JP2005537001A - 対立遺伝子特異的プライマー伸長 - Google Patents

Abstract

以下の段階からなる核酸サンプルの特性決定法が提供される：（ａ）ＤＮＡポリメラーゼ反応を実施する段階であって、該反応が、鋳型、対立遺伝子特異的プライマー、１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ及びプライマーが非加水分解性である場合に３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素の反応を含み、この反応で標識ポリリン酸を生成させる段階、（ｂ）標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させて、検出可能な化学種を生成させる段階、（ｃ）検出可能な化学種を検出する段階、及び（ｄ）かかる検出結果に基づいて核酸サンプルを特性決定する段階を含む方法も提供される。

Description

本発明は広義には正常又は非加水分解性プライマーと末端リン酸標識ヌクレオチドをＤＮＡポリメラーゼの基質として使用して、サンプル中のポリヌクレオチドを検出及び特性決定する方法に関する。本発明は、標的ポリヌクレオチド中の特異的ヌクレオチド塩基の多形性を検出する方法に関する。使用する標識は酵素での活性化の可能なものであり、化学発光部分、蛍光部分、電気化学的部分、発色団及び質量タグを含む。

サンプル中の特定の核酸又は検体を高い特異性及び感度で検出する方法は公知である。ヌクレオチド配列間の相補性に基づく分析法では遺伝的特徴を直接解析できる。この方法は遺伝疾患又は正常細胞の癌化を同定する非常に有用な手段である。

しかし、サンプル中の微量の標的ヌクレオチドの検出及び特性決定は困難である。そのため、遺伝子の直接検出法では、概して、特異的標的配列又は検体の存在に基づいて最初に核酸配列を増幅する必要がある。増幅後、増幅配列を検出して定量する。従来の核酸の検出システムには、蛍光標識の検出、蛍光酵素結合検出系、抗体を介した標識の検出、放射性標識の検出などがある。

核酸配列の増幅法としては、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）プロセスが公知である。現在、ＰＣＲは最も一般的な核酸のインビトロ増幅手段である。しかし、ＰＣＲには、厳密な温度制御の必要性、指数的増幅のため定量には適さないこと、微量の夾雑ＤＮＡが同時の増幅されるため誤った結果を与えかねないことなど、幾つかの短所がある。

配列の検出と定量を伴う増幅法に加えて、増幅した分解産物を検出するシグナル増幅法つまり反応生成物又は副生物を標的検体からのシグナルとして増幅する方法がある。

例えば、λ−エキソヌクレアーゼを利用して二本鎖ＤＮＡを特異的に切断するサイクリングアッセイが開発されている（Ｃ．Ｇ．Ｃｏｐｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｖｏｌ．１３， Ｎｏ．６， ｐｐ８８２−８９２， １９９２）。この方法では、オリゴヌクレオチドプローブを相補的な核酸配列とハイブリダイズさせ、形成された二本鎖ＤＮＡにλ−エキソヌクレアーゼを作用させて、ハイブリダイズしたプローブを分解させる。プローブは別のプローブで置き換わり、次いで分解される。このようにしてサイクリング反応を繰返す。この方法では、標的ＤＮＡ配列の存在は、変性プローブの検出によって概算される。この方法の短所は、λ−エキソヌクレアーゼには、５′末端がリン酸化されたプローブが基質として必要とされることである。公知の方法によるプローブの化学合成後、５′末端をリン酸化する必要があるが、すべての５′末端が完全にリン酸化されたことを確認するのは困難である。この方法のもう一つの問題は、サイクリング反応のターンオーバー数（つまり、プライマーと標的ヌクレオチドの間で起こるハイブリダイゼーションの回数）が低いことである。ターンオーバー数が低いのは、ハイブリダイゼーション段階を繰返す必要があるからである。

エキソヌクレアーゼによる別のサイクリングアッセイが欧州特許出願公開第５００２２４号に開示されている。この方法では、標的ＤＮＡに相補的なＤＮＡ鎖の合成は、プライマーから進行するが、同時にそのプライマーの反対側から５′→３′エキソヌクレアーゼによる分解が起こり、その結果、前にハイブリダイズしていた分解プライマーに代わって、別のプライマーが標的配列とハイブリダイズする。従って、一サイクルの反応で、ＤＮＡポリメラーゼによる相補鎖の合成だけでなく合成された鎖の分解が繰返し起こる。この方法の短所は、ターンオーバー数が低く、ハイブリダイゼーション段階を繰返し起こす必要があるのでハイブリダイゼーション段階が律速段階となることである。

特定の配列を含むポリヌクレオチドの検出のための別のサイクリングアッセイが米国特許第５８４９４８７号に開示されている。この方法は、シグナル増幅及び分解産物の検出に基づく。この方法は、核酸ポリメラーゼと３′→５′エキソヌクレアーゼとヌクレアーゼ耐性プライマーと標的核酸（限られた濃度のＤＮＡでもよい）と１種以上のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）の組合せを用いて、標的核酸配列を検出する。この方法は、さらに、ヌクレアーゼ耐性プライマーの３′末端に隣接して位置するヌクレオチド種である相補鎖の合成、次いでプライマーの末端に結合したヌクレオチド種の分解、生成したピロリン酸又はデオキシヌクレオシド一リン酸の検出を含んでおり、ヌクレオチド種の合成及び分解を２回以上繰返す。この方法及び現在広く用いられている他の検出法の短所は、最終標識産物又は副生物から標識出発物質を分離する必要があることである。かかる分離には、一般に、ゲル電気泳動又は検出用メンブランへの標的核酸配列の固定が必要とされる。例えば、米国特許第５８４９４８７号では、ヌクレアーゼ反応で生じたデオキシヌクレオシド一リン酸をクロマトグラフィーで分離し、光学的に測定する。或いは、ＤＮＡポリメラーゼによる相補塩基の取込みの際に生成するピロリン酸を、アデノシン−５′−ホスホ硫酸及びアデノシン三リン酸スルフラーゼと反応させてアデノシン三リン酸を生じさせ、次いでこれをルシフェリン−ルシフェラーゼ反応で検出することもできるが、追加の試薬及びインキュベーション段階を要するという短所がある。

また、米国特許第５８４９４８７号では、標的における特定のヌクレオチド塩基の突然変異を検出するため、ヌクレアーゼ消化後の残存ヌクレオチド種の有無だけを利用する。すなわち、特定の塩基が検出すべき突然変異である（又は検出すべき突然変異でない）場合にのみ、プライマーの３′末端にヌクレオチドが結合する。この米国特許には、最初の分析によって実際の突然変異の存在を同定する方法は開示されていない。

特定のポリヌクレオチド配列の検出のための別のシグナル増幅法は、対立遺伝子特異的プライマーの伸長反応と、標的鋳型１分子当たり複数のピロリン酸分子の生成に基づくものである（Ｇ−Ｈ Ｚｈｏｕ ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００１，２９（１９），ｅ９３）。この方法は、３′塩基ミスマッチプライマーに対して完全マッチプライマーの識別的伸長（Ｃ．Ｒ．Ｎｅｗｔｏｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９８９，１７（７），２５０３）及び上述のＡＴＰへの変換によるピロリン酸の検出に基づく。３′末端のマッチプライマー伸長とミスマッチプライマー伸長との識別は、プライマーの３′末端から２又は３塩基の一定ミスマッチを与えることによってさらに高めることができる。数個のヌクレオチドの重合、図１に示すようなプライマーの伸長、各伸長プライマーについて数個の標識ピロリン酸分子の生成によって、シグナルが増幅される。この方法の大きな問題は、ｄＮＴＰ試料中に一般に存在するピロリン酸の夾雑であり、高いバックグランドを生じかねないことである。夾雑ピロリン酸は、使用前にヌクレオチドを注意深く精製するか、ピロホスファターゼでヌクレオチドを精製することによって除去できる。ただし、両方法とも労働集約的である。さらに、アッセイに用いる温度によっては、ｄＮＴＰの分解、ピロリン酸の生成による干渉を受けかねない。そのため、この方法は高温では或いはシグナル増幅のための熱サイクリングプロセスには信頼性をもって使用することができない。

ＤＮＡ及びＲＮＡポリメラーゼは、三リン酸部分のγ位が修飾又はγ位に代わる修飾をもつヌクレオチドを認識して利用することができることが知られている。γ修飾ヌクレオシド三リン酸を認識し利用する各種ポリメラーゼの能力が、γリン酸に結合した基に応じて変わることも知られている。

γリン酸修飾ヌクレオシド存在下でのＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ合成をモニターするための比色定量アッセイが報告されている（Ｖａｓｓｉｌｉｏｕ Ｗ， Ｅｐｐ ＪＢ， Ｗａｎｇ ＢＢ， Ｄｅｌ Ｖｅｃｃｈｉｏ ＡＭ， Ｗｉｄｌａｎｓｋｉ Ｔ， Ｋａｏ ＣＣ． Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｐｒｏｍｉｓｃｕｉｔｙ： Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ． ２０００ Ｓｅｐ １； ２７４（２）：４２９−３７、Ｃ．Ｃ．Ｋａｏ ｅｔ． ａｌの米国特許第６３９９３３５号）。これらの報文では、ＲＮＡポリメラーゼ反応は、ジニトロフェニル基を用いてγリン酸を修飾したγ修飾アルカリホスファターゼ耐性ヌクレオシド三リン酸の存在下で実施されている。このγ修飾ＮＴＰを唯一のヌクレオシド三リン酸としてホモポリマー系鋳型の存在下でＲＮＡポリメラーゼ反応を実施すると、ＲＮＡポリメラーゼがこの修飾ＮＴＰを認識及び利用できることが分かっている。さらに、ポリメラーゼ反応をアルカリホスファターゼの存在下で実施すると、リン酸基転移のｐ−ニトロフェニルピロリン酸アルド産物を消化して発色性ｐ−ニトロフェニレートを生じ、吸光度が増大すると報告されている。しかし、この報文には、ポリメラーゼ活性の定量法が記載されているだけで、他のポリヌクレオチド配列の存在下でポリヌクレオチド配列を同定する方法は記載されていない。
欧州特許出願公開第５００２２４号 米国特許第５８４９４８７号明細書 米国特許第６３９９３３５号明細書 Ｃ．Ｇ．Ｃｏｐｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｖｏｌ．１３， Ｎｏ．６， ｐｐ８８２−８９２， １９９２ Ｇ−Ｈ Ｚｈｏｕ ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００１，２９（１９），ｅ９３ Ｃ．Ｒ．Ｎｅｗｔｏｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９８９，１７（７），２５０３ Ｖａｓｓｉｌｉｏｕ Ｗ， Ｅｐｐ ＪＢ， Ｗａｎｇ ＢＢ， Ｄｅｌ Ｖｅｃｃｈｉｏ ＡＭ， Ｗｉｄｌａｎｓｋｉ Ｔ， Ｋａｏ ＣＣ． Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｐｒｏｍｉｓｃｕｉｔｙ： Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ． ２０００ Ｓｅｐ １； ２７４（２）：４２９−３７

そこで、核酸の検出及び特性決定法であって、シグナル増幅プロトコールにおけるＤＮＡポリメラーゼの基質として末端リン酸標識ヌクレオチドを利用する方法を提供できれば有益である。また、かかる方法で、ヌクレオチドの末端リン酸に酵素活性化可能標識を用いて標的核酸からの検出可能な増幅化学種を生じさせ、標識生成物又は副生物から標識出発物質を分離する必要性がなくなればさらに有益である。さらに、かかる核酸の検出及び特性決定法で、通常の実験装置を用いてヘテロポリマーの標的核酸のリアルタイムモニタリングができれば極めて望ましい。

本発明の一態様は、末端リン酸修飾ｄＮＴＰをポリメラーゼ、ホスファターゼ及び対立遺伝子特異的プライマーと共に用いて、反応成分を分離せずに検出できる増幅シグナルを生じさせる、ポリヌクレオチド配列を検出及び特性決定する均一法を提供する。

本発明は核酸サンプルの検出法を提供する。一つの方法は、（ａ）ＤＮＡポリメラーゼ反応を実施する段階であって、該反応が、鋳型、プライマー、１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド及びＤＮＡポリメラーゼの反応を含み、この反応で標識ポリリン酸を生成させる段階、（ｂ）標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させて、検出可能な化学種を生成させる段階、及び（ｃ）検出可能な化学種を検出する段階を含む。

さらに、核酸サンプルの検出法であって、（ａ）ＤＮＡポリメラーゼ反応を実施する段階であって、該反応が、鋳型、プライマー、ポリリン酸鎖に４個以上のリン酸基を有する１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド及びＤＮＡポリメラーゼの反応を含み、この反応で標識ポリリン酸を生成させる段階、及び（ｂ）標識ポリリン酸を検出する段階を含む方法も提供される。

本発明のもう一つの態様は、核酸サンプルの検出法であって、（ａ）ＤＮＡポリメラーゼ反応を実施する段階であって、該反応が、鋳型、プライマー、ポリリン酸鎖に４個以上のリン酸基を有する１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド及びＤＮＡポリメラーゼの反応を含み、この反応で標識ポリリン酸を生成させる段階、（ｂ）標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させて、検出可能な化学種を生成させる段階、及び（ｃ）検出可能な化学種を検出する段階を含む方法に関する。

本発明は核酸サンプルの特性決定法も提供する。例えば、本発明は、（ａ）ＤＮＡポリメラーゼ反応を実施する段階であって、該反応が、鋳型、プライマー、１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド及びＤＮＡポリメラーゼの反応を含み、この反応で標識ポリリン酸を生成させる段階、（ｂ）標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させて、検出可能な化学種を生成させる段階、（ｃ）検出可能な化学種を検出する段階、及び（ｄ）検出結果に基づいて核酸を特性決定する段階を含む方法を提供する。

本発明には、核酸サンプルの特性決定法であって、（ａ）ＤＮＡポリメラーゼ反応を実施する段階であって、該反応が、鋳型、プライマー、ポリリン酸鎖に４個以上のリン酸基を有する１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド及びＤＮＡポリメラーゼの反応を含み、この反応で標識ポリリン酸を生成させる段階、（ｂ）標識ポリリン酸を検出する段階、及び（ｃ）検出結果に基づいて核酸サンプルを特性決定する段階を含む方法も包含される。

さらに、核酸サンプルの特性決定法であって、（ａ）ＤＮＡポリメラーゼ反応を実施する段階であって、該反応が、鋳型、プライマー、ポリリン酸鎖に４個以上のリン酸基を有する１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド及びＤＮＡポリメラーゼの反応を含み、この反応で標識ポリリン酸を生成させる段階、（ｂ）標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させ、サンプルに特徴的なシグナル特性を有する検出可能な化学種を生成させる段階、（ｃ）検出可能な化学種を検出する段階、及び（ｄ）シグナル特性に基づいて核酸サンプルを特性決定する段階を含む方法も提供される。

本発明は、さらに、標的核酸鎖における特定ヌクレオチド塩基の多形の検出法を提供する。一つの方法は、（ａ）ＤＮＡポリメラーゼ反応を実施する段階であって、該反応が、鋳型、対立遺伝子特異的プライマー、１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド及びＤＮＡポリメラーゼの反応を含み、この反応で標識ポリリン酸を生成させる段階、（ｂ）標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させて、検出可能な化学種を生成させる段階、（ｃ）検出可能な化学種を検出する段階、及び（ｄ）検出可能な化学種の有無に基づいて核酸配列における多形を特性決定する段階を含む。

さらに、標的核酸配列における特異的ヌクレオチド塩基の多形の検出法であって、（ａ）ＤＮＡポリメラーゼ反応を実施する段階であって、該反応が、鋳型、対立遺伝子特異的プライマー、ポリリン酸鎖に４個以上のリン酸基を有する１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド及びＤＮＡポリメラーゼの反応を含み、プライマーの３′末端塩基が対応鋳型塩基と塩基対を形成する場合には、この反応で標識ポリリン酸を生じる段階、（ｂ）標識ポリリン酸を検出する段階、及び（ｃ）標識ポリリン酸の有無に基づいて核酸配列における多形を特性決定する段階を含む方法も提供される。

本発明には、標的核酸配列における特異的ヌクレオチド塩基の多形の検出法であって、（ａ）ＤＮＡポリメラーゼ反応を実施する段階であって、該反応が、鋳型、対立遺伝子特異的プライマー、ポリリン酸鎖に４個以上のリン酸基を有する１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド及びＤＮＡポリメラーゼの反応を含み、プライマーの３′末端塩基が対応鋳型塩基と塩基対を形成する場合には、この反応で標識ポリリン酸を生じる段階、（ｂ）標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させて、検出可能な化学種を生成させる段階、（ｃ）検出可能な化学種を検出する段階、及び（ｄ）検出可能な化学種の有無に基づいて核酸配列における多形を特性決定する段階を含む方法も提供される。

さらに、本発明は、標的核酸鎖における特定ヌクレオチド塩基の多形の検出法を提供する。かかる方法の一つは、（ａ）ＤＮＡポリメラーゼ反応を実施する段階であって、該反応が、鋳型、対立遺伝子特異的非加水分解性プライマー、１種以上の末端リン酸標識デオキシヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ及び３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素（該酵素はＤＮＡポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ及びその組合せから選択し得る。）の反応を含み、この反応で標識ポリリン酸を生成させる段階、（ｂ）標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させて、検出可能な化学種を生成させる段階、（ｃ）検出可能な化学種を検出する段階、及び（ｄ）検出可能な化学種の有無に基づいて核酸配列における多形を特性決定する段階を含む。

本発明には、標的核酸配列における特異的ヌクレオチド塩基の多形の検出法であって、（ａ）ＤＮＡポリメラーゼ反応を実施する段階であって、該反応が、鋳型、対立遺伝子特異的非加水分解性プライマー、ポリリン酸鎖に４個以上のリン酸基を有する１種以上の末端リン酸標識デオキシヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ及び３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素（該酵素はＤＮＡポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ及びその組合せから選択し得る。）の反応を含み、プライマーの３′末端塩基が対応鋳型塩基と塩基対を形成する場合には、この反応で標識ポリリン酸を生じる段階、（ｂ）標識ポリリン酸を検出する段階、及び（ｃ）標識ポリリン酸の有無に基づいて核酸配列における多形を特性決定する段階を含む方法も包含される。

本発明には、標的核酸配列における特異的ヌクレオチド塩基の多形の検出法であって、（ａ）ＤＮＡポリメラーゼ反応を実施する段階であって、該反応が、鋳型、対立遺伝子特異的非加水分解性プライマー、ポリリン酸鎖に４個以上のリン酸基を有する１種以上の末端リン酸標識デオキシヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ及び３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素（該酵素はＤＮＡポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ及びその組合せから選択し得る。）の反応を含み、プライマーの３′末端塩基が対応鋳型塩基と塩基対を形成する場合には、この反応で標識ポリリン酸を生じる段階、（ｂ）標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させて、検出可能な化学種を生成させる段階、（ｃ）検出可能な化学種を検出する段階、及び（ｄ）検出可能な化学種の有無に基づいて核酸配列における多形を特性決定する段階を含む方法も包含される。

本発明ではさらにポリヌクレオチドの検出用キットを提供するが、一つのキットは、（ａ）１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ、及び（ｃ）ホスファターゼを備える。

本発明ではさらにポリヌクレオチドの検出用キットを提供するが、一つのキットは、（ａ）１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ、（ｃ）ホスファターゼ、及び（ｄ）ＤＮＡを３′→５′方向に分解するのに十分な酵素活性を有するヌクレアーゼを備える。

ポリヌクレオチドの検出キットであって、（ａ）１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、（ｂ）ホスファターゼ、及び（ｃ）３′→５′方向にＤＮＡを分解するのに十分なヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを備えるキットも提供される。

本発明のもう一つの態様では、標的核酸鎖における特異的ヌクレオチド塩基の多形を検出するキットを提供するが、一つのキットは、（ａ）１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ、及び（ｃ）ホスファターゼを備える。

本発明のもう一つの態様では、標的核酸鎖における特異的ヌクレオチド塩基の多形を検出するキットを提供するが、一つのキットは、（ａ）１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ、（ｃ）ホスファターゼ、及び（ｄ）ＤＮＡを３′→５′方向に分解するのに十分な酵素活性を有するヌクレアーゼを備える。

最後に、標的核酸鎖における特異的ヌクレオチド塩基の多形を検出するキットであって、（ａ）１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、（ｂ）ホスファターゼ、及び（ｃ）３′→５′方向にＤＮＡを分解するのに十分なヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを備えるキットを提供する。

本明細書では、「ヌクレオシド」という用語は、プリン、デアザプリン又はピリミジン塩基が糖又は炭素環式もしくは非環式リンカーのような糖置換体に１′位又は等価な部位で結合した化合物であり、２′−デオキシ及び２′−ヒドロキシ、２′，３′−ジデオキシ型その他の置換体を包含する。

本明細書では、「ヌクレオチド」という用語は、ヌクレオシドのリン酸エステルをいい、エステル化部位は典型的には五炭糖のＣ５位についた水酸基に相当する。

本明細書では、「対立遺伝子特異的プライマー」という用語は、その３′末端塩基が、特定の対立遺伝子の多形部位の対応鋳型塩基に相補的なプライマーである。

本明細書で用いる「マッチプライマー」又は「ミスマッチプライマー」という用語は、プライマーの３′末端塩基と対応鋳型塩基との相補性のみをいう。マッチプライマーは３′−末端塩基が対応鋳型塩基に相補的なプライマーであり、ミスマッチプライマーは３′−末端塩基が対応鋳型塩基に非相補的なプライマーである。

「オリゴヌクレオチド」という用語には、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシドなどを始めとするヌクレオチド又はその誘導体の線状オリゴマーが包含される。本明細書全体を通して、オリゴヌクレオチドを文字の配列で示すときは、特記しない限り、ヌクレオチドは左から右に５′→３′方向の順序で示し、Ａはデオキシアデノシン、Ｃはデオキシシチジン、Ｇはデオキシグアノシン、Ｔはチミジンを表す。

「プライマー」という用語は、ユニークな鋳型核酸配列に特異的にアニールしてそのユニーク配列の増幅を可能にする線状オリゴヌクレオチドをいう。

「標的核酸配列」又は「鋳型核酸」などの用語は、その配列の同定又はヌクレオシドの順序もしくは位置を本発明の１以上の方法で決定する核酸をいう。

本発明は、サンプル中のポリヌクレオチドを検出・特性決定する方法に関するが、簡便なアッセイ法を用いて３′末端マッチプライマーの３′末端への末端リン酸標識ヌクレオチドの付加をモニターする。ＤＮＡポリメラーゼは、デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）から伸長オリゴヌクレオチド鎖の３′ヒドロキシルへのヌクレオシド一リン酸の移動を介して、オリゴヌクレオチドを合成する。

この反応の駆動力は、無水結合の切断と無機ピロリン酸の同時形成である。本発明では、ヌクレオチドの末端リン酸を構造的に修飾しても、ポリメラーゼ反応で機能するその能力はなくならないという知見を利用する。このオリゴヌクレオチド合成反応で直接変化するのはヌクレオチドのα及びβホスホリル基のみであり、そのため末端リン酸位が修飾されたヌクレオチドは核酸ポリメラーゼ反応の基質として有用となる。

本発明の提供する方法では、末端リン酸に電気化学的標識、質量タグ又は発色性、化学発光性もしくは蛍光性色素標識が結合したデオキシヌクレオシドポリリン酸又はジデオキシヌクレオシドポリリン酸アナログのようなヌクレオシドポリリン酸アナログを利用する。このアナログを核酸ポリメラーゼが基質として利用すると、リン酸基転移の無機ポリリン酸副生物に酵素活性化可能標識が存在する。ホスファターゼによるリン酸基転移のポリリン酸生成物の切断によって、リン酸に結合した標識に検出可能な変化が生じる。例えば、３−シアノウンベリフェロン色素がそのヒドロキシル基を介してヌクレオチドの末端リン酸位に結合している場合、この色素は４０８ｎｍで励起しても蛍光発光せず、アルカリホスファターゼの基質でもない。このヌクレオチドがＤＮＡにいったん取込まれれば、遊離した色素無機ポリリン酸（これも４０８ｎｍで励起しても蛍光性でない。）は、アルカリホスファターゼの基質である。いったん脱リン酸化されれば、色素は４０８ｎｍで励起すれば蛍光を発し、検出可能である。ポリリン酸生成物の特異的な分析を、ポリメラーゼ反応と同じ反応溶液中で実施することができ、出発物質から反応生成物を分離する必要はない。そのため、蛍光定量又は分光光度計のような通常の装置を用いて、ポリメラーゼ反応で形成された核酸の検出と適宜定量が可能となる。

なお、ＲＮＡ及びＤＮＡポリメラーゼは、末端リン酸基が修飾されたヌクレオチドを認識できるが、本発明者らは、この出発材料がホスファターゼの基質ではないという知見を得た。以下のスキームに、本発明の方法に関連する分子、すなわち、末端リン酸標識ヌクレオチド、標識ポリリン酸副生物及び酵素活性化標識を示す。

上記スキームにおいて、ｎは１以上であり、Ｒ_１及びＲ_２は独立にＨ、ＳＨ、ＳＲ、Ｆ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｉ、Ｎ_３、ＮＨ_２、ＮＨＲ、ＯＲ又はＯＨであり、Ｂは天然又は修飾ヌクレオシド塩基であり、ＸはＯ、Ｓ又はＮＨであり、ＹはＯ、Ｓ又はＢＨ_３であり、Ｌはホスファターゼで活性化可能な標識であって、発色性、蛍光発生性又は化学発光分子、質量タグ又は電気化学的に検出可能な部分とし得る。質量タグは、質量の差によって他の反応生成物から容易に識別できる質量分析法に適した低分子量部分である。電気化学的タグは、容易に酸化又は還元できる種である。ｎが２以上の場合、ヌクレオチドは、ｎが１のときよりもポリメラーゼの基質として格段に優れていることが判明した。従って、本発明の好ましい実施形態では、ｎは２、３又は４である。本発明のさらに好ましい実施形態では、Ｘ及びＹはＯであり、Ｒ_１及びＲ_２は独立にＨ又はＯＨであり、Ｂはヌクレオチド塩基であり、Ｌは標識であって、発色性、蛍光発生性又は化学発光分子とし得る。

本発明で提供する核酸配列の検出法の一実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼ反応を実施する段階であって、該反応が、鋳型、プライマー、１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド及びＤＮＡポリメラーゼの反応を含み、プライマーの３′−末端塩基が対応鋳型塩基と塩基対を形成する場合には、この反応で標識ポリリン酸が生じる段階、標識ポリリン酸をアルカリホスファターゼのようなホスファターゼと反応させて検出可能な化学種を生成させる段階、及び検出可能な化学種を検出する段階を含む。

本発明で提供する核酸サンプルの特性決定法では、検出可能な化学種の有無によって標的核酸の特性を決定することができる。さらに、検出可能な化学種は、それに付随して特徴的な染色特性又はシグナル特性を有していてもよく、その特性はサンプルに特有である。こうして、検出可能な化学種に特有の特性に基づく標的検体の特性決定が可能となる。

ある特定の標的核酸の特性決定法では、標的核酸配列における特異的ヌクレオチド塩基の多形を検出する。本発明で提供す多形の検出法は、（ａ）ＤＮＡポリメラーゼ反応を実施する段階であって、該反応が、鋳型、対立遺伝子特異的プライマー、１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド及びＤＮＡポリメラーゼの反応を含み、この反応で標識ポリリン酸を生成させる段階、（ｂ）標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させて検出可能な化学種を生成させる段階、（ｃ）検出可能な化学種を検出する段階、及び（ｄ）検出可能な化学種の有無に基づいて核酸配列における多形を特性決定する段階を含む。

図２は、上述の各方法で用いられる一般的スキームを示す。このスキームにおいて、ｎは１以上であり、Ｒ_２は独立にＨ、ＯＨ、ＳＨ、ＳＲ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｎ_３、ＮＨ_２、ＮＨＲ又はＯＲであり、Ｇはグアニンつまり天然又は修飾ヌクレオシド塩基の代表例であり、Ｃはシトシンつまり付加されるヌクレオチドに相補的な塩基の代表例であり、ＹはＯ、Ｓ又はＢＨ_３であり、Ｌは発色性、蛍光発生性、化学発光もしくは電気化学的標識又は質量タグであり、好ましくはリン酸基が除去されたときに独立に検出可能となるものである。図１に示す通り、標的ポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドと少なくとも部分的に相補的な配列を有する対立遺伝子特異的プライマーとハイブリダイズする。形成されたハイブリッドと１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチドの存在下で、末端リン酸標識ヌクレオチドに由来するヌクレオシド一リン酸が標的ポリヌクレオチドと相補的な場合にはプライマーの３′末端に結合するような条件下でＤＮＡポリメラーゼ反応を実施する。これは標識生成物の同時形成を伴うが、この標識生成物は独立に検出できなくてもよい。ヌクレオチド種の取込みと同時に形成される標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させて独立に検出可能な化学種を生じさせ、これが標的ポリヌクレオチドからのシグナルとして機能する。３′末端に逐次複数のヌクレオチドが付加すると多重標識を生じるが、これらは４種の塩基で同一であっても、異なっていてもよい。

上述の方法で、ポリメラーゼ反応をアルカリホスファターゼのようなホスファターゼ又はリン酸転移酵素の存在下で実施してもよく、これらは標識ポリリン酸生成物を検出可能な標識に変換する。こうして、検出可能な化学種の形成を連続的リアルタイムにモニターできる核酸の検出及び特性決定のための簡便なアッセイ法が確立される。この方法は単一の試験管で実施できる均一系アッセイフォーマットである。

なお、末端リン酸標識ヌクレオチドがポリリン酸鎖に４個以上のリン酸を有する実施形態では、ホスファターゼ処理を用いなくてもリン酸基転移の標識ポリリン酸副生物を検出できることは、本発明で想定される範囲内である。例えば、天然又は修飾ヌクレオシド塩基、特にグアニンは、蛍光マーカーの消光を起こし得ることが知られている。従って、末端リン酸標識ヌクレオチドでは、標識を塩基によって部分的に消光することができる。ヌクレオシド一リン酸の取込みの際に、標識ポリリン酸副生物をその蛍光の増強によって検出し得る。別法として、蛍光、色、化学発光又は電気化学的検出による同定の前にクロマトグラフィー分離法で標識ポリリン酸生成物を物理的に分離することもできる。また、質量分析法を用いれば、質量の差によって生成物を検出することもできる。

検出可能な化学種は標的核酸の量に実質的に比例した量で生成してもよく、それ自体で標的核酸の量のシグナルとなる。本明細書に開示した方法は、反応で生じた検出可能な化学種の量に基づいて標的核酸を定量する段階をさらに含んでいてもよい。標的核酸の定量段階は、望ましくは、既知量の標的を用いて検出可能な化学種で得られたスペクトルを対比することによって行われる。

本発明では、オリゴヌクレオチドプライマーはいったんハイブリダイズすれば、鋳型ヌクレオチド配列に対して少なくとも等モル量で反応が定量的に進行するように繰返し機能させることができる。本発明の方法に有用なオリゴヌクレオチドプライマーの量は好ましいハイブリダイゼーションを達成するのに十分なものとすべきである。一般に、等モル以上、望ましくは意図する検出範囲に対して５倍過剰のプライマーの存在によって、鋭敏なアッセイを達成できる。

本発明で提供する方法は、ＤＮＡポリメラーゼ反応に１種以上の追加の検出試薬を配合する段階をさらに含んでいてもよい。追加の検出試薬は、検出可能な化学種とは検出性の異なる応答ができるものであればよい。例えば、追加の検出試薬は抗体であってもよい。

本発明の標的核酸としては、特に限定されないが、染色体ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ウイルス又はｍＲＮＡ由来ｃＤＮＡ、天然オリゴヌクレオチドが挙げられる。

本発明の方法では、問題とする領域の標的核酸配列の知識が概して必要とされる。例えば、問題とする領域は点突然変異を含んでいると疑われる領域であることがある。本発明の増幅では、既知の標的配列以外の核酸配列からの汚染を最小限にすることが望ましい。

本発明の方法及びキットに有用な末端−リン酸−標識ヌクレオチドは、式Ｉで表すことができる。

式中、Ｐはリン酸（ＰＯ_３）及びその誘導体であり、ｎは２以上であり、Ｙは酸素又はイオウ原子であり、Ｂは含窒素複素環式塩基であり、Ｓは非環式部分、炭素環式部分又は糖部分であり、Ｌは、天然又は修飾ヌクレオチドの末端リン酸でのリン酸エステル、チオエステル又はホスホルアミデート結合の形成に適したヒドロキシル基、スルフヒドリル基又はアミノ基を含有する酵素活性化可能標識であり、Ｐ−Ｌはリン酸化標識であって、好ましくはリン酸が取り除かれたときに独立に検出可能となるリン酸化標識である。

本発明の方法に有用な炭素環式部分は、Ｆｅｒｒａｒｏ，Ｍ．及びＧｏｔｏｒ，Ｖ．， Ｃｈｅｍ Ｒｅｖ． ２０００， ｖｏｌ．１００， ４３１９−４８に記載されている。適当な糖部分は、Ｊｏｅｎｇ，Ｌ．Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． １９９３， ｖｏｌ．３５６， ２６２７−３８、Ｋｉｍ，Ｈ．Ｏ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． １９３， ｖｏｌ．３６， ３０−７並びにＥｓｃｈｅｎｍｏｓｓｅｒ，Ａ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９９， ｖｏｌ．２８４，２１１８−２１２４に記載されている。また、有用な非環式部分は、Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｃ．Ｉ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９９， ｖｏｌ．２７， １２７１−１２７４、Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｃ．Ｉ．， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ １９９７， ｖｏｌ．７， ３０１３−３０１６並びにＴｒａｉｎｅｒ，Ｇ．Ｌ．の米国特許第５５５８９１号に記載されている。これらの部分の構造を以下に示すが、すべての部分についてＲはＨ、ＯＨ、ＮＨＲ、低級アルキル及びアリールであり、糖部分についてはＸ及びＹは独立にＯ、Ｓ又はＮＨであり、非環式部分についてはＸ＝Ｏ、Ｓ、ＮＨ、ＮＲである。

ある実施形態では、糖部分は、リボシル、２′−デオキシリボシル、３′−デオキシリボシル、２′，３′−ジデオキシリボシル、２′，３′−ジデヒドロジデオキシリボシル、２′−アルコキシリボシル、２′−アジドリボシル、２′−アミノリボシル、２′−フルオロリボシル、２′−メルカプトリボキシル、２′−アルキルチオリボシル、３′−アルコキシリボシル、３′−アジドリボシル、３′−アミノリボシル、３′−フルオロリボシル、３′−メルカプトリボキシル、３′−アルキルチオリボシル、炭素環式、非環式及び他の修飾糖から選択し得る。

また、上記の式Ｉにおいて、塩基としては、ウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、グアニン、７−デアザグアニン、ヒポキサンチン、７−デアザヒポキサンチン、アデニン、７−デアザアデニン、２，６−ジアミノプリン又はそのアナログが挙げられる。

ヌクレオチドの末端リン酸位に結合した酵素活性化可能な標識は、１，２−ジオキセタン化学発光化合物、蛍光発生色素、発色色素、質量タグ、電気化学的タグ又はこれらの組合せから選択し得る。こうして、色、蛍光発光、化学発光又はこれらの組合せのいずれかの存在によって、検出可能な化学種を検出することができる。

酵素活性化可能標識は、検出可能シグナルを生じる追加の化学反応又は酵素反応の基質となる化学基であってもよい。

上記の式Ｉに示すリン酸化標識が蛍光発生部分である場合、望ましくは、以下の具体例（リン酸エステルとして示す。）のいずれかから選択される：ＥＬＦ９７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）という商品名で市販されている２−（５′−クロロ−２′−ホスホリルオキシフェニル）−６−クロロ−４−（３Ｈ）−キナゾリノン、フルオレセイン二リン酸、フルオレセイン３′（６′）−Ｏ−アルキル−６′（３′）−リン酸、９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル）リン酸、４−メチルウンベリフェリルリン酸、レゾルフィンリン酸、４−トリフルオロメチルウンベリフェリルリン酸、ウンベリフェリルリン酸、３−シアノウンベリフェリルリン酸、９，９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イルリン酸、及び６，８−ジフルオロ−４−メチルウンベリフェリルリン酸。これらの色素の構造を以下に示す。

式中、上記の式Ｉに示すリン酸化された標識が発色団である場合、以下の部分（リン酸エステルとして示す。）から選択し得る：５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸、３−インドリルリン酸、ｐ−ニトロフェニルリン酸及びこれらの誘導体。これらの発色色素の構造は以下に示す。

末端リン酸位の部分は化学発光化合物であってもよく、この場合、アルカリホスファターゼ活性化１，２−ジオキセタン化合物であるのが望ましい。１，２−ジオキセタン化合物のリン酸エステルとしては、特に限定されないが、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ（Ｔｒｏｐｉｘ社（米国マサチューセッツ州ベッドフォード））という商品名で市販されている二ナトリウム２−クロロ−５−（４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２′−（５−クロロ−）トリシクロ［３，３，１−１^３，７］−デカン］−１−イル）−１−フェニルリン酸、ＣＳＰＤ（Ｔｒｏｐｉｘ）という商品名で市販されているクロロアダマンタ−２′−イリデンメトキシフェノキシリン酸化ジオキセタン、及びＡＭＰＰＤ（Ｔｒｏｐｉｘ）という商品名で市販されている３−（２′−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３″−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタンが挙げられる。これらの市販のジオキセタン化合物の構造は、それぞれ米国特許第５５８２９８０号、同第５１１２９６０号及び同第４９７８６１４号に開示されており、以下に示す通りである。

本発明のある方法では、非加水分解性プライマーが必要とされる。こうした方法では、３′−５′−エキソヌクレアーゼが存在し、プライマーから３′−ヌクレオチドを除去してプライマーの特異性が奪われかねない。３′−末端ヌクレオチドと最後から２番目のヌクレオチドの間に非加水分解性結合を用いることによってかかる加水分解を阻止することができる。上述の通り、３′→５′エキソヌクレアーゼ活性は、ＤＮＡポリメラーゼ自体に付随するものでもよい。本発明で用いるのに適当なＤＮＡポリメラーゼとしては、特に限定されないが、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノーフラグメント、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、Ａｍｐｌｉｔａｑ ＦＳ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、逆転写酵素及びＴ７ ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。

ヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドプライマーの合成法は特に限定されず、当技術分野で公知の適当な方法を使用すればよい。例えば、本発明の一実施形態では、非加水分解性プライマーは最も３′側のホスホジエステル末端結合でホスホロチオエート化する。プライマーの標的部位にホスホロチオエート結合を導入することによってヌクレアーゼ耐性をもつオリゴヌクレオチドプライマーを化学合成する方法は周知である。一つの方法では、プライマーはホスホルアミダイト法の変法で化学合成し得るが、この方法ではヨウ素水による通常の酸化段階をホスホロチオエート化に適した試薬での酸化処理で置き換えて通常のホスホジエステル結合の代わりにホスホロチオエート結合を導入する。ホスホロチオエート化に適した一つの試薬はＢｅａｕｃａｇｅ試薬（３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキサン）である。この方法を用いれば、最も３′側のホスホジエステル結合を始めとする所定の部位でホスホロチオエート結合をプライマーに導入することができる。

いずれにしても、オリゴヌクレオチドプライマーの３′−末端の近傍にホスホジエステルの代わりにホスホロチオエート結合が存在すると、３′−末端側からのエキソヌクレアーゼの切断に対する耐性をプライマー部分に与える。単一のホスホロチオエート結合の導入だけで、オリゴヌクレオチドプライマーは十分に非加水分解性となる。

緩衝液、ｐＨ及び温度などの反応条件は、十分なハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ、ヌクレアーゼ及びホスファターゼ活性が達成されるように選択すべきである。ハイブリダイゼーションに適した温度はオリゴヌクレオチドプライマーと標的配列との相同性に依存するが、約２０〜約６０℃の範囲にあると予測される。ｐＨ値はＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液などの適当な緩衝液中で約７〜９の範囲であるのが望ましい。

以下の実施例に示す通り、標的核酸サンプルはまずプライマーとマグネシウムを含む緩衝液溶液中で約５分間＞９０℃に加熱して変性させ、次いで適温で十分な時間（通常約１０分間）ハイブリダイズしなければならない。ハイブリダイゼーション段階の直後に、ＤＮＡポリメラーゼ、所望により３′→５′エキソヌクレアーゼ（ＤＮＡポリメラーゼに付随するものでもよい。）、及び基質の存在下でホスファターゼで２０〜７０℃で酵素処理してもよい。

本発明は、ハイブリダイゼーション段階に続いて、１種以上の末端リン酸標識デオキシヌクレオシドポリリン酸、ＤＮＡポリメラーゼ及びホスファターゼを系に加えて、３′−末端塩基が対応鋳型塩基と塩基対を形成するときは、プライマーの３′−末端から順次標的核酸に相補的な一連のヌクレオチドが取込まれるようにし、次いで標的核酸からのシグナルとして作用する検出可能な化学種を検出する。

非修飾プライマーが存在する場合、また別個に非加水分解性プライマーとエキソヌクレアーゼが存在する場合の本発明の実施形態について説明すれば役立つであろう。

プライマーはその３′端で試験すべき特定の塩基と向かい合ってプライマーにハイブリダイズする。ここで、標的配列の例について考察するが、星印を付した塩基が多形を表す。

プライマーは以下の配列を有する。

^３′ＧＴＴＧＧＴＡＧ^５′ （配列番号３）
ハイブリッドは以下のように形成できる。

一つのフォーマットでは、末端リン酸標識デオキシヌクレオシドポリリン酸を、本発明方法のＤＮＡポリメラーゼ反応段階に使用するが、下記に示すように、一方には取込まれるが、他方には取込まれず、取り込まれたヌクレオチドには下線を付した（配列番号４；５′−ＧＡＴＧＧＴＴＧＣＴＡＧ−３′）。

従って、Ｃはホスファターゼ耐性ヌクレオチドアナログの取込みに際し、同時に形成される標識ポリリン酸副生物のホスファターゼ消化に続き形成される検出可能な化学種の存在により、ホスファターゼ消化に際し同定し得る。標的配列中のＴを同定するためには、Ｇの代わりに３′末端にＡ以外同じ配列をもつ異なるプライマーは、検出可能な化学種を産生させる別個の分析に使用し得る。上記例に示すように、複数分子の標識ポリリン酸を生成させる複数ヌクレオチドを加えると、シグナルの増幅に影響する。さらなる増幅は熱サイクリングにより達成し得る。従って、プライマーの伸長後、サンプルを加熱して二本のＤＮＡ鎖に分離し、次いで冷却してもう一つのプライマーを標的にアニールさせる；次いで、これを伸長させ、さらにシグナルを生成させる。

交互のフォーマットは等温条件下にシグナルを増幅する異なる手段を提供する。この事例において、使用されるプライマーは３′−末端ヌクレオチドと末端前ヌクレオチドとの間に非加水分解性結合をもつ（図６）。伸長はポリメラーゼにより実施し、１個以上のヌクレオチドを付加し、伸長後（部分的又は完全）、二本鎖３′−エキソヌクレアーゼが新たに付加したヌクレオチドを切断して、当初のプライマー鋳型を再生する。結合事象ごとに数個のヌクレオチドを付加する前進型ポリメラーゼを使用することが好ましい。このフォーマットにおいて、プライマーの選択は、鋳型の３′末端が一本鎖のままとし、二本鎖３′−エキソヌクレアーゼ用の基質とならないようにしなければならない。ヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドによるＴｄＴ触媒３′−キャッピングなど、当技術分野で公知の他の鋳型保護手段もある。

上記図式において、５′−ＧＡＴＣＴＡＧＣＡＡＣＣＡＴＣＡＧＴＡＣ−３′は配列番号５であり、５′−ＧＡＴＣＴＡＧＴＡＡＣＣＡＴＣＡＧＴＡＣ−３′は配列番号６であり、５′−ＧＡＴＧＧＴＴＧｓ−３′は配列番号７であり、また５′−ＧＡＴＧＧＴＴＧｓＣＴＡＧ−３′は配列番号８である。

以下の実施例で幾つかの好ましい実施形態を例示するが、あらゆる実施形態を例示するものではない。

実施例１
δ−９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル）−チミジン−５′−四リン酸（ｄＴ４Ｐ−ＤＤＡＯ）及び色素結合四リン酸の調製
ＴＴＰ ＴＥＡ塩１０μモルを蒸発乾固した。残渣にトリブチルアミン４０μモル及び乾燥ピリジン５ｍｌを添加した。この溶液を再度蒸発乾固した。乾燥ジメチルホルムアミド３ｍｌで２回、共蒸発した後、残渣を乾燥ＤＭＦ２００μｌに再溶解し、アルゴンを流し込み、栓をした。シリンジを用いて、乾燥ＤＭＦ１００μｌに溶かしたカルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）５０μモル（８ｍｇ）を添加した。フラスコを外界温度で４時間撹拌した。

上記の反応を進行させながら、３５ｍｇ（８３μモル）のＤＤＡＯリン酸及び１６６μモルのトリブチルアミンを乾燥ＤＭＦに溶かした。ＤＤＡＯリン酸を蒸発乾固し、次いで乾燥ＤＭＦで３回、共蒸発させた。残渣を乾燥ＤＭＦ３００μｌに溶解した。

４時間反応した後、無水メタノール３．２μｌをＴＴＰ−ＣＤＩ反応液に加えた。反応液を３０分撹拌した。この混合物にＤＤＡＯリン酸溶液を加え、混合物を外界温度で１８時間撹拌した。反応は逆相ＨＰＬＣ（Ｘテラ（Ｘｔｅｒｒａ）４．６×１００カラム、０．１Ｍ−ＴＥＡＡ／アセトニトリル）でチェックした。反応容積を蒸発により２００μｌまで減少させ、反応は８０時間進行させた。

８０時間後、０．１Ｍ−ＴＥＡＢ１５ｍｌを添加して反応を停止した。希釈混合物を１９×１００ＸテラＲＰカラムに負荷し、０．１Ｍ−ＴＥＡＢ中アセトニトリル勾配で溶出した。純ｄＴ４Ｐ−ＤＤＡＯを含むフラクションを蒸発乾固し、エタノールで２回、共蒸発させた。残渣をミリＱ水で再構成した。収量：１．１０μモル（１１％）；ＨＰＬＣ純度＞９８％（４５５ｎｍにて）；ＭＳ：Ｍ−１＝８５０．０７（計算値：８４９．９５）。

δ−９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル）−デオキシグアノシン−５′−四リン酸（ｄＧ４Ｐ−ＤＤＡＯ）、δ−９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル）−デオキシシチジン−５′−四リン酸（ｄＣ４Ｐ−ＤＤＡＯ）、及びδ−９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル）−デオキシアデノシン−５′−四リン酸（ｄＡ４Ｐ−ＤＤＡＯ）は上記同様の方法で調製した；ただし、ＤＤＡＯは８．３当量の代わりに３．５当量使用した。Ｃ１８精製後、サンプルをモノＱ１０／１０カラムによるイオン交換により精製した。

δ−９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル）−デオキシグアノシン−５′−四リン酸（ｄＧ４Ｐ−ＤＤＡＯ）：収量：０．５７μモル（５．７％）；ＨＰＬＣ純度９９％（４５５ｎｍにて）；ＭＳ：Ｍ−１＝８７５．０３（計算値：８７４．９６）。

δ−９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル）−デオキシシチジン−５′−四リン酸（ｄＣ４Ｐ−ＤＤＡＯ）：収量：０．２４μモル（２．４％）；ＨＰＬＣ純度９９％（４５５ｎｍにて）；ＭＳ：Ｍ−１＝８３５．０３（計算値：８３４．９５）。

δ−９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル）−デオキシアデノシン−５′−四リン酸（ｄＡ４Ｐ−ＤＤＡＯ）：収量：０．３８μモル（３．８％）；ＨＰＬＣ純度９９％（４５５ｎｍにて）；ＭＳ：Ｍ−１＝８５９．０７（計算値：８５８．９７）。

他の末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸の合成は、上記のＤＤＡＯ−結合四リン酸の合成と本質的に同じ方法で実施した。他の合成した色素−結合四リン酸は以下の色素による：メチルクマリン、レゾルフィン、及びエチルフルオレセイン。

実施例２
対立遺伝子特異的プライマー及び末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸の識別
以下のプライマー及び鋳型を実施例２、３及び４で使用した。
プライマー：
５′−ＧＴＴ ＣＴＣ ＧＧＣ ＡＴＣ ＡＣＣ ＡＴＣ ＣＧ（ｓ）Ｔ−３′（配列番号９）
５′−ＧＴＴ ＣＴＣ ＧＧＣ ＡＴＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＣＧ（ｓ）Ｔ−３′（配列番号１０）
５′−ＧＴＴ ＣＴＣ ＧＧＣ ＡＴＣ ＡＣＣ ＡＴＣ ＧＧ（ｓ）Ｔ−３′（配列番号１１）
鋳型：
５′−ＣＡＣ ＣＣＴ ＴＡＴ ＣＴＧ ＧＴＴ ＧＴＣ ＧＡＣ ＧＧＡ ＴＧＧ ＴＧＡ ＴＧＣ ＣＧＡ ＧＡＡ Ｃ−３′（＃１，配列番号１２）
５′−ＣＡＣ ＣＣＴ ＴＡＴ ＣＴＧ ＧＴＴ ＧＴＣ ＧＧＣ ＧＧＡ ＴＧＧ ＴＧＡ ＴＧＣ ＣＧＡ ＧＡＡ Ｃ−３′（＃２，配列番号１３）
５′−ＣＡＣ ＣＣＴ ＴＡＴ ＣＴＧ ＧＴＴ ＧＴＣ ＧＣＣ ＧＧＡ ＴＧＧ ＴＧＡ ＴＧＣ ＣＧＡ ＧＡＡ Ｃ−３′（＃３，配列番号１４）
５′−ＣＡＣ ＣＣＴ ＴＡＴ ＣＴＧ ＧＴＴ ＧＴＣ ＧＴＣ ＧＧＡ ＴＧＧ ＴＧＡ ＴＧＣ ＣＧＡ ＧＡＡ Ｃ−３′（＃４，配列番号１５）
反応は実施例（１）のデオキシヌクレオチドを用いて、室温（２３℃）で構築した。反応液は、異なる２種のオリゴヌクレオチドの一方にアニールする単一のオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号９で示される）を有するプライマー鋳型の組合せを含んでいた；２種の鋳型はプライマーの３′末端ヌクレオチドの反対側の多形部位にｄＡ又はｄＧのいずれかを有し、それぞれ鋳型＃１及び鋳型＃２に相当するものである。

ここで図３に言及すると、本実施例の鋳型＃１に対して、ＤＮＡポリメラーゼは標識したｄＮＴＰでプライマーを伸長することが期待され、一方、図３の鋳型＃２については、ＤＮＡポリメラーゼがプライマーを伸長することが期待されない。

反応条件：反応液７０μｌが２５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ−ＮａＣｌ、０．１２５ｍＭ−ＭｇＣｌ_２，０．５ｍＭ−ＭｎＣｌ_２、０．０１％トゥイーン−２０、０．２５単位のエビ・アルカリホスファターゼ、５０ｎＭの鋳型にアニールするプライマー、及び１μＭの各ｄＮＴＰ−ＤＤＡＯを含み、ＬＳ−５５発光分光計（パーキン・エルマー）中の石英蛍光超マイクロキュベットに容れ、時間推進モードで操作した。励起及び発光波長はそれぞれ６２０ｎｍ及び６５５ｎｍとする。スリット幅は、励起スリットが５ｎｍ、発光スリットが１５ｎｍであった。反応は９単位のＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅの添加により開始した。

図３に示すように、色素発光はプライマーについてのみ検出した；鋳型１については、プライマーの３′−末端塩基が対応する鋳型塩基と塩基対を形成した。ホスホリル転移のピロリン酸生成物のエビ・アルカリホスファターゼによる開裂が、核酸の検出を可能とするＤＤＡＯ標識に検出可能な変化を生じる。プライマー：鋳型２については検出可能な色素発行が得られなかった。

実施例３
対立遺伝子特異的プライマーと末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸を用いる対立遺伝子の識別：内部ミスマッチの影響
図４ａについて、配列番号９の配列をもつプライマー及び３′末端に正しい又は間違った塩基をもつ鋳型＃１又は鋳型＃２を使用した。図４ｂについて、３′末端から３塩基離れて内部ミスマッチをもつ配列番号１０のプライマー及び３′末端に正しい又は間違った塩基をもつ鋳型＃１又は鋳型＃２を使用した。図７は本発明の実施例３に使用したアニールしたプライマー／鋳型対を示す模式図である。

実験は実施例２に報告した本質的に同じ方法で実施した。結果を図４に示す。明らかなことは、内部ミスマッチがバックグランド比で約１０倍シグナルを増強することである。

実施例４
対立遺伝子特異的プライマーと末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸を用いるＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼによる対立遺伝子の識別
プライマーの３′末端に正しい又は間違った塩基をもち、同時に内部ミスマッチをもつ実施例２及び３に報告した実験を、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅの代わりにＰｈｉ２９Ｄ１２ＡＤＮＡポリメラーゼを使用して繰返した。

Ｓｅｑｕｅｎａｓｅに比較して、Ｐｈｉ２９Ｄ１２ＡＤＮＡポリメラーゼは末端のマッチとミスマッチ間の識別性が低くいが、内部ミスマッチが存在すると、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼの識別能力が増強される（図５）。

以上、本発明の特定の望ましい実施形態について記載してきたが、本発明の技術的範囲から逸脱せずに変更を加えることができる。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲に記載される。

本発明において鋳型との塩基対形成に有用な対立遺伝子特異的プライマーの図解である。２本の横線をつなぐ縦線はマッチ塩基対を表す。 本発明方法の一実施形態であって、標的ポリヌクレオチドに相補的な配列の末端リン酸標識ヌクレオチドを、非加水分解性マッチプライマーに配列特異的に結合させ、次いで新たに付加したヌクレオチドを３′−エキソヌクレアーゼでの消化によって開裂するとともに、標識ポリリン酸からリン酸基の加水分解後に標識種を生成する実施形態を示す。３′末端ミスマッチプライマーは伸長しない。 蛍光発生色素で末端リン酸を標識したヌクレオチドをＤＮＡポリメラーゼであるＳｅｑｕｅｎａｓｅで取込んだ後、シグナルの発生にホスファターゼを用いて得た時間と蛍光発光の関係を示すグラフ。マッチプライマーは、ミスマッチプライマーに比して、蛍光の急激な上昇及び非常に高いシグナルを示す。 蛍光発生色素で末端リン酸を標識したヌクレオチドをＤＮＡポリメラーゼであるＳｅｑｕｅｎａｓｅで取込んだ後、シグナルの発生にホスファターゼを用いて得た時間と蛍光発光の関係を示すグラフ。マッチプライマーは、ミスマッチプライマーに比して、蛍光の急激な上昇及び非常に高いシグナルを示す。 蛍光発生色素で末端リン酸を標識したヌクレオチドをＰｈｉ２９ Ｄ１２Ａ ＤＮＡポリメラーゼで取込んだ後、シグナルの発生にホスファターゼを用いて得た時間と蛍光発光の関係を示すグラフ。内部ミスマッチを有するマッチプライマーは、ミスマッチプライマーに比して、蛍光の急激な上昇及び非常に高いシグナルを示す。 ３′−末端ヌクレオチドと最後から２番目のヌクレオチドの間に非加水分解性結合を有するプライマーを用いた核酸配列の特性決定法を示す。 本発明の実施例３で使用したプライマー／鋳型のアニール対を示す図。

Claims (28)

1. 鋳型核酸の特性決定法であって、
   （ａ）鋳型核酸、対立遺伝子特異的プライマー、１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド及びＤＮＡポリメラーゼを反応させて標識ポリリン酸を生成させる段階、
   （ｂ）標識ポリリン酸を検出する段階、及び
   （ｃ）鋳型核酸を特性決定する段階、
   を含む方法。
2. 前記検出段階が、（ａ）標識ポリリン酸をホスファターゼと混合して検出可能な化学種を生成させる段階と（ｂ）検出可能な化学種を検出する段階を含む、請求項１記載の方法。
3. 前記反応段階と混合段階を同時に実施する、請求項２記載の方法。
4. 前記検出可能な化学種が、色、蛍光発光、化学発光、質量変化、酸化還元電位及びこれらの組合せからなる群から選択される特性によって検出可能である、請求項２記載の方法。
5. 前記対立遺伝子特異的プライマーがヌクレアーゼ耐性であり、前記反応段階における反応がさらに３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を含む、請求項１記載の方法。
6. 前記ヌクレアーゼ耐性プライマーが３′末端ホスホジエステル結合にホスホン酸メチル、ボラノホスフェート又はホスホロチオエートを有する、請求項５記載の方法。
7. さらに、標識ポリリン酸エステルの生成量から鋳型核酸の量を計算する段階を含む、請求項１記載の方法。
8. 前記標識ポリリン酸とは検出性の異なる１種以上の追加の検出試薬を前記反応段階の反応に添加する、請求項１記載の方法。
9. 前記反応段階の反応が２種以上の末端リン酸標識ヌクレオチドを含む、請求項１記載の方法。
10. 前記２種以上の末端リン酸標識ヌクレオチドが、化学発光化合物、蛍光発生色素、発色色素、質量タグ、電気化学的タグ及びこれらの組合せからなる群から選択される酵素活性化可能標識を含む、請求項９記載の方法。
11. 前記対立遺伝子特異的プライマーが３′末端塩基から１、２又は３個目の塩基にミスマッチを有する、請求項１記載の方法。
12. 前記末端リン酸標識ヌクレオチドがポリリン酸鎖に４個以上のリン酸基を含む、請求項１記載の方法。
13. 前記ＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡポリメラーゼＩのクレノーフラグメント、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ａｍｐｌｉｔａｑ ＦＳ、逆転写酵素及びＴ７ ＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択される、請求項１記載の方法。
14. 前記ＤＮＡポリメラーゼが３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を有し、前記対立遺伝子特異的プライマーがヌクレアーゼ耐性である、請求項１記載の方法。
15. 前記鋳型核酸が対立遺伝子特異的プライマーの３′塩基に相補的な位置で多形であり、標識ポリリン酸の存在によって上記位置での鋳型核酸のヌクレオチド塩基の同一性が明らかとなる、請求項１記載の方法。
16. 前記末端リン酸標識ヌクレオチドが次式で表される、請求項１記載の方法。
    

    

    式中、Ｐはリン酸（ＰＯ_３）及びその誘導体であり、ｎは２以上であり、Ｙは酸素又はイオウ原子であり、Ｂは含窒素複素環式塩基であり、Ｓは非環式部分、炭素環式部分又は糖部分であり、Ｌは、天然又は修飾ヌクレオチドの末端リン酸でのリン酸エステル、チオエステル又はホスホルアミデート結合の形成に適したヒドロキシル基、スルフヒドリル基又はアミノ基を含有する酵素活性化可能標識である。
17. 前記糖部分が、リボシル、２′−デオキシリボシル、３′−デオキシリボシル、２′，３′−ジデオキシリボシル、２′，３′−ジデヒドロジデオキシリボシル、２′−アルコキシリボシル、２′−アジドリボシル、２′−アミノリボシル、２′−フルオロリボシル、２′−メルカプトリボシル、２′−アルキルチオリボシル、３′−アルコキシリボシル、３′−アジドリボシル、３′−アミノリボシル、３′−フルオロリボシル、３′−メルカプトリボシル、３′−アルキルチオリボシル、炭素環式、非環式及び他の修飾糖からなる群から選択される、請求項１６記載の方法。
18. 前記塩基が、ウラシル、チミン、シトシン、グアニン、７−デアザグアニン、ヒポキサンチン、７−デアザヒポキサンチン、アデニン、７−デアザアデニン、２，６−ジアミノプリン及びそのアナログからなる群から選択される、請求項１６記載の方法。
19. 前記酵素活性化可能標識が、化学発光化合物、蛍光発生色素、発色色素、質量タグ、電気化学的タグ及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１６記載の方法。
20. 前記酵素活性化可能標識が、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸、３−インドキシルリン酸、ｐ−ニトロフェニルリン酸及びこれらの誘導体からなる群から選択される発色団である、請求項１９記載の方法。
21. 前記酵素活性化可能標識が、２−（５′−クロロ−２′−ホスホリルオキシフェニル）−６−クロロ−４−（３Ｈ）−キナゾリノン、フルオレセイン二リン酸、フルオレセイン３′（６′）−Ｏ−アルキル−６′（３′）−リン酸、９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル）リン酸、４−メチルウンベリフェリルリン酸、レゾルフィンリン酸、４−トリフルオロメチルウンベリフェリルリン酸、ウンベリフェリルリン酸、３−シアノウンベリフェリルリン酸、９，９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イルリン酸、６，８−ジフルオロ−４−メチルウンベリフェリルリン酸及びこれらの誘導体からなる群から選択されるリン酸化標識及び蛍光発生部分である請求項１９記載の方法。
22. 前記標識がアルカリホスファターゼ活性化１，２−ジオキセタン化合物である、請求項１９記載の方法。
23. 前記１，２−ジオキセタン化合物が２−クロロ−５−（４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２′−（５−クロロ−）トリシクロ［３，３，１−１^３，７］−デカン］−１−イル）−１−フェニルリン酸、クロロアダマンタ−２′−イリデンメトキシフェノキシリン酸化ジオキセタン、３−（２′−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３″−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン及びこれらの誘導体からなる群から選択される請求項２２記載の方法。
24. 標的核酸鎖における特定ヌクレオチド塩基の多形を検出するキットであって、
    （ａ）１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、
    （ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ、及び
    （ｃ）ホスファターゼ
    を含むキット。
25. ＤＮＡを３′→５′方向に分解するのに十分な酵素活性を有するヌクレアーゼをさらに含む、請求項２４記載のキット。
26. 前記標的ポリヌクレオチドの少なくとも一部と相補的な配列を有するヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドプライマーをさらに含む、請求項２４記載のキット。
27. 前記ＤＮＡポリメラーゼが３′→５′方向にＤＮＡを分解するのに十分なヌクレアーゼ活性を有する、請求項２４記載のキット。
28. 前記反応段階で複数サイクルの核酸ポリメラーゼ反応を実施し、各サイクルの最後に鋳型核酸から反応生成物を熱的に分離する、請求項１記載の方法。

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