｄｄＵ４Ｐ−ＭｅＵｍｂ
３'−デオキシアデノシン−５'−(δ−７−(４−メチルウンベリフェロン))四リン酸もしくは３'−ｄＡ４Ｐ−ＭｅＵｍｂ
３'−デオキシグアノシン−５'−(δ−７−(４−メチルウンベリフェロン))四リン酸もしくは３'−ｄＧ４Ｐ−ＭｅＵｍｂ
３'−デオキシシチジン−５'−(δ−７−(４−メチルウンベリフェロン))四リン酸もしくは３'−ｄＣ４Ｐ−ＭｅＵｍｂ
３'−デオキシチミジン−５'−(δ−７−(４−メチルウンベリフェロン))四リン酸もしくは３'−ｄＴ４Ｐ−ＭｅＵｍｂ
３'−デオキシウリジン−５'−(δ−７−(４−メチルウンベリフェロン))四リン酸もしくは３'−ｄＵ４Ｐ−ＭｅＵｍｂ
アデノシン−５'−(ε−７−(４−メチルウンベリフェロン))五リン酸もしくはＡ５Ｐ−ＭｅＵｍｂ
グアノシン−５'−(ε−７−(４−メチルウンベリフェロン))四リン酸もしくはＧ５Ｐ−ＭｅＵｍｂ
シチジン−５'−(ε−７−(４−メチルウンベリフェロン))四リン酸もしくはＣ５Ｐ−ＭｅＵｍｂ
チミジン−５'−(ε−７−(４−メチルウンベリフェロン))四リン酸もしくはＴ５Ｐ−ＭｅＵｍｂ
ウリジン−５'−(ε−７−(４−メチルウンベリフェロン))四リン酸もしくはＵ５Ｐ−ＭｅＵｍｂ
２'−デオキシアデノシン−５'−(ε−７−(４−メチルウンベリフェロン))四リン酸もしくはｄＡ５Ｐ−ＭｅＵｍｂ
２'−デオキシグアノシン−５'−(ε−７−(４−メチルウンベリフェロン))四リン酸もしくはｄＧ５Ｐ−ＭｅＵｍｂ
２'−デオキシシチジン−５'−(ε−７−(４−メチルウンベリフェロン))四リン酸もしくはｄＣ５Ｐ−ＭｅＵｍｂ
２'−デオキシチミジン−５'−(ε−７−(４−メチルウンベリフェロン))四リン酸もしくはｄＴ５Ｐ−ＭｅＵｍｂ
２'−デオキシウリジン−５'−(ε−７−(４−メチルウンベリフェロン))四リン酸もしくはｄＵ５Ｐ−ＭｅＵｍｂ
２',３'−ジデオキシアデノシン−５'−(ε−７−(４−メチルウンベリフェロン))四リン酸もしくはｄｄＡ５Ｐ−ＭｅＵｍｂ
２',３'−ジデオキシグアノシン−５'−(ε−７−(４−メチルウンベリフェロン))四リン酸もしくはｄdＧ５Ｐ−ＭｅＵｍｂ
２',３'−ジデオキシシチジン−５'−(ε−７−(４−メチルウンベリフェロン))四リン酸もしくはｄｄＣ５Ｐ−ＭｅＵｍｂ
２',３'−ジデオキシチミジン−５'−(ε−７−(４−メチルウンベリフェロン))四リン酸もしくはｄｄＴ５Ｐ−ＭｅＵｍｂ
２',３'−ジデオキシウリジン−５'−(ε−７−(４−メチルウンベリフェロン))四リン酸もしくはｄｄＵ５Ｐ−ＭｅＵｍｂ
３'−デオキシアデノシン−５'−(ε−７−(４−メチルウンベリフェロン))四リン酸もしくは３'−ｄＡ５Ｐ−ＭｅＵｍｂ
３'−デオキシグアノシン−５'−(ε−７−(４−メチルウンベリフェロン))四リン酸もしくは３'−ｄＧ５Ｐ−ＭｅＵｍｂ
３'−デオキシシチジン−５'−(ε−７−(４−メチルウンベリフェロン))四リン酸もしくは３'−ｄＣ４Ｐ−ＭｅＵｍｂ
３'−デオキシチミジン−５'−(ε−７−(４−メチルウンベリフェロン))四リン酸もしくは３'−ｄＴ５Ｐ−ＭｅＵｍｂ
３'−デオキシウリジン−５'−(ε−７−(４−メチルウンベリフェロン))四リン酸もしくは３'−ｄＵ５Ｐ−ＭｅＵｍｂ
アデノシン−５'−(ζ−７−(４−メチルウンベリフェロン))五リン酸もしくはＡ６Ｐ−ＭｅＵｍｂ
グアノシン−５'−(ζ−７−(４−メチルウンベリフェロン))四リン酸もしくはＧ６Ｐ−ＭｅＵｍｂ
シチジン−５'−(ζ−７−(４−メチルウンベリフェロン))四リン酸もしくはＣ６Ｐ−ＭｅＵｍｂ
チミジン−５'−(ζ−７−(４−メチルウンベリフェロン))四リン酸もしくはＴ６Ｐ−ＭｅＵｍｂ
ウリジン−５'−(ζ−７−(４−メチルウンベリフェロン))四リン酸もしくはＵ６Ｐ−ＭｅＵｍｂ
２'−デオキシアデノシン−５'−(ζ−７−(４−メチルウンベリフェロン))四リン酸もしくはｄＡ６Ｐ−ＭｅＵｍｂ
２'−デオキシグアノシン−５'−(ζ−７−(４−メチルウンベリフェロン))四リン酸もしくはｄＧ６Ｐ−ＭｅＵｍｂ
２'−デオキシシチジン−５'−(ζ−７−(４−メチルウンベリフェロン))四リン酸もしくはｄＣ６Ｐ−ＭｅＵｍｂ
２'−デオキシチミジン−５'−(ζ−７−(４−メチルウンベリフェロン))四リン酸もしくはｄＴ６Ｐ−ＭｅＵｍｂ
２'−デオキシウリジン−５'−(ζ−７−(４−メチルウンベリフェロン))四リン酸もしくはｄＵ６Ｐ−ＭｅＵｍｂ
２',３'−ジデオキシアデノシン−５'−(ζ−７−(４−メチルウンベリフェロン))四リン酸もしくはｄｄＡ６Ｐ−ＭｅＵｍｂ
２',３'−ジデオキシグアノシン−５'−(ζ−７−(４−メチルウンベリフェロン))四リン酸もしくはｄdＧ６Ｐ−ＭｅＵｍｂ
２',３'−ジデオキシシチジン−５'−(ζ−７−(４−メチルウンベリフェロン))四リン酸もしくはｄｄＣ６Ｐ−ＭｅＵｍｂ
２',３'−ジデオキシチミジン−５'−(ζ−７−(４−メチルウンベリフェロン))四リン酸もしくはｄｄＴ６Ｐ−ＭｅＵｍｂ
２',３'−ジデオキシウリジン−５'−(ζ−７−(４−メチルウンベリフェロン))四リン酸もしくはｄｄＵ６Ｐ−ＭｅＵｍｂ
３'−デオキシアデノシン−５'−(ζ−７−(４−メチルウンベリフェロン))四リン酸もしくは３'−ｄＡ６Ｐ−ＭｅＵｍｂ
３'−デオキシグアノシン−５'−(ζ−７−(４−メチルウンベリフェロン))四リン酸もしくは３'−ｄＧ６Ｐ−ＭｅＵｍｂ
３'−デオキシシチジン−５'−(ζ−７−(４−メチルウンベリフェロン))四リン酸もしくは３'−ｄＣ６Ｐ−ＭｅＵｍｂ
３'−デオキシチミジン−５'−(ζ−７−(４−メチルウンベリフェロン))四リン酸もしくは３'−ｄＴ６Ｐ−ＭｅＵｍｂ
３'−デオキシウリジン−５'−(ζ−７−(４−メチルウンベリフェロン))四リン酸もしくは３'−ｄＵ６Ｐ−ＭｅＵｍｂ
アデノシン−５'−(δ−７−レゾルフィン)四リン酸もしくはＡ４Ｐ−ＲＲ
グアノシン−５'−(δ−７−レゾルフィン)四リン酸もしくはＧ４Ｐ−ＲＲ
シチジン−５'−(δ−７−レゾルフィン)四リン酸もしくはＣ４Ｐ−ＲＲ
チミジン−５'−(δ−７−レゾルフィン)四リン酸もしくはＴ４Ｐ−ＲＲ
ウリジン−５'−(δ−７−レゾルフィン)四リン酸もしくはＵ４Ｐ−ＲＲ
２'−デオキシアデノシン−５'−(δ−７−レゾルフィン)四リン酸もしくはｄＡ４Ｐ−ＲＲ
２'−デオキシグアノシン−５'−(δ−７−レゾルフィン)四リン酸もしくはｄＧ４Ｐ−ＲＲ
２'−デオキシシチジン−５'−(δ−７−レゾルフィン)四リン酸もしくはｄＣ４Ｐ−ＲＲ
２'−デオキシチミジン−５'−(δ−７−レゾルフィン)四リン酸もしくはｄＴ４Ｐ−ＲＲ
２'−デオキシウリジン−５'−(δ−７−レゾルフィン)四リン酸もしくはｄＵ４Ｐ−ＲＲ
２',３'−ジデオキシアデノシン−５'−(δ−７−レゾルフィン)四リン酸もしくはｄｄＡ４Ｐ−ＲＲ
２',３'−ジデオキシグアノシン−５'−(δ−７−レゾルフィン)四リン酸もしくはｄＧ４Ｐ−ＲＲ
２',３'−ジデオキシシチジン−５'−(δ−７−レゾルフィン)四リン酸もしくはｄｄＣ４Ｐ−ＲＲ
２',３'−ジデオキシチミジン−５'−(δ−７−レゾルフィン)四リン酸もしくはｄｄＴ４Ｐ−ＲＲ
２',３'−ジデオキシウリジン−５'−(δ−７−レゾルフィン)四リン酸もしくはｄｄＵ４Ｐ−ＲＲ
３'−デオキシアデノシン−５'−(δ−７−レゾルフィン)四リン酸もしくは３'−ｄＡ４Ｐ−ＲＲ
３'−デオキシグアノシン−５'−(δ−７−レゾルフィン)四リン酸もしくは３'−ｄＧ４Ｐ−ＲＲ
３'−デオキシシチジン−５'−(δ−７−レゾルフィン)四リン酸もしくは３'−ｄＣ４Ｐ−ＲＲ
３'−デオキシチミジン−５'−(δ−７−レゾルフィン)四リン酸もしくは３'−ｄＴ４Ｐ−ＲＲ
３'−デオキシウリジン−５'−(δ−７−レゾルフィン)四リン酸もしくは３'−ｄＵ４Ｐ−ＲＲ
アデノシン−５'−(ε−７−レゾルフィン)五リン酸もしくはＡ５Ｐ−ＲＲ
グアノシン−５'−(ε−７−レゾルフィン)四リン酸もしくはＧ５Ｐ−ＲＲ
シチジン−５'−(ε−７−レゾルフィン)四リン酸もしくはＣ５Ｐ−ＲＲ
チミジン−５'−(ε−７−レゾルフィン)四リン酸もしくはＴ５Ｐ−ＲＲ
ウリジン−５'−(ε−７−レゾルフィン)四リン酸もしくはＵ５Ｐ−ＲＲ
２'−デオキシアデノシン−５'−(ε−７−レゾルフィン)四リン酸もしくはｄＡ５Ｐ−ＲＲ
２'−デオキシグアノシン−５'−(ε−７−レゾルフィン)四リン酸もしくはｄＧ５Ｐ−ＲＲ
２'−デオキシシチジン−５'−(ε−７−レゾルフィン)四リン酸もしくはｄＣ５Ｐ−ＲＲ
２'−デオキシチミジン−５'−(ε−７−レゾルフィン)四リン酸もしくはｄＴ５Ｐ−ＲＲ
２'−デオキシウリジン−５'−(ε−７−レゾルフィン)四リン酸もしくはｄＵ５Ｐ−ＲＲ
２',３'−ジデオキシアデノシン−５'−(ε−７−レゾルフィン)四リン酸もしくはｄｄＡ５Ｐ−ＲＲ
２',３'−ジデオキシグアノシン−５'−(ε−７−レゾルフィン)四リン酸もしくはｄdＧ５Ｐ−ＲＲ
２',３'−ジデオキシシチジン−５'−(ε−７−レゾルフィン)四リン酸もしくはｄｄＣ５Ｐ−ＲＲ
２',３'−ジデオキシチミジン−５'−(ε−７−レゾルフィン)四リン酸もしくはｄｄＴ５Ｐ−ＲＲ
２',３'−ジデオキシウリジン−５'−(ε−７−レゾルフィン)四リン酸もしくはｄｄＵ５Ｐ−ＲＲ
３'−デオキシアデノシン−５'−(ε−７−レゾルフィン)四リン酸もしくは３'−ｄＡ５Ｐ−ＲＲ
３'−デオキシグアノシン−５'−(ε−７−レゾルフィン)四リン酸もしくは３'−ｄＧ５Ｐ−ＲＲ
３'−デオキシシチジン−５'−(ε−７−レゾルフィン)四リン酸もしくは３'−ｄＣ４Ｐ−ＲＲ
３'−デオキシチミジン−５'−(ε−７−レゾルフィン)四リン酸もしくは３'−ｄＴ５Ｐ−ＲＲ
３'−デオキシウリジン−５'−(ε−７−レゾルフィン)四リン酸もしくは３'−ｄＵ５Ｐ−ＲＲ
アデノシン−５'−(ζ−７−レゾルフィン)五リン酸もしくはＡ６Ｐ−ＲＲ
グアノシン−５'−(ζ−７−レゾルフィン)四リン酸もしくはＧ６Ｐ−ＲＲ
シチジン−５'−(ζ−７−レゾルフィン)四リン酸もしくはＣ６Ｐ−ＲＲ
チミジン−５'−(ζ−７−レゾルフィン)四リン酸もしくはＴ６Ｐ−ＲＲ
ウリジン−５'−(ζ−７−レゾルフィン)四リン酸もしくはＵ６Ｐ−ＲＲ
２'−デオキシアデノシン−５'−(ζ−７−レゾルフィン)四リン酸もしくはｄＡ６Ｐ−ＲＲ
２'−デオキシグアノシン−５'−(ζ−７−レゾルフィン)四リン酸もしくはｄＧ６Ｐ−ＲＲ
２'−デオキシシチジン−５'−(ζ−７−レゾルフィン)四リン酸もしくはｄＣ６Ｐ−ＲＲ
２'−デオキシチミジン−５'−(ζ−７−レゾルフィン)四リン酸もしくはｄＴ６Ｐ−ＲＲ
２'−デオキシウリジン−５'−(ζ−７−レゾルフィン)四リン酸もしくはｄＵ６Ｐ−ＲＲ
２',３'−ジデオキシアデノシン−５'−(ζ−７−レゾルフィン)四リン酸もしくはｄｄＡ６Ｐ−ＲＲ
２',３'−ジデオキシグアノシン−５'−(ζ−７−レゾルフィン)四リン酸もしくはｄdＧ６Ｐ−ＲＲ
２',３'−ジデオキシシチジン−５'−(ζ−７−レゾルフィン)四リン酸もしくはｄｄＣ６Ｐ−ＲＲ
２',３'−ジデオキシチミジン−５'−(ζ−７−レゾルフィン)四リン酸もしくはｄｄＴ６Ｐ−ＲＲ
２',３'−ジデオキシウリジン−５'−(ζ−７−レゾルフィン)四リン酸もしくはｄｄＵ６Ｐ−ＲＲ
３'−デオキシアデノシン−５'−(ζ−７−レゾルフィン)四リン酸もしくは３'−ｄＡ６Ｐ−ＲＲ
３'−デオキシグアノシン−５'−(ζ−７−レゾルフィン)四リン酸もしくは３'−ｄＧ６Ｐ−ＲＲ
３'−デオキシシチジン−５'−(ζ−７−レゾルフィン)四リン酸もしくは３'−ｄＣ６Ｐ−ＲＲ
３'−デオキシチミジン−５'−(ζ−７−レゾルフィン)四リン酸もしくは３'−ｄＴ６Ｐ−ＲＲ
３'−デオキシウリジン−５'−(ζ−７−レゾルフィン)四リン酸もしくは３'−ｄＵ６Ｐ−ＲＲ
アデノシン−５'−(δ−３'−(６'−エトキシフルオレセイン))四リン酸もしくはＡ４Ｐ−Ｆ１ＥＴ
グアノシン−５'−(δ−３'−(６'−エトキシフルオレセイン))四リン酸もしくはＧ４Ｐ−Ｆ１ＥＴ
シチジン−５'−(δ−３'−(６'−エトキシフルオレセイン))四リン酸もしくはＣ４Ｐ−Ｆ１ＥＴ
チミジン−５'−(δ−３'−(６'−エトキシフルオレセイン))四リン酸もしくはＴ４Ｐ−Ｆ１ＥＴ
ウリジン−５'−(δ−３'−(６'−エトキシフルオレセイン))四リン酸もしくはＵ４Ｐ−Ｆ１ＥＴ
２'−デオキシアデノシン−５'−(δ−３'−(６'−エトキシフルオレセイン))四リン酸もしくはｄＡ４Ｐ−Ｆ１ＥＴ
２'−デオキシグアノシン−５'−(δ−３'−(６'−エトキシフルオレセイン))四リン酸もしくはｄＧ４Ｐ−Ｆ１ＥＴ
２'−デオキシシチジン−５'−(δ−３'−(６'−エトキシフルオレセイン))四リン酸もしくはｄＣ４Ｐ−Ｆ１ＥＴ
２'−デオキシチミジン−５'−(δ−３'−(６'−エトキシフルオレセイン))四リン酸もしくはｄＴ４Ｐ−Ｆ１ＥＴ
２'−デオキシウリジン−５'−(δ−３'−(６'−エトキシフルオレセイン))四リン酸もしくはｄＵ４Ｐ−Ｆ１ＥＴ
２',３'−ジデオキシアデノシン−５'−(δ−３'−(６'−エトキシフルオレセイン))四リン酸もしくはｄｄＡ４Ｐ−Ｆ１ＥＴ
２',３'−ジデオキシグアノシン−５'−(δ−３'−(６'−エトキシフルオレセイン))四リン酸もしくはｄＧ４Ｐ−Ｆ１ＥＴ
２',３'−ジデオキシシチジン−５'−(δ−３'−(６'−エトキシフルオレセイン))四リン酸もしくはｄｄＣ４Ｐ−Ｆ１ＥＴ
２',３'−ジデオキシチミジン−５'−(δ−３'−(６'−エトキシフルオレセイン))四リン酸もしくはｄｄＴ４Ｐ−Ｆ１ＥＴ
２',３'−ジデオキシウリジン−５'−(δ−３'−(６'−エトキシフルオレセイン))四リン酸もしくはｄｄＵ４Ｐ−Ｆ１ＥＴ
３'−デオキシアデノシン−５'−(δ−３'−(６'−エトキシフルオレセイン))四リン酸もしくは３'−ｄＡ４Ｐ−Ｆ１ＥＴ
３'−デオキシグアノシン−５'−(δ−３'−(６'−エトキシフルオレセイン))四リン酸もしくは３'−ｄＧ４Ｐ−Ｆ１ＥＴ
３'−デオキシシチジン−５'−(δ−３'−(６'−エトキシフルオレセイン))四リン酸もしくは３'−ｄＣ４Ｐ−Ｆ１ＥＴ
３'−デオキシチミジン−５'−(δ−３'−(６'−エトキシフルオレセイン))四リン酸もしくは３'−ｄＴ４Ｐ−Ｆ１ＥＴ
３'−デオキシウリジン−５'−(δ−３'−(６'−エトキシフルオレセイン))四リン酸もしくは３'−ｄＵ４Ｐ−Ｆ１ＥＴ
アデノシン−５'−(ε−３'−(６'−エトキシフルオレセイン))五リン酸もしくはＡ５Ｐ−Ｆ１ＥＴ
グアノシン−５'−(ε−３'−(６'−エトキシフルオレセイン))四リン酸もしくはＧ５Ｐ−Ｆ１ＥＴ
シチジン−５'−(ε−３'−(６'−エトキシフルオレセイン))四リン酸もしくはＣ５Ｐ−Ｆ１ＥＴ
チミジン−５'−(ε−３'−(６'−エトキシフルオレセイン))四リン酸もしくはＴ５Ｐ−Ｆ１ＥＴ
ウリジン−５'−(ε−３'−(６'−エトキシフルオレセイン))四リン酸もしくはＵ５Ｐ−Ｆ１ＥＴ
２'−デオキシアデノシン−５'−(ε−３'−(６'−エトキシフルオレセイン))四リン酸もしくはｄＡ５Ｐ−Ｆ１ＥＴ
２'−デオキシグアノシン−５'−(ε−３'−(６'−エトキシフルオレセイン))四リン酸もしくはｄＧ５Ｐ−Ｆ１ＥＴ
２'−デオキシシチジン−５'−(ε−３'−(６'−エトキシフルオレセイン))四リン酸もしくはｄＣ５Ｐ−Ｆ１ＥＴ
２'−デオキシチミジン−５'−(ε−３'−(６'−エトキシフルオレセイン))四リン酸もしくはｄＴ５Ｐ−Ｆ１ＥＴ
２'−デオキシウリジン−５'−(ε−３'−(６'−エトキシフルオレセイン))四リン酸もしくはｄＵ５Ｐ−Ｆ１ＥＴ
２',３'−ジデオキシアデノシン−５'−(ε−３'−(６'−エトキシフルオレセイン))四リン酸もしくはｄｄＡ５Ｐ−Ｆ１ＥＴ
２',３'−ジデオキシグアノシン−５'−(ε−３'−(６'−エトキシフルオレセイン))四リン酸もしくはｄdＧ５Ｐ−Ｆ１ＥＴ
２',３'−ジデオキシシチジン−５'−(ε−３'−(６'−エトキシフルオレセイン))四リン酸もしくはｄｄＣ５Ｐ−Ｆ１ＥＴ
２',３'−ジデオキシチミジン−５'−(ε−３'−(６'−エトキシフルオレセイン))四リン酸もしくはｄｄＴ５Ｐ−Ｆ１ＥＴ
２',３'−ジデオキシウリジン−５'−(ε−３'−(６'−エトキシフルオレセイン))四リン酸もしくはｄｄＵ５Ｐ−Ｆ１ＥＴ
３'−デオキシアデノシン−５'−(ε−３'−(６'−エトキシフルオレセイン))四リン酸もしくは３'−ｄＡ５Ｐ−Ｆ１ＥＴ
３'−デオキシグアノシン−５'−(ε−３'−(６'−エトキシフルオレセイン))四リン酸もしくは３'−ｄＧ５Ｐ−Ｆ１ＥＴ
３'−デオキシシチジン−５'−(ε−３'−(６'−エトキシフルオレセイン))四リン酸もしくは３'−ｄＣ５Ｐ−Ｆ１ＥＴ
３'−デオキシチミジン−５'−(ε−３'−(６'−エトキシフルオレセイン))四リン酸もしくは３'−ｄＴ５Ｐ−Ｆ１ＥＴ
３'−デオキシウリジン−５'−(ε−３'−(６'−エトキシフルオレセイン))四リン酸もしくは３'−ｄＵ５Ｐ−Ｆ１ＥＴ
アデノシン−５'−(ζ−３'−(６'−エトキシフルオレセイン))五リン酸もしくはＡ６Ｐ−Ｆ１ＥＴ
グアノシン−５'−(ζ−３'−(６'−エトキシフルオレセイン))四リン酸もしくはＧ６Ｐ−Ｆ１ＥＴ
シチジン−５'−(ζ−３'−(６'−エトキシフルオレセイン))四リン酸もしくはＣ６Ｐ−Ｆ１ＥＴ
チミジン−５'−(ζ−３'−(６'−エトキシフルオレセイン))四リン酸もしくはＴ６Ｐ−Ｆ１ＥＴ
ウリジン−５'−(ζ−３'−(６'−エトキシフルオレセイン))四リン酸もしくはＵ６Ｐ−Ｆ１ＥＴ
２'−デオキシアデノシン−５'−(ζ−３'−(６'−エトキシフルオレセイン))四リン酸もしくはｄＡ６Ｐ−Ｆ１ＥＴ
２'−デオキシグアノシン−５'−(ζ−３'−(６'−エトキシフルオレセイン))四リン酸もしくはｄＧ６Ｐ−Ｆ１ＥＴ
２'−デオキシシチジン−５'−(ζ−３'−(６'−エトキシフルオレセイン))四リン酸もしくはｄＣ６Ｐ−Ｆ１ＥＴ
２'−デオキシチミジン−５'−(ζ−３'−(６'−エトキシフルオレセイン))四リン酸もしくはｄＴ６Ｐ−Ｆ１ＥＴ
２'−デオキシウリジン−５'−(ζ−３'−(６'−エトキシフルオレセイン))四リン酸もしくはｄＵ６Ｐ−Ｆ１ＥＴ
２',３'−ジデオキシアデノシン−５'−(ζ−３'−(６'−エトキシフルオレセイン))四リン酸もしくはｄｄＡ６Ｐ−Ｆ１ＥＴ
２',３'−ジデオキシグアノシン−５'−(ζ−３'−(６'−エトキシフルオレセイン))四リン酸もしくはｄdＧ６Ｐ−Ｆ１ＥＴ
２',３'−ジデオキシシチジン−５'−(ζ−３'−(６'−エトキシフルオレセイン))四リン酸もしくはｄｄＣ６Ｐ−Ｆ１ＥＴ
２',３'−ジデオキシチミジン−５'−(ζ−３'−(６'−エトキシフルオレセイン))四リン酸もしくはｄｄＴ６Ｐ−Ｆ１ＥＴ
２',３'−ジデオキシウリジン−５'−(ζ−３'−(６'−エトキシフルオレセイン))四リン酸もしくはｄｄＵ６Ｐ−Ｆ１ＥＴ
３'−デオキシアデノシン−５'−(ζ−３'−(６'−エトキシフルオレセイン))四リン酸もしくは３'−ｄＡ６Ｐ−Ｆ１ＥＴ
３'−デオキシグアノシン−５'−(ζ−３'−(６'−エトキシフルオレセイン))四リン酸もしくは３'−ｄＧ６Ｐ−Ｆ１ＥＴ
３'−デオキシシチジン−５'−(ζ−３'−(６'−エトキシフルオレセイン))四リン酸もしくは３'−ｄＣ６Ｐ−Ｆ１ＥＴ
３'−デオキシチミジン−５'−(ζ−３'−(６'−エトキシフルオレセイン))四リン酸もしくは３'−ｄＴ６Ｐ−Ｆ１ＥＴ
３'−デオキシウリジン−５'−(ζ−３'−(６'−エトキシフルオレセイン))四リン酸もしくは３'−ｄＵ６Ｐ−Ｆ１ＥＴ
【００３６】
式Ｉにおいてリン酸化標識が蛍光原部分であるところでは、それは、以下(全てリン酸モノエステルとして示される)の一つから望ましくは選択される：ＥＬＦ９７の商品名(Molecular Probes, Inc.)で発売される、２−(５'−クロロ−２'−ホスホリルオキシフェニル)−６−クロロ−４−(３Ｈ)−キナゾリノン、二リン酸フルオレセイン(テトラアンモニウム塩）、フルオレセイン３'(６')−Ｏ−アルキル−６'(３')−リン酸、９Ｈ−(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル)リン酸(ジアンモニウム塩)、リン酸４−メチルウンベリフェリル(遊離酸)、リン酸レゾルフィン、リン酸４−トリフルオロメチルウンベリフェリル、リン酸ウンベリフェリル、リン酸３−シアノウンベリフェリル、リン酸９,９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル、リン酸６,８−ジフルオロ−４−メチルウンベリフェリルおよびそれらの誘導体である。
これらの色素の構造は以下に示される：
【化７】

２−(５'−クロロ−２'−ホスホリルオキシフェニル)−６−クロロ−４−(３Ｈ)−キナゾリノン
【化８】

二リン酸フルオレセイン フルオレセイン３'(６')−Ｏ−アルキル−６'(３')−リン酸
【化９】

９Ｈ−(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル)リン酸(ジアンモニウム塩)
【化１０】

リン酸４−メチルウンベリフェリル
【化１１】

リン酸６,８−ジフルオロ−４−メチルウンベリフェリル
【化１２】

リン酸４−トリフルオロメチルウンベリフェリル
【化１３】

リン酸ウンベリフェリル
【化１４】

リン酸３−シアノウンベリフェリル
【化１５】

リン酸レゾルフィン
【化１６】

リン酸９,９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル
【００３７】
上の式Ｉにおいてリン酸化標識が発色性部分であるところでは、それは、以下から選択される：リン酸１−エチル−２−(ナフチル−１−ビニレン)−３,３−ジメチル−(３Ｈ)−６−インドリニウム、リン酸ビス−(１,３−ジブチルバルビツール酸)ペンタメチンオイソノール、リン酸ｐ−ニトロフェニルおよびそれらの誘導体である。これらの発色性色素の構造は、リン酸モノエステルとして以下に示される。
【化１７】

リン酸１−エチル−２−(ナフチル−１−ビニレン)−３,３−ジメチル−(３Ｈ)−６−インドリニウム
【化１８】

リン酸ビス−(１,３−ジブチルバルビツール酸)ペンタメチンオイソノール
【化１９】

リン酸ｐ−ニトロフェニル
【００３８】
末端−ホスフェート位置における部分はさらに、ホスファターゼ−活性化１,２−ジオキセタン化合物であることが望まれる、化学発光物質であり得る。１,２−ジオキセタン化合物には、限定するものではないが、ＣＤＰ−Starの商品名(Tropix, Inc., Bedford, MA)で発売される、リン酸２−クロロ−５−(４−メトキシスピロ[１,２−ジオキセタン−３,２'−(５−クロロ−)トリシクロ[３,３,１−１^{３ , ７}]−デカン]−１−イル)−１−フェニル二ナトリウム、ＣＳＰＤの商品名(Tropix)で発売される、クロロアダマント−２'−イリデンメトキシフェノキシリン酸化ジオキセタン、ＡＭＰＰＤの商品名(Tropix)で発売される、３−(２'−スピロアダマンタン)−４−メトキシ−４−(３''−ホスホリルオキシ)フェニル−１,２−ジオキセタンが含まれる。これらの市販のジオキセタン化合物の構造は、米国特許第５,５８２,９８０号、第５,１１２,９６０号および第４,９７８,６１４号[出典明示により本明細書の一部とする]に、それぞれ開示されている。
【００３９】
末端ホスフェートにおける部分は、さらに、生物分子を標識するために現在使用される蛍光の、発光のおよび着色性の色素のいずれかであり得て、常に“ｏｎ”(表２)である。種々のこれらの色素は、Molecular Probes、Applied Biosystems、Atto-tecおよびAmersham Biosciencesを含む市販供給源から入手可能であって、リンカーを通して末端ホスフェートに付加されることができる。この場合には、標識は、ホスファターゼもしくはホスフェートを転移する酵素により開裂可能であるものに加えて、ホスホン酸アルキル結合を通して付加され得る。ホスホン酸アルキル結合は容易に開裂可能でなくて、標識はホスホン酸エステルの形で末端ホスフェートに留まると期待される。
【００４０】
本発明は、四つ以上のホスフェートを持ち、ＤＮＡポリメラーゼのための基質であるところの式１の末端ホスフェート標識ヌクレオシドポリホスフェートの形にある物質のさらに別な組成物を提供し、そこでは、標識は、上で説明したものに加えて、ホスフェート除去後にさらなる反応を受けて、検出可能な部分を生成するところの質量タグもしくは部分である。これらの例は多数であって、二つのみを以下に示す：リン酸レサズリンおよびリン酸エチルである。
【化２０】

リン酸レサズリン
【化２１】

リン酸エチル
【００４１】
例えば、ホスフェートの切断後にレサズリンはＮＡＤ(Ｐ)Ｈと反応して、蛍光性のレサズリンを与え得る。エチル誘導体の場合には、エタノールはアルコール酸化酵素により使用されて、溶解酸素を過酸化水素に還元し得る。後者は、アクリジニウムエステルのような、他の化学薬品と相互作用して、シグナルを作成する。エタノール酸化は、下記のようなもう一つの酵素反応とさらに連結して、シグナルを増幅する。これらの方法は、標識が直接に対応するホスフェートから放出されるものより望ましくないが、シグナル増幅もしくは他の理由のために有用であり得る。
【化２２】

【００４２】
本発明は、便利なアッセイがＲＮＡもしくはＤＮＡ合成を核酸ポリメラーゼ活性を介してモニターするために用いられる、試料中でポリヌクレオチドを検出する方法に関する。ＲＮＡおよびＤＮＡポリメラーゼは、ヌクレシド三リン酸(ＮＴＰ)もしくはデオキシヌクレオシド三リン酸(ｄＮＴＰ)から成長するオリゴヌクレオチド鎖の３'ヒドロキシルへのヌクレオシド一リン酸の転移を介してオリゴヌクレオチドを合成する。この反応を駆動する力は、酸無水物結合の開裂および無機のピロホスフェートの付随する形成である。本発明は、ヌクレオチドの末端−ホスフェートの構造的修飾はポリメラーゼ反応において機能するその能力を破棄しないという発見を利用する。オリゴヌクレオチドの合成反応は、ヌクレオチドのα−およびβ−ホスホリル基においてのみ直接な変化を伴い、末端ホスフェート位置における修飾を持つヌクレオチドを核酸ポリメラーゼ反応のための基質として貴重であるようにさせる。
【００４３】
特定の実施態様において、ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＩＩもしくはＩＩＩまたはＤＮＡポリメラーゼα、β、γ、または末端デオキシヌクレオチジル転移酵素もしくはテロメラーゼのような、ＤＮＡポリメラーゼである。他の実施態様において、適当なポリメラーゼには、限定するものではないが、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ、プライマーゼ、もしくはＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ(逆転転写酵素)が含まれる。
【００４４】
本発明により提供される組成物は、末端−ホスフェートに付加した電気化学的標識、質量タグ、または比色性色素、化学発光のもしくは蛍光性の標識を持つデオキシヌクレオシドポリホスフェート、ジデオキシヌクレオシドポリホスフェート、炭素環式のヌクレオシドポリホスフェート、または非環式のヌクレオシドポリホスフェート類似体のような、ヌクレオシドポリホスフェートを含む。核酸ポリメラーゼがこの類似体を基質として用いるときには、酵素で活性化可能な標識は、ホスホリル転移の無機のポリホスフェート副産物上に存在するであろう。ホスファターゼを介するホスホリル転移のポリホスフェート生成物の開裂は、その上に付加した標識中で検出可能な変化に至る。ＲＮＡおよびＤＮＡポリメラーゼは、修飾した末端ホスホリル基を持つヌクレオチドを認識することができる一方で、本発明者等はこの出発原料はホスファターゼのための鋳型ではないことを決定していることが注目される。下の反応式は、本発明の方法において最も関連する分子；即ち、末端−ホスフェート−標識ヌクレオチド、標識ポリホスフェート副産物および酵素で活性化された標識、を示す。
【化２３】

【００４５】
上の反応式において、ｎは２もしくはそれより大であり、Ｒ_１およびＲ_２は独立してＨ、ＯＨ、ＳＨ、ＳＲ、ＯＲ、Ｆ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｉ、Ｎ_３、ＮＨＲもしくはＮＨ_２であり；Ｂはヌクレオチド塩基もしくは修飾複素環式塩基であり；ＸはＯ、ＳもしくはＮＨであり；ＹはＯ、ＳもしくはＢＨ_３であり；そしてＬは、発色性の、蛍光原の、化学発光の分子、質量タグ、電気化学的タグであり得るところのホスファターゼで活性化可能な標識である。質量タグは、質量の相違により他の成分から容易に識別可能であるところの質量スペクトル法に適当な小分子量部分である。電気化学的タグは、容易に酸化可能なもしくは還元可能な種である。ｎが２もしくはそれより大であるときには、ヌクレオチドは、ｎが１であるときよりポリメラーゼに対して顕著にさらに良い基質であることが発見されている。
【００４６】
本明細書中で提供される核酸配列の存在を検出する方法の一つの実施態様において、工程は、(ａ)反応が、一つの末端−ホスフェート−標識ヌクレオチドに加えて、ホスファターゼに実質的に無反応性である少なくとも一つのヌクレオチドを含み、ポリメラーゼ反応が標識ポリホスフェートの生産をもたらす、核酸ポリメラーゼ反応を実施すること；ｂ)標識ポリホスフェートが、リン酸エステルを加水分解するのに適当なホスファターゼと反応して、検出可能な種を生産することを可能とすること；およびｃ)適当な手段により検出可能な種の存在を検出することを含む。この実施態様において、核酸ポリメラーゼ反応のために用いられる鋳型は、ヘテロポリマー性のもしくはホモポリマー性の鋳型であり得る。末端−ホスフェート−標識ヌクレオチドとは、ヌクレオシド一リン酸の成長するヌクレオチド鎖の中への組み込みに引き続いて付随的に放出された標識ポリホスフェートがホスファターゼと反応して、検出可能な種を生産し得ることを本明細書を通して意味する。ホスファターゼに実質的に無反応性である反応に含まれる他のヌクレオチドは、例えば、検出可能な種の生産に至らない部分により末端−ホスフェートにおいてブロックされ得る。この特別な実施態様において検出のための核酸には、ＲＮＡ、天然のもしくは合成のオリゴヌクレオチド、ミトコンドリアのまたは染色体のＤＮＡが含まれ得る。
【００４７】
本発明は、ＤＮＡ配列の存在を検出する方法であって、(ａ)末端−ホスフェート標識ヌクレオチドの存在下で、その反応は標識ポリホスフェートの生産をもたらす、ＤＮＡポリメラーゼ反応を実施すること；(ｂ)標識ポリホスフェートがホスファターゼと反応して、検出可能な種を生産することを可能とすること；および(ｃ)当該検出可能な種の存在を検出すること：の工程を含む、方法をさらに提供する。検出のためのＤＮＡ配列には、細胞から分離されたＤＮＡ、重亜硫酸塩で処理されたメチル化ＤＮＡのような化学的に処理されたＤＮＡまたは当分野で既知な方法にしたがい化学的にもしくは酵素的に合成されたＤＮＡが含まれ得る。そのような方法には、ＰＣＲならびに「ＤＮＡ構造パートＡ：ＤＮＡの合成および物理分析」、Lilley, D.M.J. and Dahlberg, J.E. (Eds.), Methods Enzymol., 211, Academic Press, Inc., New York (1992)[出典明示により本明細書の一部とする]、に記載されているものが含まれる。ＤＮＡ配列にはさらに、染色体のＤＮＡおよび天然のもしくは合成のオリゴヌクレオチドが含まれ得る。ＤＮＡは二本−もしくは一本−鎖のどちらかであり得る。
【００４８】
本発明の方法はさらに、ポリメラーゼ反応において一つもしくはそれ以上のさらに別な検出試薬を含む工程を含み得る。さらに別な検出試薬は、検出可能な種から検出可能に異なるところの応答の能力があり得る。例えば、さらに別な検出試薬は抗体であり得る。
【００４９】
ポリメラーゼ反応において基質としての添加のために適当なヌクレオチドには、デオキシリボヌクレオシドポリホスフェート、リボヌクレオシドポリホスフェート、ジデオキシヌクレオシドポリホスフェート、炭素環式のヌクレオシドポリホスフェート、および非環式のヌクレオシドポリホスフェートならびにそれらの類似体を、限定するものではないが、含むような、ヌクレオシドポリホスフェートが含まれる。特別に望ましいのは、末端ホスフェートが標識されている、ポリホスフェート鎖中に４，５もしくは６個のホスフェート基を含むヌクレオチドである。
【００５０】
ポリホスフェート鎖中に四つもしくはそれ以上のホスフェートを有する末端−ホスフェート−標識ヌクレオチドを含む実施態様において、ホスホリル転移の標識ポリホスフェート副産物は、ホスファターゼ処置の使用無しに検出され得ることは本発明の意図の内にあることが注目される。例えば、天然もしくは修飾ヌクレオシド塩基、特にグアニン、は蛍光マーカーの失活を引き起こすことができることは公知である。それ故に、末端−ホスフェート−標識ヌクレオチドにおいては、標識は、塩基により部分的に失活させられ得る。ヌクレオシド一リン酸の組み込みで、標識ポリホスフェート副産物は、その強化された蛍光により検出され得る。これに代えて、標識ポリホスフェート生成物を、蛍光、色、化学発光もしくは電気化学的検出による同定の前にクロマトグラフ的または他の分離方法により物理的に分離することが可能である。加えて、質量スペクトル法を用いて、質量の相違により生成物を検出できるかもしれない。
【００５１】
本発明の方法は、少なくとも一つのＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼの存在下でポリメラーゼ反応を実施することを含み得る。適当な核酸ポリメラーゼにはまた、プライマーゼ、テロメラーゼ、末端デオキシヌクレオチジル転移酵素および逆転転写酵素が含まれ得る。核酸鋳型が、ポリメラーゼ反応が起こるために必要とされ得て、ポリメラーゼ反応溶液に添加され得る。本発明の検出方法における工程(ａ)、(ｂ)および(ｃ)の全ては、単一の均一な反応混合液を用いて同時に行い、ならびに逐次的に行えるかもしれないことが期待される。
【００５２】
核酸ポリメラーゼ反応がポリメラーゼを利用する増幅方法を含み得ることは、本発明の意図内に十分ある。そのような方法の例には、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)、ローリングサークル増幅(ＲＣＡ)および核酸配列ベースの増幅(ＮＡＳＢＡ)が含まれる。例えば、標的分子がＤＮＡのような核酸ポリマーであるところでは、それは、アデニン、チミン、シトシン、グアニンもしくは他の窒素複素環式塩基のようなガンマ−ホスフェート標識ヌクレオチド塩基のＤＮＡ分子内へのＰＣＲ組み込みにより検出され得る。ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)方法は、Saiki et al in Science Vol. 239, page 487, 1988, Mullis et al、米国特許第４,６８３,１９５号およびby Sambrook, J. et al. (Eds.)、「分子クローニング、第二版」、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1980), Ausubel, F.M. et al. (Eds.)、「分子生物学における現行の実験計画」、John Wiley & Sons, Inc., NY (1999), and Wu, R. (Ed.)、「組み換えＤＮＡ方法論ＩＩ、発酵学における方法」、Academic Press, Inc., NY, (1995)、により記載されている。ＰＣＲを用いて、ＤＮＡのような検出のための標的核酸は、それをＰＣＲ試薬および適切なプライマーを含有する反応容器の中に直接に置くことにより増幅される。典型的には、標的核酸の少なくとも部分に配列で相補的であるプライマーが選択される。
【００５３】
本発明の方法の工程(ａ)を実施するのに適当な核酸ポリメラーゼ反応は、核酸配列を増幅する種々のＲＣＡ方法をさらに含み得ることが注目される。例えば、Lizardi, Paul Mへの米国特許第５,８５４,０３３号[出典明示により本明細書の一部とする]、に開示されたものが有用である。ポリメラーゼ反応は、システムが、ＤＮＡでなく、ＲＮＡの増幅を伴い、そして増幅は同温であり、一つの温度(４１℃)で起こる、核酸配列ベースの増幅(ＮＡＳＢＡ)をさらに含み得る。標的ＲＮＡのＮＡＳＢＡによる増幅は、試料の標的ＲＮＡに向けて指向されたオリゴヌクレオチドプライマーと一緒に三つの酵素：逆転転写酵素、Rnase ＨおよびＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、の調和した活性を伴う。これらの酵素は、四つの工程：拡張、分解、ＤＮＡ合成および環状ＲＮＡ増幅、において標的一本鎖ＲＮＡの指数的増幅に触媒作用を及ぼす。
【００５４】
ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＣＡおよびＮＡＳＢＡの方法は一般的に、標的核酸の初期量を増幅生成物の定量化により間接的に測定することを必要とする。典型的には、増幅生成物は、アガロースゲル上の電気泳動を介して出発原料から先ず分離されて、成功的な増幅を確認して、次いで、蛍光標識の検出、酵素−結合検出システム、抗体−仲介標識検出および放射性標識の検出のような、核酸のための従来の検出システムのいずれかを用いて定量化される。対照的に、本方法は、これらの生成物を検出できる前に出発原料からポリメラーゼ反応の生成物を分離する必要を除外する。例えば、本発明においては、レポーター分子(蛍光性の、化学発光のもしくは発色性の)または他の有用な分子を、ホスフェート付加によりマスクされたときには特定の条件下で検出可能でないような方式で、ヌクレオチドに付加させる。しかしながら、成長するオリゴヌクレオチド鎖の中にヌクレオチドの組み込みおよび反応液のホスファターゼ処理に引き続いては、これらの条件下で標識は検出可能である。例えば、もしも１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン(ＤＤＡＯ)の三重環構造の側上のヒドロキシル基がヌクレオチドの末端−ホスフェート位置に付加されるならば、ＤＤＡＯは６５９ｎｍにおいて蛍光を放たない。一旦ヌクレオシド一リン酸がＤＮＡの中に組み込まれると、他の生成物である、ＤＤＡＯポリホスフェート(これもまた６５９ｎｍにおいて蛍光を放たない)がホスファターゼに対する基質である。一旦脱リン酸化して、ＤＤＡＯを形成すると、色素部分は６５９ｎｍにおいて蛍光性にかつそれ故に検出可能になるであろう。ポリホスフェート生成物の特異的分析を、出発原料から反応生成物を分離する必要を除外して、ポリメラーゼ反応溶液中で行うことができる。この方式は、分光光度計のような日常的な計測器を用いて、ポリメラーゼ反応の間に形成される核酸の検出および、任意に、定量化を可能とする。
【００５５】
上で説明した方法において、ポリメラーゼ反応工程はさらに、標識ポリホスフェート副産物を検出可能な標識へ転化するところのホスファターゼの存在下でポリメラーゼ反応を実施することを含み得る。それ自体で、検出可能種の形成の連続的モニタリングを可能とする便利なアッセイが、核酸配列の存在を検出するために確立される。これは、その中で単一の管の中で実施できる均一系アッセイフォーマットを表す。
【００５６】
上で説明したアッセイ方法の一つのフォーマットには、限定するものではないが、検出可能な種、例えば、末端−ホスフェート−修飾ＡＴＰを生産する能力がある現行の発明の末端−ホスフェート−標識ヌクレオチドの単一タイプの存在下でポリメラーゼ反応を実施することが含まれ得て、そこでは全ての他のヌクレオチドはホスファターゼに実質的に無反応性であるが、非−検出可能種を生成する。
【００５７】
もう一つのアッセイフォーマットでは、二つ以上のタイプの現行の発明の末端−ホスフェート−標識ヌクレオチドの存在下でポリメラーゼ反応を実施し得て、それぞれのタイプは独特に検出可能な種を生産する能力がある。例えば、アッセイは、ホスホリル転移の無機ポリホスフェート副産物から酵素的に遊離されたときに、第一の波長で光を放射する第一の標識に関連するところの第一のヌクレオチド(例えば、アデノシンポリホスフェート)および第二の波長で光を放射する第二の標識に関連するところの第二のヌクレオチド(例えば、グアノシンポリホスフェート)を含み得る。望ましくは、第一および第二波長の放射は、実質的に少ないかまったく無い重複を有する。ヌクレオシド配列情報に基づく多重の同時アッセイが、それ故に、ポリホスフェートから放出される特別な標識に基づいて誘導され得ることは本発明の意図の内にある。
【００５８】
上で説明した方法はさらに、核酸配列を定量化する工程を含み得る。関連する態様において、検出可能の種を、増幅された核酸配列の量に実質的に比例する量で生産し得る。核酸配列を定量化する工程を、検出可能の種により作製されたスペクトルと既知のスペクトルとの比較により行うように望まれる。
【００５９】
一つの実施態様において、本発明は、核酸を定量化する方法であって、(ａ)ポリメラーゼ反応が、少なくとも一つの現行の発明の末端−ホスフェート−標識ヌクレオチドに加えて、ホスファターゼに実質的に無反応性であるヌクレオチドの反応を含み、その反応は標識ポリホスフェートの生産をもたらす、核酸ポリメラーゼ反応を実施すること；(ｂ)標識ポリホスフェートがホスファターゼと反応して、検出可能な副産物種を定量化されるべき核酸の量に実質的に比例する量で生産することを可能とすること；(ｃ)検出可能な種を測定すること；および(ｄ)既知の標準を用いて測定を比較して、核酸の量を測定する：工程を含む、方法を提供する。核酸を定量化する方法のこの実施態様において、定量化されるべき核酸はＲＮＡであり得る。核酸はさらに、天然のもしくは合成のオリゴヌクレオチド、染色体ＤＮＡ，またはＤＮＡであり得る。
【００６０】
本発明はさらに、ＤＮＡ配列を定量化する方法であって、(ａ)反応が標識ポリホスフェートの生産をもたらす、現行の発明の末端−ホスフェート−標識ヌクレオチドの存在下でＤＮＡポリメラーゼ反応を実施すること；(ｂ)標識ポリホスフェートがホスファターゼと反応して、検出可能な副産物種を定量化されるべきＤＮＡ配列の量に実質的に比例する量で生産することを可能とすること；(ｃ)検出可能な種を測定すること；および(ｄ)既知の標準を用いて測定を比較して、ＤＮＡの量を測定する：工程を含む、方法を提供する。この実施態様において、定量化のためのＤＮＡ配列には、天然のもしくは合成のオリゴヌクレオチド、または染色体ＤＮＡを含む細胞から単離されたＤＮＡが含まれ得る。
【００６１】
上で説明した核酸配列を定量化する工程のいずれにおいても、ポリメラーゼ反応工程は、ホスファターゼの存在下でポリメラーゼ反応を実施することをさらに含み得る。本明細書において早く説明したように、これは核酸ポリメラーゼ活性のリアルタイムのモニタリング、およびそれ故に、定量化のための標的核酸配列のリアルタイムの検出を可能とするであろう。
【００６２】
本明細書中で提供された核酸配列を定量化する方法に有用な末端−ホスフェート−標識ヌクレオチドは、上で示した式Ｉにより表され得る。酵素で活性化可能な標識は、検出可能の種を生成するような方式で、標識および天然もしくは修飾ヌクレオチドの末端−ホスフェートの間のリン酸エステル結合を変更するところのホスファターゼの酵素活性を通して検出可能になる。検出可能の種は、色、蛍光放射、化学発光、質量変化、電気化学的電位のいずれか一つもしくはそれらの組み合わせの存在により検出可能である。上ですでに説明したように、酵素で活性化可能な標識は、１,２−ジオキセタン化学発光化合物、蛍光色素、発色性色素、質量タグもしくは電気化学的タグまたはそれらの組み合わせであり得る。適当な標識は上で説明したものと同一である。
【００６３】
実施例の項でさらに詳細に説明されるであろうように、本発明は、標的核酸配列における単一のヌクレオチドの同一性を決定する方法を提供する。これらの方法は、(ａ)少なくとも一つの現行の発明の末端ホスフェート−標識ヌクレオチドの存在下で、その反応は標識ポリホスフェートの生産をもたらす、核酸ポリメラーゼ反応を実施すること；(ｂ)標識ポリホスフェートがホスファターゼと反応して、検出可能な種を生産することを可能とすること；(ｃ)検出可能な種の存在を検出すること；および(ｄ)組み込まれたヌクレオシドを同定すること：の工程を含む。望まれる実施態様において、末端ホスフェート−標識ヌクレオチドは、ポリホスフェート鎖の中に四つもしくはそれ以上のホスフェートを含む。
【００６４】
本発明のもう一つの態様は、核酸検出キットであって、
(ａ)下の式Ｉ：
【化２４】

[式中、Ｐ＝ホスフェート(ＰＯ_３)およびその誘導体、ｎは３もしくはそれより大であり；Ｙは酸素もしくは硫黄原子であり；Ｂは窒素含有の複素環式塩基であり；Ｓは非環式部分、炭素環式部分もしくは糖部分であり；Ｌは、天然または修飾ヌクレオチドの末端ホスフェートにおいてリン酸エステル、チオエステルもしくはホスホラミデート結合を形成するのに適当なヒドロキシル基、スルフヒドリル基またはアミノ基を含む酵素で活性化可能な標識であり；Ｐ−Ｌは、ホスフェートが除去されるときに、好ましくは独立して検出可能になるところのリン酸化標識である]
にしたがう少なくとも一つもしくはそれ以上の末端−ホスフェート−標識ヌクレオチド；
(ｂ)少なくとも一つのＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼもしくは逆転転写酵素；
および
(ｃ)ホスフェートもしくはポリホスフェートを転移する酵素
を含む、キットに関する。
【００６５】
キットに含まれる末端−ホスフェート−標識ヌクレオチド中の糖部分には、限定するものではないが、リボシル、２'−デオキシリボシル、３'−デオキシリボシル、２',３'−ジデオキシリボシル、２',３'−ジデヒドロジデオキシリボシル、２'−もしくは３'−アルコキシリボシル、２'−もしくは３'−アミノリボシル、２'−もしくは３'−フルオロリボシル、２'−もしくは３'−メルカプトリボシル、２'−もしくは３'−アルキルチオリボシル、非環式、炭素環式および他の修飾糖が含まれる。
【００６６】
塩基は、限定するものではないが、ウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、グアニン、７−デアザグアニン、ヒポキサンチン、７−デアザヒポキサンチン、アデニン、７−デアザアデニンおよび２，６−ジアミノプリンならびにそれらの類似体であり得る。
【００６７】
さらに、上で説明したように、酵素で活性化可能な標識は、１,２−ジオキセタン化学発光化合物、蛍光色素、発色性色素、質量タグ、電気化学的タグもしくはそれらの組み合わせであり得る。ヌクレオチドの末端−ホスフェート位置において結合に適当な化合物は、上で説明したものと同一である。
(実施例)
以下の実施例は、特定の好ましい実例の態様を例示するが、これらは全ての態様を例示するように意図するものではない。
【００６８】
実施例１
γ−(７−ヒドロキシ−３Ｈ−フェノキサジン−３−オン)ｄｄＧＴＰ(γ−レゾルフィン−ｄｄＧＴＰ)の作成
ｄｄＧＴＰ(８６.７ｍＭ溶液１２５μｌ、１０.８μmol)を無水のＤＭＦ(３×０.２５ｍｌ)と共に共蒸発した。これに、ＤＣＣ(５当量)を加えて、混合液を再び無水のＤＭＦ(０.２５ｍｌ)と共に共蒸発した。残渣を無水のＤＭＦ(１ｍｌ)中に取って、反応液を室温で週末にかけて攪拌した。レゾルフィン(２０当量)を無水のＤＭＦ(２×１ｍｌ)と共に共蒸発して、上の環化工程からのｄｄＧＴＰトリメタリン酸に引き続いてトリエチルアミン２０当量を加えた。２週間後に、反応混合液をロータリーエバポレーター上で濃縮し、そして残渣を水(３×２ｍｌ)で抽出して、ろ過した。ろ液を、Xterra ＲＰ Ｃ１８(１９×１００ｍｍ)カラム上で、０.１Ｍ重炭酸トリエチルアンモニウム(ｐＨ６.７)中の０〜３０％アセトニトリルを５カラム容積でおよび３０〜５０％アセトニトリルを１カラム容積で用いて精製した。純粋なフラクションをロータリーエバポレーター上で濃縮して、メタノール(２×５ｍｌ)と共に共蒸発した。残渣を水(１.５ｍｌ)中に溶解すると、０.５ｍＭの溶液を与えた。ＨＰＬＣ純度：２６０ｎｍにおいて＞９８％、４７０ｎｍにおいて＞９７.５％；ＵＶ／ＶＩＳ＝２５１および４７２ｎｍ。ＭＳ：Ｍ−１＝６８５.１０(計算値６８５.０３)。
【化２５】

【００６９】
実施例２
γ−(３−シアノクマリニル)ｄｄＡＴＰ(γＣＮクマリン−ｄｄＡＴＰ)の作成
ｄｄＡＴＰ(８９ｍＭ溶液１００μｌ、＞９６％)を無水のＤＭＦ(２×１ｍｌ)と共に共蒸発した。これに、ＤＣＣ(９.２ｍｇ、５当量)を加えて、混合液を再び無水のＤＭＦ(１ｍｌ)と共に共蒸発した。残渣を無水のＤＭＦ(０.５ｍｌ)中に取って、反応液を室温で攪拌した。一夜後に、７−ヒドロキシ−３−シアノクマリン(３３.３ｍｇ，２０当量)およびＴＥＡ(２５μｌ、２０当量)を加えて、混合液を室温で攪拌した。１日後に、主要生成物(２５４ｎｍにおいて５５％)が、１０分におけるもう一つの微少生成物(約１０％)と共に、８.１分に観察された。もう１日後に顕著な変化は起きなかった。反応混合液をロータリーエバポレーター上で濃縮し、そして残渣を水３×２ｍｌで抽出して、ろ過した。水溶液を濃縮して、Ｃ１８上で、３０分間で０.１ＭＴＥＡＢ(ｐＨ６.７)中の０〜３０％アセトニトリルおよび１０分間で３０〜５０％アセトニトリル、流速１５ｍｌ／分を用いて精製した。主要ピークを３つのフラクションに採取した。主要ピーク(フラクション２)のＨＰＬＣは、２５４ｎｍにおいて９５.６％および３３５ｎｍにおいて９８.１％の純度を示した。それをロータリーエバポレーター上で濃縮して(室温で)、ＭｅＯＨ(２回)および水(１回)と共に共蒸発した。残渣を水０.５ｍｌ中に溶解した。試料５μｌをＵＶ分析のために１ｍｌに希釈した。Ａ３４６ｎｍ＝０.７８４。２０,０００の吸光度(７−エトキキシ−３−シアノクマリン、Molecular Probesカタログ、について報告された)を仮定して、濃度＝７.８４ｍＭ。収量＝３．９２μｍｏｌ、４４％。試料をＣ−１８カラム上で上と同一の方法を用いて再精製した。試料ピークを３つのフラクションに採取した。２５４ｎｍにおいて＞９８％の純度および３４０ｎｍにおいて＞９９.５％の純度を持つフラクション２および３を合併した。濃縮後に、残渣を、ＭｅＯＨ(２回)および水(１回)と共に共蒸発した。試料を水(１ｍｌ)中に溶解すると、２.７７ｍＭ溶液を与えた。ＭＳ：Ｍ⁻＝６４２.９８ａｕ(計算値６４３.００ａｕ)、ＵＶλ_Ａ＝２６３および３４６ｎｍ。ｄｄＡＴＰのガンマホスフェートに付加したシアノクマリン色素は、３４６ｎｍの励起極大および約４１１ｎｍの照射極大をもって蛍光性である。遊離のクマリン色素を放出するリン酸エステルの加水分解で、スペクトルは約４０８ｎｍの励起極大および約４５０ｎｍの照射極大をもって変化する。この変化は、簡単な蛍光測定もしくは色の変化により容易に検出される。ガンマヌクレオチドの合成は、Arzumanov, A. et al. in J Biol Chem (1996) Oct 4; 271 (40): 24389-94、により一般的に記述されている。
【化２６】

γ−(３−シアノクマリニル)ジデオキシアデノシン−５'−三リン酸 (γＣＮクマリン−ｄｄＡＴＰ)
【００７０】
実施例３
δ−９Ｈ(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル)−ジデオキシチミジン−５'−四リン酸(ｄｄＴ４Ｐ−ＤＤＡＯ)の作成
ｄｄＴＴＰ(８０ｍＭ溶液１００μｌ)を無水のジメチルホルムアミド(ＤＭＦ、２×１ｍｌ)と共に共蒸発した。これに、ジシクロヘキシルカルボジイミド(８.３ｍｇ、５当量)を加えて、混合液を再び無水のＤＭＦ(１ｍｌ)と共に共蒸発した。残渣を無水のＤＭＦ(１ｍｌ)中に取って、反応液を終夜室温で攪拌した。ＨＰＬＣはほとんど環化したトリホスフェート(約８２％)を示した。反応混合液を濃縮して、残渣を無水のジエチルエーテルで３回洗浄した。それを無水のＤＭＦ中に再溶解して、ロータリーエバポレーター上で濃縮乾固した。残渣を無水のＤＭＦ２００μｌ中のＤＤＡＯ−一リン酸、アンモニウム塩(５ｍｇ、１.５当量)と共に取って、週末にかけて４０℃で攪拌した。ＨＰＬＣは、１１.９６分に望ましいＵＶ特色を持つ新しい生成物の形成を示した。(ＨＰＬＣ方法：１５分間で０.１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム(ｐＨ７)中の０〜３０％アセトニトリル、５分間で３０〜５０％アセトニトリル、Novapak Ｃ１８ ３.９×１５０ｍｍカラム、１ｍｌ／分)。ＬＣＭＳ(ＥＳ−)はまた、Ｍ−１ピークとして主要質量ピーク８３４を示した。反応混合液を濃縮して、Deltapak Ｃ１８ １９×３００ｍｍカラム上で０.１Ｍ ＴＥＡＢ(ｐＨ６.７)およびアセトニトリルを用いて精製した。生成物を持つフラクションを上で説明した同一の方法を用いるＨＰＬＣにより再精製した。純粋な生成物を持つフラクションを濃縮して、ＭｅＯＨ(２回)および水(１回)と共に共蒸発した。残渣を水(１.２ｍｌ)中に溶解すると、１.２３ｍＭの溶液を与えた。ＨＰＬＣ純度：２５４ｎｍにおいて＞９７.５％、４５５ｎｍにおいて＞９６％；ＵＶλ_Ａ＝２６７ｎｍおよび４５５ｎｍ；ＭＳ：Ｍ−１＝８３４.０４(計算値８３３.９５)。
【００７１】
δ−９Ｈ(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル)−ジデオキシシチジン−５'−四リン酸(ｄｄＣ４Ｐ−ＤＤＡＯ)、δ−９Ｈ(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル)−ジデオキシアデノシン−５'−四リン酸(ｄｄＡ４Ｐ−ＤＤＡＯ)およびδ−９Ｈ(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル)−ジデオキシグアノシン−５'−四リン酸(ｄｄＧ４Ｐ−ＤＤＡＯ)を、同一の様式で合成して精製した。これらの精製した化合物の分析は以下のデータを与えた：ｄｄＣ４Ｐ−ＤＤＡＯ：ＵＶλ_Ａ＝２６８ｎｍおよび４５４ｎｍ；ＭＳ：Ｍ−１＝８１９.３２(計算値８１８.９６)；ｄｄＡ４Ｐ−ＤＤＡＯ：ＵＶλ_Ａ＝２６３ｎｍおよび４５７ｎｍ；ＭＳ：Ｍ−１＝８４３.３０(計算値８４２.９７)；ｄｄＧ４Ｐ−ＤＤＡＯ：ＵＶλ_Ａ＝２５７ｎｍおよび４５７ｎｍ；ＭＳ：Ｍ−１＝８５９.４０(計算値８５８.９７)。
【化２７】

【化２８】

【化２９】

【化３０】

【００７２】
実施例４
δ−９Ｈ(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル)−デオキシチミジン−５'−四リン酸(ｄＴ４Ｐ−ＤＤＡＯ)の作成
ＴＴＰ ＴＥＡ塩１０μモルを蒸発乾固した。残渣にトリブチルアミン４０μモルおよび乾燥ピリジン５ｍｌを加えた。溶液を再蒸発乾固した。乾燥ジメチルホルムアミド(ＤＭＦ)３ｍｌと共に２回の共蒸発後に、残渣を乾燥ＤＭＦ２００μｌ中に再溶解し、アルゴンでフラッシュして、栓をした。注射器を用いて、乾燥ＤＭＦ１００μｌ中に溶解したカルボニルジイミダゾール５０μモル(８ｍｇ)を加えた。フラスコを環境温度において４時間攪拌した。
【００７３】
上の反応が進行している間に、ＤＤＡＯ−リン酸３５ｍｇ(８３μモル)およびトリブチルアミン１６６μモルを乾燥ＤＭＦ中に溶解した。ＤＤＡＯ−リン酸を蒸発乾固し、引き続いて乾燥ＤＭＦと共に３回共蒸発した。残渣を乾燥ＤＭＦ３００μｌ中に溶解した。
【００７４】
４時間の反応時間の後に、無水のメタノール３.２μｌをＴＴＰ−ＣＤＩ反応液に加えた。反応液を３０分間攪拌した。この混合液に、ＤＤＡＯ−リン酸溶液を加えて、混合液を環境温度において１８時間攪拌した。反応を逆相ＨＰＬＣ(Xterra４.６×１００ｍｍカラム、０.１Ｍ ＴＥＡＡ／アセトニトリル)によりチェックした。反応液の容積を蒸発により２００μｌに減少して、反応を８０時間進行させた。
【００７５】
８０時間後に、反応を０.１Ｍ ＴＥＡＢ１５ｍｌを加えることにより停止させた。希釈した混合液を１９×１００Xterra ＲＰカラムに加えて、０.１Ｍ ＴＥＡＢ中でアセトニトリル傾斜で溶出した。純粋なＤＤＡＯ Ｔ４Ｐを含有するフラクションを蒸発乾固して、エタノールと共に２回の共蒸発させた。残渣をMilliQ水で再溶解した。収量：１.１０μモル、１１％；ＨＰＬＣ純度：４５５ｎｍにおいて＞９８％；ＭＳ：Ｍ−１＝８５０.０７(計算値８４９.９５)。
【００７６】
δ−９Ｈ(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル)−デオキシグアノシン−５'−四リン酸(ｄＧ４Ｐ−ＤＤＡＯ)、δ−９Ｈ(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル)−デオキシシチジン−５'−四リン酸(ｄＣ４Ｐ−ＤＤＡＯ)およびδ−９Ｈ(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル)−デオキシアデノシン−５'−四リン酸(ｄＡ４Ｐ−ＤＤＡＯ)を、３.５当量のＤＤＡＯ−リン酸を８.３当量の代わりの用いた以外は、上で説明したのと同様な様式で作成した。Ｃ１８の精製後に、試料をMono Ｑ １０／１０カラムを用いるイオン交換上で精製した。
【００７７】
δ−９Ｈ(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル)−デオキシグアノシン−５'−四リン酸(ｄＧ４Ｐ−ＤＤＡＯ)：収量：０.５７μモル、５.７％；ＨＰＬＣ純度：４５５ｎｍにおいて９９％；ＭＳ：Ｍ−１＝８７５.０３(計算値８７４.９６)。
【００７８】
δ−９Ｈ(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル)−デオキシシチジン−５'−四リン酸(ｄＣ４Ｐ−ＤＤＡＯ)：収量：０.２４μモル、２.４％；ＨＰＬＣ純度：４５５ｎｍにおいて９９％；ＭＳ：Ｍ−１＝８３５.０３(計算値８３４.９５)。
【００７９】
δ−９Ｈ(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル)−デオキシアデノシン−５'−四リン酸(ｄＡ４Ｐ−ＤＤＡＯ)：収量：０.３８μモル、３.８％；ＨＰＬＣ純度：４５５ｎｍにおいて９９％；ＭＳ：Ｍ−１＝８５９.０７(計算値８５８.９７)。
【化３１】

【００８０】
実施例５
ε−９Ｈ(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル)−ジデオキシチミジン−５'−五リン酸ＤＤＡＯ−ｄｄＴ−五リン酸(ｄｄＴ５Ｐ−ＤＤＡＯ)の作成
Ａ．ＤＤＡＯ−ピロリン酸の作成
ＤＤＡＯ−リン酸二アンモニウム塩(１１.８μｍｏｌ)を無水のＤＭＦ(３×０.２５ｍｌ)と共に共蒸発して、ＤＭＦ(０.５ｍｌ)中に溶解した。これに、カルボニルジイミダゾール(ＣＤＩ、９.６ｍｇ、５当量)を加えて、混合液を終夜室温で攪拌した。過剰のＣＤＩをＭｅＯＨ(５μｌ)の添加により分解して、３０分間攪拌した。混合液に、リン酸水素トリブチルアンモニウム(１０当量、ＤＭＦ中の０.５Ｍ溶液２３６ｍｌ)を加えて、混合液を室温で４日間攪拌した。反応混合液をロータリーエバポレーター上で濃縮した。残渣をHiPrep １６.１０ Ｑ ＸＬカラム上で、０.１Ｍ ＴＥＡＢ／アセトニトリル(３：１)を緩衝液Ａとしてそして１Ｍ ＴＥＡＢ／アセトニトリル(３：１)を緩衝液Ｂとして用いる０〜１００％Ｂを使用して、精製した。主要ピーク(９８％ＨＰＬＣ純度)を採取して、濃縮して、メタノール(２回)と共に共蒸発した。残渣を水１ｍｌ中に溶解すると、５.９ｍＭの溶液を与えた。ＵＶ／ＶＩＳ λ_ｍａｘ＝４５６ｎｍ。
【００８１】
Ｂ．ｄｄＴ５Ｐ−ＤＤＡＯの作成
ｄｄＴＴＰ(４７.５ｍＭ水溶液１００μｌ)を無水のＤＭＦ(２×１ｍｌ)と共に共蒸発した。これに、ＤＣＣ(５当量、４.９ｍｇ)を加えて、混合液をＤＭＦ(１×１ｍｌ)と共に共蒸発した。残渣を無水のＤＭＦ(０.５ｍｌ)中に取って、室温で３時間攪拌した。これに、別に無水のＤＭＦ(２×１ｍｌ)と共に共蒸発したＤＤＡＯ−ピロリン酸１.０３当量をＤＭＦ溶液として加えた。混合液を濃縮乾固して、次いで無水のＤＭＦ２００μｌ中に取った。混合液を３８℃で２日間攪拌した。反応混合液を濃縮し、水で希釈し、ろ過して、HiTrap ５ｍｌイオン交換カラム上で、二段階傾斜を用いる０〜１００％Ａ−Ｂを使用して精製した。溶媒Ａ＝０.１Ｍ ＴＥＡＢ／アセトニトリル(３：１)および溶媒Ｂ＝１Ｍ ＴＥＡＢ／アセトニトリル(３：１)。生成物の大部分を含有するフラクション１２×１３を合併し、濃縮して、メタノール(２回)と共に共蒸発した。残渣をXterra ＲＰ Ｃ−１８ ３０〜１００ｍｍカラム上で、０.１Ｍ ＴＥＡＢ中の０〜３０％アセトニトリルを５倍のカラム容積でそして３０〜５０％アセトニトリルを２倍のカラム容積で、流速１０ｍｌ／分を使用して再精製した。純粋な生成物を含有するフラクションを濃縮して、ＭｅＯＨ(２回)および水(１回)と共に共蒸発した。４５５ｎｍにおけるＨＰＬＣ純度：＞９９％。ＵＶ／ＶＩＳ＝２６８ｎｍおよび４５５ｎｍ。ＭＳ：Ｍ−１＝９１４.０３(計算値９１３.９３)。
【００８２】
これらのポリホスフェートのガンマホスフェートに付加したＤＤＡＯ色素は、４５５ｎｍの励起極大および約６０８ｎｍの照射極大をもって蛍光性である。遊離の色素を放出するリン酸エステルの加水分解で、スペクトルは約６４５ｎｍの励起極大および約６５９ｎｍの照射極大をもって変化する。この変化は、簡単な蛍光測定もしくは色の変化により容易に検出される。
【化３２】

【００８３】
末端−ホスフェートに付加した色素もしくは他の検出可能な部分を持つ同様なヌクレオチド化合物はまた、上の実施例１〜５に説明したものと同様の方法を用いて作製されるかもしれないということが注目される。これらとしては、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシヌクレオチド、天然起源の塩基(アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ヒポキサンチンおよびウラシル)ならびに修飾した塩基もしくは修飾した糖のいずれかを持つヌクレオチドが含まれる。
【００８４】
下の実施例６、７および８は、末端−ホスフェートに付加した色素誘導体を有する四つ以上のホスフェートを持つヌクレオチドが、単に三つのホスフェートを持つものより顕著により良い基質であることを実証する。
【００８５】
実施例６
ｄｄＴＰｎ−ＤＤＡＯ[式中、ｎは３、４もしくは５である]のポリメラーゼによる組み込み
実施例(１〜５)のジデオキシヌクレオチドを用いて、反応液を室温(２３℃)でアセンブルした。反応液は、配列番号２に相当するオリゴヌクレオチド鋳型にアニールした単一のオリゴヌクレオチドプライマー(配列番号１により表される)を有するプライマー：鋳型の組合せを含有した。
【００８６】
反応条件：５０ｍＭトリス、ＰＨ８.０、５％グリセロール，５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０.０１％tween−２０、エビアルカリ性ホスファターゼ０.２１単位、鋳型にアニールした１００ｎＭプライマーおよび１μＭ ｄｄＴＰｎ−ＤＤＡＯを含有する反応液７０μｌを、時間ドライブモードで運転される、ＬＳ−５５ルミネセンス分光計(Perkin Elmer)の中で石英蛍光超微小キュベット中にアッセンブルした。励起および放射波長は、それぞれ、６２０ｎｍおよび６５５ｎｍである。スリット幅は、励起スリットについて５ｎｍ、放射スリットについて１５ｎｍであった。遺伝子的に工学して、３'−５'エキソヌクレアーゼ活性、５'−３'エキソヌクレアーゼ活性およびジデオキシヌクレオチドに対する識別を除外した、クローン化ＤＮＡポリメラーゼＩの０.３５μｌ(１１単位)ならびに０.２５ｍＭ ＭｎＣｌ_２の添加により、反応を開始した。
【００８７】
図１に示すように、テトラ−およびペンタ−ホスフェートの両方はトリホスフェートより顕著により良い基質である。
【００８８】
実施例７
ｄＴＰｎ−ＤＤＡＯ[式中、ｎは３もしくは４である]の異なるポリメラーゼによる組み込みの速度の比較
実施例(１〜５)のジデオキシヌクレオチドを用いて、反応液を室温(２３℃)でアセンブルした。反応液は、配列番号２に相当するオリゴヌクレオチド鋳型にアニールした単一のオリゴヌクレオチドプライマー(配列番号１により表される)を有するプライマー：鋳型の組合せを含有した。
【００８９】
反応条件：５０ｍＭトリス、ＰＨ８.０、５％グリセロール，５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０.０１％tween−２０、エビアルカリ性ホスファターゼ０.２５単位、鋳型にアニールした１００ｎＭプライマーおよび１μＭ ｄｄＴＰｎ−ＤＤＡＯを含有する反応液７０μｌを、時間ドライブモードで運転される、ＬＳ−５５ルミネセンス分光計(Perkin Elmer)の中で石英蛍光超微小キュベット中にアッセンブルした。励起および放射波長は、それぞれ、６２０ｎｍおよび６５５ｎｍである。スリット幅は、励起スリットについて５ｎｍ、放射スリットについて１５ｎｍであった。(遺伝子的に工学して、３'−５'エキソヌクレアーゼ活性、５'−３'エキソヌクレアーゼ活性およびジデオキシヌクレオチドに対する識別を除外した)クローン化ＤＮＡポリメラーゼＩの０.３５μｌ(１１単位)もしくはＭＭＬＶ逆転写酵素、ならびに０.２５ｍＭ ＭｎＣｌ_２の添加により、反応を開始した。
【００９０】
図２に示すように、ポリメラーゼおよび逆転写酵素の両方によって、ｄＴ４Ｐ−ＤＤＡＯの組み込みの速度はｄＴ３Ｐ−ＤＤＡＯのそれより顕著により高い。
【００９１】
実施例８
ｄｄＮＰｎ−ＤＤＡＯおよびｄｄＮＰｎ−レゾルフィン[式中、ＮはＡ、Ｃ、ＧもしくはＴであり、ｎ＝３もしくは４、である]の組み込み
実施例(１〜５)のジデオキシヌクレオチドを用いて、反応液を室温(２３℃)でアセンブルした。反応液は、添加される次の塩基に依存して配列番号２〜５に相当するオリゴヌクレオチド鋳型にアニールした単一のオリゴヌクレオチドプライマー(配列番号１により表される)を有するプライマー：鋳型の組合せを含有した。
【００９２】
反応条件：５０ｍＭトリス、ＰＨ８.０、５％グリセロール，５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０.０１％tween−２０、エビアルカリ性ホスファターゼ０.２１単位、鋳型にアニールした１００ｎＭプライマーおよび１μＭ ｄｄＴＰｎ−ＤＤＡＯを含有する反応液７０μｌを、時間ドライブモードで運転される、ＬＳ−５５ルミネセンス分光計(Perkin Elmer)の中で石英蛍光超微小キュベット中にアッセンブルした。励起および放射波長は、それぞれ、６２０ｎｍおよび６５５ｎｍである。スリット幅は、励起スリットについて５ｎｍ、放射スリットについて１５ｎｍであった。遺伝子的に工学して、３'−５'エキソヌクレアーゼ活性、５'−３'エキソヌクレアーゼ活性およびジデオキシヌクレオチドに対する識別を除外した、クローン化ＤＮＡポリメラーゼＩの０.３５μｌ(１１単位)ならびに０.２５ｍＭ ＭｎＣｌ_２の添加により、反応を開始した。
【００９３】
図３から明らかなように、検討された全ての異なる塩基ならびに異なる色素により、四リン酸エステル類似体は三リン酸エステル対応体より顕著により良く組み入れられる。
【００９４】
本明細書に本発明の特定の、望ましい態様を説明しているので、本発明の意図する範囲から逸脱すること無しにここを通して修飾を成し得ることは、認識されるべきである。本発明の真の範囲は、本明細書に添付される特許請求の範囲に示される。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】図１は、ホスファターゼ処理後に遊離色素の放出により測定された、ＤＮＡポリメラーゼによる末端ホスフェート標識ヌクレオシド三−、四−および五−リン酸類似体の取り込み速度の比較を提示する。
【図２】図２は、二つの異なるＤＮＡを重合する酵素による末端ホスフェート標識ヌクレオシド三−および四−リン酸の取り込みの比較を提示する。
【図３】図３は、全ての四つの異なる塩基および二つの異なる色素を持つ二組の末端ホスフェート標識ヌクレオシド三−および四−リン酸の取り込み速度の相違を提示する。
【図４】図４は、合成のオリゴヌクレオチド配列を提示する。

Claims (32)

1. 式
   

   

   [式中、Ｐ＝ホスフェート(ＰＯ_３)およびその誘導体、ｎは３もしくはそれより大であり；Ｙは酸素もしくは硫黄原子であり；Ｂは窒素含有の複素環式塩基であり；Ｓは非環式部分、炭素環式部分もしくは糖部分であり；Ｌは、天然または修飾ヌクレオチドの末端ホスフェートにおいてリン酸エステル、チオエステル、ホスホラミデートもしくはホスホン酸アルキル結合を形成するのに適当なヒドロキシル基、スルフヒドリル基、アミノ基またはハロアルキル基を含むリンカーを持つかまたは持たない蛍光性の、蛍光原性の、化学発光の、着色性の、発色性の、質量タグのまたは電気化学的な標識である]
   の末端ホスフェート標識ヌクレオシドポリホスフェートを含む組成物。
2. 請求項１に記載の組成物であって、当該標識が化学発光化合物、蛍光もしくは蛍光原の色素、着色もしくは発色性の色素、電気化学的タグおよびそれらの組合せからなる群から選択されるものである、組成物。
3. ｎが四，五もしくは六である、請求項１に記載の組成物。
4. 請求項１に記載の組成物であって、当該標識が化学発光化合物、蛍光原色素、発色性色素、電気化学的タグおよびそれらの組合せからなる群から選択される、組成物。
5. 請求項１に記載の組成物であって、当該検出可能な種が色、蛍光放射、化学発光、還元／酸化電位もしくはそれらの組み合わせからなる群から選択される性質により検出可能である、組成物。
6. 請求項５に記載の組成物であって、当該標識が酵素で活性化可能な蛍光原部分であってそして２−(５'−クロロ−２'−ホスホリルオキシフェニル)−６−クロロ−４−(３Ｈ)−キナゾリノン、二リン酸フルオレセイン、フルオレセイン３'(６')−Ｏ−アルキル−６'(３')−リン酸、９Ｈ−(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル)リン酸、リン酸４−メチルウンベリフェリル、リン酸レゾルフィン、リン酸４−トリフルオロメチルウンベリフェリル、リン酸ウンベリフェリル、リン酸３−シアノウンベリフェリル、リン酸９,９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル、リン酸６,８−ジフルオロ−４−メチルウンベリフェリルおよびそれらの誘導体からなる群から選択される、組成物。
7. 請求項５に記載の組成物であって、当該標識がフルオレセイン、ローダミン、ボジピー(Bodipy)[登録商標]、シアニン、アレキサ(Alexa)[登録商標]、ナフトフルオレセイン、オレゴングリーン[登録商標]、クマリン、ダンシル、テキサスレッド[登録商標]、ピレンおよびそれらの誘導体からなる群から選択される蛍光部分である、組成物。
8. 請求項５に記載の組成物であって、当該酵素で活性化可能な標識がリン酸ｐ−ニトロフェニル、リン酸ｐ−ジニトロフェニル、オキソノール、メロシアニンおよびそれらの誘導体からなる群から選択される発色性部分である組成物。
9. 当該化学発光化合物がホスファターゼで活性化された１,２−ジオキセタン化合物である、請求項５に記載の組成物。
10. 請求項９に記載の組成物であって、当該１,２−ジオキセタン化合物がリン酸２−クロロ−５−(４−メトキシスピロ[１,２−ジオキセタン−３,２'−(５−クロロ−)トリシクロ[３,３,１−１^{３ , ７}]−デカン]−１−イル)−１−フェニル、クロロアダマント−２'−イリデンメトキシフェノキシリン酸化ジオキセタン、３−(２'−スピロアダマンタン)−４−メトキシ−４−(３''−ホスホリルオキシ)フェニル−１,２−ジオキセタンおよびそれらの誘導体からなる群から選択される、組成物。
11. 請求項１に記載の組成物であって、当該糖部分がリボシル、２'−デオキシリボシル、３'−デオキシリボシル、２',３'−ジデオキシリボシル、２',３'−ジデヒドロジデオキシリボシル、２'−アルコキシリボシル、２'−アジドリボシル、２'−アミノリボシル、２'−フルオロリボシル、２'−メルカプトリボシル、２'−アルキルチオリボシル、炭素環式、非環式および他の修飾糖からなる群から選択される、組成物。
12. 請求項１に記載の組成物であって、当該塩基がウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、グアニン、７−デアザグアニン、ヒポキサンチン、７−デアザヒポキサンチン、アデニン、７−デアザアデニン、２，６−ジアミノプリンおよびそれらの類似体からなる群から選択される組成物。
13. 核酸ポリメラーゼの基質である、請求項１に記載の組成物。
14. ホスフェートの除去後の検出可能な部分がさらに別な化学的および／もしくは酵素的部分と相互作用して、シグナルを作成する、請求項１に記載の組成物。
15. 当該さらに別な検出試薬が当該検出可能な種から検出可能に異なるところの応答が可能である、請求項１に記載の組成物。
16. 当該さらに別な検出試薬が抗体である、請求項１に記載の組成物。
17. ＤＮＡ配列の存在を検出する方法であって、
    ａ)末端−ホスフェート−標識ヌクレオチドの存在下で、ＤＮＡポリメラーゼ反応を実施し、その反応は標識ポリホスフェートの生産をもたらす；
    ｂ)当該標識ポリホスフェートがホスフェートもしくはポリホスフェートを転移する酵素と反応して、検出可能な種を生産することを可能とすること；および
    ｃ)当該検出可能な種の存在を検出すること：
    の工程を含む、方法。
18. 工程(ａ)がホスフェートもしくはポリホスフェートを転移する酵素の存在下で当該ポリメラーゼ反応を実施することをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
19. 工程(ａ)が別個の標識を持つ二つもしくはそれ以上の末端−ホスフェート−標識ヌクレオチドの存在下で当該ポリメラーゼ反応を実施することをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
20. 請求項１６に記載の方法であって、当該標識が化学発光化合物、蛍光原もしくは蛍光の色素、発色性もしくは着色の色素、質量タグ、電気化学的タグおよびそれらの組合せからなる群から選択される酵素で活性化可能な標識である、方法。
21. 請求項１６に記載の方法であって、当該末端−ホスフェート−標識ヌクレオチドが式Ｉ：
    

    

    [式中、Ｐ＝ホスフェート(ＰＯ_３)およびその誘導体、ｎは３もしくはそれより大であり；Ｙは酸素もしくは硫黄原子であり；Ｂは窒素含有の複素環式塩基であり；Ｓは非環式部分、炭素環式部分もしくは糖部分であり；Ｌは、天然または修飾ヌクレオチドの末端ホスフェートにおいてリン酸エステル、チオエステル、ホスホラミデートもしくはホスホン酸アルキル結合を形成するのに適当なヒドロキシル基、スルフヒドリル基、アミノ基またはハロアルキル基を含むリンカーを持つかまたは持たない蛍光性の、蛍光原性の、化学発光の、着色性の、発色性の、電気化学的なまたは質量タグである]
    により表され得る、方法。
22. ｎが四もしくはである、請求項１６に記載の方法。
23. 当該ＤＮＡ配列を定量化する工程をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
24. 当該検出可能な種が配列の量と実質的に比例する量で生産される、請求項１６に記載の方法。
25. 当該ポリメラーゼ反応において一つもしくはそれ以上のさらに別な検出試薬を含む工程をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
26. 当該さらに別な検出試薬が当該検出可能な種から検出可能に異なるところの応答が可能である、請求項２４に記載の方法。
27. 当該さらに別な検出試薬が抗体である、請求項２４に記載の方法。
28. 核酸検出キットであって、
    (ａ)少なくとも一つもしくはそれ以上の請求項１に記載の末端−ホスフェート−標識ヌクレオチド；
    (ｂ)ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼもしくは逆転転写酵素からなる群から選択される少なくとも一つの酵素；
    および
    (ｃ)ホスフェートもしくはポリホスフェートを転移する酵素
    を含む、キット。
29. ｎが四もしくは五である請求項２７に記載のキット。
30. 請求項２７に記載のキットであって、当該糖部分がリボシル、２'−デオキシリボシル、３'−デオキシリボシル、２',３'−ジデヒドロジデオキシリボシル、２',３'−ジデオキシリボシル、２'−アルコキシリボシル、２'−アジドリボシル、２'−アミノリボシル、２'−フルオロリボシル、２'−メルカプトリボシル、２'−アルキルチオリボシル、炭素環式、非環式および他の修飾糖からなる群から選択される、キット。
31. 請求項２７に記載のキットであって、当該塩基がウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、グアニン、７−デアザグアニン、ヒポキサンチン、７−デアザヒポキサンチン、アデニン、７−デアザアデニン、２，６−ジアミノプリンおよびそれらの類似体からなる群から選択されるキット。
32. 請求項２７に記載のキットであって、当該酵素で活性化可能な標識が化学発光化合物、蛍光原色素、発色性色素、質量タグ、電気化学的タグおよびそれらの組合せからなる群から選択される、キット。

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