JPWO2020085165A1 - 標的物質の分離方法および定量方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、標的物質の種類（電荷）にかかわらず、標的物質を分離できる手段を提供する。本発明の標的物質の分離方法は、標的物質を含むサンプルおよび前記標的物質の部位を特異的に認識する第１レセプターが固定された磁性粒子を用いて標的物質−磁性粒子の複合体を形成し、前記標的物質−磁性粒子の複合体を磁気および電気泳動により分離することを有する。

Description

本開示は、標的物質の分離方法および定量方法に関する。
生体内に存在するペプチドの中には疾患により存在量が変化するものがあり、これらのペプチドは特定の疾患のマーカーになりうる。例えば、糖尿病は、インスリンの作用の低下や分泌不足により、血液中のグルコースレベル（血糖値）が高い状態になる病気である。高い血糖値が長時間にわたって持続すると、腎臓、網膜、末梢神経に障害を与えたり、血管に障害を及ぼし、動脈硬化を助長して心筋梗塞や脳梗塞の危険因子となる。このため、糖尿病の診断、予防および治療には、血糖値や、糖尿病に関わる因子の血中成分濃度を把握することが重要である。例えば、特開２０１４−１４５６８０号公報には、分子量の大きな２種のレセプターを用いて標的物質（例えば、プロインスリンの構成物質である血中Ｃ−ペプチド）とレセプターとの複合体を形成し、電気泳動での分子量差により複合体と遊離レセプターとを分離する方法が報告されている。
レセプターとして好ましいタンパク質は、所定の電荷を有する。しかし、レセプターと、標的物質との電荷や分子量の大小関係によっては、特開２０１４−１４５６８０号公報に記載の方法によってでも、複合体とレセプターとを明確に分離することは困難である場合がある。
したがって、本開示は、上記事情を鑑みてなされたものであり、標的物質を分離できる手段を提供することを目的とする。
本発明者は、上記課題を解決すべく、鋭意研究を行った。その結果、電気泳動と磁気による分離とを組み合わせることにより上記課題を解決できることを見出した。すなわち、上記目的は、標的物質を含むサンプルおよび前記標的物質の部位を特異的に認識する第１レセプターが固定された磁性粒子を用いて標的物質−磁性粒子の複合体を形成し、前記標的物質−磁性粒子の複合体を磁気および電気泳動により分離することを有する、標的物質の分離方法によって達成できる。
図１ＡおよびＢは、本開示の方法を説明するための工程図である。図１Ａおよび図１Ｂ中、２，３は電極を；４は試薬を；５は電気泳動基材を；６は基板を；７は標的物質を含むサンプルを；および８は磁石を、それぞれ、示す。 図１ＣおよびＤは、本開示の方法を説明するための工程図である。図１ＣおよびＤ中、２，３は電極を；５は電気泳動基材を；６は基板を；８は磁石；および９は標的物質−磁性粒子−標識物質の複合体を、それぞれ、示す。 図２Ａは、実施例（泳動溶液充填ガラス四角管の作製）における磁気による回収前のガラス四角管の写真である。図２Ｂは、実施例（泳動溶液充填ガラス四角管の作製）における磁気による回収後のガラス四角管の写真である。 図３は、実施例（電気泳動）で使用した電気泳動装置の写真である。 図４は、実施例（電気泳動）において電気泳動前後に蛍光スキャナーで測定した際のガラス四角管の写真である。 図５は、実施例においてＨ−ＦＡＢＰの終濃度に対する蛍光強度の関係を表す図である。
以下、本開示の実施の形態を説明する。なお、本開示は、以下の実施の形態のみには限定されない。
本開示の第１の形態は、標的物質を含むサンプルおよび前記標的物質の部位を特異的に認識する第１レセプターが固定された磁性粒子を用いて標的物質−磁性粒子の複合体を形成し、前記標的物質−磁性粒子の複合体を磁気および電気泳動により分離することを有する、標的物質の分離方法である。当該形態によれば、標的物質の種類（例えば、電荷、分子量）によらず、標的物質を分離できる。また、当該形態によれば、検出し難い標的物質を分離できる。
本開示の第２の形態は、標的物質を含むサンプルと、前記標的物質の部位を特異的に認識する第１レセプターが固定された磁性粒子と、前記標的物質の部位とは異なる部位を特異的に認識する第２レセプターが固定された標識物質と、を混合して、標的物質−磁性粒子−標識物質の複合体を含む混合物を得、磁気および電気泳動により前記標的物質−磁性粒子−標識物質の複合体を分離した後、前記標的物質−磁性粒子−標識物質の複合体のシグナル強度を検出することを有する、標的物質量の測定方法である。当該形態によれば、標的物質の種類（例えば、電荷、分子量）によらず、標的物質量を高精度に測定できる。また、当該形態によれば、検出し難い標的物質であっても、標的物質量を高精度に測定できる。
本明細書において、「標的物質の部位を特異的に認識する第１レセプター」を単に「第１レセプター」とも称する。また、「標的物質の部位を特異的に認識する第１レセプターが固定された磁性粒子」を単に「第１レセプター固定磁性粒子」または「本開示に係る磁性粒子」とも称する。「標的物質の部位とは異なる部位を特異的に認識する第２レセプター」とは、第２レセプターは第１レセプターが認識する標的物質の部位とは異なる部位を特異的に認識することを意味し、単に「第２レセプター」とも称する。また、「標的物質の部位とは異なる部位を特異的に認識する第２レセプターが固定された標識物質」を単に「第２レセプター固定標識物質」または「本開示に係る標識物質」とも称する。
本明細書において、範囲を示す「Ｘ〜Ｙ」は、ＸおよびＹを含み、「Ｘ以上Ｙ以下」を意味する。また、特記しない限り、操作および物性等の測定は室温（２０〜２５℃）／相対湿度４０〜５０％ＲＨの条件で行ったが、この条件に限られるものではない。
＜標的物質の分離方法（本開示の第１の形態）＞
本開示の第１の形態は、標的物質を含むサンプルおよび前記標的物質の部位を特異的に認識する第１レセプターが固定された磁性粒子を用いて標的物質−磁性粒子の複合体を形成し、前記標的物質−磁性粒子の複合体を磁気および電気泳動により分離することを有する、標的物質の分離方法である。
本開示の方法によると、第１レセプターを介して標的物質と磁性粒子との複合体（標的物質−磁性粒子の複合体）を形成する。磁気によってこの複合体に含まれる磁性粒子を所定の位置で捕捉する。このため、複合体を磁気で捕捉しながらまたは捕捉した後に、電気泳動を行うと、複合体は磁気により所定の位置に固定されたまま移動しない。しかし、複合体以外の成分（例えば、血球等の生体由来の成分）は移動するまたは移動しない。したがって、標的物質（標的物質−磁性粒子の複合体）を選択的に分離・回収できる。本開示の方法は磁性粒子を用いて目的とする標的物質を回収する方法であるため、標的物質の種類（例えば、電荷、等電点や分子量）によらずに、標的物質を効率よく分離できる。
以下、本開示の第１の形態を説明する。
（標的物質を含むサンプル）
標的物質は、目的（診断しようとする疾患の種類）に応じて、適宜選択される。このため、標的物質としては、特に限定されない。具体的には、インスリン、インスリン前駆体（例えば、Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ）、ＧＬＰ−１（グルカゴン様ペプチド−１）、ＧＩＰ（グルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド）、アディポネクチン、Ｈ−ＦＡＢＰ（心筋型脂肪酸結合タンパク質）、ミオグロビン、トロポニンＩ、トロポニンＴ、ＢＮＰ（脳性ナトリウム利尿ペプチド）、ＮＴ−ＰｒｏＢＮＰ（Ｎ末端プロ脳性ナトリウム利尿ペプチド）、脂肪酸結合タンパク質等のタンパク質、ペプチド、糖鎖、核酸、低分子化合物、高分子化合物ならびにこれらの複合体などが挙げられる。中でも、有益性や凡用性などの観点から、標的物質は、タンパク質またはペプチドであることが好ましく、血液や尿などの体液の検査に使用されるタンパク質やペプチド（例えば、インスリン、Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅなど）がより好ましい。なお、上記タンパク質またはペプチドは、遊離体、リン酸基、メチル基、アセチル基、糖鎖、脂質、ニトリル基等の修飾を受けた修飾体、酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩）などとの塩、核酸と結合している核タンパク質など他の物質と結合しているタンパク質またはペプチドを包含する。また、上記タンパク質は、天然由来であっても合成物であってもよい。本明細書において、「タンパク質」は、１０ｋＤａ以上のポリペプチドを意味し、ペプチドは１０ｋＤａ未満のポリペプチドを意味する。
標的物質を含むサンプルは、上記したような所望の標的物質を含むものであれば特に制限されない。具体的には、被検試料（血液、血漿、血清、組織、関節液、尿、リンパ液等）、細胞（培養細胞、細胞株等）、その培養上清、それらの抽出物、それらの部分精製画分などが挙げられる。ここで、被検試料の由来も特に制限されず、ヒトまたはヒト以外の哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ハムスター、モルモット等の齧歯類；ヒツジ、ブタ、ウシやウマ等の家畜；ウサギ、ネコ、イヌ等のペット；アカゲザル、ミドリザル、カニクイザル、チンパンジー等の霊長類）由来のいずれであってもよい。また、各種環境の土壌、水等などの検体または上記検体からの抽出物を使用してもよい。これらのうち、有益性（例えば、診断目的）などを考慮すると、標的物質を含むサンプルは、被検試料が好ましく、血液（例えば、全血、血漿、血清など）、間質液および尿がより好ましい。すなわち、本開示の好ましい形態によると、サンプルは、血液、間質液および尿からなる群より選択される。
なお、標的物質は精製（抽出）せずに、上記被検試料をそのままサンプルとして用いても、または精製（抽出）した後使用してもよい。例えば、被検者の血液、血漿、血清、組織、関節液、尿、リンパ液等の生体成分等の被検試料を用いてもよい。この際、被検試料に対して、希釈、精製等の処理を行ってもよい。または、標的物質は、公知のタンパク質の精製方法を用いて精製することにより、調製されてもよい。具体的には、例えば、哺乳動物の組織または細胞を、適切なバッファーの存在下でホモジナイズし、得られる組織の粗抽出物画分を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー等に付すことにより、精製されうる。または、標的物質は市販品であってもよい。
（標的物質の部位を特異的に認識する第１レセプターが固定された磁性粒子）
本開示に係る磁性粒子（第１レセプター固定磁性粒子）は、標的物質の部位を特異的に認識する第１レセプターが（例えば、表面に）固定されてなる。
本明細書において、「レセプター」とは、標的物質と特異的に結合することができる物質を指す。なお、レセプターは、電気泳動中（例えば、電気泳動緩衝液中で）標的物質に対する結合活性を維持している。本開示において、第１レセプターは標的物質のある部位（部位１）を特異的に認識する。また、第２レセプターは第１レセプターが認識する標的物質の部位（部位１）とは異なる標的物質の部位（部位２）を特異的に認識する。
レセプターとしては、特に制限されず、例えば、抗体、標的物質との結合活性を有する抗体の断片（抗体フラグメント）、ＤＮＡアプタマー等の核酸、タンパク質、タンパク質で構成された受容体、バインディングプロテイン、ペプチド、生体レセプター、化学合成レセプター、糖鎖などが挙げられる。これらのうち、標的物質との特異的結合性が高い点などから、抗体または、抗体の断片をレセプターとして用いることが好ましい。第１レセプターは、標的物質の特定の配列から成る構造単位（エピトープ）（エピトープ１）を認識する抗体または抗体の断片であることが好ましい。また、第２レセプターはエピトープ１とは異なるエピトープ（エピトープ２）を認識する抗体または抗体の断片であることが好ましい。あるいは、第２レセプターは、第１レセプターを特異的に認識するレセプター（リガンドの場合を含む）であってもよい。
抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、一本鎖抗体、改変抗体（例えば抗原認識部位のみヒト化した「ヒト化抗体」など）、キメラ抗体、２つのエピトープを同時に認識することができる二機能性抗体などが挙げられる。抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭなど、いずれのクラスのものであってもよい。エピトープへの特異的結合性の観点からはモノクローナル抗体を用いることが好ましく、ＩｇＧモノクローナル抗体を用いることがより好ましい。
抗体の断片（フラグメント）としては、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ミニボディー、ダイアボディー等の遺伝子工学的に作製されたコンジュゲート分子、あるいはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等のタンパク質安定化作用を有する分子等で修飾されたそれらの誘導体等が挙げられる。レセプターは、抗体を種々のプロテアーゼで処理したものでもよいし、目的に応じて任意の標識（タグ）を付けたものでもよい。
標的物質と結合するレセプターの製造は従来公知の方法により作製することができる。例えば、モノクローナル抗体は次の手順で作製することができる。まず、抗原を、動物の抗原の投与により抗体産生が可能な部位に、それ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与する。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。用いられる動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギなどの哺乳動物が挙げられる。抗血清中の抗体価の測定は常法により行うことができる。抗原を免疫された動物から抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。融合操作は既知の方法、例えば、Nature 256:495(1975)記載の方法に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などが挙げられる。骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０などが挙げられる。モノクローナル抗体の選別は、公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができるが、通常はＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地などで行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いてもよい。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。モノクローナル抗体の分離精製は、通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様の、例えば塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例えば、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相またはプロテインＡもしくはプロテインＧ、抗原アフィニティ精製などを用いた特異的精製法による免疫グロブリンの分離精製法に従って行うことができる。
また、ポリクローナル抗体は、例えば次の手順で作製することができる。ポリクローナル抗体は、例えば、エピトープを含むペプチド等を抗原とし、キャリアーとの複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に哺乳動物に免疫を行ない、該免疫動物から活性型ハプトグロビンに対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造されうる。抗原とキャリアーとの複合体を形成する際に、キャリアーの種類および抗原とキャリアーとの混合比は、キャリアーに架橋させた抗原に対して抗体が効率良く製造できれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよい。キャリアーとしては、例えば、ウシ血清アルブミン、ウシサイログロブリン、キーホール・リンペット・ヘモシアニン等が用いられる。また、抗原とキャリアーとのカップリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオピリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。抗原とキャリアーとの複合体は、免疫される動物の抗体産生が可能な部位に、それ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なうことができる。用いられる動物としては、モノクローナル抗体作製の場合と同様の哺乳動物が挙げられる。ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の手順で行なうことができる。
抗体は市販品を用いてもよい。例えば、インスリンが標的物質である場合には、Monoclonal mouse anti-human（C7C9）、Monoclonal mouse anti-human（D4B8）、Monoclonal mouse anti-human（7F8）、Monoclonal mouse anti-human（3A6）、Monoclonal mouse anti-human（8E2）、Monoclonal mouse anti-human（7F5）（いずれも、Ｈｙｔｅｓｔ製）などが挙げられる。また、例えば、脂肪酸結合タンパク質が標的物質である場合には、Monoclonal mouse anti-human fatty acid binding protein (28)やMonoclonal mouse anti-human fatty acid binding protein (25)、Monoclonal mouse anti-human fatty acid binding protein (5B5)、Monoclonal mouse anti-human fatty acid binding protein (9F3)、Monoclonal mouse anti-human fatty acid binding protein (10E1)、Monoclonal mouse anti-human fatty acid binding protein (22)、Monoclonal mouse anti-human fatty acid binding protein (30)（いずれも、Ｈｙｔｅｓｔ製）などが挙げられる。さらに、例えば、Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅが標的物質である場合には、Monoclonal mouse anti human C-peptide(7E10)（ａｂｃａｍ社製）、Anti C-peptide antibody(5B8)(Mouse monoclonal（ａｂｃａｍ社製））、Anti C-peptide antibody(2B7)(Mouse monoclonal（ａｂｃａｍ社製）、Anti C-peptide antibody(2A11)（Mouse monoclonal（ａｂｎｏｖａ社製））と、Anti-h C-peptide 9101 SPTN-5（Mouse monoclonal（Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製））のいずれかから選ばれるモノクローナル抗体とAnti-h C-peptide 9103 SPRN-5（Mouse monoclonal（Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製））との組み合わせ、あるいは、Anti C-peptide antibody(2A11)（Mouse monoclonal（ａｂｎｏｖａ社製））とAnti C-peptide antibody(4H8)（Mouse monoclonal（ａｂｃａｍ社製））、Anti C-peptide antibody(4H8)（Mouse monoclonal（ａｂｃａｍ社製））とAnti C-peptide antibody(5B8)（Mouse monoclonal（ａｂｃａｍ社製））等との組み合わせなどが挙げられる。
磁性粒子（第１レセプターが固定される前の磁性粒子）は、磁性を有するものであれば特に制限されない。例えば、磁性粒子は、式：ＭＦｅ２Ｏ４（Ｍ＝Ｃｏ、Ｍｎ、Ｎｉ、Ｍｇ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｌｉ０．５Ｆｅ０．５等）で表わされるフェライト、マグヘマイト（γ−Ｆｅ２Ｏ３）、マグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）、ニッケル亜鉛フェライト（Ｎｉ１−ＸＺｎＸＦｅ２Ｏ４）およびマンガン亜鉛フェライト（Ｍｎ１−ｘＺｎＸＦｅ２Ｏ４）、鉄、マンガン、ニッケル、コバルト、クロムなどの金属や、コバルト、ニッケル、マンガンなどの合金等の磁性材料から構成される。これらのうち、高い飽和磁化及び低い残留磁化の点から、γ−Ｆｅ２Ｏ３、Ｆｅ３Ｏ４が好ましい。また、磁性粒子の平均粒径サイズ（一次粒径）は、特に制限されず、電気泳動条件（例えば、電気泳動基材の内径、泳動バッファーとの相性）などに応じて適宜選択できる。電気泳動中の移動性、分散性や十分な磁力などの観点から、磁性粒子の平均粒径サイズ（一次粒径（直径））は、好ましくは５０ｎｍ〜２０μｍ、より好ましくは１００ｎｍ〜１０μｍ、特に好ましくは１〜５μｍである。なお、「粒径サイズ」とは、磁性粒子の輪郭線上の任意の２点間の距離のうち、最大の距離を意味する。また、本明細書において、「平均粒径サイズ」とは、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）や光学顕微鏡による写真において３００個以上の粒子を抽出し、これらの粒子の直径を測定し、その数平均として算出した値である。
また、磁性粒子は、ポリマーなどで表面が被覆されてもよい。ここで、ポリマーとしては、特に制限されず、生化学分野（例えば、担体、ポリマービーズ、磁性粒子）に使用される公知のポリマーを同様にしてまたは適宜修飾して使用できる。具体的には、（メタ）アクリレート系ポリマー、スチレン系ポリマー等のラジカル重合性ポリマーなどが挙げられる。これらのうち、生化学物質と結合できるポリスチレンやポリシクロヘキシルメタクリレートなどの疎水表面を有するポリマー、カルボキシル基やトシル基などの表面官能基を有するポリマーが好ましく使用できる。なお、本明細書において、「（メタ）アクリレート」は、「アクリレート」および「メタクリレート」双方を包含する。また、磁性粒子がポリマーなどで表面が被覆される場合には、被膜は、アミノ基、アルデヒド基、カルボキシ基、トシル基、メルカプト基、ヒドロキシ基およびエポキシ基からなる群より選ばれる少なくとも１種の極性基を有していてもよい。このような場合には、標的物質または抗体等のレセプターを、上記極性基を介して磁性粒子に容易に結合（担持）できる。
上記被覆に代えてまたは加えて、磁性粒子は表面に修飾物質が固定化されてもよい。ここで、修飾物質は、特に制限されず、所望の用途に応じて適宜選択できる。具体的には、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、抗原、抗体、酵素等のタンパク質；ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸；および低分子医薬品、生理活性物質、オリゴペプチド、オリゴヌクレオチド、脂質等の低分子化合物などが挙げられる。このような修飾物質で修飾することにより、レセプターとの結合を容易にできる。ここで、磁性粒子への上記修飾物質の固定化（修飾）方法は、特に制限されず、例えば、特開２００７−２６２１１４号公報、特開２００８−３２４１１号公報（US 2008/026222 A1に相当）、特開2012-177691号公報等に記載の方法が同様にしてまたは適宜修飾して、適用できる。
または、磁性粒子は市販品を使用してもよい。用いる磁性粒子は、磁気ビーズ、磁気アガロースビーズのような複数個の磁性体をポリマーやゲル（例えば、メタクリレート、デキストラン）で被覆したビーズ等を用いてもよく、抗体結合磁気ビーズ、タグ抗体結合ビーズ等、目的に応じて適宜修飾された磁気粒子でもよい。具体的には、ＭａｇｎｏｓｐｈｅｒｅTM ＭＳ３００／Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、ＭａｇｎｏｓｐｈｅｒｅTM ＭＳ１６０／Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、ＭａｇｎｏｓｐｈｅｒｅTM ＳＳ１５０／Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、ＭａｇｎｏｓｐｈｅｒｅTM ＳＳ５５０／Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（いずれもＪＳＲ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）等のストレプトアビジン標識磁性ビーズ、ＭａｇｎｏｓｐｈｅｒｅTM ＭＳ３００／Ｃａｒｂｏｘｙｌ、ＭａｇｎｏｓｐｈｅｒｅTM ＭＳ１６０／Ｃａｒｂｏｘｙｌ、ＭａｇｎｏｓｐｈｅｒｅTM ＭＸ２００／Ｃａｒｂｏｘｙｌ、ＭａｇｎｏｓｐｈｅｒｅTM ＳＳ１５０／Ｃａｒｂｏｘｙｌ、ＭａｇｎｏｓｐｈｅｒｅTM ＳＳ５５０／Ｃａｒｂｏｘｙｌ（いずれもＪＳＲ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）等のカルボキシ基導入磁性ビーズ、ＭａｇｎｏｓｐｈｅｒｅTM ＭＳ３００／Ｔｏｓｙｌ、ＭａｇｎｏｓｐｈｅｒｅTM ＭＳ１６０／Ｔｏｓｙｌ等のトシル基導入磁性ビーズなどが挙げられる。
磁性粒子表面に第１レセプターを固定する方法もまた特に制限されない。例えば、レセプター（例えば、抗体）にビオチンを標識し、このビオチン標識レセプターをストレプトアビジン標識磁性ビーズと結合させる方法、レセプター（例えば、抗体）にストレプトアビジンを標識し、このストレプトアビジン標識レセプターを、ビオチンを標識させた磁性ビーズと結合させる方法等、対になる物質に対して特異的な結合性を示す物質を化学的に結合させる特異的結合対標識化法；カルボキシ基導入磁性ビーズのカルボキシル基をＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）によって選択的に活性化してビーズ表面に−ＣＯＯ−ＮＨＳ基を形成し、この−ＣＯＯ−ＮＨＳ基を介してレセプター（例えば、抗体）と結合するＮＨＳ法；レセプター（例えば、抗体）のジスルフィド結合を還元剤で還元してスルフヒドリル基（−ＳＨ）を形成し、その一方で磁性粒子表面にマレイミド基を導入し、このマレイミド基とレセプターのスルフヒドリル基とを反応させるマレイミド法；酵素の糖鎖部分を過ヨウ素酸で酸化し、アルデヒド基を導入し、このアルデヒド基をレセプター（例えば、抗体）のアミノ基と反応させ、シッフ塩基（−ＣＨ＝Ｎ−）を形成し、このシッフ塩基を−ＣＨ２ＮＨ−に還元する過ヨウ素酸法；酵素を過剰のグルタルアルデヒドで処理して、アルデヒド基を導入し、このアルデヒド基をレセプター（例えば、抗体）のアミノ基と反応させ、シッフ塩基（−ＣＨ＝Ｎ−）を形成し、このシッフ塩基を−ＣＨ２ＮＨ−に還元するグルタルアルデヒド法などの公知の方法が同様にしてまたは適宜修飾して使用できる。
本開示に係る第１レセプター固定磁性粒子の使用量は、特に制限されず、標的物質の量に応じて適宜選択されるが、通常、標的物質の量に対して多い。本開示に係る第１レセプター固定磁性粒子の使用量は、標的物質１モルに対して、好ましくは１〜１００００モル以下、より好ましくは１モルを超えて１０００モル、特に好ましくは１０〜１０００モルの第１レセプター（例えば、抗体）が存在するような量である。なお、２個の標的物質が１個の磁性粒子に結合する場合には（例えば、ＩｇＧ抗体が固定された磁性粒子では）、上記第１レセプター固定磁性粒子の量は、重量として、上記好ましい量の２倍の量となる。また、標的物質の量は、例えば、血液中に含まれるインスリン量など、当業者であればある程度予想することができ、予想範囲の上限を標的物質量とする。なお、当業者が標的物質の量を予想できない場合には、第１レセプターを過剰量（例えば、反応液中に０．１〜１００μｇ／ｍＬの第１レセプター）使用すればよい。
（標的物質−磁性粒子の複合体の形成）
上記標的物質を含むサンプルを、上記本開示に係る磁性粒子（第１レセプター固定磁性粒子）と混合することによって、第１レセプターを介して標的物質と磁性粒子とが結合して、標的物質−磁性粒子の複合体が形成される。この際の標的物質−磁性粒子の複合体形成条件は、所望の複合体が形成される条件であれば特に制限されない。例えば、標的物質を含むサンプルおよび第１レセプター固定磁性粒子を、緩衝液中で混合する。ここで、緩衝液は、特に限定されず、公知の緩衝液が使用できる。具体的には、例えば、クエン酸、コハク酸、酒石酸、リンゴ酸等の有機酸、及び、その塩類等を含有する溶液等；グリシン、タウリン、アルギニン等のアミノ酸類；塩酸、硝酸、硫酸、リン酸、ホウ酸、酢酸等の無機酸、及び、その塩類等を含有する溶液等が挙げられる。具体的な泳動用緩衝液としては、例えば、グッドバッファー（トリス−グリシン緩衝液、トリス緩衝液、トリス−トリシン緩衝液、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液、ＰＩＰＥＳ緩衝液、トリス−塩酸（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝溶液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＰＩＰＥＳ緩衝液、ＡＣＥＳ緩衝液、ＭＯＰＳＯ緩衝液、ＢＥＳ緩衝液、ＴＥＳ緩衝液、ＤＩＰＳＯ緩衝液、ＴＡＰＳＯ緩衝液、ＰＯＰＳＯ緩衝液、ＨＥＰＰＳＯ緩衝液、ＥＰＰＳ緩衝液、ＴＡＰＳ緩衝液、Ｂｉｃｉｎｅ緩衝液、ＣＨＥＳ緩衝液、ＣＡＰＳＯ緩衝液、ＣＡＰＳ緩衝液等）、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、酢酸緩衝液、炭酸緩衝液、グリシン緩衝液などが挙げられる。上記緩衝液は、１種を単独で使用してもまたは２種以上の混合物の形態で使用してもよい。また、緩衝液は、ＥＤＴＡ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、ポリエチレングリコール等の安定化剤、Ｔｗｅｅｎ、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ等の非イオン界面活性剤などを含んでもよい。緩衝液のｐＨは、特に制限されず、レセプターが標的物質結合活性を維持する環境下であれば特に制限されない。レセプターの標的物質への結合活性維持能などを考慮すると、通常、中性から弱塩基性付近であることが好ましい。かような観点から、緩衝液のｐＨは、６．０〜９．０、特に好ましくは６．０〜８．０であることがより好ましい。混合温度は、好ましくは４〜４０℃、より好ましくは４〜２５℃である。また、混合時間は、好ましくは１〜７２時間、より好ましくは８〜２４時間である。または、混合時間は、好ましくは１〜６０分、より好ましくは５〜３０分である。
標的物質を含むサンプルと本開示に係る磁性粒子（第１レセプター固定磁性粒子）との混合（反応）により、１個または２個の標的物質が１個の磁性粒子に結合した標的物質−磁性粒子の複合体（なお、還元抗体を使用する場合には、１個の標的物質が１個の磁性粒子に結合した標的物質−磁性粒子の複合体）および未反応の磁性粒子を含む反応液が得られる。
（標的物質−磁性粒子の複合体の分離）
このようにして形成された標的物質−磁性粒子の複合体を、磁気および電気泳動により分離する。すなわち、磁気によって標的物質−磁性粒子の複合体に含まれる磁性粒子を所定の位置で捕捉する。このため、複合体を磁気で捕捉しながらまたは捕捉した後に、電気泳動を行うと、複合体は磁気により所定の位置に固定されたまま、複合体以外の成分（例えば、血球等の生体由来の成分）は移動するまたは全く移動しない。ゆえに、本開示の方法によると、標的物質の種類にかかわらず、または検出し難い標的物質であっても、標的物質（標的物質−磁性粒子の複合体）を効率よく分離・回収できる。なお、標的物質−磁性粒子の複合体は、上記（標的物質−磁性粒子の複合体の形成）で得られたように、緩衝液中に含まれた形態であってもよい、または緩衝液から分離した形態であっても、または緩衝液から分離した後別の緩衝液に分散させた状態であってもよい。
電気泳動は、特に制限されず、公知の電気泳動が使用できる。具体的には、アガロースゲル電気泳動、パルスフィールドゲル電気泳動（pulsed-field gel electrophoresis；ＰＦＧＥ）、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis；ＰＡＧＥ）等のゲル電気泳動、泳動ゲル中にｐＨ勾配を形成させた等電点電気泳動、等電点電気泳動（１次元目）とＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）とを組み合わせた二次元電気泳動、尿素やホルムアミドを変性剤として使用する変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis；ＤＧＧＥ）等の担体電気泳動；ならびに無担体等電点電気泳動、マイクロチップ電気泳動等の無担体電気泳動などが挙げられる。なお、上記担体電気泳動では、上記以外にも、デキストラン等のゲルを下記記載のキャピラリー高分子等の担体を代わりに使用してもよい。これらのうち、以下の理由により無担体電気泳動が好ましい。例えば、血液（全血）をサンプルとして担体電気泳動を行う場合、サンプルと担体（例えば、ゲル）との境界面に血球だまりができる。この血球だまりは、通常の濃度範囲の標的物質（例えば、サンプル中にｍＭ〜μＭオーダーで標的物質が含まれる場合）を検出する場合であれば、標的物質の測定に対する影響を排除できる。しかし、標的物質の蛍光が微量の場合、蛍光検出する際に、サンプルと担体との境界面にある血球だまりに含まれる血球中のタンパク質などが蛍光を発することで（自家蛍光）、大きなノイズを生み、ひいては感度低下を引き起こす。また、担体を用いた電気泳動の場合、この血球だまりに標的物質−レセプターの複合体の一部が残り、信号低下を引き起こす可能性がある。一方、無担体電気泳動の場合には、サンプルと担体との境界面が存在しないため、血球だまりができない。血球は電気泳動により（通常、プラス側）泳動される。すなわち、感度低下の一因である、血球による自家蛍光が防止・抑制できる。このため、高感度な測定を達成できる。また、無担体電気泳動は、担体を含まないため、分離後の処理が容易である。加えて、大量の連続泳動が可能であり、他の分離手段との接続も容易である。すなわち、本開示の好ましい形態によると、電気泳動は無担体電気泳動である。
また、標的物質−磁性粒子の複合体は磁気により他の成分と分離される。ここで、分離される他の成分は、標的物質以外の成分を意味する。具体的には、サンプル中に含まれる標的物質以外の成分（例えば、血液成分）、（使用する場合には）希釈液（例えば、緩衝液）の構成成分などがある。
本開示では、電気泳動方向の所定の位置に磁石を設置する。磁石としては、磁性粒子を捕捉できるものであれば特に制限されない。具体的には、希土類磁石（ネオジム磁石、ボンド磁石など）、フェライト磁石、電磁石などが挙げられる。
以下では、標的物質−磁性粒子の複合体の分離を無担体電気泳動および磁気により行う形態を、図を参照しながら説明する。なお、本開示は下記形態に限定されない。
図１Ａ〜Ｄは、本開示の方法を説明するための工程図である。
まず、図１Ａに示されるように、電気泳動基材（例えば、キャピラリー）５に第１レセプター固定磁性粒子を含む試薬４を充填する。この電気泳動基材５を、電気泳動装置の基板６上に配置する。また、電気泳動基材５の両端に電極（例えば、白金電極）２，３を設置する。これにより、電気泳動基材５の長手方向に電場がかかる。上記試薬は、第１レセプター固定磁性粒子のみから構成されるものであってもよい。または、試薬は、第１レセプター固定磁性粒子に加えて、ｐＨ調整剤（例えば、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、硫酸、塩酸、リン酸等）、緩衝剤（リン酸水素ナトリウム、リン酸ナトリウム、Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ等）、サポニン等の溶血剤、界面活性剤などを含んでもよい。
電気泳動基材５は、特に制限されないが、複合体の流れの視認性等の観点から透明であることが好ましい。具体的には、電気泳動基材は、アクリル樹脂等の透明樹脂、石英ガラス、合成石英などの透明材料で形成されることが好ましい。自家蛍光がより少ないという観点から、石英ガラス、合成石英製の電気泳動基材がより好ましく、合成石英製の電気泳動基材が特に好ましい。または、コストの面からは、透明樹脂製の電気泳動基材が特に好ましい。また、電気泳動基材５の形状もまた、特に制限されず、円柱、角柱などいずれでもよい。設置安定性などを考慮すると、電気泳動基材５の断片形状が角形、特に四角形である角柱が好ましい。電気泳動基材５の大きさもまた、特に制限されない。バッファーやサンプルの流れやすさや電気浸透流（Electro Osmotic Flow：ＥＯＦ）の防止・抑制効果などを考慮すると、電気泳動基材５断面の最大長さ（断面が角形の場合には１辺（内辺）の長さ、断面が円形の場合には内径（直径））は、好ましくは０．１〜２ｍｍ、より好ましくは０．５〜１ｍｍである。また、複合体の分離しやすさや取扱い易さなどを考慮すると、電気泳動基材５の長さは、好ましくは１〜１０ｃｍ、より好ましくは２〜５ｃｍである。
また、基板６は、特に制限されないが、複合体の流れの視認性等の観点から透明であることが好ましい。具体的には、基板は、アクリル樹脂等の透明樹脂、石英ガラス、合成石英などの透明材料で形成されることが好ましい。自家蛍光がより少ないという観点から、石英ガラス、合成石英製の基板がより好ましく、合成石英製の基板が特に好ましい。または、コストの面からは、透明樹脂製の基板６が特に好ましい。
次に、図１Ａに示されるように、白金電極２側に、標的物質を含むサンプル７を滴下する。これにより、サンプル７が毛細管現象により電気泳動基材５内に入り、試薬４と混合する。これにより、電気泳動基材５内で、サンプル７中の標的物質と、第１レセプター固定磁性粒子に存在する第１レセプターと、が反応して、標的物質−磁性粒子の複合体を形成する。ここで、標的物質を含むサンプル７（検体１）の滴下量は、特に制限されず、電気泳動基材の大きさなどに応じて適宜設定される。また、反応条件は、特に制限されないが、上記したような条件が同様にして適用できる。本形態では、サンプル７をプラス（＋）の電極２側に滴下したが、当該形態に限定されない。当該形態は、上述したように、タンパク質に存在するカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）がマイナスに帯電させた場合に特に好適に適用される。
試薬中の第１レセプター固定磁性粒子の量は、特に制限されないが、上記（標的物質の部位を特異的に認識する第１レセプターが固定された磁性粒子）の項で記載したのと同様の量が使用できる。
本形態では、電気泳動基材５内に予め第１レセプター固定磁性粒子を含む試薬を充填していたが、第１レセプター固定磁性粒子と標的物質とを予め反応させて標的物質−磁性粒子の複合体を形成した後、この反応物を電気泳動基材５に充填してもよい（第２の実施形態）。当該第２の実施形態の場合には、上記反応のためのチャンバー（図示せず）を基板６上に別途設けることが好ましい。
または、他の形態では、第１レセプター固定磁性粒子及びバッファーを含む試薬溶液を電気泳動基材の両端部に滴下して液だまりを作り、毛細管現象により電気泳動基材内に試薬溶液で満たして、電気泳動基材５の両端に電極（例えば、白金電極）２，３を設置し、いずれかの電極に標的物質を含むサンプルを滴下してもよい（第３の実施形態）。当該第３の実施形態において、バッファーとしては、レセプターが標的物質結合活性を維持する環境下であれば特に制限されず、通常電気泳動に使用される緩衝液が同様にしてあるいは適宜修正して使用できる。具体的には、緩衝液としては、緩衝能を有する従来公知の緩衝液組成物を含有する溶液であれば特に限定されない。例えば、上記（標的物質−磁性粒子の複合体の形成）の項で例示したのと同様の緩衝液等が挙げられる。または、市販の電気泳動用キット中に提供されている緩衝液等も使用することができる。泳動用緩衝液は、一般に電気泳動用緩衝液として使用される濃度で使用することができる。緩衝液のｐＨは、特に制限されず、レセプターが標的物質結合活性を維持する環境下であれば特に制限されない。ただし、レセプターが標的物質結合活性維持能、試薬の安定性、反応性などを考慮すると、通常、ｐＨは中性〜弱塩基性付近であることが好ましい。かような観点から、緩衝液のｐＨは、６〜９であることがより好ましい。特に標的物質がタンパク質である場合には、緩衝液のｐＨが塩基性側であることにより、タンパク質に存在するカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）がマイナスに帯電する（−ＣＯＯ−になる）ため、電気泳動中の複合体の移動を促進できる。緩衝液のｐＨ調整には、塩酸などの酸性物質や水酸化ナトリウムなどの塩基性物質を用いて適宜調整すればよい。
次に、図１Ｂに示されるように、磁石８を電気泳動基材５の白金電極２（陽極）側に設置する。これにより、標的物質−磁性粒子の複合体に含まれる磁性粒子が磁石８に捕捉される。次に、図１Ｃに示されるように、電気泳動基材５の長手方向上に磁石８を移動させた後、電気泳動を開始する。これにより、標的物質−磁性粒子の複合体を選択的に分離できる。すなわち、本開示の好ましい形態によると、標的物質−磁性粒子の複合体を含む混合物を得た後、磁気により前記標的物質−磁性粒子の複合体を所定に位置に捕捉した後、電気泳動を行うことで、前記混合物から前記標的物質−磁性粒子の複合体を分離する。
ここで、磁石８の移動場所は特に制限されないが、磁石８を電気泳動基材５の陰極側（図１Ｃでは、白金電極３）側に設置することが好ましい。当該形態であれば、サンプル中の標的物質から分離したい成分（例えば、検出の際にノイズやバックグラウンド上昇を引き起こす物質（下記の第２の実施形態では、自家蛍光を発する血球、検出対象外の蛍光を有する物質等））は陽極側に移動する。このため、検出時に、電気泳動基材５内において、標的物質−磁性粒子の複合体と、ノイズとなり得る物質との距離をあけることができる。このため、感度低下をより効果的に防止・抑制でき、バックグラウンドやノイズを減少させることで、感度をさらに向上できる。具体的には、磁石を、泳動開始地点から泳動終了地点までの全泳動過程の半分より陰極側（図１Ｃ中のＹ／Ｘ≦１／２の位置）に設置することが好ましい。より好ましくは、磁石を、陰極からの磁石までの距離（図１Ｃ中のＹ）が、陰極（図１Ｃ中のＹ＝０）から陽極までの全泳動過程（図１Ｃ中のＹ＝Ｘ）において、陰極を超えて半分までの位置（図１Ｃ中のＹ／Ｘ＝０を超えて１／２以下の位置）に設置する。特に好ましくは、磁石を、陰極から陽極までの全泳動過程（図１Ｃ中のＸ）に対する陰極からの磁石までの距離（図１Ｃ中のＹ）の割合（Ｙ／Ｘ）が、１／１０〜３／５の位置（図１Ｃ中のＹ／Ｘ＝１／１０〜３／５の位置）に設置し、最も好ましくは磁石を、陰極から陽極までの全泳動過程（図１Ｃ中のＸ）に対する陰極からの磁石までの距離（図１Ｃ中のＹ）の割合（Ｙ／Ｘ）が、１／１０〜２／５の位置（図１Ｃ中のＹ／Ｘ＝１／１０〜２／５の位置）に設置する。上記位置に設置することにより、自家蛍光等の感度低下をさらに効果的に防止・抑制できる。なお、図１Ｃにおいて、「Ｘ」は、陰極と陽極との間の長さ（電気泳動基材５の全長に相当）（ｍｍ）を示す。また、「Ｙ」は、陰極から磁石の幅の中点（中心）までの距離（ｍｍ）を示す。また、この陰極、陽極に対する磁石の設置距離の関係は、検出物質の種類によって、第２の実施形態と反対の関係にすることも可能である。
磁石８を電気泳動基材５上の所定の位置に配置した後、電気泳動を開始する。ここで、電気泳動条件は、複合体以外の成分（例えば、サンプル由来の夾雑物）が分離できる条件であれば特に制限されず、通常の条件が適用できる。例えば、電気泳動における印加電圧は、通常この分野で用いられている範囲から適宜選択すればよく、通常、直流電圧で、好ましくは５〜２００Ｖ、より好ましくは１０〜１００Ｖの範囲で印加される。電気泳動時間は、通常、３０〜１８０分であり得る。迅速な分離という観点からは、泳動時間は数分〜１０分程度であることが好ましい。なお、電気泳動温度は、特に制限されないが、通常、室温（２０〜２５℃）で行われる。
上述したように、電気泳動直前のサンプル（以下、「検体１」とも称する）は、サンプル中に含まれる成分（例えば、血球等の生体由来の成分）や緩衝液に含まれる成分に加えて、標的物質−磁性粒子の複合体および未反応の磁性粒子を含む。上記電気泳動では、標的物質−磁性粒子の複合体および未反応の磁性粒子が磁石に捕捉される。また、通常、１箇所に捕捉した磁性粒子は目視できる（例えば、図２Ｂ参照）。このため、磁石が配置される電気泳動基材部分のみを切除などにより取り出すことにより、標的物質は、サンプルや緩衝液に含まれる成分（例えば、血球など）から効率よく分離できる。なお、目的物（標的物質−磁性粒子の複合体）の拡散を防止するため、磁石が配置される電気泳動基材部分のみの取り出しは、磁石を配置したまま行うことが好ましい。
＜標的物質量の測定方法（本開示の第２の形態）＞
本開示の第２の形態は、標的物質を含むサンプルと、前記標的物質の部位を特異的に認識する第１レセプターが固定された磁性粒子と、前記標的物質の部位とは異なる部位を特異的に認識する第２レセプターが固定された標識物質と、を混合して、標的物質−磁性粒子−標識物質の複合体を含む混合物を得、磁気および電気泳動により前記標的物質−磁性粒子−標識物質の複合体を分離した後、前記標的物質−磁性粒子−標識物質の複合体のシグナル強度を検出することを有する、標的物質量の測定方法である。
本開示の方法によると、第１レセプターを介して標的物質と磁性粒子とが結合し、第２レセプターを介して標的物質と標識物質とが結合し、磁性粒子と標的物質と標識物質との複合体（標的物質−磁性粒子−標識物質の複合体）を形成する。磁気によってこの複合体に含まれる磁性粒子を所定の位置で捕捉する。このため、複合体（標的物質−磁性粒子−標識物質の複合体）を磁気で捕捉しながらまたは捕捉した後に、電気泳動を行うと、複合体は磁気により所定の位置に固定されたままで、複合体以外の成分（例えば、血球等の生体由来の成分やタンパク質）は移動する。特に、測定対象物を蛍光標識したレセプターを用いて検出する場合、検出対象ではない夾雑物（タンパク質、ペプチド、アミノ酸、細胞膜、脂肪酸等）を、電気泳動により陰極側、または、陽極側に泳動できる。特に、そのものが蛍光を有するアミノ酸や、ペプチド、検出対象ではないタンパク質を、電気泳動により分離すれば、大幅にノイズやバックグラウンドを減少させることができる。したがって、標的物質（標的物質−磁性粒子−標識物質の複合体）を選択的に分離・回収できる。本開示の方法は磁性粒子を用いて目的とする標的物質を回収する方法であるため、標的物質の種類（例えば、電荷、等電点や分子量）によらずに、標的物質を効率よく分離できる。また、標的物質−磁性粒子−標識物質の複合体を選択的に回収できるため、目的とする標的物質の量を高精度で測定できる。
以下、本開示の第２の形態を説明するが、重複する事項（例えば、標的物質を含むサンプル、本開示に係る磁性粒子（第１レセプター固定磁性粒子）、磁石、電気泳動）に関する説明は本開示の第１の形態における説明と同様であるため、ここでは説明を省略する。
（標的物質の部位とは異なる部位を特異的に認識する第２レセプターが固定された標識物質）
本開示に係る標識物質（第２レセプター固定標識物質）は、第１レセプターの認識部位とは異なる部位を特異的に認識する第２レセプターが（例えば、表面に）固定されてなる。ここで、第２レセプターは、特に制限されず、本開示に係る磁性粒子（第１レセプター固定磁性粒子）にて説明したのと同様であるため、ここでは、説明を省略する。なお、第２レセプターは、第１レセプターとは異なる部位を認識する、すなわち、第１レセプター、第２レセプター（例えば、抗体）は、１つの標的物質の異なる部位をそれぞれ認識する。例えば、第１レセプターおよび第２レセプターが脂肪酸結合タンパク質を認識する場合には、Monoclonal mouse anti-human fatty acid binding protein (25)を第１レセプターとして使用し、Monoclonal mouse anti-human fatty acid binding protein (28)を第２レセプターとして使用するなど、異なるレセプター（例えば、抗体）を選択する。
標識物質（第２レセプターが固定される前の標識物質）は、後の工程で所望の標的物質の量を測定するのに使用できるものであれば特に制限されない。例えば、蛍光物質、放射性同位体、酵素およびレドックス物質などが好ましく挙げられる。上記標識物質は、１種を単独で使用してもまたは２種以上を組み合わせて使用してもよい。すなわち、本開示の好ましい形態によると、標識物質は、蛍光物質、放射性同位体、酵素およびレドックス物質からなる群より選択される少なくとも一種である。ここで、蛍光物質としては、特に制限されず、通常標的物質の量を測定するのに使用されるものが使用できる。具体的には、Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ（Ｌｉｆｅ社）、Ｈｉｌｙｔｅ Ｆｌｏｕｒ（Ａｎａ ｓｐｅｃ社）、ＩＲＤｙｅ（LI-COR Biosciences製）、ＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ（LI-COR Biosciences製）、ＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ Ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、ＰＥ（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）、ＡＰＣ（Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ）、Ｃｙ−３、Ｃｙ−５、テトラメチルローダミンイソシアネート、半導体量子ドットなどが挙げられる。これらのうち、長波長側で励起する蛍光色素を使用することが好ましい。短波長で蛍光を発する物質が自然界に多く存在するため、長波長側で励起する蛍光色素を使用することにより、自家蛍光をより効果的に低減できる。上記点を考慮すると、７００〜１，０００ｎｍ、特に７５０〜９００ｎｍで励起する蛍光色素を使用することが好ましい。このような波長域で励起する蛍光色素は検出効率がよく、感度をより向上できるという利点もある。放射性同位体としては、特に制限されず、通常標的物質の量を測定するのに使用されるものが使用できる。具体的には、１２５Ｉ、３２Ｐ、１４Ｃ、３５Ｓまたは３Ｈ等のラジオアイソトープなどが挙げられる。酵素としては、特に制限されず、通常標的物質の量を測定するのに使用されるものが使用できる。具体的には、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ（例えば、セイヨウペルオキシダーゼ）、β−ガラクトシダーゼ、フィコエリトリンなどが挙げられる。レドックス物質としては、特に制限されず、通常標的物質の量を測定するのに使用されるものが使用できる。具体的には、鉄、バナジウム、クロム、亜鉛、およびこれらの混合物から選択されるレドックス金属イオンを含む化合物があり、より具体的には、フェロセン、１，１’−ジメチルフェロセン、フェロシアン化物及びフェリシアン化物、ルテニウム（ＩＩＩ）及びルテニウム（ＩＩ）ヘキサアミン、ＰＭＳ（フェンジンメトサルフェート）、ｍ−ＰＭＳ等などが挙げられる。
標識物質に第２レセプターを固定する方法もまた特に制限されず、本開示に係る磁性粒子（第１レセプター固定磁性粒子）にて説明したのと同様であるため、ここでは、説明を省略する。なお、上記（標的物質の部位を特異的に認識する第１レセプターが固定された磁性粒子）における「磁性粒子第１レセプターを固定する方法」の説明において、「磁性ビーズ」または「磁性粒子」を「標識物質」と読み替えることによって適用できる。
本開示に係る第２レセプター固定標識物質の使用量は、特に制限されず、標的物質の量に応じて適宜選択されるが、通常、標的物質の量に対して多い。例えば、１個の標的物質が標識物質に結合する場合には（例えば、還元抗体が固定された標識物質では）、本開示に係る第２レセプター固定標識物質の使用量は、標的物質１モルに対して、好ましくは１モルを超えて１００モル以下、より好ましくは１モルを超えて５０モル以下、特に好ましくは２〜５０モルの第２レセプター（例えば、抗体）が存在するような量である。なお、２個の標的物質が標識物質に結合する場合には（例えば、ＩｇＧ抗体が固定された標識物質では）、上記第２レセプター固定標識物質の量は、上記好ましい量の２倍の量となる。また、標識物質の量は、例えば、血液中に含まれるインスリン量など、当業者であればある程度予想することができ、予想範囲の上限を標識物質量とする。なお、当業者が標識物質の量を予想できない場合には、第２レセプター固定標識物質を過剰量（例えば、反応液中に０．１〜１００μｇ／ｍＬの第２レセプター固定標識物質または１〜１００ｎＭの第２レセプター（例えば、抗体）が含まれるような量）使用すればよい。
また、本開示に係る標識物質（第２レセプター固定標識物質）と本開示に係る磁性粒子（第１レセプター固定磁性粒子）との混合割合は、特に制限されないが、第１レセプター固定磁性粒子の方が第２レセプター固定標識物質より多く存在することが好ましい。これにより、未反応の標識物質による感度の低下をより効果的に抑制しつつ、サンプル中に存在する標識物質をより効率的に捕捉できる。具体的には、標識物質及び磁性粒子共に１個の標的物質が結合する場合には（例えば、還元抗体が固定された磁性粒子または標識物質では）、本開示に係る標識物質（第２レセプター固定標識物質）と本開示に係る磁性粒子（第１レセプター固定磁性粒子）との混合割合は、本開示に係る磁性粒子に結合する第１レセプターが、本開示に係る標識物質に結合する第２レセプター １モルに対して、好ましくは１モルを超えて１００００モル以下、より好ましくは１０〜１０００モル、特に好ましくは１０モルを超えて５０モル以下存在するような割合である。このような混合割合であれば、未反応の標識物質による感度の低下をさらにより効果的に抑制しつつ、サンプル中に存在する標識物質をさらにより効率的に捕捉できる。
（標的物質−磁性粒子−標識物質の複合体の形成）
上記標的物質を含むサンプルを、上記本開示に係る磁性粒子（第１レセプター固定磁性粒子）および上記本開示に係る標識物質（第２レセプター固定標識物質）と混合することによって、第１レセプターを介して標的物質と磁性粒子とがおよび第２レセプターを介して標的物質と標識物質とが結合して、標的物質−磁性粒子−標識物質の複合体が形成される。この際の標的物質−磁性粒子−標識物質の複合体形成条件は、所望の複合体が形成される条件であれば特に制限されない。例えば、標的物質を含むサンプル、第１レセプター固定磁性粒子および第２レセプター固定標識物質を、緩衝液中で混合する。ここで、緩衝液は、特に限定されず、公知の緩衝液が使用できる。具体的には、上記（標的物質−磁性粒子の複合体の形成）の項で例示したのと同様の緩衝液等が挙げられる。また、緩衝液のｐＨは、特に制限されず、レセプターが標的物質結合活性を維持する環境下であれば特に制限されない。ただし、レセプターが標的物質結合活性低下の抑制などを考慮すると、通常、中性から弱塩基性付近であることが好ましい。かような観点から、緩衝液のｐＨは、６．０〜９．０、特に好ましくは６．０〜８．０であることがより好ましい。混合温度は、好ましくは４〜４０℃、より好ましくは２５〜３７℃である。また、混合時間は、好ましくは１〜６０分、より好ましくは５〜３０分である。
標的物質を含むサンプルと本開示に係る磁性粒子（第１レセプター固定磁性粒子）と本開示に係る標識物質（第２レセプター固定標識物質）との混合（反応）により、標的物質−磁性粒子−標識物質の複合体を含む混合物が得られる。具体的には、上記混合物は、標的物質を介して磁性粒子及び標識物質が結合した標的物質−磁性粒子−標識物質の複合体、標的物質が磁性粒子のみに結合した標的物質−磁性粒子の複合体、標的物質が標識物質のみに結合した標的物質−標識物質の複合体、未反応の磁性粒子および未反応の標識物質を含む。
（標的物質−磁性粒子−標識物質の複合体の分離）
このようにして形成された標的物質−磁性粒子−標識物質の複合体を含む混合物に電気泳動を行い、前記電気泳動中に磁気により前記標的物質−磁性粒子−標識物質の複合体を分離する。すなわち、電気泳動する途中または、電気泳動する前に、磁気によって標的物質−磁性粒子−標識物質の複合体に存在する磁性粒子を捕捉して、目的とする標的物質（標的物質−磁性粒子−標識物質の複合体）を回収する。なお、標的物質−磁性粒子−標識物質の複合体は、上記（標的物質−磁性粒子−標識物質の複合体の形成）で得られたように、緩衝液中に含まれた形態であってもよい、または緩衝液から分離した形態であっても、または緩衝液から分離した後、別の緩衝液に分散させた状態であってもよい。ここで、電気泳動は、特に制限されず、公知の電気泳動が使用できる。具体的には、上記（標的物質−磁性粒子の複合体の分離）の項で説明したのと同様であるため、ここでは説明を省略する。
上記電気泳動中に、目的とする標的物質−磁性粒子−標識物質の複合体を磁気により分離する。詳細には、標的物質−磁性粒子−標識物質の複合体、標的物質が磁性粒子のみに結合した標的物質−磁性粒子の複合体および未反応の磁性粒子が磁気により捕捉される。このため、電気泳動中、サンプル中に含まれる標的物質以外の成分、（使用する場合には）試薬希釈液（例えば、緩衝液）、標的物質が非特異的に結合した物質（標識物質のみに結合した標的物質−標識物質の複合体等）、および未反応の標識物質が分離される。
本開示では、電気泳動途中に磁石を設置する。ここで、磁石の具体的な説明は、上記（標的物質−磁性粒子の複合体の分離）の項で説明したのと同様であるため、ここでは説明を省略する。
（標的物質−磁性粒子−標識物質の複合体のシグナル強度の検出）
上記にて分離された標的物質−磁性粒子−標識物質の複合体のシグナル強度を検出することにより、目的とする標的物質の量を測定する。なお、上記分離工程では、標的物質−磁性粒子−標識物質の複合体に加えて、標的物質が磁性粒子のみに非特異的に結合した標的物質−磁性粒子の複合体や、未反応の磁性粒子も磁石に捕捉される。本実施形態では、標識物質として、標的物質に特異的に結合する抗体を用いる。このため、未反応の磁性粒子には標的物質が存在しないため、標識物質は未反応の磁性粒子に結合しない。すなわち、未反応の磁性粒子は標的物質−磁性粒子−標識物質の複合体のシグナル強度（ゆえに、測定精度）には実質的な影響を及ぼさない。このため、当該工程では標的物質由来のシグナル強度が選択的に検出される、即ち、標的物質の量を高精度で測定できる。また、感度低下の原因となるサンプル中の他の成分（例えば、血球）、や未反応の標識物質は電気泳動により当該磁石より陰極または陽極側に移動している。標識物質の配合量は、標的物質の種類、磁性粒子等の他の試薬成分の使用量、サンプルの種類を考慮したうえで、標的物質が測定対象範囲において十分検出可能となるように配合する。ゆえに、本開示の方法によれば、目的とする標的物質の存在量を高感度（高精度）で測定できる。
以下では、標的物質−磁性粒子−標識物質の複合体の分離を無担体電気泳動および磁気により行った後、当該複合体のシグナル強度を検出する形態を、図を参照しながら説明する。なお、本開示は下記形態に限定されない。
図１Ａ〜Ｄは、本開示の方法を説明するための工程図である。
図１Ａ、ＢおよびＣの説明において、上記本開示の第１の形態における説明と重複する事項についてはここでは説明を省略する。
まず、図１Ａに示されるように、電気泳動基材（例えば、キャピラリー）５に第１レセプター固定磁性粒子および第２レセプター固定標識物質を含む試薬４を充填する。この電気泳動基材５を、電気泳動装置の基板６上に配置する。また、電気泳動基材５の両端に電極（例えば、白金電極）２，３を設置する。これにより、電気泳動基材５の長手方向に電場がかかる。上記試薬は、第１レセプター固定磁性粒子および第２レセプター固定標識物質のいずれか一方を含むものであってもよい。または、試薬は、第１レセプター固定磁性粒子および第２レセプター固定標識物質に加えて、ｐＨ調整剤（例えば、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、硫酸、塩酸、リン酸等）、緩衝剤（リン酸水素ナトリウム、リン酸ナトリウム、Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ等）、サポニン等の溶血剤、界面活性剤などを含んでもよい。
試薬中の第１レセプター固定磁性粒子の量は、特に制限されず、上記（標的物質の部位を特異的に認識する第１レセプターが固定された磁性粒子）の項で記載したのと同様の量が使用できる。同様にして、第２レセプター固定標識物質の量や第１レセプター固定磁性粒子と第２レセプター固定標識物質との混合割合は、特に制限されず、上記（標的物質の部位とは異なる部位を特異的に認識する第２レセプターが固定された標識物質）の項で記載したのと同様の量や割合が使用できる。
本形態では、電気泳動基材５内に予め第１レセプター固定磁性粒子及び第２レセプター固定標識物質を含む試薬を充填していたが、第１レセプター固定磁性粒子と第２レセプター固定標識物質と標的物質（サンプル）とを予め反応させて標的物質−磁性粒子−標識物質の複合体を形成した後、この反応物を電気泳動基材５に充填してもよい（第２’の実施形態）。当該第２’の実施形態の場合には、上記反応のためのチャンバー（図示せず）を基板６上に別途設けることが好ましい。
または、他の形態では、第１レセプター固定磁性粒子、第２レセプター固定標識物質及びバッファーを含む試薬溶液を電気泳動基材の両端部に滴下して液だまりを作り、毛細管現象により電気泳動基材内に試薬溶液で満たして、電気泳動基材５の両端に電極（例えば、白金電極）２，３を設置し、いずれかの電極に標的物質を含むサンプルを滴下してもよい（第３’の実施形態）。
次に、図１Ｂに示されるように、磁石８を電気泳動基材５の白金電極２（陽極）側に設置する。これにより、標的物質−磁性粒子の複合体に含まれる磁性粒子が磁石８に捕捉される。次に、図１Ｃに示されるように、電気泳動基材５の長手方向上に磁石８を移動させた後、電気泳動を開始する。これにより、標的物質−磁性粒子−標識物質の複合体を選択的に分離できる。ゆえに、以下で詳述するシグナル強度の検出において、標的物質−磁性粒子−標識物質の複合体（ゆえに、この複合体に含まれる標識物質）の量を高精度で測定できる。すなわち、本開示の好ましい形態によると、標的物質−磁性粒子−標識物質の複合体を含む混合物を得た後、磁気により前記標的物質−磁性粒子−標識物質の複合体を所定に位置に集めた後、電気泳動を行うことで、前記標的物質−磁性粒子−標識物質の複合体と、未反応の第２レセプターが固定された標識物質（標的物質と結合しない第２レセプター固定標識物質）と、を分離する。ここで、磁石８の移動場所は特に制限されないが、上記（標的物質−磁性粒子の複合体の分離）における図１Ｃの項で記載したのと同様の位置に磁石を設置することが好ましい。
磁石８を電気泳動基材５の外表面上また電気泳動基材５の外表面に近い位置で、電気泳動基材５に沿って、陰極と陽極との間を少なくとも１回、移動させる。その後、磁石８を所定の位置に配置し、電気泳動を開始する。磁石８の配置位置としては、特に規定されるものではなく、電気泳動基材５に、適切な磁力を与えることができる位置であればよいが、上記（標的物質−磁性粒子の複合体の分離）の項で規定したのと同様の位置に磁石を配置することができる。
上述したように、電気泳動直前のサンプル（以下、「検体２」とも称する）は、サンプル中に含まれる成分（例えば、血球等の生体由来の成分）や緩衝液に含まれる成分に加えて、標的物質−磁性粒子−標識物質の複合体、標的物質−磁性粒子の複合体、標的物質−標識物質の複合体、未反応の磁性粒子および未反応の標識物質を含む。上記電気泳動では、標的物質−磁性粒子−標識物質の複合体、標的物質−磁性粒子の複合体および未反応の磁性粒子が磁石に捕捉される。しかし、標識物質と磁性粒子との混合比を適切にすることによって、標的物質−磁性粒子の複合体の混入量は最小限にすることができる。このため、標的物質−磁性粒子−標識物質の複合体および未反応の磁性粒子が磁石に選択的に捕捉される。しかし、この未反応の磁性粒子には標識物質が特異的に結合しない（下記シグナル強度の検出では検出されない）。このため、電気泳動後の分離物のシグナル強度を測定することによって、標的物質−磁性粒子−標識物質の複合体（ゆえに標的物質）の存在量を高感度（高精度）で測定できる。
次に、図１Ｄに示されるように、磁石８が配置される電気泳動基材５部分に存在する標的物質−磁性粒子−標識物質の複合体９のシグナル強度を検出する。ここで、この複合体中に存在する標識物質のシグナル強度は、標的物質量に対応する。すなわち、予め測定した標的物質−磁性粒子−標識物質のバンドのシグナル強度について、標的物質量との検量線を作成することができ、当該検量線に基づいて、検出された標的物質−磁性粒子−標識物質の複合体のバンドのシグナル強度を比較することで、サンプル中の標的物質量を正確に測定できる。すなわち、本開示の好ましい形態によると、予め量が既知の標的物質を用いて、標的物質量に対する標的物質−磁性粒子−標識物質の複合体のシグナル強度の検量線を作成し、前記検量線および前記検出された標的物質−磁性粒子−標識物質の複合体のシグナル強度に基づいて、前記サンプル中に含まれる標的物質の量を測定する。
本開示では、予め標的物質量が既知のサンプルを用いて、標的物質量に対する標的物質−磁性粒子−標識物質の複合体のバンドのシグナル強度の関係（検量線）を作成することが好ましい。すなわち、予め標的物質量が既知のサンプルについて、上記と同様の操作を行い、標的物質−磁性粒子−標識物質の複合体のバンドのシグナル強度を算出し、標準物質量とバンドのシグナル強度との検量線を作成する。ここで、シグナル強度の測定方法は、標識物質の種類に応じて公知の方法が使用できる。例えば、標識物質が蛍光物質である場合には、定量を行う場合には、蛍光測定器（蛍光スキャナー）や画像処理システムで蛍光強度を測定する。また、標識物質が放射性同位体である場合には、放射線計数装置で放射線量を測定する。標識物質が酵素である場合には、酵素により生じた産物の検出および／または定量は、当該産物の吸光度を測定することにより行なうことができる。例えば、酵素基質として、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンを用いた場合には、６５５ｎｍにおける吸光度を測定すればよい。また、標識物質がレドックス物質である場合には、生成する電気化学的シグナルを測定することにより行なう。
標的物質の定量は、例えば、既知濃度の標的物質が含まれる標準試料を用いて得られた蛍光強度を利用して検量線を作成することによって、試料中に含まれる標的物質の量を簡便に定量する。
本開示により求められる検量線は、泳動条件などの外来要因にはよらず、定常的なものであるため、検量線として有効である。このため、この検量線を利用することにより、サンプル中の標的物質量を正確に測定できる。
上記検出方法は、特に標的物質が何らかの疾患に関与するマーカーである場合に、臨床検査において非常に有用なアッセイ手段となる。
なお、図１Ｄでは、磁石を取り外しているが、目的物（標的物質−磁性粒子−標識物質の複合体）の拡散を防止するため、電気泳動基材５に磁石を配置したままシグナル強度を適切に（例えば、基板の下方から）検出することが好ましい。この点からも、基板や電気泳動基材が透明であることが好ましい。
［診断方法］
本開示の第３の形態は、第１または第２の実施形態の分離・測定方法を用いた標的物質に関与する疾患の診断方法である。具体的には、被検者から試料を採取する段階と、前記試料中の標的物質と、前記標的物質の部位を特異的に認識する第１レセプターが固定された磁性粒子と、前記標的物質の部位とは異なる部位を特異的に認識する第２レセプターが固定された標識物質と、を混合して、標的物質−磁性粒子−標識物質の複合体を含む混合物を得、前記混合物に電気泳動を行い、磁気および電気泳動により前記標的物質−磁性粒子−標識物質の複合体を分離した後、前記標的物質−磁性粒子−標識物質の複合体のシグナル強度を検出し、健常者の標的物質の値と比較して被検者が標的物質に関与する疾患に罹患しているか否かを判定することを含む、標的物質に関与する疾患の診断方法である。したがって、本発明は、被検者から試料を採取し、前記試料中の標的物質と、前記標的物質の部位を特異的に認識する第１レセプターが固定された磁性粒子と、前記標的物質が認識する部位とは異なる部位を特異的に認識する第２レセプターが固定された標識物質と、を混合して、標的物質−磁性粒子−標識物質の複合体を含む混合物を得、磁気および電気泳動により前記標的物質−磁性粒子−標識物質の複合体を分離した後、前記標的物質−磁性粒子−標識物質の複合体のシグナル強度（シグナル強度１）を検出し；健常者から試料を採取し、前記試料中の標的物質と、前記標的物質の部位を特異的に認識する第１レセプターが固定された磁性粒子と、前記標的物質の部位とは異なる部位を特異的に認識する第２レセプターが固定された標識物質と、を混合して、標的物質−磁性粒子−標識物質の複合体を含む混合物を得、磁気および電気泳動により前記標的物質−磁性粒子−標識物質の複合体を分離した後、前記標的物質−磁性粒子−標識物質の複合体のシグナル強度（シグナル強度２）を検出し；前記シグナル強度１を前記シグナル強度２と比較して被検者が標的物質に関与する疾患に罹患しているか否かを判定することを有する、標的物質に関与する疾患の診断方法をも提供する。ここで、被検者又は健常者は、ヒト又はヒト以外の哺乳動物であることが好ましい。上記疾患としては、例えば、標的物質がインスリンである場合、インスリンノーマ、肥満、肝疾患、クッシング症候群、末端肥大症、異常インスリン血症、インスリン自己免疫症候群、糖尿病、低血糖、低栄養状態、褐色細胞腫、下垂体副腎機能低下症などが挙げられる。健常者の値と比較して被験者のシグナル強度が高ければ、上記したような疾患にインスリンノーマ、肥満、肝疾患、クッシング症候群、末端肥大症、異常インスリン血症、インスリン自己免疫症候群などに罹患している可能性がある。一方、健常者の値と比較して被験者のシグナル強度が低ければ、糖尿病、低血糖、低栄養状態、褐色細胞腫、下垂体副腎機能低下症などに罹患している可能性がある。すなわち、前記標的物質がインスリンであり、前記シグナル強度１を前記シグナル強度２より低い場合には、前記被検者が糖尿病、低血糖、低栄養状態、褐色細胞腫または下垂体副腎機能低下症に罹患しているまたは罹患の危険性を有すると判断する。
［検査キットまたは検査システム］
本開示の第４の形態は、標的物質の部位を特異的に認識する第１レセプターが固定された磁性粒子（第１レセプター固定磁性粒子）、標的物質の部位とは異なる部位を特異的に認識する第２レセプターが固定された標識物質（第２レセプター固定標識物質）および磁石を含む標的物質に関与する疾患の検査キットである。したがって、本発明は、標的物質の部位を特異的に認識する第１レセプターが固定されてなる磁性粒子、前記標的物質が認識する部位とは異なる部位を特異的に認識する第２レセプターが固定されてなる標識物質、および磁石を含む標的物質に関与する疾患の検査キットをも提供する。
本開示の第５の形態は、標的物質の部位を特異的に認識する第１レセプターが固定された磁性粒子、標的物質の部位とは異なる部位を特異的に認識する第２レセプターが固定された標識物質、磁石および電気泳動装置（好ましくは無担体電気泳動装置）を含む標的物質に関与する疾患の検査システムである。したがって、本発明は、標的物質の部位を特異的に認識する第１レセプターが固定されてなる磁性粒子、前記標的物質が認識する部位とは異なる部位を特異的に認識する第２レセプターが固定されてなる標識物質、磁石、および電気泳動装置を含む標的物質に関与する疾患の検査システムをも提供する。本形態において、前記電気泳動装置は、無担体電気泳動装置であることが好ましい。
検査キットに含まれる第１レセプター固定磁性粒子や第２レセプター固定標識物質は、１つのまたは別々の容器に入れられていてもよい。また、第１レセプター固定磁性粒子や第２レセプター固定標識物質は、緩衝液と共に容器に入れられていてもよい。また、上記検査キットは、アッセイ用の緩衝液またはその濃縮ストック溶液などを含む電気泳動用セットであってもよい。すなわち、本開示の第６の形態は、標的物質の部位を特異的に認識する第１レセプターが固定された磁性粒子、標的物質の部位とは異なる部位を特異的に認識する第２レセプターが固定された標識物質、磁石および電気泳動セット（好ましくは無担体電気泳動セット）を含む標的物質に関与する疾患の検査システムである。したがって、本発明は、標的物質の部位を特異的に認識する第１レセプターが固定されてなる磁性粒子、前記標的物質が認識する部位とは異なる部位を特異的に認識する第２レセプターが固定されてなる標識物質、磁石、および電気泳動セットを含む標的物質に関与する疾患の検査システムをも提供する。本形態において、前記電気泳動セットは、無担体電気泳動セットであることが好ましい。ここで、電気泳動用セットには、その他、電気泳動槽、電気泳動用ガラス板、バッファー槽、スペーサー、コーム、クリップ、パワーサプライ、又はペリスタポンプ等の一般的な電気泳動用器械；電気泳動用試薬；検出試薬等を含めることができる。
本形態の検査キットまたは検査システムは、量（濃度）が既知である標準サンプルおよびこれを含む容器をキットまたはシステムにさらに含んでいてもよい。検査キットまたは検査システムに含まれる各試薬は、１試料測定分毎に容器に分注されて提供されていてもよく、複数試料測定分が各試薬毎に纏めて個々の容器に含まれて提供されてもよい。後者の場合は、用時に各試薬を所定の測定用容器に分注して使用する。試薬が１試料測定分毎に提供される場合は、各試薬を含む容器はカートリッジとして一体成形されてもよく、そのカートリッジの異なる区画に各試薬が格納されていてもよい。第１レセプター固定磁性粒子や第２レセプター固定標識物質が固体形状でキットに含まれる場合には、検査キットまたは検査システムは、複合体を形成するための上述のような緩衝液をさらに含んでもよい。検査キットまたは検査システムに含まれてもよい容器は第１レセプター固定磁性粒子や第２レセプター固定標識物質と相互作用せず、アッセイに利用される反応、例えば酵素反応、化学発光反応を妨害しない材料であればどんな材質のものでもよい。必要であればそのような相互作用を起こさないように表面を予め処理して提供されてもよい。検査キットまたは検査システムには、通常取り扱い説明書が添付される。
本開示の効果を、以下の実施例および比較例を用いて説明する。ただし、本開示の技術的範囲が以下の実施例のみに制限されるわけではない。なお、下記実施例において、特記しない限り、操作は室温（２５℃）で行われた。また、特記しない限り、「％」および「部」は、それぞれ、「質量％」および「質量部」を意味する。
実施例１
（第１レセプター固定磁性粒子の調製）
マウス抗ヒト脂肪酸結合タンパク質（Ｈ−ＦＡＢＰ）ＩｇＧモノクローナル抗体２８（Monoclonal mouse anti-human fatty acid binding protein (FABP) 28、Hytest Ltd.製）０．０３２ｍＬ（０．２ｍｇ）をBiotin Labeling Kit-SH（株式会社同仁化学研究所製）を用い、製造社のプロトコルに従って、ビオチン化して、Biotin標識Anti H-FABP(28)（ビオチン化Ｈ−ＦＡＢＰ抗体）を含むＰＢＳ溶液（ｐＨ ７．４）（溶液Ａ−１）０．２ｍＬ（１ｍｇ／ｍＬ）を得た。
この溶液Ａ−１ ０．２ｍＬに、MagnosphereMS300/Streptavidin（平均粒子径：３．０μｍ、ＪＳＲライフサイエンス株式会社製）（磁性粒子）０．２ｍＬ（磁性粒子量：２ｍｇ）を加え、一晩４℃でビオチン化ＦＡＢＰ抗体のビオチン部分と磁性粒子のストレプトアビジン部分とを反応させて、Biotin標識Anti H-FABP(28)/Streptavidin磁気ビーズ複合体（第１レセプター固定磁性粒子）を含む反応液（溶液Ａ−２）を得た。所定時間インキュベーションした後、永久磁石を使い、第１レセプター固定磁性粒子を反応液（溶液Ａ−２）から分離し、０．１％ ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ ７．４）にて洗浄した。最終洗浄後、第１レセプター固定磁性粒子をデカンテーションにより単離した後、０．１％ ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ ７．４）０．２ｍＬを加えて、第１レセプター固定磁性粒子溶液（溶液Ａ−３）を調製した。なお、溶液Ａ−３中の第１レセプター固定磁性粒子、抗体及び磁性粒子の濃度は、それぞれ、１１ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ及び１０ｍｇ／ｍＬであった。
（第２レセプター固定標識物質の調製）
マウス抗ヒト脂肪酸結合タンパク質（ＦＡＢＰ）ＩｇＧモノクローナル抗体２５（Monoclonal mouse anti-human fatty acid binding protein (FABP) 25、Hytest Ltd.製）０．０５５ｍＬ（０．３ｍｇ）を、５０ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍ リン酸バッファー（ｐＨ６．０） ０．３ｍＬに添加して、抗体溶液（溶液Ｂ−１）を調製した。この抗体溶液（溶液Ｂ−１）に、０．１Ｍメルカプトエチルアミン塩酸塩及び５０ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．０）０．０５ｍＬを加えた。この液を、３７℃で２時間インキュベートして、抗体のジスルフィド結合を還元してスルフヒドリル基（−ＳＨ）を形成して、還元抗体を含む溶液（溶液Ｂ−２）を得た。この溶液（溶液Ｂ−２）について、脱塩処理を行い、還元抗体を含むＰＢＳ溶液（溶液Ｂ−３）０．４ｍＬを得た。
別途、IRDye（登録商標） 800CW Maleimide（LI-COR Biosciences製）（標識物質）（励起波長：８００ｎｍ）０．５ｍＬに、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）０．０３ｍＬを加えて溶解して、標識物質溶液（溶液Ｂ−４）を調製した。この標識物質溶液（溶液Ｂ−４）０．０１ｍＬを、上記還元抗体を含むＰＢＳ溶液（溶液Ｂ−３）０．４ｍＬに加えて、３７℃で３０分インキュベートして還元抗体のスルフヒドリル基（−ＳＨ）と標識物質のマレイミド基とを反応させて、IRDye800CW標識AntiH-FABP(25)複合体（第２レセプター固定標識物質）を含む反応液（溶液Ｂ−５）を得た。所定時間インキュベート後、このようにして得られた反応液（溶液Ｂ−５）について、Zebaスピン脱塩カラム（ZebaTM Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）を用いてＰＢＳにバッファー交換して、第２レセプター固定標識物質を含むＰＢＳ溶液（溶液Ｂ−６）０．４ｍＬを得た。なお、バッファー交換は、溶液を０．２ｍＬづつに分けてスピン脱塩カラムを２本使用して行った後、カラム処理液を合わせた（溶液Ｂ−６）。
最後に、このようにして得られた溶液Ｂ−６を、抗体濃度が０．１ｍｇ／ｍＬになるように、０．１％ ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ ７．４）で希釈して、第２レセプター固定標識物質溶液（溶液Ｂ−７）を調製した。
（Ｈ−ＦＡＢＰ溶液の調製）
ヒト脂肪酸結合タンパク質（Ｈ−ＦＡＢＰ）（Fatty acid binding protein (FABP), human、Hytest Ltd.製）０．１ｍｇに、０．１％ ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液 ２ｍＬを添加・溶解して、Ｈ−ＦＡＢＰ溶液（Ｈ−ＦＡＢＰ濃度：０．０５ｍｇ／ｍＬ）を調製した。
（泳動溶液の作製）
上記にて調製した第１レセプター固定磁性粒子溶液（溶液Ａ−３）、第２レセプター固定標識物質溶液（溶液Ｂ−７）、Ｈ−ＦＡＢＰ溶液、０．１％ ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ ７．４）（下記表１中の「０．１％ ＢＳＡ ＰＢＳ」）および０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）（下記表１中の「Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ」）を、下記表１に示される組成（ｐＨ ８．５）となるように混合して、２５℃で５分間、反応させ、脂肪酸結合タンパク質−Biotin標識Anti H-FABP(28)/Streptavidin磁気ビーズ−IRDye800CW標識AntiH-FABP(25)の複合体１〜５（複合体１〜５）を含む泳動溶液１〜５（サンプル１〜５）を作製した。なお、下記表１において、「Ｈ−ＦＡＢＰ溶液の希釈率」とは、上記にて調製したＨ−ＦＡＢＰ溶液を希釈する際の希釈倍率を示し、「希釈後のＨ−ＦＡＢＰ溶液」とは、上記所定の希釈率にて希釈した後のＨ−ＦＡＢＰ溶液の添加量を示す。このため、例えば、サンプル１は、上記にて調製したＨ−ＦＡＢＰ溶液を２倍希釈したものを１μＬ使用することを意味する。また、下記表１中、「溶液Ａ−３の抗体／Ｈ−ＦＡＢＰ（モル比）」は、各サンプルにおける脂肪酸結合タンパク質（Ｈ−ＦＡＢＰ、標的物質）に対するAnti H-FABP(28)（第１レセプター）のモル比を意味する。同様にして、「溶液Ｂ−７の抗体／Ｈ−ＦＡＢＰ（モル比））」は、各サンプルにおける脂肪酸結合タンパク質（Ｈ−ＦＡＢＰ、標的物質）に対するAnti H-FABP(25)（第２レセプター）のモル比を意味する。なお、磁性粒子へのビオチン結合量は、使用した磁性粒子の取扱説明書に記載の量に基づき算出できる。また、抗体とビオチンは１：１のモル比で、全て結合したと仮定して計算できる。
Figure 2020085165
（泳動溶液充填ガラス四角管の作製）
上記（泳動溶液の作製）にて調製したサンプル１〜５ ０．０４ｍＬを、それぞれ、ガラス製の四角管（外辺：１．５ｍｍ、内辺：１．０ｍｍ、肉厚：０．２５ｍｍ、長さ：４０ｍｍ、材質：石英）に充填した（図２Ａ）。ネオジム永久磁石を、各サンプルを充填した管上を、管の延在方向に沿ってスライドさせて、複合体１〜５及び未反応の第１レセプター固定磁性粒子を一カ所（位置Ａ）に集め、ガラス四角管１〜５をそれぞれ得た（図２Ｂ）。なお、磁石は、陰極から陽極までの距離（Ｘ）に対する陰極からの磁石までの距離（Ｙ）の割合（Ｙ／Ｘ）が１／５の地点に設置した。
（電気泳動）
図３に示される電気泳動装置に、上記（泳動溶液の作製）にて作製したガラス四角管１〜５を、それぞれセットした後、１００Ｖの電圧で５分間、電気泳動を行った。
電気泳動後、各管中の複合体が移動しないように、ネオジム永久磁石を位置Ａに固定しながら、ガラス四角管１〜５をそれぞれ電気泳動装置から外した。このガラス四角管１〜５の位置Ａにおける蛍光強度を、それぞれ、蛍光スキャナー（Ｏｄｙｓｓｅｙ ＣＬｘ イメージングシステム、LI-COR Biosciences製）を用いて測定した。また、サンプル１を充填したガラス四角管の電気泳動前後の蛍光スキャナーで測定した際の写真を図４に示す。図４中、白四角で囲んである部分は、複合体が存在している場所を示す。図４から、電気泳動後に複合体１が未反応の（脂肪酸結合タンパク質が結合しない）第２レセプター固定標識物質と良好に分離できていることが分かる。
また、Ｈ−ＦＡＢＰの終濃度に対する蛍光強度をプロットした。結果を図５に示す。図５から、Ｈ−ＦＡＢＰ濃度０〜９．２ｎＭ（１３８ｎｇ／ｍＬ）の範囲において、標的物質−磁性粒子−標識物質の複合体のシグナル強度（蛍光強度）とＨ−ＦＡＢＰ濃度との間に良好な正の相関（直線性）（ｙ＝２１３８４ｘ＋７１９０（ここで、ｙはシグナル強度（蛍光強度）を表わし、ｘはＨ−ＦＡＢＰ濃度（ｎＭ）を表わす）、Ｒ２＝０．９８６７）が観察された。このため、予め量が既知の標的物質を用いて作成した検量線に基づけば、サンプル中の脂肪酸結合タンパク質量を高精度で測定できることが期待される。なお、本実施例では、脂肪酸結合タンパク質を用いて実験を行ったが、インスリン抗体、インスリンレセプター等、他のレセプターについても同様の結果が得られると考察される。また、本実施例では、脂肪酸結合タンパク質を使用したが、血液等の生体試料を使用した場合であっても、複合体以外の生体由来の成分は電気泳動により陽極側に移動する。このため、このような場合であっても、複合体を他の生体成分と良好に分離できると考察される。
本出願は、２０１８年１０月２６日に出願された日本特許出願番号２０１８−２０１９０８号に基づいており、その開示内容は、参照され、全体として、組み入れられている。
２，３…電極、
４…試薬、
５…電気泳動基材、
６…基板、
７…標的物質を含むサンプル、
８…磁石、
９…標的物質−磁性粒子−標識物質の複合体。

Claims (11)

  1. 標的物質を含むサンプルおよび前記標的物質の部位を特異的に認識する第１レセプターが固定された磁性粒子を用いて標的物質−磁性粒子の複合体を形成し、前記標的物質−磁性粒子の複合体を磁気および電気泳動により分離することを有する、標的物質の分離方法。
  2. 標的物質−磁性粒子の複合体を含む混合物を得た後、磁気により前記標的物質−磁性粒子の複合体を所定の位置に集めた後、電気泳動を行うことで、前記混合物から前記標的物質−磁性粒子の複合体を分離する、請求項１に記載の方法。
  3. 前記電気泳動が無担体電気泳動である、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記サンプルは、血液、間質液および尿からなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 標的物質を含むサンプルと、前記標的物質の部位を特異的に認識する第１レセプターが固定された磁性粒子と、前記標的物質の部位とは異なる部位を特異的に認識する第２レセプターが固定された標識物質と、を混合して、標的物質−磁性粒子−標識物質の複合体を含む混合物を得、磁気および電気泳動により前記標的物質−磁性粒子−標識物質の複合体を分離した後、前記標的物質−磁性粒子−標識物質の複合体のシグナル強度を検出することを有する、標的物質量の測定方法。
  6. 標的物質−磁性粒子−標識物質の複合体を含む混合物を得た後、磁気により前記標的物質−磁性粒子−標識物質の複合体を所定に位置に集めた後、電気泳動を行うことで、前記標的物質−磁性粒子−標識物質の複合体と、未反応の第２レセプターが固定された標識物質と、を分離する、請求項５に記載の方法。
  7. 前記電気泳動が無担体電気泳動である、請求項５または６に記載の方法。
  8. 予め量が既知の標的物質を用いて、標的物質量に対する標的物質−磁性粒子−標識物質の複合体のシグナル強度の検量線を作成し、前記検量線および前記検出された標的物質−磁性粒子−標識物質の複合体のシグナル強度に基づいて、前記サンプル中に含まれる標的物質の量を測定する、請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 前記標識物質は、蛍光物質、放射性同位体、酵素およびレドックス物質からなる群より選択される少なくとも一種である、請求項５〜８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 前記サンプルは、血液、間質液および尿からなる群より選択される、請求項５〜９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 標的物質の部位を特異的に認識する第１レセプターが固定されてなる磁性粒子、前記標的物質が認識する部位とは異なる部位を特異的に認識する第２レセプターが固定されてなる標識物質および磁石を含む標的物質に関与する疾患の検査キット。
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