WO2020085165A1 - 標的物質の分離方法および定量方法 - Google Patents

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嘉哉 佐藤
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    • G01N27/44769—Continuous electrophoresis, i.e. the sample being continuously introduced, e.g. free flow electrophoresis [FFE]

Definitions

  • the present disclosure relates to a method for separating and quantifying a target substance.
  • Some peptides existing in the living body change in abundance depending on the disease, and these peptides can be markers for specific diseases.
  • diabetes is a disease in which the glucose level (blood glucose level) in the blood becomes high due to a decreased action of insulin or insufficient secretion.
  • blood glucose level blood glucose level
  • a high blood glucose level persists for a long time, it damages the kidney, retina, peripheral nerves, blood vessels, promotes arteriosclerosis, and becomes a risk factor for myocardial infarction or cerebral infarction. Therefore, for the diagnosis, prevention and treatment of diabetes, it is important to understand the blood glucose level and the blood component concentration of factors related to diabetes.
  • JP-A-2014-145680 a complex of a target substance (for example, blood C-peptide which is a constituent of proinsulin) and a receptor is formed by using two types of receptors having large molecular weight, A method for separating the complex and the free receptor by the difference in molecular weight by electrophoresis has been reported.
  • a target substance for example, blood C-peptide which is a constituent of proinsulin
  • a receptor having large molecular weight
  • a preferred protein as a receptor has a predetermined charge. However, depending on the magnitude relationship between the charge and the molecular weight of the receptor and the target substance, it may be difficult to clearly separate the complex from the receptor even by the method described in JP-A-2014-145680. .
  • the present disclosure has been made in view of the above circumstances, and an object thereof is to provide a means capable of separating a target substance.
  • the present inventor has conducted diligent research to solve the above problems. As a result, they have found that the above problems can be solved by combining electrophoresis and magnetic separation. That is, the above-mentioned object is to form a target substance-magnetic particle complex by using a sample containing a target substance and magnetic particles to which a first receptor that specifically recognizes a site of the target substance is immobilized, It can be achieved by a method of separating a target substance, which comprises separating the complex of magnetic particles by magnetism and electrophoresis.
  • FIGS. 1A and 1B are process drawings for explaining the method of the present disclosure.
  • 2 and 3 are electrodes; 4 is a reagent; 5 is an electrophoretic substrate; 6 is a substrate; 7 is a sample containing a target substance; and 8 is a magnet.
  • . 1C and 1D are process diagrams for explaining the method of the present disclosure.
  • 2 and 3 are electrodes; 5 is an electrophoretic substrate; 6 is a substrate; 8 is a magnet; and 9 is a target substance-magnetic particle-label substance complex, respectively.
  • FIG. 2A is a photograph of a glass square tube before magnetic recovery in an example (manufacture of a glass square tube filled with an electrophoretic solution).
  • FIG. 2B is a photograph of the glass square tube after magnetic recovery in the example (preparation of the migration solution-filled glass square tube).
  • FIG. 3 is a photograph of the electrophoresis device used in the example (electrophoresis).
  • FIG. 4 is a photograph of a glass square tube measured by a fluorescence scanner before and after electrophoresis in an example (electrophoresis).
  • FIG. 5 is a graph showing the relationship between the final concentration of H-FABP and the fluorescence intensity in Examples.
  • a first embodiment of the present disclosure forms a target substance-magnetic particle complex by using a sample containing a target substance and magnetic particles to which a first receptor that specifically recognizes a site of the target substance is immobilized,
  • a method of separating a target substance which comprises separating the target substance-magnetic particle complex by magnetism and electrophoresis. According to this mode, the target substance can be separated regardless of the type (for example, charge or molecular weight) of the target substance. Moreover, according to the said form, the target substance which is difficult to detect can be isolate
  • a second aspect of the present disclosure is that a sample containing a target substance, magnetic particles to which a first receptor that specifically recognizes the site of the target substance is immobilized, and a site different from the site of the target substance are specific.
  • the target substance-magnetic particles-labeling substance is obtained by magnetic and electrophoresis by mixing the target substance-magnetic particle-labeling substance complex with a labeling substance having a second receptor that is immobilized on the target substance.
  • the method for measuring the amount of a target substance which comprises detecting the signal intensity of the complex of the target substance-magnetic particle-labeled substance after separating the complex.
  • the target substance amount can be measured with high accuracy regardless of the type (for example, charge or molecular weight) of the target substance. Moreover, according to the said form, even if it is a target substance which is difficult to detect, the amount of target substances can be measured with high precision.
  • first receptor that specifically recognizes the site of the target substance
  • first receptor a magnetic particle having a first receptor immobilized which specifically recognizes a site of a target substance
  • second receptor that specifically recognizes a site different from the site of the target substance
  • labeling substance having the second receptor immobilized thereon that specifically recognizes a site different from the target substance is also simply referred to as the “second receptor-immobilized labeling substance” or the “labeling substance according to the present disclosure”.
  • X to Y indicating a range includes X and Y and means “greater than or equal to X and less than or equal to Y”.
  • the operation and the measurement of physical properties were performed at room temperature (20 to 25 ° C.) / Relative humidity of 40 to 50% RH, but the conditions are not limited to these.
  • a first embodiment of the present disclosure forms a target substance-magnetic particle complex by using a sample containing a target substance and magnetic particles to which a first receptor that specifically recognizes a site of the target substance is immobilized,
  • a method of separating a target substance which comprises separating the target substance-magnetic particle complex by magnetism and electrophoresis.
  • a complex of a target substance and magnetic particles is formed via the first receptor.
  • the magnetic particles contained in this complex are captured at a predetermined position by magnetism. Therefore, if electrophoresis is performed while or while capturing the complex with magnetism, the complex does not move while being fixed at a predetermined position by magnetism.
  • components other than the complex for example, components derived from a living body such as blood cells
  • the target substance can be selectively separated and collected. Since the method of the present disclosure is a method of recovering a target substance of interest using magnetic particles, the target substance can be efficiently separated regardless of the type of target substance (eg, charge, isoelectric point or molecular weight). .
  • the target substance is appropriately selected according to the purpose (type of disease to be diagnosed). Therefore, the target substance is not particularly limited. Specifically, insulin, insulin precursor (eg, C-peptide), GLP-1 (glucagon-like peptide-1), GIP (glucose-dependent insulin secretagogue polypeptide), adiponectin, H-FABP (cardiac fatty acid) Binding protein), myoglobin, troponin I, troponin T, BNP (brain natriuretic peptide), NT-ProBNP (N-terminal pro-brain natriuretic peptide), proteins such as fatty acid binding protein, peptides, sugar chains, nucleic acids, low molecular weight compounds , Polymer compounds and complexes thereof.
  • insulin precursor eg, C-peptide
  • GLP-1 glucagon-like peptide-1
  • GIP glucose-dependent insulin secretagogue polypeptide
  • H-FABP cardiac fatty acid Binding protein
  • the target substance is preferably a protein or a peptide from the viewpoint of benefit and generality, and the protein or peptide (eg, insulin, C-peptide, etc.) used in the examination of body fluids such as blood and urine is preferable. ) Is more preferable.
  • the above-mentioned protein or peptide is a free form, a modified form modified with a phosphate group, a methyl group, an acetyl group, a sugar chain, a lipid, a nitrile group, an acid (eg, an inorganic acid, an organic acid) or a base ( Examples thereof include a salt with an alkali metal salt), a protein or peptide bound to another substance such as a nuclear protein bound to a nucleic acid.
  • the above-mentioned protein may be naturally derived or synthetic.
  • protein means a polypeptide of 10 kDa or more, and a peptide means a polypeptide of less than 10 kDa.
  • the sample containing the target substance is not particularly limited as long as it contains the desired target substance as described above. Specifically, test samples (blood, plasma, serum, tissue, joint fluid, urine, lymph, etc.), cells (cultured cells, cell lines, etc.), culture supernatants thereof, extracts thereof, partial purification thereof. Fractions are included.
  • the origin of the test sample is not particularly limited, and humans or mammals other than humans (for example, rats, mice, hamsters, rodents such as guinea pigs; sheep, pigs, livestock such as cows and horses; rabbits, Pets such as cats and dogs; primates such as rhesus monkeys, green monkeys, cynomolgus monkeys, and chimpanzees).
  • samples such as soil and water in various environments or extracts from the samples may be used.
  • the sample containing the target substance is preferably a test sample, and blood (eg, whole blood, plasma, serum, etc.), interstitial fluid and urine are more preferable.
  • blood eg, whole blood, plasma, serum, etc.
  • interstitial fluid and urine are more preferable.
  • the sample is selected from the group consisting of blood, interstitial fluid and urine.
  • the target substance may be used as a sample as it is, without being purified (extracted), or may be used after being purified (extracted).
  • a test sample such as blood, plasma, serum, tissue, biological fluid such as synovial fluid, urine, or lymph of a subject may be used.
  • the test sample may be subjected to treatments such as dilution and purification.
  • the target substance may be prepared by purification using a known protein purification method. Specifically, for example, mammalian tissues or cells are homogenized in the presence of an appropriate buffer, and the crude extract fractions of the obtained tissues are subjected to reverse phase chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, etc. It can be purified by subjecting it to chromatography and the like.
  • the target substance may be a commercially available product.
  • the magnetic particles (first receptor-immobilized magnetic particles) according to the present disclosure are formed by immobilizing the first receptor (for example, on the surface) that specifically recognizes the site of the target substance.
  • the “receptor” refers to a substance that can specifically bind to a target substance.
  • the receptor maintains the binding activity to the target substance during electrophoresis (for example, in electrophoresis buffer).
  • the first receptor specifically recognizes a site (site 1) where the target substance is present.
  • the second receptor specifically recognizes a site (site 2) of the target substance different from the site (site 1) of the target substance recognized by the first receptor.
  • the receptor is not particularly limited, and examples thereof include an antibody, a fragment of an antibody having an activity of binding to a target substance (antibody fragment), a nucleic acid such as a DNA aptamer, a protein, a receptor composed of a protein, a binding protein, a peptide, Examples include biological receptors, chemically synthesized receptors, sugar chains and the like. Among these, it is preferable to use an antibody or an antibody fragment as a receptor because of its high specific binding property with a target substance.
  • the first receptor is preferably an antibody or a fragment of an antibody that recognizes a structural unit (epitope) (epitope 1) consisting of a specific sequence of a target substance.
  • the second receptor is preferably an antibody or an antibody fragment that recognizes an epitope (epitope 2) different from epitope 1.
  • the second receptor may be a receptor (including a ligand) that specifically recognizes the first receptor.
  • a monoclonal antibody a polyclonal antibody, a single chain antibody, a modified antibody (for example, a "humanized antibody” in which only the antigen recognition site is humanized), a chimeric antibody, and a bifunctional compound capable of simultaneously recognizing two epitopes are used.
  • An antibody etc. are mentioned.
  • the antibody may be of any class, such as IgA, IgD, IgE, IgG, IgM. From the viewpoint of specific binding to an epitope, it is preferable to use a monoclonal antibody, and it is more preferable to use an IgG monoclonal antibody.
  • antibody fragments include Fab fragments, Fab 'fragments, F (ab)' 2 fragments, single chain antibodies (scFv), scFv-Fc, minibodies, and diabodies produced by genetic engineering. And a derivative thereof modified with a molecule having a protein stabilizing action such as polyethylene glycol (PEG).
  • the receptor may be an antibody treated with various proteases, or may be an arbitrary tag attached depending on the purpose.
  • the receptor that binds to the target substance can be produced by a conventionally known method.
  • a monoclonal antibody can be produced by the following procedure. First, the antigen is administered to the site where the antibody can be produced by administering the antigen of the animal, itself or together with the carrier and the diluent. Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered to enhance the antibody-producing ability upon administration. Examples of animals used include mammals such as monkeys, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep and goats. The antibody titer in the antiserum can be measured by a conventional method.
  • a monoclonal antibody-producing hybridoma can be prepared.
  • the fusion operation can be performed according to a known method, for example, the method described in Nature 256: 495 (1975).
  • the fusion accelerator include polyethylene glycol (PEG) and the like.
  • myeloma cells include NS-1, P3U1, SP2 / 0 and the like.
  • the selection of the monoclonal antibody can be carried out by a known method or a method analogous thereto, but usually it can be carried out in a medium for animal cells supplemented with HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine).
  • HAT hyperxanthine, aminopterin, thymidine
  • any medium can be used as long as the hybridoma can grow.
  • the antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the antibody titer in antiserum.
  • Separation and purification of the monoclonal antibody is similar to the separation and purification of ordinary polyclonal antibodies, for example, salting out method, alcohol precipitation method, isoelectric focusing method, electrophoresis method, adsorption / desorption method using ion exchanger (for example, DEAE), It can be performed according to a method for separating and purifying immunoglobulin by a specific purification method such as ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen-binding solid phase or protein A or protein G, and antigen affinity purification.
  • a specific purification method such as ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen-binding solid phase or protein A or protein G, and antigen affinity purification.
  • polyclonal antibodies can be produced, for example, by the following procedure.
  • Polyclonal antibodies include, for example, a peptide containing an epitope as an antigen, form a complex with a carrier, immunize a mammal in the same manner as in the above-described method for producing a monoclonal antibody, and contain an antibody against active haptoglobin from the immunized animal. It can be produced by collecting the product and separating and purifying the antibody.
  • the kind of the carrier and the mixing ratio of the antigen and the carrier are such that if the antibody can be efficiently produced against the antigen cross-linked to the carrier, what It may be crosslinked in a ratio.
  • the carrier for example, bovine serum albumin, bovine thyroglobulin, keyhole limpet hemocyanin, etc. are used.
  • various condensing agents can be used for the coupling between the antigen and the carrier, and glutaraldehyde, carbodiimide, maleimide active ester, active ester reagent containing a thiol group, dithiopyridyl group and the like are used.
  • the complex of the antigen and the carrier is administered to the immunized animal at a site where antibody production is possible, itself or together with the carrier and the diluent.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered to enhance the antibody-producing ability upon administration.
  • the administration can be usually performed once every about 2 to 6 weeks and about 3 to 10 times in total.
  • animals used include the same mammals as in the case of producing monoclonal antibodies.
  • the polyclonal antibody can be collected from blood, ascites, etc., preferably blood of an animal immunized by the above method.
  • the polyclonal antibody titer in the antiserum can be measured in the same manner as the above-mentioned antibody titer in the serum. Separation and purification of the polyclonal antibody can be performed by the same procedure as the above-mentioned separation and purification of the monoclonal antibody.
  • C-peptide is the target substance
  • Monoclonal mouse anti-human C-peptide (7E10) manufactured by abcam
  • AntiC-peptide antibody (5B8) Mae monoclonal (manufactured by abcam)
  • Anti-C-peptide antibody (2B7) Mae monoclonal (abcam)
  • Anti C-peptide antibody (2A11) Mae monoclonal (abnova)
  • Anti-h C-peptide 9101 SPTN-5 Mouse monoclonal ( Anti-hC-peptide9103SPRN-5 (Mouse monoclonal (Medix Biochemical)
  • AntiC-peptideantibody (4H8) Maemonoclonal (abcam)
  • AntiC-peptideantibody (4H8) Mousemonoclonal (abcam)
  • the magnetic particles are not particularly limited as long as they have magnetism.
  • Magnetite Fe 3 O 4
  • nickel zinc ferrite Ni 1-X Zn X Fe 2 O 4
  • manganese zinc ferrite Mn 1-x Zn X Fe 2 O 4
  • iron, manganese, nickel, cobalt It is composed of a metal such as chrome or a magnetic material such as an alloy of cobalt, nickel or manganese.
  • the average particle size (primary particle size) of the magnetic particles is not particularly limited, and can be appropriately selected according to the electrophoresis conditions (for example, the inner diameter of the electrophoretic substrate, compatibility with the electrophoretic buffer) and the like.
  • the average particle size (primary particle size (diameter)) of the magnetic particles is preferably 50 nm to 20 ⁇ m, more preferably 100 nm to 10 ⁇ m, particularly preferably from the viewpoints of mobility, dispersibility, and sufficient magnetic force during electrophoresis. Is 1 to 5 ⁇ m.
  • particle size means the maximum distance among the distances between any two points on the contour line of the magnetic particles.
  • average particle size means that 300 or more particles are extracted from a photograph taken by a scanning electron microscope (SEM), a transmission electron microscope (TEM) or an optical microscope, and It is a value calculated by measuring the diameter and averaging the numbers.
  • the surface of the magnetic particles may be coated with a polymer or the like.
  • the polymer is not particularly limited, and known polymers used in the field of biochemistry (for example, carriers, polymer beads, magnetic particles) can be used in the same manner or modified appropriately.
  • Specific examples include radically polymerizable polymers such as (meth) acrylate-based polymers and styrene-based polymers.
  • polymers having a hydrophobic surface such as polystyrene and polycyclohexylmethacrylate capable of binding biochemical substances
  • polymers having a surface functional group such as a carboxyl group or a tosyl group can be preferably used.
  • the coating film is at least one selected from the group consisting of an amino group, an aldehyde group, a carboxy group, a tosyl group, a mercapto group, a hydroxy group and an epoxy group. It may have a polar group. In such a case, a target substance or a receptor such as an antibody can be easily bound (carried) to the magnetic particles via the polar group.
  • a modifier may be immobilized on the surface of the magnetic particles.
  • the modifier is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the desired application. Specifically, proteins such as biotin, avidin, streptavidin, neutravidin, protein A, protein G, protein L, antigens, antibodies and enzymes; nucleic acids such as DNA and RNA; and low molecular drugs, physiologically active substances, oligos Examples include low molecular weight compounds such as peptides, oligonucleotides and lipids. By modifying with such a modifier, binding to the receptor can be facilitated.
  • the method for immobilizing (modifying) the modifying substance on the magnetic particles is not particularly limited, and, for example, JP 2007-262114 A and JP 2008-32411 A (corresponding to US 2008/026222 A1).
  • JP 2007-262114 A and JP 2008-32411 A corresponding to US 2008/026222 A1.
  • the methods described in JP-A-2012-177691 and the like can be applied in the same manner or with appropriate modifications.
  • the magnetic particles used may be beads coated with a polymer or gel (for example, methacrylate or dextran) on a plurality of magnetic materials such as magnetic beads and magnetic agarose beads, and antibody-bound magnetic beads and tag-antibody-bound beads.
  • a polymer or gel for example, methacrylate or dextran
  • magnetic particles appropriately modified according to the purpose may be used.
  • Magnosphere TM MS300 / Streptavidin, Magnosphere TM MS160 / Streptavidin, Magnosphere TM SS150 / Streptavidin, Magnosphere TM SS550 / Streptavidin streptavidin-labeled magnetic beads, such as, Magnosphere TM MS300 / Carboxyl, Magnosesphere TM MS160 / Carboxyl, Magnosphere TM MX200 / Carboxyl, Magnosesphere TM SS150 / Carboxyl, Magnosphere TM SS550 / Carboxylc, etc. SSRlifec. Rubokishi group introducing magnetic beads, Magnosphere TM MS300 / Tosyl, tosyl group introduction magnetic beads such Magnosphere TM MS160 / Tosyl can be mentioned.
  • the method of immobilizing the first receptor on the surface of the magnetic particles is also not particularly limited.
  • a receptor eg, antibody
  • a receptor eg, antibody
  • streptavidin-labeled magnetic beads e.g., a receptor in which a receptor (eg, antibody) is labeled with biotin and the biotin-labeled receptor is bound to streptavidin-labeled magnetic beads, a receptor (eg, antibody) is labeled with streptavidin, and the streptavidin-labeled receptor is labeled with biotin.
  • Specific binding pair labeling method of chemically binding a substance showing specific binding property to a pair of substances such as a method of binding to a labeled magnetic bead; NHS method of selectively activating by N-hydroxysuccinimide (NHS) to form —COO—NHS group on the bead surface and binding to a receptor (eg, antibody) via this —COO—NHS group; , Antibody) disulfide bond is reduced with a reducing agent to produce a sulfhydryl group.
  • a receptor eg, antibody
  • Antibody disulfide bond is reduced with a reducing agent to produce a sulfhydryl group.
  • a known method such as a glutaraldehyde method for reducing a base to —CH 2 NH— can be used in the same manner or with appropriate modification.
  • the amount of the first receptor-immobilized magnetic particles according to the present disclosure is not particularly limited and is appropriately selected according to the amount of the target substance, but is usually large relative to the amount of the target substance.
  • the amount of the first receptor-immobilized magnetic particles according to the present disclosure used is preferably 1 to 10000 mol or less, more preferably more than 1 mol and 1000 mol, particularly preferably 10 to 1000 mol, based on 1 mol of the target substance.
  • An amount such that the first receptor (eg, antibody) is present.
  • the amount of the first receptor-immobilized magnetic particle is the above-mentioned preferable amount as the weight.
  • the amount of the target substance can be predicted to some extent by those skilled in the art, for example, the amount of insulin contained in blood, and the upper limit of the predicted range is set as the target substance amount. If the person skilled in the art cannot predict the amount of the target substance, the first receptor may be used in an excessive amount (for example, 0.1 to 100 ⁇ g / mL of the first receptor in the reaction solution).
  • target substance-magnetic particle complex By mixing the sample containing the target substance with the magnetic particles (first receptor-immobilized magnetic particles) according to the present disclosure, the target substance and the magnetic particles are bound via the first receptor, and the target substance-magnetic A complex of particles is formed.
  • the target substance-magnetic particle complex forming conditions at this time are not particularly limited as long as the desired complex is formed.
  • the sample containing the target substance and the first receptor-immobilized magnetic particles are mixed in a buffer solution.
  • the buffer solution is not particularly limited, and a known buffer solution can be used.
  • a solution containing an organic acid such as citric acid, succinic acid, tartaric acid, malic acid and the like, salts thereof; amino acids such as glycine, taurine, arginine; hydrochloric acid, nitric acid, sulfuric acid, phosphorus
  • solutions containing an acid, boric acid, an inorganic acid such as acetic acid, and salts thereof include, for example, Good's buffer (Tris-glycine buffer, Tris buffer, Tris-tricine buffer, Bis-Tris buffer, PIPES buffer, Tris-HCl buffer).
  • MOPS buffer solution MOPS buffer solution, HEPES buffer solution, PIPES buffer solution, ACES buffer solution, MOPSO buffer solution, BES buffer solution, TES buffer solution, DIPSO buffer solution, TAPSO buffer solution, POPSO buffer solution, HEPPSO buffer solution, EPPS buffer solution, TAPS buffer, Bicine buffer, CHES buffer, CAPSO buffer, CAPS buffer, etc.), phosphate buffer (PBS), acetate buffer, carbonate buffer, glycine buffer and the like.
  • the above buffer solutions may be used alone or in the form of a mixture of two or more kinds.
  • the buffer solution may contain a stabilizing agent such as EDTA, bovine serum albumin (BSA), casein, polyethylene glycol, and a nonionic surfactant such as Tween and Triton-X.
  • the pH of the buffer solution is not particularly limited, and is not particularly limited as long as the receptor maintains the target substance binding activity. Considering, for example, the ability of the receptor to maintain the binding activity to the target substance, it is usually preferable that the neutrality is in the vicinity of weak basicity. From such a viewpoint, the pH of the buffer solution is more preferably 6.0 to 9.0, and particularly preferably 6.0 to 8.0.
  • the mixing temperature is preferably 4 to 40 ° C, more preferably 4 to 25 ° C.
  • the mixing time is preferably 1 to 72 hours, more preferably 8 to 24 hours. Alternatively, the mixing time is preferably 1 to 60 minutes, more preferably 5 to 30 minutes.
  • Target substance-magnetic particle in which one or two target substances are bound to one magnetic particle by mixing (reaction) with a sample containing the target substance and the magnetic particles (first receptor-immobilized magnetic particles) according to the present disclosure
  • the reaction liquid containing the complex of (1) when a reducing antibody is used, a target substance-magnetic particle complex in which one target substance is bound to one magnetic particle) and unreacted magnetic particles are obtained.
  • the target substance-magnetic particle complex thus formed is separated by magnetism and electrophoresis. That is, the magnetic particles contained in the target substance-magnetic particle complex are captured at a predetermined position by magnetism. Therefore, when the complex is magnetically captured or after the complex is electrophoresed, the complex remains magnetically fixed at a predetermined position, and a component other than the complex (for example, from a living body such as blood cells) Component) moves or does not move at all. Therefore, according to the method of the present disclosure, the target substance (target substance-magnetic particle complex) can be efficiently separated / collected regardless of the type of the target substance or even if the target substance is difficult to detect.
  • the target substance-magnetic particle complex may be in the form of being contained in a buffer solution as obtained in the above (formation of target substance-magnetic particle complex), or from the buffer solution It may be in a separated form, or may be in a state of being separated from the buffer and then dispersed in another buffer.
  • the electrophoresis is not particularly limited, and known electrophoresis can be used. Specifically, gel electrophoresis such as agarose gel electrophoresis, pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) and poly-acrylamide gel electrophoresis (PAGE), pH in the electrophoresis gel Gradient isoelectric focusing, two-dimensional electrophoresis combining isoelectric focusing (first dimension) and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), urea or formamide as denaturant Examples include carrier electrophoresis such as denaturant concentration gradient gel electrophoresis (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis; DGGE) to be used; and carrier-free electrophoresis such as carrier-free isoelectric focusing and microchip electrophoresis.
  • gel electrophoresis such as agarose gel electrophoresis, pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) and poly-acrylamide gel electrophores
  • gels such as dextran may be used instead of the carriers such as the capillary polymer described below in the above carrier electrophoresis.
  • carrier-free electrophoresis is preferred for the following reasons. For example, when carrier electrophoresis is performed using blood (whole blood) as a sample, blood cell pools are formed at the interface between the sample and the carrier (eg, gel). This blood cell pool can eliminate the influence on the measurement of the target substance if the target substance in the normal concentration range (for example, when the sample contains the target substance in the order of mM to ⁇ M) is detected.
  • the electrophoresis is carrier-free electrophoresis.
  • the target substance-magnetic particle complex is separated from other components by magnetism.
  • the other component separated means a component other than the target substance.
  • components for example, blood components
  • constituent components of a diluent for example, buffer solution
  • a magnet is installed at a predetermined position in the electrophoresis direction.
  • the magnet is not particularly limited as long as it can capture magnetic particles. Specific examples include rare earth magnets (neodymium magnets, bonded magnets, etc.), ferrite magnets, electromagnets, and the like.
  • FIG. 1A to 1D are process charts for explaining the method of the present disclosure.
  • an electrophoretic substrate eg, capillary
  • a reagent 4 containing first receptor-immobilized magnetic particles The electrophoretic substrate 5 is placed on the substrate 6 of the electrophoretic device. Further, electrodes (for example, platinum electrodes) 2 and 3 are installed on both ends of the electrophoretic substrate 5. Thereby, an electric field is applied in the longitudinal direction of the electrophoretic substrate 5.
  • the reagent may be composed only of the first receptor-immobilized magnetic particles.
  • the reagent is, in addition to the first receptor-immobilized magnetic particles, a pH adjusting agent (for example, sodium hydroxide, sodium carbonate, sodium hydrogen carbonate, sulfuric acid, hydrochloric acid, phosphoric acid, etc.), a buffering agent (sodium hydrogen phosphate, phosphorus). Sodium acid, Tris-HCL, etc.), haemolytic agents such as saponin, and surfactants may be included.
  • a pH adjusting agent for example, sodium hydroxide, sodium carbonate, sodium hydrogen carbonate, sulfuric acid, hydrochloric acid, phosphoric acid, etc.
  • a buffering agent sodium hydrogen phosphate, phosphorus
  • haemolytic agents such as saponin, and surfactants may be included.
  • the electrophoretic substrate 5 is not particularly limited, but is preferably transparent from the viewpoint of visibility of the flow of the complex.
  • the electrophoretic substrate is preferably made of a transparent resin such as an acrylic resin, a transparent material such as quartz glass, synthetic quartz. From the viewpoint of less autofluorescence, an electrophoretic substrate made of quartz glass or synthetic quartz is more preferable, and an electrophoretic substrate made of synthetic quartz is particularly preferable. Alternatively, from the viewpoint of cost, an electrophoretic substrate made of transparent resin is particularly preferable.
  • the shape of the electrophoretic substrate 5 is not particularly limited, and may be a column, a prism, or the like.
  • the electrophoretic substrate 5 has a rectangular fragmental shape, particularly a rectangular prism.
  • the size of the electrophoretic substrate 5 is also not particularly limited. Considering the ease of flow of buffers and samples, and the effect of preventing / suppressing electroosmotic flow (EOF), the maximum length of the cross section of the electrophoretic substrate 5 (one side (inner side if the cross section is square)
  • the length () and the inner diameter (diameter) when the cross section is circular are preferably 0.1 to 2 mm, more preferably 0.5 to 1 mm.
  • the length of the electrophoretic substrate 5 is preferably 1 to 10 cm, more preferably 2 to 5 cm.
  • the substrate 6 is not particularly limited, but is preferably transparent from the viewpoint of visibility of the flow of the composite.
  • the substrate is preferably formed of a transparent resin such as an acrylic resin, a transparent material such as quartz glass, synthetic quartz. From the viewpoint of less self-fluorescence, quartz glass and synthetic quartz substrates are more preferable, and synthetic quartz substrates are particularly preferable.
  • the transparent resin substrate 6 is particularly preferable in terms of cost.
  • the sample 7 containing the target substance is dropped on the platinum electrode 2 side.
  • the sample 7 enters the electrophoretic substrate 5 by the capillary phenomenon and mixes with the reagent 4.
  • the target substance in the sample 7 and the first receptor existing in the first receptor-immobilized magnetic particles react with each other to form a target substance-magnetic particle complex.
  • the dropping amount of the sample 7 (specimen 1) containing the target substance is not particularly limited and is appropriately set according to the size of the electrophoretic substrate.
  • the reaction conditions are not particularly limited, but the conditions as described above can be applied in the same manner.
  • the sample 7 is dropped on the plus (+) electrode 2 side, but the present invention is not limited to this embodiment. As described above, this form is particularly preferably applied when the carboxyl group (—COOH) present in the protein is negatively charged.
  • the amount of the first receptor-immobilized magnetic particles in the reagent is not particularly limited, but is similar to that described in the above section (Magnetic particles to which the first receptor that specifically recognizes the site of the target substance is immobilized). Can be used.
  • the reagent containing the first receptor-immobilized magnetic particles is previously filled in the electrophoretic substrate 5, but the first receptor-immobilized magnetic particles and the target substance are preliminarily reacted with each other to form a target substance-magnetic particle composite.
  • the reaction product may be filled in the electrophoretic substrate 5 (second embodiment). In the case of the second embodiment, it is preferable to separately provide a chamber (not shown) for the above reaction on the substrate 6.
  • a reagent solution containing the first receptor-immobilized magnetic particles and a buffer is dropped on both ends of the electrophoretic substrate to form a liquid pool, and the electrophoretic substrate is filled with the reagent solution by a capillary phenomenon.
  • electrodes for example, platinum electrodes 2 and 3 may be installed on both ends of the electrophoretic substrate 5, and a sample containing a target substance may be dropped on either of the electrodes (third embodiment).
  • the buffer is not particularly limited as long as it is in an environment in which the receptor maintains the target substance binding activity, and a buffer solution usually used for electrophoresis is used in the same manner or with appropriate modification. it can.
  • the buffer solution is not particularly limited as long as it is a solution containing a conventionally known buffer composition having a buffering ability.
  • a buffer solution containing a conventionally known buffer composition having a buffering ability can be used.
  • the same buffer solution as exemplified in the above section (Formation of target substance-magnetic particle complex) can be used.
  • a buffer solution or the like provided in a commercially available electrophoresis kit can be used.
  • the electrophoresis buffer can be used at a concentration generally used as an electrophoresis buffer.
  • the pH of the buffer solution is not particularly limited, and is not particularly limited as long as the receptor maintains the target substance binding activity.
  • the pH of the buffer solution is more preferably 6 to 9.
  • carboxyl groups present in the protein (-COOH) is negatively charged (-COO - becomes) because, electrophoresis The movement of the complex inside can be promoted.
  • the pH of the buffer solution may be adjusted using an acidic substance such as hydrochloric acid or a basic substance such as sodium hydroxide.
  • the magnet 8 is installed on the platinum electrode 2 (anode) side of the electrophoretic substrate 5.
  • the magnetic particles contained in the target substance-magnetic particle complex are captured by the magnet 8.
  • FIG. 1C after moving the magnet 8 in the longitudinal direction of the electrophoretic substrate 5, electrophoresis is started.
  • the target substance-magnetic particle complex can be selectively separated. That is, according to a preferred embodiment of the present disclosure, after a mixture containing a target substance-magnetic particle complex is obtained, the target substance-magnetic particle complex is magnetically captured at a predetermined position, and then electrophoresis is performed. Thus, the target substance-magnetic particle complex is separated from the mixture.
  • the moving position of the magnet 8 is not particularly limited, but it is preferable to install the magnet 8 on the cathode side (the platinum electrode 3 in FIG. 1C) side of the electrophoretic substrate 5.
  • a component to be separated from the target substance in the sample for example, a substance that causes noise or background rise at the time of detection (in the second embodiment described below, blood cells that emit autofluorescence, A substance having fluorescence, etc.) moves to the anode side. Therefore, at the time of detection, it is possible to increase the distance between the target substance-magnetic particle complex and the substance that may become noise in the electrophoretic substrate 5.
  • X indicates the length (corresponding to the total length of the electrophoretic substrate 5) (mm) between the cathode and the anode.
  • Y indicates the distance (mm) from the cathode to the midpoint (center) of the width of the magnet.
  • the relationship of the installation distance of the magnet with respect to the cathode and the anode can be made opposite to that of the second embodiment depending on the type of the detection substance.
  • the electrophoresis conditions are not particularly limited as long as components other than the complex (for example, impurities derived from the sample) can be separated, and usual conditions can be applied.
  • the applied voltage in electrophoresis may be appropriately selected from the range generally used in this field, and is usually a direct current voltage, preferably 5 to 200 V, and more preferably 10 to 100 V.
  • Electrophoresis times can usually be 30-180 minutes. From the viewpoint of rapid separation, the migration time is preferably several minutes to 10 minutes.
  • the electrophoresis temperature is not particularly limited, but is usually room temperature (20 to 25 ° C.).
  • the sample immediately before the electrophoresis includes, in addition to the components contained in the sample (for example, components derived from a living body such as blood cells) and the components contained in the buffer solution, It includes a target substance-magnetic particle complex and unreacted magnetic particles.
  • the target substance-magnetic particle complex and unreacted magnetic particles are captured by the magnet.
  • the magnetic particles trapped in one place are usually visible (see, for example, FIG. 2B). Therefore, the target substance can be efficiently separated from the components (for example, blood cells) contained in the sample or the buffer solution by removing only the electrophoretic substrate portion where the magnet is arranged by cutting out or the like.
  • a second aspect of the present disclosure is that a sample containing a target substance, magnetic particles to which a first receptor that specifically recognizes the site of the target substance is immobilized, and a site different from the site of the target substance are specific.
  • the target substance-magnetic particles-labeling substance is obtained by magnetic and electrophoresis by mixing the target substance-magnetic particle-labeling substance complex with a labeling substance having a second receptor that is immobilized on the target substance.
  • the method for measuring the amount of a target substance which comprises detecting the signal intensity of the complex of the target substance-magnetic particle-labeled substance after separating the complex.
  • the target substance and the magnetic particle are bound to each other via the first receptor, the target substance and the labeling substance are bound to each other via the second receptor, and the composite of the magnetic particle, the target substance and the labeling substance is combined.
  • a body (complex of target substance-magnetic particles-labeling substance) is formed.
  • the magnetic particles contained in this complex are captured at a predetermined position by magnetism. For this reason, when the complex (target substance-magnetic particle-labeled substance complex) is magnetically captured while or after being captured, the complex remains magnetically fixed at a predetermined position.
  • Components other than the body for example, living body-derived components such as blood cells and proteins move.
  • the target substance can be selectively separated and collected.
  • the method of the present disclosure is a method of recovering a target substance of interest using magnetic particles, the target substance can be efficiently separated regardless of the type of target substance (eg, charge, isoelectric point or molecular weight). . Further, the target substance-magnetic particle-labeled substance complex can be selectively recovered, so that the amount of the target substance of interest can be measured with high accuracy.
  • the type of target substance eg, charge, isoelectric point or molecular weight
  • the labeling substance according to the present disclosure (second receptor-immobilized labeling substance) is formed by immobilizing a second receptor (for example, on the surface) that specifically recognizes a site different from the recognition site of the first receptor.
  • the second receptor is not particularly limited, and is the same as described for the magnetic particles (first receptor-immobilized magnetic particles) according to the present disclosure, and therefore the description thereof is omitted here.
  • the second receptor recognizes a site different from that of the first receptor, that is, the first receptor and the second receptor (eg, antibody) recognize different sites of one target substance.
  • Monoclonal mouse anti-human fatty acid binding protein (25) is used as the first receptor
  • Monoclonal mouse anti-human fatty acid binding protein (25) is used.
  • the labeling substance (the labeling substance before the second receptor is immobilized) is not particularly limited as long as it can be used to measure the desired amount of the target substance in the subsequent step.
  • Preferred examples include fluorescent substances, radioisotopes, enzymes and redox substances.
  • the labeling substances may be used alone or in combination of two or more. That is, according to a preferred embodiment of the present disclosure, the labeling substance is at least one selected from the group consisting of a fluorescent substance, a radioisotope, an enzyme and a redox substance.
  • the fluorescent substance is not particularly limited, and a substance usually used for measuring the amount of the target substance can be used.
  • Alexa Flour Life Inc.
  • Hilyte Flour Ana spec Inc.
  • IRDye Manufactured by LI-COR Biosciences
  • IRDye 800CW Maleimide manufactured by LI-COR Biosciences
  • FITC Fluorescein Ethycoate
  • FITC Fluorescein ethyrothiate
  • APC Allophycocyanin
  • Cy-3 Cy-5, tetramethylrhodamine isocyanate
  • semiconductor quantum dots and the like it is preferable to use a fluorescent dye that excites on the long wavelength side.
  • the radioisotope is not particularly limited, and those usually used for measuring the amount of the target substance can be used. Specific examples thereof include radioisotopes such as 125 I, 32 P, 14 C, 35 S and 3 H.
  • the enzyme is not particularly limited, and an enzyme usually used for measuring the amount of the target substance can be used.
  • redox substance is not particularly limited, and those usually used for measuring the amount of the target substance can be used.
  • redox metal ions selected from iron, vanadium, chromium, zinc, and mixtures thereof, and more specifically, ferrocene, 1,1′-dimethylferrocene, ferrocyanide and Examples thereof include ferricyanide, ruthenium (III) and ruthenium (II) hexaamine, PMS (phenzine methosulfate), and m-PMS.
  • the method for immobilizing the second receptor on the labeling substance is also not particularly limited, and is the same as that described for the magnetic particles according to the present disclosure (first receptor-immobilized magnetic particles), and therefore the description is omitted here. It should be noted that, in the description of the “method for immobilizing the magnetic particle first receptor” in the above (magnetic particles having the first receptor specifically recognizing the site of the target substance immobilized), the term “magnetic beads” or “magnetic particles” is used. It can be applied by replacing it with "labeled substance”.
  • the amount of the second receptor-immobilized labeling substance according to the present disclosure is not particularly limited and is appropriately selected according to the amount of the target substance, but is usually large relative to the amount of the target substance.
  • the amount of the second receptor-immobilized labeling substance according to the present disclosure used is 1 mol of the target substance.
  • the amount is preferably more than 1 mol and 100 mol or less, more preferably more than 1 mol and 50 mol or less, particularly preferably 2 to 50 mol of the second receptor (eg, antibody). .
  • the amount of the second receptor-immobilized labeling substance is twice the preferable amount described above.
  • the amount of the labeling substance can be predicted to some extent by those skilled in the art, for example, the amount of insulin contained in blood, and the upper limit of the expected range is set as the amount of the labeling substance. If the person skilled in the art cannot predict the amount of the labeling substance, an excess amount of the second receptor-immobilized labeling substance (for example, 0.1-100 ⁇ g / mL of the second receptor-immobilized labeling substance or 1-100 nM in the reaction solution) is used. Of the second receptor (eg, an antibody) may be used.
  • the mixing ratio of the labeling substance according to the present disclosure (second receptor-immobilized labeling substance) and the magnetic particles according to the present disclosure (first receptor-immobilized magnetic particles) is not particularly limited, but the first receptor-immobilized magnetic particles are more preferable. Is preferably present in a larger amount than the second receptor-immobilized labeling substance. As a result, the labeling substance present in the sample can be more efficiently captured while effectively suppressing the decrease in sensitivity due to the unreacted labeling substance.
  • the labeling substance according to the present disclosure when one target substance is bound to both the labeling substance and the magnetic particles (for example, in the case of a magnetic particle or a labeling substance to which a reducing antibody is immobilized), the labeling substance according to the present disclosure (second receptor immobilization)
  • the mixing ratio of the labeling substance) and the magnetic particles according to the present disclosure is such that the first receptor binding to the magnetic particles according to the present disclosure binds to the labeling substance according to the present disclosure.
  • the proportion is preferably more than 1 mol and not more than 10,000 mol, more preferably 10 to 1000 mol, and particularly preferably more than 10 mol and not more than 50 mol, relative to 1 mol. With such a mixing ratio, the labeling substance present in the sample can be captured more efficiently while suppressing the decrease in sensitivity due to the unreacted labeling substance more effectively.
  • Target substance-magnetic particle-label substance complex Formation of target substance-magnetic particle-label substance complex
  • first receptor-immobilized magnetic particles By mixing a sample containing the target substance with the magnetic particles according to the present disclosure (first receptor-immobilized magnetic particles) and the labeling substance according to the present disclosure (second receptor-immobilized labeling substance), it is possible to pass through the first receptor.
  • the target substance and the magnetic particles are bound to each other and the target substance and the labeling substance are bound to each other via the second receptor to form a target substance-magnetic particle-labeling substance complex.
  • the target substance-magnetic particle-label substance complex formation conditions at this time are not particularly limited as long as the desired complex is formed.
  • the sample containing the target substance, the first receptor-immobilized magnetic particles and the second receptor-immobilized labeling substance are mixed in a buffer solution.
  • the buffer solution is not particularly limited, and a known buffer solution can be used. Specifically, the same buffer solution as exemplified in the above (Formation of complex of target substance-magnetic particles) and the like can be mentioned.
  • the pH of the buffer solution is not particularly limited, and is not particularly limited as long as the receptor maintains the target substance binding activity. However, in consideration of suppression of decrease in target substance binding activity of the receptor, it is usually preferable that the receptor is in the vicinity of neutral to weakly basic.
  • the pH of the buffer solution is more preferably 6.0 to 9.0, and particularly preferably 6.0 to 8.0.
  • the mixing temperature is preferably 4 to 40 ° C, more preferably 25 to 37 ° C.
  • the mixing time is preferably 1 to 60 minutes, more preferably 5 to 30 minutes.
  • the target substance-magnetic particles-label A mixture containing a complex of substances is obtained.
  • the mixture is a target substance-magnetic particle-labeling substance complex in which magnetic particles and a labeling substance are bound via a target substance, or a target substance-magnetic particle complex in which the target substance is bound only to magnetic particles.
  • Body a target substance-labeled substance complex in which the target substance is bound only to the labeling substance, unreacted magnetic particles and unreacted labeling substance.
  • the mixture containing the target substance-magnetic particle-labeling substance complex thus formed is subjected to electrophoresis, and the target substance-magnetic particle-labeling substance complex is magnetically separated during the electrophoresis. That is, during or before electrophoresis, magnetic particles existing in the target substance-magnetic particle-labeling substance complex are captured by magnetism to obtain the target substance (target substance-magnetic particle-label).
  • the target substance-magnetic particle-labeled substance complex may be in the form of being contained in a buffer solution as obtained in the above (formation of target substance-magnetic particle-labeled substance complex).
  • electrophoresis is not particularly limited, and known electrophoresis can be used. Specifically, since it is the same as that described in the above section (separation of the target substance-magnetic particle complex), the description thereof is omitted here.
  • the target target substance-magnetic particle-labeled substance complex is magnetically separated. Specifically, the target substance-magnetic particle-labeled substance complex, the target substance-magnetic particle complex in which the target substance is bound only to the magnetic particles, and the unreacted magnetic particles are magnetically captured. Therefore, during electrophoresis, components other than the target substance contained in the sample, a reagent diluent (for example, a buffer solution) (when used), and a substance to which the target substance nonspecifically binds (only the labeling substance is included). The bound target substance-labeled substance complex) and the unreacted labeling substance are separated.
  • a reagent diluent for example, a buffer solution
  • a magnet is installed during electrophoresis.
  • the specific description of the magnet is the same as that described in the above section (separation of the target substance-magnetic particle complex), and therefore the description thereof is omitted here.
  • the amount of the target substance of interest is measured by detecting the signal intensity of the target substance-magnetic particle-label substance complex separated as described above.
  • the separation step in addition to the target substance-magnetic particle-labeling substance complex, the target substance-magnetic particle complex in which the target substance nonspecifically binds only to the magnetic particles, and unreacted magnetic particles are used. Is also captured by the magnet.
  • an antibody that specifically binds to the target substance is used as the labeling substance. Therefore, since the target substance does not exist in the unreacted magnetic particles, the labeling substance does not bind to the unreacted magnetic particles.
  • the unreacted magnetic particles do not substantially affect the signal intensity (and hence the measurement accuracy) of the target substance-magnetic particle-label substance complex. Therefore, in this step, the signal intensity derived from the target substance is selectively detected, that is, the amount of the target substance can be measured with high accuracy. Further, other components (eg, blood cells) in the sample, which cause a decrease in sensitivity, and unreacted labeling substance are moved from the magnet to the cathode or anode side by electrophoresis. The labeling substance is blended so that the target substance can be sufficiently detected in the measurement target range in consideration of the type of target substance, the amount of other reagent components such as magnetic particles used, and the type of sample. Therefore, according to the method of the present disclosure, the existing amount of the target substance of interest can be measured with high sensitivity (high accuracy).
  • the existing amount of the target substance of interest can be measured with high sensitivity (high accuracy).
  • FIG. 1A to 1D are process charts for explaining the method of the present disclosure.
  • an electrophoretic substrate eg, capillary
  • a reagent 4 containing first receptor-immobilized magnetic particles and a second receptor-immobilized labeling substance.
  • the electrophoretic substrate 5 is placed on the substrate 6 of the electrophoretic device.
  • electrodes for example, platinum electrodes
  • electrodes 2 and 3 are installed on both ends of the electrophoretic substrate 5. Thereby, an electric field is applied in the longitudinal direction of the electrophoretic substrate 5.
  • the reagent may contain one of the first receptor-immobilized magnetic particles and the second receptor-immobilized labeling substance.
  • the reagent is, in addition to the first receptor-immobilized magnetic particles and the second receptor-immobilized labeling substance, a pH adjuster (eg, sodium hydroxide, sodium carbonate, sodium hydrogen carbonate, sulfuric acid, hydrochloric acid, phosphoric acid, etc.), a buffering agent.
  • a pH adjuster eg, sodium hydroxide, sodium carbonate, sodium hydrogen carbonate, sulfuric acid, hydrochloric acid, phosphoric acid, etc.
  • a buffering agent eg, sodium hydrogen phosphate, sodium phosphate, Tris-HCL, etc.
  • hemolytic agents such as saponin, surfactants and the like may be included.
  • the amount of the first receptor-immobilized magnetic particles in the reagent is not particularly limited, and is similar to that described in the above section (magnetic particles to which the first receptor that specifically recognizes the site of the target substance is immobilized). Can be used.
  • the amount of the second receptor-immobilized labeling substance and the mixing ratio of the first receptor-immobilized magnetic particles and the second receptor-immobilized labeling substance are not particularly limited, and the above-mentioned (specifically a site different from the site of the target substance can be used). The same amount and ratio as described in the section of the labeling substance to which the second receptor recognized in (4) is immobilized can be used.
  • the electrophoretic substrate 5 was previously filled with the reagent containing the first receptor-immobilized magnetic particles and the second receptor-immobilized labeling substance.
  • the first receptor-immobilized magnetic particles, the second receptor-immobilized labeling substance, and the target After the reaction with the substance (sample) in advance to form the target substance-magnetic particle-label substance complex, the reaction substance may be filled in the electrophoretic substrate 5 (second embodiment). In the case of the second 'embodiment, it is preferable to separately provide a chamber (not shown) for the above reaction on the substrate 6.
  • a reagent solution containing the first receptor-immobilized magnetic particles, the second receptor-immobilized labeling substance and the buffer is dropped on both ends of the electrophoretic substrate to form a liquid pool, and the electrophoretic substrate is formed by capillary action.
  • the inside may be filled with a reagent solution, electrodes (for example, platinum electrodes) 2 and 3 may be installed at both ends of the electrophoretic substrate 5, and a sample containing a target substance may be dropped onto either of the electrodes (3 ′).
  • the magnet 8 is installed on the platinum electrode 2 (anode) side of the electrophoretic substrate 5.
  • the magnetic particles contained in the target substance-magnetic particle complex are captured by the magnet 8.
  • FIG. 1C after moving the magnet 8 in the longitudinal direction of the electrophoretic substrate 5, electrophoresis is started.
  • the target substance-magnetic particle-label substance complex can be selectively separated. Therefore, in the detection of signal intensity described in detail below, the amount of the target substance-magnetic particle-labeling substance complex (and hence the labeling substance contained in this complex) can be measured with high accuracy.
  • the target substance-magnetic particle-labeling substance complex is magnetically collected at a predetermined position. Then, by performing electrophoresis, a complex of the target substance-magnetic particles-labeling substance, and a labeling substance to which an unreacted second receptor is immobilized (a second receptor-immobilized labeling substance that does not bind to the target substance), To separate.
  • the moving position of the magnet 8 is not particularly limited, but it is preferable to install the magnet at the same position as described in the section of FIG. 1C in the above (separation of the target substance-magnetic particle complex).
  • the magnet 8 is moved on the outer surface of the electrophoretic substrate 5 or at a position close to the outer surface of the electrophoretic substrate 5 along the electrophoretic substrate 5 at least once between the cathode and the anode. After that, the magnet 8 is placed at a predetermined position and the electrophoresis is started.
  • the arrangement position of the magnet 8 is not particularly limited, and may be any position as long as an appropriate magnetic force can be applied to the electrophoretic substrate 5, but the above-mentioned (separation of target substance-magnetic particle complex).
  • the magnet can be arranged at the same position as defined in the above section.
  • the sample immediately before the electrophoresis contains, in addition to the components contained in the sample (for example, components derived from a living body such as blood cells) and the components contained in the buffer solution, It includes a target substance-magnetic particle-labeling substance complex, a target substance-magnetic particle complex, a target substance-labeling substance complex, unreacted magnetic particles and unreacted labeling substance.
  • the target substance-magnetic particle-labeling substance complex, the target substance-magnetic particle complex and unreacted magnetic particles are captured by the magnet.
  • the mixing amount of the target substance-magnetic particle complex can be minimized. Therefore, the target substance-magnetic particle-label substance complex and unreacted magnetic particles are selectively captured by the magnet.
  • the labeling substance does not specifically bind to the unreacted magnetic particles (not detected by the detection of the signal intensity below). Therefore, the abundance of the target substance-magnetic particle-label substance complex (and thus the target substance) can be measured with high sensitivity (high accuracy) by measuring the signal intensity of the separated substance after electrophoresis.
  • the signal intensity of the target substance-magnetic particle-label substance complex 9 existing in the portion of the electrophoretic substrate 5 on which the magnet 8 is arranged is detected.
  • the signal intensity of the labeling substance present in this complex corresponds to the amount of the target substance. That is, it is possible to prepare a calibration curve with the amount of the target substance for the signal intensity of the band of the target substance-magnetic particles-labeled substance measured in advance, and the detected target substance-magnetic particles-based on the calibration curve. The amount of the target substance in the sample can be accurately measured by comparing the signal intensities of the bands of the complex of the labeling substance.
  • a calibration curve of the signal intensity of the target substance-magnetic particle-labeled substance complex with respect to the target substance amount is prepared by using a target substance whose amount is known in advance, and the calibration curve and The amount of the target substance contained in the sample is measured based on the signal intensity of the detected target substance-magnetic particle-label substance complex.
  • a relationship (calibration curve) of the signal intensity of the band of the complex of the target substance-magnetic particle-labeling substance with respect to the amount of the target substance using a sample in which the amount of the target substance is known in advance. That is, the same operation as above is performed for a sample having a known amount of the target substance in advance, the signal intensity of the band of the target substance-magnetic particle-labeling substance complex is calculated, and the amount of the standard substance and the signal intensity of the band are calculated. Create a calibration curve.
  • a known method can be used depending on the type of the labeling substance.
  • the labeling substance when the labeling substance is a fluorescent substance, the fluorescence intensity is measured by a fluorescence measuring device (fluorescence scanner) or an image processing system when quantifying.
  • the labeling substance is a radioisotope, the radiation dose is measured with a radiation counter.
  • the labeling substance is an enzyme, the product produced by the enzyme can be detected and / or quantified by measuring the absorbance of the product. For example, when 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine is used as the enzyme substrate, the absorbance at 655 nm may be measured.
  • the labeling substance is a redox substance, the measurement is performed by measuring the electrochemical signal generated.
  • the amount of the target substance contained in the sample can be easily determined by creating a calibration curve using the fluorescence intensity obtained using a standard sample containing a known concentration of the target substance. Quantify.
  • the calibration curve obtained according to the present disclosure is effective as a calibration curve because it is a constant curve regardless of external factors such as electrophoresis conditions. Therefore, the amount of the target substance in the sample can be accurately measured by using this calibration curve.
  • the above detection method will be a very useful assay means in clinical tests, especially when the target substance is a marker involved in some disease.
  • the signal intensity is kept appropriate while the magnet is placed on the electrophoretic substrate 5. (E.g., from below the substrate). From this point as well, the substrate and the electrophoretic substrate are preferably transparent.
  • a third aspect of the present disclosure is a method for diagnosing a disease associated with a target substance, which uses the separation / measurement method according to the first or second embodiment. Specifically, a step of collecting a sample from a subject, a target substance in the sample, magnetic particles to which a first receptor that specifically recognizes a site of the target substance is immobilized, and the target substance A labeling substance to which a second receptor that specifically recognizes a site different from the site is immobilized is mixed to obtain a mixture containing the target substance-magnetic particle-labeling substance complex, and the mixture is subjected to electrophoresis.
  • the target substance-magnetic particle-labeled substance complex is separated by magnetic and electrophoresis, and then the signal intensity of the target substance-magnetic particle-labeled substance complex is detected. It is a method for diagnosing a disease related to a target substance, which comprises determining whether or not a subject is afflicted with a disease related to the target substance in comparison with. Therefore, according to the present invention, a sample is collected from a subject, and the target substance in the sample, the magnetic particles to which the first receptor that specifically recognizes the site of the target substance is immobilized, and the target substance are recognized.
  • the target substance-magnetic particle-labeling substance complex is mixed with a labeling substance to which a second receptor that specifically recognizes a site different from the After separating the complex of the target substance-magnetic particles-labeling substance, the signal intensity (signal intensity 1) of the complex of the target substance-magnetic particles-labeling substance is detected; A target substance in a sample, a magnetic particle on which a first receptor that specifically recognizes a site of the target substance is immobilized, and a second receptor that specifically recognizes a site different from the site of the target substance are immobilized.
  • the substance and the substance are mixed to obtain a mixture containing the target substance-magnetic particle-labeled substance complex, and the target substance-magnetic particle-labeled substance complex is separated by magnetism and electrophoresis.
  • a method for diagnosing a disease involving a target substance which comprises determining whether
  • the subject or healthy subject is preferably a human or a mammal other than human.
  • Examples of the above diseases include, when the target substance is insulin, insulin norma, obesity, liver disease, Cushing's syndrome, acromegaly, dysinsulinemia, insulin autoimmune syndrome, diabetes, hypoglycemia, malnutrition, brown Cell tumors, hypopituitarism, and the like. If the signal intensity of the subjects is higher than that of healthy subjects, the above-mentioned diseases may be associated with insulin norma, obesity, liver disease, Cushing's syndrome, acromegaly, abnormal insulinemia, insulin autoimmune syndrome, etc.
  • the subject is suffering from diabetes, hypoglycemia, malnutrition, pheochromocytoma, hypopituitarism, and the like. That is, when the target substance is insulin and the signal intensity 1 is lower than the signal intensity 2, the subject has diabetes, hypoglycemia, malnutrition, pheochromocytoma or hypopituitarism. Determined to be affected or at risk of contracting.
  • a fourth aspect of the present disclosure is a magnetic particle having a first receptor immobilized thereon that specifically recognizes a site of a target substance (first receptor-immobilized magnetic particle), and a site specifically different from the site of the target substance.
  • the present invention is a test kit for a disease involving a target substance including a labeling substance having a second receptor immobilized thereon (second receptor-immobilized labeling substance) and a magnet. Therefore, according to the present invention, a magnetic particle having a first receptor that specifically recognizes a site of a target substance immobilized thereon and a second receptor that specifically recognizes a site different from the site recognized by the target substance are immobilized.
  • the present invention also provides a test kit for diseases associated with a target substance including a labeling substance and a magnet.
  • a magnetic particle having a first receptor that specifically recognizes a site of a target substance immobilized thereon, and a second receptor that specifically recognizes a site different from the site of the target substance have been immobilized. It is an inspection system for a disease involving a target substance including a labeling substance, a magnet, and an electrophoretic device (preferably a carrier-free electrophoretic device). Therefore, according to the present invention, a magnetic particle having a first receptor that specifically recognizes a site of a target substance immobilized thereon and a second receptor that specifically recognizes a site different from the site recognized by the target substance are immobilized.
  • the present invention also provides a test system for a disease involving a target substance, which comprises a labeling substance, a magnet, and an electrophoretic device.
  • the electrophoretic device is preferably a carrier-free electrophoretic device.
  • the first receptor-immobilized magnetic particles and the second receptor-immobilized labeling substance contained in the test kit may be contained in one container or separate containers. Further, the first receptor-immobilized magnetic particles and the second receptor-immobilized labeling substance may be contained in a container together with a buffer solution. Further, the test kit may be an electrophoresis set containing an assay buffer solution or a concentrated stock solution thereof. That is, in the sixth aspect of the present disclosure, magnetic particles having a first receptor that specifically recognizes a site of a target substance immobilized, and a second receptor that specifically recognizes a site different from the site of the target substance are immobilized.
  • the present invention is a test system for a disease involving a target substance including a labeled substance, a magnet, and an electrophoretic set (preferably a carrier-free electrophoretic set). Therefore, according to the present invention, a magnetic particle having a first receptor that specifically recognizes a site of a target substance immobilized thereon and a second receptor that specifically recognizes a site different from the site recognized by the target substance are immobilized. Also provided is a test system for a disease involving a target substance, which comprises a labeling substance, a magnet, and an electrophoretic set. In this embodiment, the electrophoresis set is preferably a carrier-free electrophoresis set.
  • electrophoretic tanks in addition to the electrophoretic set, other electrophoretic tanks, electrophoretic glass plates, buffer tanks, spacers, combs, clips, power supplies, or general electrophoretic devices such as peristaltic pumps; electrophoretic reagents A detection reagent or the like can be included.
  • the test kit or test system of the present embodiment may further include a standard sample having a known amount (concentration) and a container containing the standard sample in the kit or system.
  • a standard sample having a known amount (concentration)
  • a container containing the standard sample in the kit or system may be dispensed into a container for each sample measurement, and a plurality of sample measurements may be collected for each reagent and provided in each container. May be done. In the latter case, each reagent is dispensed into a predetermined measuring container before use.
  • the container containing each reagent may be integrally molded as a cartridge, and each reagent may be stored in different compartments of the cartridge.
  • the test kit or test system may further include a buffer solution as described above for forming a complex.
  • the container that may be included in the test kit or the test system is a material that does not interact with the first receptor-immobilized magnetic particles or the second receptor-immobilized labeling substance and does not interfere with the reaction used in the assay, for example, enzyme reaction or chemiluminescent reaction. So long as it is made of any material. If desired, the surface may be provided with a pre-treatment to prevent such interactions.
  • the test kit or test system is usually accompanied by instructions.
  • Example 1 (Preparation of first receptor-immobilized magnetic particles) Mouse anti-human fatty acid binding protein (H-FABP) IgG monoclonal antibody 28 (Monoclonal mouse anti-human fatty acid binding protein (FABP) 28, manufactured by Hytest Ltd.) 0.032 mL (0.2 mg) was added to Biotin Labeling Kit-SH ( PBS solution (pH 7.4) containing Biotin-labeled Anti H-FABP (28) (biotinylated H-FABP antibody), which was biotinylated by using Dojindo Laboratories Co., Ltd. according to the manufacturer's protocol. A-1) 0.2 mL (1 mg / mL) was obtained.
  • H-FABP Mouse anti-human fatty acid binding protein
  • the first receptor-immobilized magnetic particles were separated from the reaction solution (solution A-2) using a permanent magnet, and washed with PBS (pH 7.4) containing 0.1% BSA. After the final washing, the first receptor-immobilized magnetic particles were isolated by decantation, 0.2 mL of PBS (pH 7.4) containing 0.1% BSA was added, and the first receptor-immobilized magnetic particle solution (solution A -3) was prepared.
  • the concentrations of the first receptor-immobilized magnetic particles, the antibody, and the magnetic particles in the solution A-3 were 11 mg / mL, 1 mg / mL, and 10 mg / mL, respectively.
  • Mouse anti-human fatty acid binding protein (FABP) IgG monoclonal antibody 25 (Monoclonal mouse anti-human fatty acid binding protein (FABP) 25, Hytest Ltd.) 0.055 mL (0.3 mg) was added to 0.1 M containing 50 mM EDTA.
  • An antibody solution (solution B-1) was prepared by adding 0.3 mL of a phosphate buffer (pH 6.0). To this antibody solution (Solution B-1), 0.05 mL of 0.1 M phosphate buffer (pH 6.0) containing 0.1 M mercaptoethylamine hydrochloride and 50 mM EDTA was added.
  • solution B-2 This solution was incubated at 37 ° C for 2 hours to reduce the disulfide bond of the antibody to form a sulfhydryl group (-SH), and thus a solution containing the reduced antibody (solution B-2) was obtained.
  • This solution (solution B-2) was desalted to obtain 0.4 mL of a PBS solution (solution B-3) containing a reducing antibody.
  • reaction solution B-5 a reaction solution containing the IRDye800CW-labeled AntiH-FABP (25) complex (second receptor-immobilized labeling substance).
  • solution B-5 the reaction solution obtained in this way
  • Zeba spin desalting columns Zeba TM Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5, Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.
  • the buffer was exchanged with PBS to obtain 0.4 mL of a PBS solution (solution B-6) containing the second receptor-immobilized labeling substance.
  • the buffer was exchanged by dividing the solution into 0.2 mL each by using two spin desalting columns and then combining the column treatment liquids (solution B-6).
  • solution B-6 thus obtained was diluted with PBS (pH 7.4) containing 0.1% BSA so that the antibody concentration was 0.1 mg / mL, and the second A receptor-immobilized labeling substance solution (solution B-7) was prepared.
  • H-FABP human fatty acid binding protein
  • Fatty acid binding protein (FABP) human, manufactured by Hytest Ltd.
  • a solution H-FABP concentration: 0.05 mg / mL was prepared.
  • the first receptor-immobilized magnetic particle solution (solution A-3), the second receptor-immobilized labeling substance solution (solution B-7), the H-FABP solution, and PBS containing 0.1% BSA (pH 7. 4) (“0.1% BSA PBS” in Table 1 below) and 0.1 M Tris-HCl (pH 8.5) (“Tris-HCl” in Table 1 below) were added to the composition shown in Table 1 below.
  • the mixture was mixed at (pH 8.5) and reacted at 25 ° C. for 5 minutes to prepare fatty acid binding protein-Biotin-labeled Anti H-FABP (28) / Streptavidin magnetic beads-IRDye800CW-labeled Anti H-FABP (25).
  • Electrophoresis solutions 1 to 5 (samples 1 to 5) containing complexes 1 to 5 (complexes 1 to 5) were prepared.
  • the "dilution rate of the H-FABP solution” indicates the dilution ratio when the H-FABP solution prepared above is diluted
  • the "diluted H-FABP solution” means The added amount of the H-FABP solution after being diluted with the above predetermined dilution ratio is shown. Therefore, for example, Sample 1 means that 1 ⁇ L of the H-FABP solution prepared above is diluted 2-fold.
  • antibody of solution A-3 / H-FABP (molar ratio)
  • Anti H-FABP (28) first group
  • Anti H-FABP second receptor
  • Anti H-FABP Second receptor
  • the amount of biotin bound to the magnetic particles can be calculated based on the amount described in the instruction manual of the magnetic particles used. Further, it can be calculated assuming that the antibody and biotin are all bound at a molar ratio of 1: 1.
  • Electrophoresis After setting the glass square tubes 1 to 5 prepared in the above (Preparation of migration solution) to the electrophoresis apparatus shown in FIG. 3, electrophoresis was performed at a voltage of 100 V for 5 minutes.
  • FIG. 4 shows photographs of a glass square tube filled with sample 1 when measured with a fluorescence scanner before and after electrophoresis.
  • a part surrounded by a white square shows a place where the complex exists. From FIG. 4, it can be seen that the complex 1 can be well separated from the unreacted (the fatty acid-binding protein does not bind) second receptor-immobilized labeling substance after electrophoresis.
  • the amount of fatty acid binding protein in a sample can be measured with high accuracy based on a calibration curve prepared using a target substance whose amount is known in advance.
  • the experiment was conducted using a fatty acid-binding protein, but it is considered that similar results can be obtained with other receptors such as insulin antibody and insulin receptor.
  • the fatty acid binding protein was used, but even when a biological sample such as blood is used, components derived from a living body other than the complex migrate to the anode side by electrophoresis. Therefore, it is considered that the complex can be satisfactorily separated from other biological components even in such a case.
  • Electrophoretic substrate 6 ... substrate, 7 ... A sample containing the target substance, 8 ... Magnet, 9 ... Complex of target substance-magnetic particle-label substance.

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Abstract

本発明は、標的物質の種類（電荷）にかかわらず、標的物質を分離できる手段を提供する。本発明の標的物質の分離方法は、標的物質を含むサンプルおよび前記標的物質の部位を特異的に認識する第１レセプターが固定された磁性粒子を用いて標的物質－磁性粒子の複合体を形成し、前記標的物質－磁性粒子の複合体を磁気および電気泳動により分離することを有する。

Description

標的物質の分離方法および定量方法
　本開示は、標的物質の分離方法および定量方法に関する。
　生体内に存在するペプチドの中には疾患により存在量が変化するものがあり、これらのペプチドは特定の疾患のマーカーになりうる。例えば、糖尿病は、インスリンの作用の低下や分泌不足により、血液中のグルコースレベル（血糖値）が高い状態になる病気である。高い血糖値が長時間にわたって持続すると、腎臓、網膜、末梢神経に障害を与えたり、血管に障害を及ぼし、動脈硬化を助長して心筋梗塞や脳梗塞の危険因子となる。このため、糖尿病の診断、予防および治療には、血糖値や、糖尿病に関わる因子の血中成分濃度を把握することが重要である。例えば、特開２０１４－１４５６８０号公報には、分子量の大きな２種のレセプターを用いて標的物質（例えば、プロインスリンの構成物質である血中Ｃ－ペプチド）とレセプターとの複合体を形成し、電気泳動での分子量差により複合体と遊離レセプターとを分離する方法が報告されている。
　レセプターとして好ましいタンパク質は、所定の電荷を有する。しかし、レセプターと、標的物質との電荷や分子量の大小関係によっては、特開２０１４－１４５６８０号公報に記載の方法によってでも、複合体とレセプターとを明確に分離することは困難である場合がある。
　したがって、本開示は、上記事情を鑑みてなされたものであり、標的物質を分離できる手段を提供することを目的とする。
　本発明者は、上記課題を解決すべく、鋭意研究を行った。その結果、電気泳動と磁気による分離とを組み合わせることにより上記課題を解決できることを見出した。すなわち、上記目的は、標的物質を含むサンプルおよび前記標的物質の部位を特異的に認識する第１レセプターが固定された磁性粒子を用いて標的物質－磁性粒子の複合体を形成し、前記標的物質－磁性粒子の複合体を磁気および電気泳動により分離することを有する、標的物質の分離方法によって達成できる。
図１ＡおよびＢは、本開示の方法を説明するための工程図である。図１Ａおよび図１Ｂ中、２，３は電極を；４は試薬を；５は電気泳動基材を；６は基板を；７は標的物質を含むサンプルを；および８は磁石を、それぞれ、示す。 図１ＣおよびＤは、本開示の方法を説明するための工程図である。図１ＣおよびＤ中、２，３は電極を；５は電気泳動基材を；６は基板を；８は磁石；および９は標的物質－磁性粒子－標識物質の複合体を、それぞれ、示す。 図２Ａは、実施例（泳動溶液充填ガラス四角管の作製）における磁気による回収前のガラス四角管の写真である。図２Ｂは、実施例（泳動溶液充填ガラス四角管の作製）における磁気による回収後のガラス四角管の写真である。 図３は、実施例（電気泳動）で使用した電気泳動装置の写真である。 図４は、実施例（電気泳動）において電気泳動前後に蛍光スキャナーで測定した際のガラス四角管の写真である。 図５は、実施例においてＨ－ＦＡＢＰの終濃度に対する蛍光強度の関係を表す図である。
　以下、本開示の実施の形態を説明する。なお、本開示は、以下の実施の形態のみには限定されない。
　本開示の第１の形態は、標的物質を含むサンプルおよび前記標的物質の部位を特異的に認識する第１レセプターが固定された磁性粒子を用いて標的物質－磁性粒子の複合体を形成し、前記標的物質－磁性粒子の複合体を磁気および電気泳動により分離することを有する、標的物質の分離方法である。当該形態によれば、標的物質の種類（例えば、電荷、分子量）によらず、標的物質を分離できる。また、当該形態によれば、検出し難い標的物質を分離できる。
　本開示の第２の形態は、標的物質を含むサンプルと、前記標的物質の部位を特異的に認識する第１レセプターが固定された磁性粒子と、前記標的物質の部位とは異なる部位を特異的に認識する第２レセプターが固定された標識物質と、を混合して、標的物質－磁性粒子－標識物質の複合体を含む混合物を得、磁気および電気泳動により前記標的物質－磁性粒子－標識物質の複合体を分離した後、前記標的物質－磁性粒子－標識物質の複合体のシグナル強度を検出することを有する、標的物質量の測定方法である。当該形態によれば、標的物質の種類（例えば、電荷、分子量）によらず、標的物質量を高精度に測定できる。また、当該形態によれば、検出し難い標的物質であっても、標的物質量を高精度に測定できる。
　本明細書において、「標的物質の部位を特異的に認識する第１レセプター」を単に「第１レセプター」とも称する。また、「標的物質の部位を特異的に認識する第１レセプターが固定された磁性粒子」を単に「第１レセプター固定磁性粒子」または「本開示に係る磁性粒子」とも称する。「標的物質の部位とは異なる部位を特異的に認識する第２レセプター」とは、第２レセプターは第１レセプターが認識する標的物質の部位とは異なる部位を特異的に認識することを意味し、単に「第２レセプター」とも称する。また、「標的物質の部位とは異なる部位を特異的に認識する第２レセプターが固定された標識物質」を単に「第２レセプター固定標識物質」または「本開示に係る標識物質」とも称する。
　本明細書において、範囲を示す「Ｘ～Ｙ」は、ＸおよびＹを含み、「Ｘ以上Ｙ以下」を意味する。また、特記しない限り、操作および物性等の測定は室温（２０～２５℃）／相対湿度４０～５０％ＲＨの条件で行ったが、この条件に限られるものではない。
　＜標的物質の分離方法（本開示の第１の形態）＞
　本開示の第１の形態は、標的物質を含むサンプルおよび前記標的物質の部位を特異的に認識する第１レセプターが固定された磁性粒子を用いて標的物質－磁性粒子の複合体を形成し、前記標的物質－磁性粒子の複合体を磁気および電気泳動により分離することを有する、標的物質の分離方法である。
　本開示の方法によると、第１レセプターを介して標的物質と磁性粒子との複合体（標的物質－磁性粒子の複合体）を形成する。磁気によってこの複合体に含まれる磁性粒子を所定の位置で捕捉する。このため、複合体を磁気で捕捉しながらまたは捕捉した後に、電気泳動を行うと、複合体は磁気により所定の位置に固定されたまま移動しない。しかし、複合体以外の成分（例えば、血球等の生体由来の成分）は移動するまたは移動しない。したがって、標的物質（標的物質－磁性粒子の複合体）を選択的に分離・回収できる。本開示の方法は磁性粒子を用いて目的とする標的物質を回収する方法であるため、標的物質の種類（例えば、電荷、等電点や分子量）によらずに、標的物質を効率よく分離できる。
　以下、本開示の第１の形態を説明する。
　（標的物質を含むサンプル）
　標的物質は、目的（診断しようとする疾患の種類）に応じて、適宜選択される。このため、標的物質としては、特に限定されない。具体的には、インスリン、インスリン前駆体（例えば、Ｃ－ｐｅｐｔｉｄｅ）、ＧＬＰ－１（グルカゴン様ペプチド－１）、ＧＩＰ（グルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド）、アディポネクチン、Ｈ－ＦＡＢＰ（心筋型脂肪酸結合タンパク質）、ミオグロビン、トロポニンＩ、トロポニンＴ、ＢＮＰ（脳性ナトリウム利尿ペプチド）、ＮＴ－ＰｒｏＢＮＰ（Ｎ末端プロ脳性ナトリウム利尿ペプチド）、脂肪酸結合タンパク質等のタンパク質、ペプチド、糖鎖、核酸、低分子化合物、高分子化合物ならびにこれらの複合体などが挙げられる。中でも、有益性や凡用性などの観点から、標的物質は、タンパク質またはペプチドであることが好ましく、血液や尿などの体液の検査に使用されるタンパク質やペプチド（例えば、インスリン、Ｃ－ｐｅｐｔｉｄｅなど）がより好ましい。なお、上記タンパク質またはペプチドは、遊離体、リン酸基、メチル基、アセチル基、糖鎖、脂質、ニトリル基等の修飾を受けた修飾体、酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩）などとの塩、核酸と結合している核タンパク質など他の物質と結合しているタンパク質またはペプチドを包含する。また、上記タンパク質は、天然由来であっても合成物であってもよい。本明細書において、「タンパク質」は、１０ｋＤａ以上のポリペプチドを意味し、ペプチドは１０ｋＤａ未満のポリペプチドを意味する。
　標的物質を含むサンプルは、上記したような所望の標的物質を含むものであれば特に制限されない。具体的には、被検試料（血液、血漿、血清、組織、関節液、尿、リンパ液等）、細胞（培養細胞、細胞株等）、その培養上清、それらの抽出物、それらの部分精製画分などが挙げられる。ここで、被検試料の由来も特に制限されず、ヒトまたはヒト以外の哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ハムスター、モルモット等の齧歯類；ヒツジ、ブタ、ウシやウマ等の家畜；ウサギ、ネコ、イヌ等のペット；アカゲザル、ミドリザル、カニクイザル、チンパンジー等の霊長類）由来のいずれであってもよい。また、各種環境の土壌、水等などの検体または上記検体からの抽出物を使用してもよい。これらのうち、有益性（例えば、診断目的）などを考慮すると、標的物質を含むサンプルは、被検試料が好ましく、血液（例えば、全血、血漿、血清など）、間質液および尿がより好ましい。すなわち、本開示の好ましい形態によると、サンプルは、血液、間質液および尿からなる群より選択される。
　なお、標的物質は精製（抽出）せずに、上記被検試料をそのままサンプルとして用いても、または精製（抽出）した後使用してもよい。例えば、被検者の血液、血漿、血清、組織、関節液、尿、リンパ液等の生体成分等の被検試料を用いてもよい。この際、被検試料に対して、希釈、精製等の処理を行ってもよい。または、標的物質は、公知のタンパク質の精製方法を用いて精製することにより、調製されてもよい。具体的には、例えば、哺乳動物の組織または細胞を、適切なバッファーの存在下でホモジナイズし、得られる組織の粗抽出物画分を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー等に付すことにより、精製されうる。または、標的物質は市販品であってもよい。
　（標的物質の部位を特異的に認識する第１レセプターが固定された磁性粒子）
　本開示に係る磁性粒子（第１レセプター固定磁性粒子）は、標的物質の部位を特異的に認識する第１レセプターが（例えば、表面に）固定されてなる。
　本明細書において、「レセプター」とは、標的物質と特異的に結合することができる物質を指す。なお、レセプターは、電気泳動中（例えば、電気泳動緩衝液中で）標的物質に対する結合活性を維持している。本開示において、第１レセプターは標的物質のある部位（部位１）を特異的に認識する。また、第２レセプターは第１レセプターが認識する標的物質の部位（部位１）とは異なる標的物質の部位（部位２）を特異的に認識する。
　レセプターとしては、特に制限されず、例えば、抗体、標的物質との結合活性を有する抗体の断片（抗体フラグメント）、ＤＮＡアプタマー等の核酸、タンパク質、タンパク質で構成された受容体、バインディングプロテイン、ペプチド、生体レセプター、化学合成レセプター、糖鎖などが挙げられる。これらのうち、標的物質との特異的結合性が高い点などから、抗体または、抗体の断片をレセプターとして用いることが好ましい。第１レセプターは、標的物質の特定の配列から成る構造単位（エピトープ）（エピトープ１）を認識する抗体または抗体の断片であることが好ましい。また、第２レセプターはエピトープ１とは異なるエピトープ（エピトープ２）を認識する抗体または抗体の断片であることが好ましい。あるいは、第２レセプターは、第１レセプターを特異的に認識するレセプター（リガンドの場合を含む）であってもよい。
　抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、一本鎖抗体、改変抗体（例えば抗原認識部位のみヒト化した「ヒト化抗体」など）、キメラ抗体、２つのエピトープを同時に認識することができる二機能性抗体などが挙げられる。抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭなど、いずれのクラスのものであってもよい。エピトープへの特異的結合性の観点からはモノクローナル抗体を用いることが好ましく、ＩｇＧモノクローナル抗体を用いることがより好ましい。
　抗体の断片（フラグメント）としては、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、ミニボディー、ダイアボディー等の遺伝子工学的に作製されたコンジュゲート分子、あるいはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等のタンパク質安定化作用を有する分子等で修飾されたそれらの誘導体等が挙げられる。レセプターは、抗体を種々のプロテアーゼで処理したものでもよいし、目的に応じて任意の標識（タグ）を付けたものでもよい。
　標的物質と結合するレセプターの製造は従来公知の方法により作製することができる。例えば、モノクローナル抗体は次の手順で作製することができる。まず、抗原を、動物の抗原の投与により抗体産生が可能な部位に、それ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与する。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。用いられる動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギなどの哺乳動物が挙げられる。抗血清中の抗体価の測定は常法により行うことができる。抗原を免疫された動物から抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２～５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。融合操作は既知の方法、例えば、Nature 256:495(1975)記載の方法に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などが挙げられる。骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ－１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０などが挙げられる。モノクローナル抗体の選別は、公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができるが、通常はＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地などで行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いてもよい。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。モノクローナル抗体の分離精製は、通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様の、例えば塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例えば、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相またはプロテインＡもしくはプロテインＧ、抗原アフィニティ精製などを用いた特異的精製法による免疫グロブリンの分離精製法に従って行うことができる。
　また、ポリクローナル抗体は、例えば次の手順で作製することができる。ポリクローナル抗体は、例えば、エピトープを含むペプチド等を抗原とし、キャリアーとの複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に哺乳動物に免疫を行ない、該免疫動物から活性型ハプトグロビンに対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造されうる。抗原とキャリアーとの複合体を形成する際に、キャリアーの種類および抗原とキャリアーとの混合比は、キャリアーに架橋させた抗原に対して抗体が効率良く製造できれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよい。キャリアーとしては、例えば、ウシ血清アルブミン、ウシサイログロブリン、キーホール・リンペット・ヘモシアニン等が用いられる。また、抗原とキャリアーとのカップリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオピリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。抗原とキャリアーとの複合体は、免疫される動物の抗体産生が可能な部位に、それ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２～６週毎に１回ずつ、計約３～１０回程度行なうことができる。用いられる動物としては、モノクローナル抗体作製の場合と同様の哺乳動物が挙げられる。ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の手順で行なうことができる。
　抗体は市販品を用いてもよい。例えば、インスリンが標的物質である場合には、Monoclonal mouse anti-human（C7C9）、Monoclonal mouse anti-human（D4B8）、Monoclonal mouse anti-human（7F8）、Monoclonal mouse anti-human（3A6）、Monoclonal mouse anti-human（8E2）、Monoclonal mouse anti-human（7F5）（いずれも、Ｈｙｔｅｓｔ製）などが挙げられる。また、例えば、脂肪酸結合タンパク質が標的物質である場合には、Monoclonal mouse anti-human fatty acid binding protein (28)やMonoclonal mouse anti-human fatty acid binding protein (25)、Monoclonal mouse anti-human fatty acid binding protein (5B5)、Monoclonal mouse anti-human fatty acid binding protein (9F3)、Monoclonal mouse anti-human fatty acid binding protein (10E1)、Monoclonal mouse anti-human fatty acid binding protein (22)、Monoclonal mouse anti-human fatty acid binding protein (30)（いずれも、Ｈｙｔｅｓｔ製）などが挙げられる。さらに、例えば、Ｃ－ｐｅｐｔｉｄｅが標的物質である場合には、Monoclonal mouse anti human C-peptide(7E10)（ａｂｃａｍ社製）、Anti C-peptide antibody(5B8)(Mouse monoclonal（ａｂｃａｍ社製））、Anti C-peptide antibody(2B7)(Mouse monoclonal（ａｂｃａｍ社製）、Anti C-peptide antibody(2A11)（Mouse monoclonal（ａｂｎｏｖａ社製））と、Anti-h C-peptide 9101 SPTN-5（Mouse monoclonal（Ｍｅｄｉｘ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製））のいずれかから選ばれるモノクローナル抗体とAnti-h C-peptide 9103 SPRN-5（Mouse monoclonal（Ｍｅｄｉｘ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製））との組み合わせ、あるいは、Anti C-peptide antibody(2A11)（Mouse monoclonal（ａｂｎｏｖａ社製））とAnti C-peptide antibody(4H8)（Mouse monoclonal（ａｂｃａｍ社製））、Anti C-peptide antibody(4H8)（Mouse monoclonal（ａｂｃａｍ社製））とAnti C-peptide antibody(5B8)（Mouse monoclonal（ａｂｃａｍ社製））等との組み合わせなどが挙げられる。
　磁性粒子（第１レセプターが固定される前の磁性粒子）は、磁性を有するものであれば特に制限されない。例えば、磁性粒子は、式：ＭＦｅ２Ｏ４（Ｍ＝Ｃｏ、Ｍｎ、Ｎｉ、Ｍｇ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｌｉ０．５Ｆｅ０．５等）で表わされるフェライト、マグヘマイト（γ－Ｆｅ２Ｏ３）、マグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）、ニッケル亜鉛フェライト（Ｎｉ１－ＸＺｎＸＦｅ２Ｏ４）およびマンガン亜鉛フェライト（Ｍｎ１－ｘＺｎＸＦｅ２Ｏ４）、鉄、マンガン、ニッケル、コバルト、クロムなどの金属や、コバルト、ニッケル、マンガンなどの合金等の磁性材料から構成される。これらのうち、高い飽和磁化及び低い残留磁化の点から、γ－Ｆｅ２Ｏ３、Ｆｅ３Ｏ４が好ましい。また、磁性粒子の平均粒径サイズ（一次粒径）は、特に制限されず、電気泳動条件（例えば、電気泳動基材の内径、泳動バッファーとの相性）などに応じて適宜選択できる。電気泳動中の移動性、分散性や十分な磁力などの観点から、磁性粒子の平均粒径サイズ（一次粒径（直径））は、好ましくは５０ｎｍ～２０μｍ、より好ましくは１００ｎｍ～１０μｍ、特に好ましくは１～５μｍである。なお、「粒径サイズ」とは、磁性粒子の輪郭線上の任意の２点間の距離のうち、最大の距離を意味する。また、本明細書において、「平均粒径サイズ」とは、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）や光学顕微鏡による写真において３００個以上の粒子を抽出し、これらの粒子の直径を測定し、その数平均として算出した値である。
　また、磁性粒子は、ポリマーなどで表面が被覆されてもよい。ここで、ポリマーとしては、特に制限されず、生化学分野（例えば、担体、ポリマービーズ、磁性粒子）に使用される公知のポリマーを同様にしてまたは適宜修飾して使用できる。具体的には、（メタ）アクリレート系ポリマー、スチレン系ポリマー等のラジカル重合性ポリマーなどが挙げられる。これらのうち、生化学物質と結合できるポリスチレンやポリシクロヘキシルメタクリレートなどの疎水表面を有するポリマー、カルボキシル基やトシル基などの表面官能基を有するポリマーが好ましく使用できる。なお、本明細書において、「（メタ）アクリレート」は、「アクリレート」および「メタクリレート」双方を包含する。また、磁性粒子がポリマーなどで表面が被覆される場合には、被膜は、アミノ基、アルデヒド基、カルボキシ基、トシル基、メルカプト基、ヒドロキシ基およびエポキシ基からなる群より選ばれる少なくとも１種の極性基を有していてもよい。このような場合には、標的物質または抗体等のレセプターを、上記極性基を介して磁性粒子に容易に結合（担持）できる。
　上記被覆に代えてまたは加えて、磁性粒子は表面に修飾物質が固定化されてもよい。ここで、修飾物質は、特に制限されず、所望の用途に応じて適宜選択できる。具体的には、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、抗原、抗体、酵素等のタンパク質；ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸；および低分子医薬品、生理活性物質、オリゴペプチド、オリゴヌクレオチド、脂質等の低分子化合物などが挙げられる。このような修飾物質で修飾することにより、レセプターとの結合を容易にできる。ここで、磁性粒子への上記修飾物質の固定化（修飾）方法は、特に制限されず、例えば、特開２００７－２６２１１４号公報、特開２００８－３２４１１号公報（US 2008/026222 A1に相当）、特開2012-177691号公報等に記載の方法が同様にしてまたは適宜修飾して、適用できる。
　または、磁性粒子は市販品を使用してもよい。用いる磁性粒子は、磁気ビーズ、磁気アガロースビーズのような複数個の磁性体をポリマーやゲル（例えば、メタクリレート、デキストラン）で被覆したビーズ等を用いてもよく、抗体結合磁気ビーズ、タグ抗体結合ビーズ等、目的に応じて適宜修飾された磁気粒子でもよい。具体的には、ＭａｇｎｏｓｐｈｅｒｅTM　ＭＳ３００／Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、ＭａｇｎｏｓｐｈｅｒｅTM　ＭＳ１６０／Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、ＭａｇｎｏｓｐｈｅｒｅTM　ＳＳ１５０／Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、ＭａｇｎｏｓｐｈｅｒｅTM　ＳＳ５５０／Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（いずれもＪＳＲ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）等のストレプトアビジン標識磁性ビーズ、ＭａｇｎｏｓｐｈｅｒｅTM　ＭＳ３００／Ｃａｒｂｏｘｙｌ、ＭａｇｎｏｓｐｈｅｒｅTM　ＭＳ１６０／Ｃａｒｂｏｘｙｌ、ＭａｇｎｏｓｐｈｅｒｅTM　ＭＸ２００／Ｃａｒｂｏｘｙｌ、ＭａｇｎｏｓｐｈｅｒｅTM　ＳＳ１５０／Ｃａｒｂｏｘｙｌ、ＭａｇｎｏｓｐｈｅｒｅTM　ＳＳ５５０／Ｃａｒｂｏｘｙｌ（いずれもＪＳＲ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）等のカルボキシ基導入磁性ビーズ、ＭａｇｎｏｓｐｈｅｒｅTM　ＭＳ３００／Ｔｏｓｙｌ、ＭａｇｎｏｓｐｈｅｒｅTM　ＭＳ１６０／Ｔｏｓｙｌ等のトシル基導入磁性ビーズなどが挙げられる。
　磁性粒子表面に第１レセプターを固定する方法もまた特に制限されない。例えば、レセプター（例えば、抗体）にビオチンを標識し、このビオチン標識レセプターをストレプトアビジン標識磁性ビーズと結合させる方法、レセプター（例えば、抗体）にストレプトアビジンを標識し、このストレプトアビジン標識レセプターを、ビオチンを標識させた磁性ビーズと結合させる方法等、対になる物質に対して特異的な結合性を示す物質を化学的に結合させる特異的結合対標識化法；カルボキシ基導入磁性ビーズのカルボキシル基をＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）によって選択的に活性化してビーズ表面に－ＣＯＯ－ＮＨＳ基を形成し、この－ＣＯＯ－ＮＨＳ基を介してレセプター（例えば、抗体）と結合するＮＨＳ法；レセプター（例えば、抗体）のジスルフィド結合を還元剤で還元してスルフヒドリル基（－ＳＨ）を形成し、その一方で磁性粒子表面にマレイミド基を導入し、このマレイミド基とレセプターのスルフヒドリル基とを反応させるマレイミド法；酵素の糖鎖部分を過ヨウ素酸で酸化し、アルデヒド基を導入し、このアルデヒド基をレセプター（例えば、抗体）のアミノ基と反応させ、シッフ塩基（－ＣＨ＝Ｎ－）を形成し、このシッフ塩基を－ＣＨ２ＮＨ－に還元する過ヨウ素酸法；酵素を過剰のグルタルアルデヒドで処理して、アルデヒド基を導入し、このアルデヒド基をレセプター（例えば、抗体）のアミノ基と反応させ、シッフ塩基（－ＣＨ＝Ｎ－）を形成し、このシッフ塩基を－ＣＨ２ＮＨ－に還元するグルタルアルデヒド法などの公知の方法が同様にしてまたは適宜修飾して使用できる。
　本開示に係る第１レセプター固定磁性粒子の使用量は、特に制限されず、標的物質の量に応じて適宜選択されるが、通常、標的物質の量に対して多い。本開示に係る第１レセプター固定磁性粒子の使用量は、標的物質１モルに対して、好ましくは１～１００００モル以下、より好ましくは１モルを超えて１０００モル、特に好ましくは１０～１０００モルの第１レセプター（例えば、抗体）が存在するような量である。なお、２個の標的物質が１個の磁性粒子に結合する場合には（例えば、ＩｇＧ抗体が固定された磁性粒子では）、上記第１レセプター固定磁性粒子の量は、重量として、上記好ましい量の２倍の量となる。また、標的物質の量は、例えば、血液中に含まれるインスリン量など、当業者であればある程度予想することができ、予想範囲の上限を標的物質量とする。なお、当業者が標的物質の量を予想できない場合には、第１レセプターを過剰量（例えば、反応液中に０．１～１００μｇ／ｍＬの第１レセプター）使用すればよい。
　（標的物質－磁性粒子の複合体の形成）
　上記標的物質を含むサンプルを、上記本開示に係る磁性粒子（第１レセプター固定磁性粒子）と混合することによって、第１レセプターを介して標的物質と磁性粒子とが結合して、標的物質－磁性粒子の複合体が形成される。この際の標的物質－磁性粒子の複合体形成条件は、所望の複合体が形成される条件であれば特に制限されない。例えば、標的物質を含むサンプルおよび第１レセプター固定磁性粒子を、緩衝液中で混合する。ここで、緩衝液は、特に限定されず、公知の緩衝液が使用できる。具体的には、例えば、クエン酸、コハク酸、酒石酸、リンゴ酸等の有機酸、及び、その塩類等を含有する溶液等；グリシン、タウリン、アルギニン等のアミノ酸類；塩酸、硝酸、硫酸、リン酸、ホウ酸、酢酸等の無機酸、及び、その塩類等を含有する溶液等が挙げられる。具体的な泳動用緩衝液としては、例えば、グッドバッファー（トリス－グリシン緩衝液、トリス緩衝液、トリス－トリシン緩衝液、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ緩衝液、ＰＩＰＥＳ緩衝液、トリス－塩酸（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝溶液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＰＩＰＥＳ緩衝液、ＡＣＥＳ緩衝液、ＭＯＰＳＯ緩衝液、ＢＥＳ緩衝液、ＴＥＳ緩衝液、ＤＩＰＳＯ緩衝液、ＴＡＰＳＯ緩衝液、ＰＯＰＳＯ緩衝液、ＨＥＰＰＳＯ緩衝液、ＥＰＰＳ緩衝液、ＴＡＰＳ緩衝液、Ｂｉｃｉｎｅ緩衝液、ＣＨＥＳ緩衝液、ＣＡＰＳＯ緩衝液、ＣＡＰＳ緩衝液等）、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、酢酸緩衝液、炭酸緩衝液、グリシン緩衝液などが挙げられる。上記緩衝液は、１種を単独で使用してもまたは２種以上の混合物の形態で使用してもよい。また、緩衝液は、ＥＤＴＡ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、ポリエチレングリコール等の安定化剤、Ｔｗｅｅｎ、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ等の非イオン界面活性剤などを含んでもよい。緩衝液のｐＨは、特に制限されず、レセプターが標的物質結合活性を維持する環境下であれば特に制限されない。レセプターの標的物質への結合活性維持能などを考慮すると、通常、中性から弱塩基性付近であることが好ましい。かような観点から、緩衝液のｐＨは、６．０～９．０、特に好ましくは６．０～８．０であることがより好ましい。混合温度は、好ましくは４～４０℃、より好ましくは４～２５℃である。また、混合時間は、好ましくは１～７２時間、より好ましくは８～２４時間である。または、混合時間は、好ましくは１～６０分、より好ましくは５～３０分である。
　標的物質を含むサンプルと本開示に係る磁性粒子（第１レセプター固定磁性粒子）との混合（反応）により、１個または２個の標的物質が１個の磁性粒子に結合した標的物質－磁性粒子の複合体（なお、還元抗体を使用する場合には、１個の標的物質が１個の磁性粒子に結合した標的物質－磁性粒子の複合体）および未反応の磁性粒子を含む反応液が得られる。
　（標的物質－磁性粒子の複合体の分離）
　このようにして形成された標的物質－磁性粒子の複合体を、磁気および電気泳動により分離する。すなわち、磁気によって標的物質－磁性粒子の複合体に含まれる磁性粒子を所定の位置で捕捉する。このため、複合体を磁気で捕捉しながらまたは捕捉した後に、電気泳動を行うと、複合体は磁気により所定の位置に固定されたまま、複合体以外の成分（例えば、血球等の生体由来の成分）は移動するまたは全く移動しない。ゆえに、本開示の方法によると、標的物質の種類にかかわらず、または検出し難い標的物質であっても、標的物質（標的物質－磁性粒子の複合体）を効率よく分離・回収できる。なお、標的物質－磁性粒子の複合体は、上記（標的物質－磁性粒子の複合体の形成）で得られたように、緩衝液中に含まれた形態であってもよい、または緩衝液から分離した形態であっても、または緩衝液から分離した後別の緩衝液に分散させた状態であってもよい。
　電気泳動は、特に制限されず、公知の電気泳動が使用できる。具体的には、アガロースゲル電気泳動、パルスフィールドゲル電気泳動（pulsed-field gel electrophoresis；ＰＦＧＥ）、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis；ＰＡＧＥ）等のゲル電気泳動、泳動ゲル中にｐＨ勾配を形成させた等電点電気泳動、等電点電気泳動（１次元目）とＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）とを組み合わせた二次元電気泳動、尿素やホルムアミドを変性剤として使用する変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis；ＤＧＧＥ）等の担体電気泳動；ならびに無担体等電点電気泳動、マイクロチップ電気泳動等の無担体電気泳動などが挙げられる。なお、上記担体電気泳動では、上記以外にも、デキストラン等のゲルを下記記載のキャピラリー高分子等の担体を代わりに使用してもよい。これらのうち、以下の理由により無担体電気泳動が好ましい。例えば、血液（全血）をサンプルとして担体電気泳動を行う場合、サンプルと担体（例えば、ゲル）との境界面に血球だまりができる。この血球だまりは、通常の濃度範囲の標的物質（例えば、サンプル中にｍＭ～μＭオーダーで標的物質が含まれる場合）を検出する場合であれば、標的物質の測定に対する影響を排除できる。しかし、標的物質の蛍光が微量の場合、蛍光検出する際に、サンプルと担体との境界面にある血球だまりに含まれる血球中のタンパク質などが蛍光を発することで（自家蛍光）、大きなノイズを生み、ひいては感度低下を引き起こす。また、担体を用いた電気泳動の場合、この血球だまりに標的物質－レセプターの複合体の一部が残り、信号低下を引き起こす可能性がある。一方、無担体電気泳動の場合には、サンプルと担体との境界面が存在しないため、血球だまりができない。血球は電気泳動により（通常、プラス側）泳動される。すなわち、感度低下の一因である、血球による自家蛍光が防止・抑制できる。このため、高感度な測定を達成できる。また、無担体電気泳動は、担体を含まないため、分離後の処理が容易である。加えて、大量の連続泳動が可能であり、他の分離手段との接続も容易である。すなわち、本開示の好ましい形態によると、電気泳動は無担体電気泳動である。
　また、標的物質－磁性粒子の複合体は磁気により他の成分と分離される。ここで、分離される他の成分は、標的物質以外の成分を意味する。具体的には、サンプル中に含まれる標的物質以外の成分（例えば、血液成分）、（使用する場合には）希釈液（例えば、緩衝液）の構成成分などがある。
　本開示では、電気泳動方向の所定の位置に磁石を設置する。磁石としては、磁性粒子を捕捉できるものであれば特に制限されない。具体的には、希土類磁石（ネオジム磁石、ボンド磁石など）、フェライト磁石、電磁石などが挙げられる。
　以下では、標的物質－磁性粒子の複合体の分離を無担体電気泳動および磁気により行う形態を、図を参照しながら説明する。なお、本開示は下記形態に限定されない。
　図１Ａ～Ｄは、本開示の方法を説明するための工程図である。
　まず、図１Ａに示されるように、電気泳動基材（例えば、キャピラリー）５に第１レセプター固定磁性粒子を含む試薬４を充填する。この電気泳動基材５を、電気泳動装置の基板６上に配置する。また、電気泳動基材５の両端に電極（例えば、白金電極）２，３を設置する。これにより、電気泳動基材５の長手方向に電場がかかる。上記試薬は、第１レセプター固定磁性粒子のみから構成されるものであってもよい。または、試薬は、第１レセプター固定磁性粒子に加えて、ｐＨ調整剤（例えば、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、硫酸、塩酸、リン酸等）、緩衝剤（リン酸水素ナトリウム、リン酸ナトリウム、Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ等）、サポニン等の溶血剤、界面活性剤などを含んでもよい。
　電気泳動基材５は、特に制限されないが、複合体の流れの視認性等の観点から透明であることが好ましい。具体的には、電気泳動基材は、アクリル樹脂等の透明樹脂、石英ガラス、合成石英などの透明材料で形成されることが好ましい。自家蛍光がより少ないという観点から、石英ガラス、合成石英製の電気泳動基材がより好ましく、合成石英製の電気泳動基材が特に好ましい。または、コストの面からは、透明樹脂製の電気泳動基材が特に好ましい。また、電気泳動基材５の形状もまた、特に制限されず、円柱、角柱などいずれでもよい。設置安定性などを考慮すると、電気泳動基材５の断片形状が角形、特に四角形である角柱が好ましい。電気泳動基材５の大きさもまた、特に制限されない。バッファーやサンプルの流れやすさや電気浸透流（Electro Osmotic Flow：ＥＯＦ）の防止・抑制効果などを考慮すると、電気泳動基材５断面の最大長さ（断面が角形の場合には１辺（内辺）の長さ、断面が円形の場合には内径（直径））は、好ましくは０．１～２ｍｍ、より好ましくは０．５～１ｍｍである。また、複合体の分離しやすさや取扱い易さなどを考慮すると、電気泳動基材５の長さは、好ましくは１～１０ｃｍ、より好ましくは２～５ｃｍである。
　また、基板６は、特に制限されないが、複合体の流れの視認性等の観点から透明であることが好ましい。具体的には、基板は、アクリル樹脂等の透明樹脂、石英ガラス、合成石英などの透明材料で形成されることが好ましい。自家蛍光がより少ないという観点から、石英ガラス、合成石英製の基板がより好ましく、合成石英製の基板が特に好ましい。または、コストの面からは、透明樹脂製の基板６が特に好ましい。
　次に、図１Ａに示されるように、白金電極２側に、標的物質を含むサンプル７を滴下する。これにより、サンプル７が毛細管現象により電気泳動基材５内に入り、試薬４と混合する。これにより、電気泳動基材５内で、サンプル７中の標的物質と、第１レセプター固定磁性粒子に存在する第１レセプターと、が反応して、標的物質－磁性粒子の複合体を形成する。ここで、標的物質を含むサンプル７（検体１）の滴下量は、特に制限されず、電気泳動基材の大きさなどに応じて適宜設定される。また、反応条件は、特に制限されないが、上記したような条件が同様にして適用できる。本形態では、サンプル７をプラス（＋）の電極２側に滴下したが、当該形態に限定されない。当該形態は、上述したように、タンパク質に存在するカルボキシル基（－ＣＯＯＨ）がマイナスに帯電させた場合に特に好適に適用される。
　試薬中の第１レセプター固定磁性粒子の量は、特に制限されないが、上記（標的物質の部位を特異的に認識する第１レセプターが固定された磁性粒子）の項で記載したのと同様の量が使用できる。
　本形態では、電気泳動基材５内に予め第１レセプター固定磁性粒子を含む試薬を充填していたが、第１レセプター固定磁性粒子と標的物質とを予め反応させて標的物質－磁性粒子の複合体を形成した後、この反応物を電気泳動基材５に充填してもよい（第２の実施形態）。当該第２の実施形態の場合には、上記反応のためのチャンバー（図示せず）を基板６上に別途設けることが好ましい。
　または、他の形態では、第１レセプター固定磁性粒子及びバッファーを含む試薬溶液を電気泳動基材の両端部に滴下して液だまりを作り、毛細管現象により電気泳動基材内に試薬溶液で満たして、電気泳動基材５の両端に電極（例えば、白金電極）２，３を設置し、いずれかの電極に標的物質を含むサンプルを滴下してもよい（第３の実施形態）。当該第３の実施形態において、バッファーとしては、レセプターが標的物質結合活性を維持する環境下であれば特に制限されず、通常電気泳動に使用される緩衝液が同様にしてあるいは適宜修正して使用できる。具体的には、緩衝液としては、緩衝能を有する従来公知の緩衝液組成物を含有する溶液であれば特に限定されない。例えば、上記（標的物質－磁性粒子の複合体の形成）の項で例示したのと同様の緩衝液等が挙げられる。または、市販の電気泳動用キット中に提供されている緩衝液等も使用することができる。泳動用緩衝液は、一般に電気泳動用緩衝液として使用される濃度で使用することができる。緩衝液のｐＨは、特に制限されず、レセプターが標的物質結合活性を維持する環境下であれば特に制限されない。ただし、レセプターが標的物質結合活性維持能、試薬の安定性、反応性などを考慮すると、通常、ｐＨは中性～弱塩基性付近であることが好ましい。かような観点から、緩衝液のｐＨは、６～９であることがより好ましい。特に標的物質がタンパク質である場合には、緩衝液のｐＨが塩基性側であることにより、タンパク質に存在するカルボキシル基（－ＣＯＯＨ）がマイナスに帯電する（－ＣＯＯ－になる）ため、電気泳動中の複合体の移動を促進できる。緩衝液のｐＨ調整には、塩酸などの酸性物質や水酸化ナトリウムなどの塩基性物質を用いて適宜調整すればよい。
　次に、図１Ｂに示されるように、磁石８を電気泳動基材５の白金電極２（陽極）側に設置する。これにより、標的物質－磁性粒子の複合体に含まれる磁性粒子が磁石８に捕捉される。次に、図１Ｃに示されるように、電気泳動基材５の長手方向上に磁石８を移動させた後、電気泳動を開始する。これにより、標的物質－磁性粒子の複合体を選択的に分離できる。すなわち、本開示の好ましい形態によると、標的物質－磁性粒子の複合体を含む混合物を得た後、磁気により前記標的物質－磁性粒子の複合体を所定に位置に捕捉した後、電気泳動を行うことで、前記混合物から前記標的物質－磁性粒子の複合体を分離する。
　ここで、磁石８の移動場所は特に制限されないが、磁石８を電気泳動基材５の陰極側（図１Ｃでは、白金電極３）側に設置することが好ましい。当該形態であれば、サンプル中の標的物質から分離したい成分（例えば、検出の際にノイズやバックグラウンド上昇を引き起こす物質（下記の第２の実施形態では、自家蛍光を発する血球、検出対象外の蛍光を有する物質等））は陽極側に移動する。このため、検出時に、電気泳動基材５内において、標的物質－磁性粒子の複合体と、ノイズとなり得る物質との距離をあけることができる。このため、感度低下をより効果的に防止・抑制でき、バックグラウンドやノイズを減少させることで、感度をさらに向上できる。具体的には、磁石を、泳動開始地点から泳動終了地点までの全泳動過程の半分より陰極側（図１Ｃ中のＹ／Ｘ≦１／２の位置）に設置することが好ましい。より好ましくは、磁石を、陰極からの磁石までの距離（図１Ｃ中のＹ）が、陰極（図１Ｃ中のＹ＝０）から陽極までの全泳動過程（図１Ｃ中のＹ＝Ｘ）において、陰極を超えて半分までの位置（図１Ｃ中のＹ／Ｘ＝０を超えて１／２以下の位置）に設置する。特に好ましくは、磁石を、陰極から陽極までの全泳動過程（図１Ｃ中のＸ）に対する陰極からの磁石までの距離（図１Ｃ中のＹ）の割合（Ｙ／Ｘ）が、１／１０～３／５の位置（図１Ｃ中のＹ／Ｘ＝１／１０～３／５の位置）に設置し、最も好ましくは磁石を、陰極から陽極までの全泳動過程（図１Ｃ中のＸ）に対する陰極からの磁石までの距離（図１Ｃ中のＹ）の割合（Ｙ／Ｘ）が、１／１０～２／５の位置（図１Ｃ中のＹ／Ｘ＝１／１０～２／５の位置）に設置する。上記位置に設置することにより、自家蛍光等の感度低下をさらに効果的に防止・抑制できる。なお、図１Ｃにおいて、「Ｘ」は、陰極と陽極との間の長さ（電気泳動基材５の全長に相当）（ｍｍ）を示す。また、「Ｙ」は、陰極から磁石の幅の中点（中心）までの距離（ｍｍ）を示す。また、この陰極、陽極に対する磁石の設置距離の関係は、検出物質の種類によって、第２の実施形態と反対の関係にすることも可能である。
　磁石８を電気泳動基材５上の所定の位置に配置した後、電気泳動を開始する。ここで、電気泳動条件は、複合体以外の成分（例えば、サンプル由来の夾雑物）が分離できる条件であれば特に制限されず、通常の条件が適用できる。例えば、電気泳動における印加電圧は、通常この分野で用いられている範囲から適宜選択すればよく、通常、直流電圧で、好ましくは５～２００Ｖ、より好ましくは１０～１００Ｖの範囲で印加される。電気泳動時間は、通常、３０～１８０分であり得る。迅速な分離という観点からは、泳動時間は数分～１０分程度であることが好ましい。なお、電気泳動温度は、特に制限されないが、通常、室温（２０～２５℃）で行われる。
　上述したように、電気泳動直前のサンプル（以下、「検体１」とも称する）は、サンプル中に含まれる成分（例えば、血球等の生体由来の成分）や緩衝液に含まれる成分に加えて、標的物質－磁性粒子の複合体および未反応の磁性粒子を含む。上記電気泳動では、標的物質－磁性粒子の複合体および未反応の磁性粒子が磁石に捕捉される。また、通常、１箇所に捕捉した磁性粒子は目視できる（例えば、図２Ｂ参照）。このため、磁石が配置される電気泳動基材部分のみを切除などにより取り出すことにより、標的物質は、サンプルや緩衝液に含まれる成分（例えば、血球など）から効率よく分離できる。なお、目的物（標的物質－磁性粒子の複合体）の拡散を防止するため、磁石が配置される電気泳動基材部分のみの取り出しは、磁石を配置したまま行うことが好ましい。
　＜標的物質量の測定方法（本開示の第２の形態）＞
　本開示の第２の形態は、標的物質を含むサンプルと、前記標的物質の部位を特異的に認識する第１レセプターが固定された磁性粒子と、前記標的物質の部位とは異なる部位を特異的に認識する第２レセプターが固定された標識物質と、を混合して、標的物質－磁性粒子－標識物質の複合体を含む混合物を得、磁気および電気泳動により前記標的物質－磁性粒子－標識物質の複合体を分離した後、前記標的物質－磁性粒子－標識物質の複合体のシグナル強度を検出することを有する、標的物質量の測定方法である。
　本開示の方法によると、第１レセプターを介して標的物質と磁性粒子とが結合し、第２レセプターを介して標的物質と標識物質とが結合し、磁性粒子と標的物質と標識物質との複合体（標的物質－磁性粒子－標識物質の複合体）を形成する。磁気によってこの複合体に含まれる磁性粒子を所定の位置で捕捉する。このため、複合体（標的物質－磁性粒子－標識物質の複合体）を磁気で捕捉しながらまたは捕捉した後に、電気泳動を行うと、複合体は磁気により所定の位置に固定されたままで、複合体以外の成分（例えば、血球等の生体由来の成分やタンパク質）は移動する。特に、測定対象物を蛍光標識したレセプターを用いて検出する場合、検出対象ではない夾雑物（タンパク質、ペプチド、アミノ酸、細胞膜、脂肪酸等）を、電気泳動により陰極側、または、陽極側に泳動できる。特に、そのものが蛍光を有するアミノ酸や、ペプチド、検出対象ではないタンパク質を、電気泳動により分離すれば、大幅にノイズやバックグラウンドを減少させることができる。したがって、標的物質（標的物質－磁性粒子－標識物質の複合体）を選択的に分離・回収できる。本開示の方法は磁性粒子を用いて目的とする標的物質を回収する方法であるため、標的物質の種類（例えば、電荷、等電点や分子量）によらずに、標的物質を効率よく分離できる。また、標的物質－磁性粒子－標識物質の複合体を選択的に回収できるため、目的とする標的物質の量を高精度で測定できる。
　以下、本開示の第２の形態を説明するが、重複する事項（例えば、標的物質を含むサンプル、本開示に係る磁性粒子（第１レセプター固定磁性粒子）、磁石、電気泳動）に関する説明は本開示の第１の形態における説明と同様であるため、ここでは説明を省略する。
　（標的物質の部位とは異なる部位を特異的に認識する第２レセプターが固定された標識物質）
　本開示に係る標識物質（第２レセプター固定標識物質）は、第１レセプターの認識部位とは異なる部位を特異的に認識する第２レセプターが（例えば、表面に）固定されてなる。ここで、第２レセプターは、特に制限されず、本開示に係る磁性粒子（第１レセプター固定磁性粒子）にて説明したのと同様であるため、ここでは、説明を省略する。なお、第２レセプターは、第１レセプターとは異なる部位を認識する、すなわち、第１レセプター、第２レセプター（例えば、抗体）は、１つの標的物質の異なる部位をそれぞれ認識する。例えば、第１レセプターおよび第２レセプターが脂肪酸結合タンパク質を認識する場合には、Monoclonal mouse anti-human fatty acid binding protein (25)を第１レセプターとして使用し、Monoclonal mouse anti-human fatty acid binding protein (28)を第２レセプターとして使用するなど、異なるレセプター（例えば、抗体）を選択する。
　標識物質（第２レセプターが固定される前の標識物質）は、後の工程で所望の標的物質の量を測定するのに使用できるものであれば特に制限されない。例えば、蛍光物質、放射性同位体、酵素およびレドックス物質などが好ましく挙げられる。上記標識物質は、１種を単独で使用してもまたは２種以上を組み合わせて使用してもよい。すなわち、本開示の好ましい形態によると、標識物質は、蛍光物質、放射性同位体、酵素およびレドックス物質からなる群より選択される少なくとも一種である。ここで、蛍光物質としては、特に制限されず、通常標的物質の量を測定するのに使用されるものが使用できる。具体的には、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｏｕｒ（Ｌｉｆｅ社）、Ｈｉｌｙｔｅ　Ｆｌｏｕｒ（Ａｎａ　ｓｐｅｃ社）、ＩＲＤｙｅ（LI-COR Biosciences製）、ＩＲＤｙｅ　８００ＣＷ　Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ（LI-COR Biosciences製）、ＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　Ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、ＰＥ（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）、ＡＰＣ（Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ）、Ｃｙ－３、Ｃｙ－５、テトラメチルローダミンイソシアネート、半導体量子ドットなどが挙げられる。これらのうち、長波長側で励起する蛍光色素を使用することが好ましい。短波長で蛍光を発する物質が自然界に多く存在するため、長波長側で励起する蛍光色素を使用することにより、自家蛍光をより効果的に低減できる。上記点を考慮すると、７００～１，０００ｎｍ、特に７５０～９００ｎｍで励起する蛍光色素を使用することが好ましい。このような波長域で励起する蛍光色素は検出効率がよく、感度をより向上できるという利点もある。放射性同位体としては、特に制限されず、通常標的物質の量を測定するのに使用されるものが使用できる。具体的には、１２５Ｉ、３２Ｐ、１４Ｃ、３５Ｓまたは３Ｈ等のラジオアイソトープなどが挙げられる。酵素としては、特に制限されず、通常標的物質の量を測定するのに使用されるものが使用できる。具体的には、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ（例えば、セイヨウペルオキシダーゼ）、β－ガラクトシダーゼ、フィコエリトリンなどが挙げられる。レドックス物質としては、特に制限されず、通常標的物質の量を測定するのに使用されるものが使用できる。具体的には、鉄、バナジウム、クロム、亜鉛、およびこれらの混合物から選択されるレドックス金属イオンを含む化合物があり、より具体的には、フェロセン、１，１’－ジメチルフェロセン、フェロシアン化物及びフェリシアン化物、ルテニウム（ＩＩＩ）及びルテニウム（ＩＩ）ヘキサアミン、ＰＭＳ（フェンジンメトサルフェート）、ｍ－ＰＭＳ等などが挙げられる。
　標識物質に第２レセプターを固定する方法もまた特に制限されず、本開示に係る磁性粒子（第１レセプター固定磁性粒子）にて説明したのと同様であるため、ここでは、説明を省略する。なお、上記（標的物質の部位を特異的に認識する第１レセプターが固定された磁性粒子）における「磁性粒子第１レセプターを固定する方法」の説明において、「磁性ビーズ」または「磁性粒子」を「標識物質」と読み替えることによって適用できる。
　本開示に係る第２レセプター固定標識物質の使用量は、特に制限されず、標的物質の量に応じて適宜選択されるが、通常、標的物質の量に対して多い。例えば、１個の標的物質が標識物質に結合する場合には（例えば、還元抗体が固定された標識物質では）、本開示に係る第２レセプター固定標識物質の使用量は、標的物質１モルに対して、好ましくは１モルを超えて１００モル以下、より好ましくは１モルを超えて５０モル以下、特に好ましくは２～５０モルの第２レセプター（例えば、抗体）が存在するような量である。なお、２個の標的物質が標識物質に結合する場合には（例えば、ＩｇＧ抗体が固定された標識物質では）、上記第２レセプター固定標識物質の量は、上記好ましい量の２倍の量となる。また、標識物質の量は、例えば、血液中に含まれるインスリン量など、当業者であればある程度予想することができ、予想範囲の上限を標識物質量とする。なお、当業者が標識物質の量を予想できない場合には、第２レセプター固定標識物質を過剰量（例えば、反応液中に０．１～１００μｇ／ｍＬの第２レセプター固定標識物質または１～１００ｎＭの第２レセプター（例えば、抗体）が含まれるような量）使用すればよい。
　また、本開示に係る標識物質（第２レセプター固定標識物質）と本開示に係る磁性粒子（第１レセプター固定磁性粒子）との混合割合は、特に制限されないが、第１レセプター固定磁性粒子の方が第２レセプター固定標識物質より多く存在することが好ましい。これにより、未反応の標識物質による感度の低下をより効果的に抑制しつつ、サンプル中に存在する標識物質をより効率的に捕捉できる。具体的には、標識物質及び磁性粒子共に１個の標的物質が結合する場合には（例えば、還元抗体が固定された磁性粒子または標識物質では）、本開示に係る標識物質（第２レセプター固定標識物質）と本開示に係る磁性粒子（第１レセプター固定磁性粒子）との混合割合は、本開示に係る磁性粒子に結合する第１レセプターが、本開示に係る標識物質に結合する第２レセプター　１モルに対して、好ましくは１モルを超えて１００００モル以下、より好ましくは１０～１０００モル、特に好ましくは１０モルを超えて５０モル以下存在するような割合である。このような混合割合であれば、未反応の標識物質による感度の低下をさらにより効果的に抑制しつつ、サンプル中に存在する標識物質をさらにより効率的に捕捉できる。
　（標的物質－磁性粒子－標識物質の複合体の形成）
　上記標的物質を含むサンプルを、上記本開示に係る磁性粒子（第１レセプター固定磁性粒子）および上記本開示に係る標識物質（第２レセプター固定標識物質）と混合することによって、第１レセプターを介して標的物質と磁性粒子とがおよび第２レセプターを介して標的物質と標識物質とが結合して、標的物質－磁性粒子－標識物質の複合体が形成される。この際の標的物質－磁性粒子－標識物質の複合体形成条件は、所望の複合体が形成される条件であれば特に制限されない。例えば、標的物質を含むサンプル、第１レセプター固定磁性粒子および第２レセプター固定標識物質を、緩衝液中で混合する。ここで、緩衝液は、特に限定されず、公知の緩衝液が使用できる。具体的には、上記（標的物質－磁性粒子の複合体の形成）の項で例示したのと同様の緩衝液等が挙げられる。また、緩衝液のｐＨは、特に制限されず、レセプターが標的物質結合活性を維持する環境下であれば特に制限されない。ただし、レセプターが標的物質結合活性低下の抑制などを考慮すると、通常、中性から弱塩基性付近であることが好ましい。かような観点から、緩衝液のｐＨは、６．０～９．０、特に好ましくは６．０～８．０であることがより好ましい。混合温度は、好ましくは４～４０℃、より好ましくは２５～３７℃である。また、混合時間は、好ましくは１～６０分、より好ましくは５～３０分である。
　標的物質を含むサンプルと本開示に係る磁性粒子（第１レセプター固定磁性粒子）と本開示に係る標識物質（第２レセプター固定標識物質）との混合（反応）により、標的物質－磁性粒子－標識物質の複合体を含む混合物が得られる。具体的には、上記混合物は、標的物質を介して磁性粒子及び標識物質が結合した標的物質－磁性粒子－標識物質の複合体、標的物質が磁性粒子のみに結合した標的物質－磁性粒子の複合体、標的物質が標識物質のみに結合した標的物質－標識物質の複合体、未反応の磁性粒子および未反応の標識物質を含む。
　（標的物質－磁性粒子－標識物質の複合体の分離）
　このようにして形成された標的物質－磁性粒子－標識物質の複合体を含む混合物に電気泳動を行い、前記電気泳動中に磁気により前記標的物質－磁性粒子－標識物質の複合体を分離する。すなわち、電気泳動する途中または、電気泳動する前に、磁気によって標的物質－磁性粒子－標識物質の複合体に存在する磁性粒子を捕捉して、目的とする標的物質（標的物質－磁性粒子－標識物質の複合体）を回収する。なお、標的物質－磁性粒子－標識物質の複合体は、上記（標的物質－磁性粒子－標識物質の複合体の形成）で得られたように、緩衝液中に含まれた形態であってもよい、または緩衝液から分離した形態であっても、または緩衝液から分離した後、別の緩衝液に分散させた状態であってもよい。ここで、電気泳動は、特に制限されず、公知の電気泳動が使用できる。具体的には、上記（標的物質－磁性粒子の複合体の分離）の項で説明したのと同様であるため、ここでは説明を省略する。
　上記電気泳動中に、目的とする標的物質－磁性粒子－標識物質の複合体を磁気により分離する。詳細には、標的物質－磁性粒子－標識物質の複合体、標的物質が磁性粒子のみに結合した標的物質－磁性粒子の複合体および未反応の磁性粒子が磁気により捕捉される。このため、電気泳動中、サンプル中に含まれる標的物質以外の成分、（使用する場合には）試薬希釈液（例えば、緩衝液）、標的物質が非特異的に結合した物質（標識物質のみに結合した標的物質－標識物質の複合体等）、および未反応の標識物質が分離される。
　本開示では、電気泳動途中に磁石を設置する。ここで、磁石の具体的な説明は、上記（標的物質－磁性粒子の複合体の分離）の項で説明したのと同様であるため、ここでは説明を省略する。
　（標的物質－磁性粒子－標識物質の複合体のシグナル強度の検出）
　上記にて分離された標的物質－磁性粒子－標識物質の複合体のシグナル強度を検出することにより、目的とする標的物質の量を測定する。なお、上記分離工程では、標的物質－磁性粒子－標識物質の複合体に加えて、標的物質が磁性粒子のみに非特異的に結合した標的物質－磁性粒子の複合体や、未反応の磁性粒子も磁石に捕捉される。本実施形態では、標識物質として、標的物質に特異的に結合する抗体を用いる。このため、未反応の磁性粒子には標的物質が存在しないため、標識物質は未反応の磁性粒子に結合しない。すなわち、未反応の磁性粒子は標的物質－磁性粒子－標識物質の複合体のシグナル強度（ゆえに、測定精度）には実質的な影響を及ぼさない。このため、当該工程では標的物質由来のシグナル強度が選択的に検出される、即ち、標的物質の量を高精度で測定できる。また、感度低下の原因となるサンプル中の他の成分（例えば、血球）、や未反応の標識物質は電気泳動により当該磁石より陰極または陽極側に移動している。標識物質の配合量は、標的物質の種類、磁性粒子等の他の試薬成分の使用量、サンプルの種類を考慮したうえで、標的物質が測定対象範囲において十分検出可能となるように配合する。ゆえに、本開示の方法によれば、目的とする標的物質の存在量を高感度（高精度）で測定できる。
　以下では、標的物質－磁性粒子－標識物質の複合体の分離を無担体電気泳動および磁気により行った後、当該複合体のシグナル強度を検出する形態を、図を参照しながら説明する。なお、本開示は下記形態に限定されない。
　図１Ａ～Ｄは、本開示の方法を説明するための工程図である。
　図１Ａ、ＢおよびＣの説明において、上記本開示の第１の形態における説明と重複する事項についてはここでは説明を省略する。
　まず、図１Ａに示されるように、電気泳動基材（例えば、キャピラリー）５に第１レセプター固定磁性粒子および第２レセプター固定標識物質を含む試薬４を充填する。この電気泳動基材５を、電気泳動装置の基板６上に配置する。また、電気泳動基材５の両端に電極（例えば、白金電極）２，３を設置する。これにより、電気泳動基材５の長手方向に電場がかかる。上記試薬は、第１レセプター固定磁性粒子および第２レセプター固定標識物質のいずれか一方を含むものであってもよい。または、試薬は、第１レセプター固定磁性粒子および第２レセプター固定標識物質に加えて、ｐＨ調整剤（例えば、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、硫酸、塩酸、リン酸等）、緩衝剤（リン酸水素ナトリウム、リン酸ナトリウム、Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ等）、サポニン等の溶血剤、界面活性剤などを含んでもよい。
　試薬中の第１レセプター固定磁性粒子の量は、特に制限されず、上記（標的物質の部位を特異的に認識する第１レセプターが固定された磁性粒子）の項で記載したのと同様の量が使用できる。同様にして、第２レセプター固定標識物質の量や第１レセプター固定磁性粒子と第２レセプター固定標識物質との混合割合は、特に制限されず、上記（標的物質の部位とは異なる部位を特異的に認識する第２レセプターが固定された標識物質）の項で記載したのと同様の量や割合が使用できる。
　本形態では、電気泳動基材５内に予め第１レセプター固定磁性粒子及び第２レセプター固定標識物質を含む試薬を充填していたが、第１レセプター固定磁性粒子と第２レセプター固定標識物質と標的物質（サンプル）とを予め反応させて標的物質－磁性粒子－標識物質の複合体を形成した後、この反応物を電気泳動基材５に充填してもよい（第２’の実施形態）。当該第２’の実施形態の場合には、上記反応のためのチャンバー（図示せず）を基板６上に別途設けることが好ましい。
　または、他の形態では、第１レセプター固定磁性粒子、第２レセプター固定標識物質及びバッファーを含む試薬溶液を電気泳動基材の両端部に滴下して液だまりを作り、毛細管現象により電気泳動基材内に試薬溶液で満たして、電気泳動基材５の両端に電極（例えば、白金電極）２，３を設置し、いずれかの電極に標的物質を含むサンプルを滴下してもよい（第３’の実施形態）。
　次に、図１Ｂに示されるように、磁石８を電気泳動基材５の白金電極２（陽極）側に設置する。これにより、標的物質－磁性粒子の複合体に含まれる磁性粒子が磁石８に捕捉される。次に、図１Ｃに示されるように、電気泳動基材５の長手方向上に磁石８を移動させた後、電気泳動を開始する。これにより、標的物質－磁性粒子－標識物質の複合体を選択的に分離できる。ゆえに、以下で詳述するシグナル強度の検出において、標的物質－磁性粒子－標識物質の複合体（ゆえに、この複合体に含まれる標識物質）の量を高精度で測定できる。すなわち、本開示の好ましい形態によると、標的物質－磁性粒子－標識物質の複合体を含む混合物を得た後、磁気により前記標的物質－磁性粒子－標識物質の複合体を所定に位置に集めた後、電気泳動を行うことで、前記標的物質－磁性粒子－標識物質の複合体と、未反応の第２レセプターが固定された標識物質（標的物質と結合しない第２レセプター固定標識物質）と、を分離する。ここで、磁石８の移動場所は特に制限されないが、上記（標的物質－磁性粒子の複合体の分離）における図１Ｃの項で記載したのと同様の位置に磁石を設置することが好ましい。
　磁石８を電気泳動基材５の外表面上また電気泳動基材５の外表面に近い位置で、電気泳動基材５に沿って、陰極と陽極との間を少なくとも１回、移動させる。その後、磁石８を所定の位置に配置し、電気泳動を開始する。磁石８の配置位置としては、特に規定されるものではなく、電気泳動基材５に、適切な磁力を与えることができる位置であればよいが、上記（標的物質－磁性粒子の複合体の分離）の項で規定したのと同様の位置に磁石を配置することができる。
　上述したように、電気泳動直前のサンプル（以下、「検体２」とも称する）は、サンプル中に含まれる成分（例えば、血球等の生体由来の成分）や緩衝液に含まれる成分に加えて、標的物質－磁性粒子－標識物質の複合体、標的物質－磁性粒子の複合体、標的物質－標識物質の複合体、未反応の磁性粒子および未反応の標識物質を含む。上記電気泳動では、標的物質－磁性粒子－標識物質の複合体、標的物質－磁性粒子の複合体および未反応の磁性粒子が磁石に捕捉される。しかし、標識物質と磁性粒子との混合比を適切にすることによって、標的物質－磁性粒子の複合体の混入量は最小限にすることができる。このため、標的物質－磁性粒子－標識物質の複合体および未反応の磁性粒子が磁石に選択的に捕捉される。しかし、この未反応の磁性粒子には標識物質が特異的に結合しない（下記シグナル強度の検出では検出されない）。このため、電気泳動後の分離物のシグナル強度を測定することによって、標的物質－磁性粒子－標識物質の複合体（ゆえに標的物質）の存在量を高感度（高精度）で測定できる。
　次に、図１Ｄに示されるように、磁石８が配置される電気泳動基材５部分に存在する標的物質－磁性粒子－標識物質の複合体９のシグナル強度を検出する。ここで、この複合体中に存在する標識物質のシグナル強度は、標的物質量に対応する。すなわち、予め測定した標的物質－磁性粒子－標識物質のバンドのシグナル強度について、標的物質量との検量線を作成することができ、当該検量線に基づいて、検出された標的物質－磁性粒子－標識物質の複合体のバンドのシグナル強度を比較することで、サンプル中の標的物質量を正確に測定できる。すなわち、本開示の好ましい形態によると、予め量が既知の標的物質を用いて、標的物質量に対する標的物質－磁性粒子－標識物質の複合体のシグナル強度の検量線を作成し、前記検量線および前記検出された標的物質－磁性粒子－標識物質の複合体のシグナル強度に基づいて、前記サンプル中に含まれる標的物質の量を測定する。
　本開示では、予め標的物質量が既知のサンプルを用いて、標的物質量に対する標的物質－磁性粒子－標識物質の複合体のバンドのシグナル強度の関係（検量線）を作成することが好ましい。すなわち、予め標的物質量が既知のサンプルについて、上記と同様の操作を行い、標的物質－磁性粒子－標識物質の複合体のバンドのシグナル強度を算出し、標準物質量とバンドのシグナル強度との検量線を作成する。ここで、シグナル強度の測定方法は、標識物質の種類に応じて公知の方法が使用できる。例えば、標識物質が蛍光物質である場合には、定量を行う場合には、蛍光測定器（蛍光スキャナー）や画像処理システムで蛍光強度を測定する。また、標識物質が放射性同位体である場合には、放射線計数装置で放射線量を測定する。標識物質が酵素である場合には、酵素により生じた産物の検出および／または定量は、当該産物の吸光度を測定することにより行なうことができる。例えば、酵素基質として、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジンを用いた場合には、６５５ｎｍにおける吸光度を測定すればよい。また、標識物質がレドックス物質である場合には、生成する電気化学的シグナルを測定することにより行なう。
　標的物質の定量は、例えば、既知濃度の標的物質が含まれる標準試料を用いて得られた蛍光強度を利用して検量線を作成することによって、試料中に含まれる標的物質の量を簡便に定量する。
　本開示により求められる検量線は、泳動条件などの外来要因にはよらず、定常的なものであるため、検量線として有効である。このため、この検量線を利用することにより、サンプル中の標的物質量を正確に測定できる。
　上記検出方法は、特に標的物質が何らかの疾患に関与するマーカーである場合に、臨床検査において非常に有用なアッセイ手段となる。
　なお、図１Ｄでは、磁石を取り外しているが、目的物（標的物質－磁性粒子－標識物質の複合体）の拡散を防止するため、電気泳動基材５に磁石を配置したままシグナル強度を適切に（例えば、基板の下方から）検出することが好ましい。この点からも、基板や電気泳動基材が透明であることが好ましい。
　［診断方法］
　本開示の第３の形態は、第１または第２の実施形態の分離・測定方法を用いた標的物質に関与する疾患の診断方法である。具体的には、被検者から試料を採取する段階と、前記試料中の標的物質と、前記標的物質の部位を特異的に認識する第１レセプターが固定された磁性粒子と、前記標的物質の部位とは異なる部位を特異的に認識する第２レセプターが固定された標識物質と、を混合して、標的物質－磁性粒子－標識物質の複合体を含む混合物を得、前記混合物に電気泳動を行い、磁気および電気泳動により前記標的物質－磁性粒子－標識物質の複合体を分離した後、前記標的物質－磁性粒子－標識物質の複合体のシグナル強度を検出し、健常者の標的物質の値と比較して被検者が標的物質に関与する疾患に罹患しているか否かを判定することを含む、標的物質に関与する疾患の診断方法である。したがって、本発明は、被検者から試料を採取し、前記試料中の標的物質と、前記標的物質の部位を特異的に認識する第１レセプターが固定された磁性粒子と、前記標的物質が認識する部位とは異なる部位を特異的に認識する第２レセプターが固定された標識物質と、を混合して、標的物質－磁性粒子－標識物質の複合体を含む混合物を得、磁気および電気泳動により前記標的物質－磁性粒子－標識物質の複合体を分離した後、前記標的物質－磁性粒子－標識物質の複合体のシグナル強度（シグナル強度１）を検出し；健常者から試料を採取し、前記試料中の標的物質と、前記標的物質の部位を特異的に認識する第１レセプターが固定された磁性粒子と、前記標的物質の部位とは異なる部位を特異的に認識する第２レセプターが固定された標識物質と、を混合して、標的物質－磁性粒子－標識物質の複合体を含む混合物を得、磁気および電気泳動により前記標的物質－磁性粒子－標識物質の複合体を分離した後、前記標的物質－磁性粒子－標識物質の複合体のシグナル強度（シグナル強度２）を検出し；前記シグナル強度１を前記シグナル強度２と比較して被検者が標的物質に関与する疾患に罹患しているか否かを判定することを有する、標的物質に関与する疾患の診断方法をも提供する。ここで、被検者又は健常者は、ヒト又はヒト以外の哺乳動物であることが好ましい。上記疾患としては、例えば、標的物質がインスリンである場合、インスリンノーマ、肥満、肝疾患、クッシング症候群、末端肥大症、異常インスリン血症、インスリン自己免疫症候群、糖尿病、低血糖、低栄養状態、褐色細胞腫、下垂体副腎機能低下症などが挙げられる。健常者の値と比較して被験者のシグナル強度が高ければ、上記したような疾患にインスリンノーマ、肥満、肝疾患、クッシング症候群、末端肥大症、異常インスリン血症、インスリン自己免疫症候群などに罹患している可能性がある。一方、健常者の値と比較して被験者のシグナル強度が低ければ、糖尿病、低血糖、低栄養状態、褐色細胞腫、下垂体副腎機能低下症などに罹患している可能性がある。すなわち、前記標的物質がインスリンであり、前記シグナル強度１を前記シグナル強度２より低い場合には、前記被検者が糖尿病、低血糖、低栄養状態、褐色細胞腫または下垂体副腎機能低下症に罹患しているまたは罹患の危険性を有すると判断する。
　［検査キットまたは検査システム］
　本開示の第４の形態は、標的物質の部位を特異的に認識する第１レセプターが固定された磁性粒子（第１レセプター固定磁性粒子）、標的物質の部位とは異なる部位を特異的に認識する第２レセプターが固定された標識物質（第２レセプター固定標識物質）および磁石を含む標的物質に関与する疾患の検査キットである。したがって、本発明は、標的物質の部位を特異的に認識する第１レセプターが固定されてなる磁性粒子、前記標的物質が認識する部位とは異なる部位を特異的に認識する第２レセプターが固定されてなる標識物質、および磁石を含む標的物質に関与する疾患の検査キットをも提供する。
　本開示の第５の形態は、標的物質の部位を特異的に認識する第１レセプターが固定された磁性粒子、標的物質の部位とは異なる部位を特異的に認識する第２レセプターが固定された標識物質、磁石および電気泳動装置（好ましくは無担体電気泳動装置）を含む標的物質に関与する疾患の検査システムである。したがって、本発明は、標的物質の部位を特異的に認識する第１レセプターが固定されてなる磁性粒子、前記標的物質が認識する部位とは異なる部位を特異的に認識する第２レセプターが固定されてなる標識物質、磁石、および電気泳動装置を含む標的物質に関与する疾患の検査システムをも提供する。本形態において、前記電気泳動装置は、無担体電気泳動装置であることが好ましい。
　検査キットに含まれる第１レセプター固定磁性粒子や第２レセプター固定標識物質は、１つのまたは別々の容器に入れられていてもよい。また、第１レセプター固定磁性粒子や第２レセプター固定標識物質は、緩衝液と共に容器に入れられていてもよい。また、上記検査キットは、アッセイ用の緩衝液またはその濃縮ストック溶液などを含む電気泳動用セットであってもよい。すなわち、本開示の第６の形態は、標的物質の部位を特異的に認識する第１レセプターが固定された磁性粒子、標的物質の部位とは異なる部位を特異的に認識する第２レセプターが固定された標識物質、磁石および電気泳動セット（好ましくは無担体電気泳動セット）を含む標的物質に関与する疾患の検査システムである。したがって、本発明は、標的物質の部位を特異的に認識する第１レセプターが固定されてなる磁性粒子、前記標的物質が認識する部位とは異なる部位を特異的に認識する第２レセプターが固定されてなる標識物質、磁石、および電気泳動セットを含む標的物質に関与する疾患の検査システムをも提供する。本形態において、前記電気泳動セットは、無担体電気泳動セットであることが好ましい。ここで、電気泳動用セットには、その他、電気泳動槽、電気泳動用ガラス板、バッファー槽、スペーサー、コーム、クリップ、パワーサプライ、又はペリスタポンプ等の一般的な電気泳動用器械；電気泳動用試薬；検出試薬等を含めることができる。
　本形態の検査キットまたは検査システムは、量（濃度）が既知である標準サンプルおよびこれを含む容器をキットまたはシステムにさらに含んでいてもよい。検査キットまたは検査システムに含まれる各試薬は、１試料測定分毎に容器に分注されて提供されていてもよく、複数試料測定分が各試薬毎に纏めて個々の容器に含まれて提供されてもよい。後者の場合は、用時に各試薬を所定の測定用容器に分注して使用する。試薬が１試料測定分毎に提供される場合は、各試薬を含む容器はカートリッジとして一体成形されてもよく、そのカートリッジの異なる区画に各試薬が格納されていてもよい。第１レセプター固定磁性粒子や第２レセプター固定標識物質が固体形状でキットに含まれる場合には、検査キットまたは検査システムは、複合体を形成するための上述のような緩衝液をさらに含んでもよい。検査キットまたは検査システムに含まれてもよい容器は第１レセプター固定磁性粒子や第２レセプター固定標識物質と相互作用せず、アッセイに利用される反応、例えば酵素反応、化学発光反応を妨害しない材料であればどんな材質のものでもよい。必要であればそのような相互作用を起こさないように表面を予め処理して提供されてもよい。検査キットまたは検査システムには、通常取り扱い説明書が添付される。
　本開示の効果を、以下の実施例および比較例を用いて説明する。ただし、本開示の技術的範囲が以下の実施例のみに制限されるわけではない。なお、下記実施例において、特記しない限り、操作は室温（２５℃）で行われた。また、特記しない限り、「％」および「部」は、それぞれ、「質量％」および「質量部」を意味する。
　実施例１
　（第１レセプター固定磁性粒子の調製）
　マウス抗ヒト脂肪酸結合タンパク質（Ｈ－ＦＡＢＰ）ＩｇＧモノクローナル抗体２８（Monoclonal mouse anti-human fatty acid binding protein (FABP) 28、Hytest Ltd.製）０．０３２ｍＬ（０．２ｍｇ）をBiotin Labeling Kit-SH（株式会社同仁化学研究所製）を用い、製造社のプロトコルに従って、ビオチン化して、Biotin標識Anti H-FABP(28)（ビオチン化Ｈ－ＦＡＢＰ抗体）を含むＰＢＳ溶液（ｐＨ　７．４）（溶液Ａ－１）０．２ｍＬ（１ｍｇ／ｍＬ）を得た。
　この溶液Ａ－１　０．２ｍＬに、MagnosphereMS300/Streptavidin（平均粒子径：３．０μｍ、ＪＳＲライフサイエンス株式会社製）（磁性粒子）０．２ｍＬ（磁性粒子量：２ｍｇ）を加え、一晩４℃でビオチン化ＦＡＢＰ抗体のビオチン部分と磁性粒子のストレプトアビジン部分とを反応させて、Biotin標識Anti H-FABP(28)/Streptavidin磁気ビーズ複合体（第１レセプター固定磁性粒子）を含む反応液（溶液Ａ－２）を得た。所定時間インキュベーションした後、永久磁石を使い、第１レセプター固定磁性粒子を反応液（溶液Ａ－２）から分離し、０．１％　ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ　７．４）にて洗浄した。最終洗浄後、第１レセプター固定磁性粒子をデカンテーションにより単離した後、０．１％　ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ　７．４）０．２ｍＬを加えて、第１レセプター固定磁性粒子溶液（溶液Ａ－３）を調製した。なお、溶液Ａ－３中の第１レセプター固定磁性粒子、抗体及び磁性粒子の濃度は、それぞれ、１１ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ及び１０ｍｇ／ｍＬであった。
　（第２レセプター固定標識物質の調製）
　マウス抗ヒト脂肪酸結合タンパク質（ＦＡＢＰ）ＩｇＧモノクローナル抗体２５（Monoclonal mouse anti-human fatty acid binding protein (FABP) 25、Hytest Ltd.製）０．０５５ｍＬ（０．３ｍｇ）を、５０ｍＭ　ＥＤＴＡを含む０．１Ｍ　リン酸バッファー（ｐＨ６．０）　０．３ｍＬに添加して、抗体溶液（溶液Ｂ－１）を調製した。この抗体溶液（溶液Ｂ－１）に、０．１Ｍメルカプトエチルアミン塩酸塩及び５０ｍＭ　ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．０）０．０５ｍＬを加えた。この液を、３７℃で２時間インキュベートして、抗体のジスルフィド結合を還元してスルフヒドリル基（－ＳＨ）を形成して、還元抗体を含む溶液（溶液Ｂ－２）を得た。この溶液（溶液Ｂ－２）について、脱塩処理を行い、還元抗体を含むＰＢＳ溶液（溶液Ｂ－３）０．４ｍＬを得た。
　別途、IRDye（登録商標） 800CW Maleimide（LI-COR Biosciences製）（標識物質）（励起波長：８００ｎｍ）０．５ｍＬに、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）０．０３ｍＬを加えて溶解して、標識物質溶液（溶液Ｂ－４）を調製した。この標識物質溶液（溶液Ｂ－４）０．０１ｍＬを、上記還元抗体を含むＰＢＳ溶液（溶液Ｂ－３）０．４ｍＬに加えて、３７℃で３０分インキュベートして還元抗体のスルフヒドリル基（－ＳＨ）と標識物質のマレイミド基とを反応させて、IRDye800CW標識AntiH-FABP(25)複合体（第２レセプター固定標識物質）を含む反応液（溶液Ｂ－５）を得た。所定時間インキュベート後、このようにして得られた反応液（溶液Ｂ－５）について、Zebaスピン脱塩カラム（ZebaTM Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）を用いてＰＢＳにバッファー交換して、第２レセプター固定標識物質を含むＰＢＳ溶液（溶液Ｂ－６）０．４ｍＬを得た。なお、バッファー交換は、溶液を０．２ｍＬづつに分けてスピン脱塩カラムを２本使用して行った後、カラム処理液を合わせた（溶液Ｂ－６）。
　最後に、このようにして得られた溶液Ｂ－６を、抗体濃度が０．１ｍｇ／ｍＬになるように、０．１％　ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ　７．４）で希釈して、第２レセプター固定標識物質溶液（溶液Ｂ－７）を調製した。
　（Ｈ－ＦＡＢＰ溶液の調製）
　ヒト脂肪酸結合タンパク質（Ｈ－ＦＡＢＰ）（Fatty acid binding protein (FABP), human、Hytest Ltd.製）０．１ｍｇに、０．１％　ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液　２ｍＬを添加・溶解して、Ｈ－ＦＡＢＰ溶液（Ｈ－ＦＡＢＰ濃度：０．０５ｍｇ／ｍＬ）を調製した。
　（泳動溶液の作製）
　上記にて調製した第１レセプター固定磁性粒子溶液（溶液Ａ－３）、第２レセプター固定標識物質溶液（溶液Ｂ－７）、Ｈ－ＦＡＢＰ溶液、０．１％　ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ　７．４）（下記表１中の「０．１％　ＢＳＡ　ＰＢＳ」）および０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）（下記表１中の「Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ」）を、下記表１に示される組成（ｐＨ　８．５）となるように混合して、２５℃で５分間、反応させ、脂肪酸結合タンパク質－Biotin標識Anti H-FABP(28)/Streptavidin磁気ビーズ－IRDye800CW標識AntiH-FABP(25)の複合体１～５（複合体１～５）を含む泳動溶液１～５（サンプル１～５）を作製した。なお、下記表１において、「Ｈ－ＦＡＢＰ溶液の希釈率」とは、上記にて調製したＨ－ＦＡＢＰ溶液を希釈する際の希釈倍率を示し、「希釈後のＨ－ＦＡＢＰ溶液」とは、上記所定の希釈率にて希釈した後のＨ－ＦＡＢＰ溶液の添加量を示す。このため、例えば、サンプル１は、上記にて調製したＨ－ＦＡＢＰ溶液を２倍希釈したものを１μＬ使用することを意味する。また、下記表１中、「溶液Ａ－３の抗体／Ｈ－ＦＡＢＰ（モル比）」は、各サンプルにおける脂肪酸結合タンパク質（Ｈ－ＦＡＢＰ、標的物質）に対するAnti H-FABP(28)（第１レセプター）のモル比を意味する。同様にして、「溶液Ｂ－７の抗体／Ｈ－ＦＡＢＰ（モル比））」は、各サンプルにおける脂肪酸結合タンパク質（Ｈ－ＦＡＢＰ、標的物質）に対するAnti H-FABP(25)（第２レセプター）のモル比を意味する。なお、磁性粒子へのビオチン結合量は、使用した磁性粒子の取扱説明書に記載の量に基づき算出できる。また、抗体とビオチンは１：１のモル比で、全て結合したと仮定して計算できる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　（泳動溶液充填ガラス四角管の作製）
　上記（泳動溶液の作製）にて調製したサンプル１～５　０．０４ｍＬを、それぞれ、ガラス製の四角管（外辺：１．５ｍｍ、内辺：１．０ｍｍ、肉厚：０．２５ｍｍ、長さ：４０ｍｍ、材質：石英）に充填した（図２Ａ）。ネオジム永久磁石を、各サンプルを充填した管上を、管の延在方向に沿ってスライドさせて、複合体１～５及び未反応の第１レセプター固定磁性粒子を一カ所（位置Ａ）に集め、ガラス四角管１～５をそれぞれ得た（図２Ｂ）。なお、磁石は、陰極から陽極までの距離（Ｘ）に対する陰極からの磁石までの距離（Ｙ）の割合（Ｙ／Ｘ）が１／５の地点に設置した。
　（電気泳動）
　図３に示される電気泳動装置に、上記（泳動溶液の作製）にて作製したガラス四角管１～５を、それぞれセットした後、１００Ｖの電圧で５分間、電気泳動を行った。
　電気泳動後、各管中の複合体が移動しないように、ネオジム永久磁石を位置Ａに固定しながら、ガラス四角管１～５をそれぞれ電気泳動装置から外した。このガラス四角管１～５の位置Ａにおける蛍光強度を、それぞれ、蛍光スキャナー（Ｏｄｙｓｓｅｙ　ＣＬｘ　イメージングシステム、LI-COR Biosciences製）を用いて測定した。また、サンプル１を充填したガラス四角管の電気泳動前後の蛍光スキャナーで測定した際の写真を図４に示す。図４中、白四角で囲んである部分は、複合体が存在している場所を示す。図４から、電気泳動後に複合体１が未反応の（脂肪酸結合タンパク質が結合しない）第２レセプター固定標識物質と良好に分離できていることが分かる。
　また、Ｈ－ＦＡＢＰの終濃度に対する蛍光強度をプロットした。結果を図５に示す。図５から、Ｈ－ＦＡＢＰ濃度０～９．２ｎＭ（１３８ｎｇ／ｍＬ）の範囲において、標的物質－磁性粒子－標識物質の複合体のシグナル強度（蛍光強度）とＨ－ＦＡＢＰ濃度との間に良好な正の相関（直線性）（ｙ＝２１３８４ｘ＋７１９０（ここで、ｙはシグナル強度（蛍光強度）を表わし、ｘはＨ－ＦＡＢＰ濃度（ｎＭ）を表わす）、Ｒ２＝０．９８６７）が観察された。このため、予め量が既知の標的物質を用いて作成した検量線に基づけば、サンプル中の脂肪酸結合タンパク質量を高精度で測定できることが期待される。なお、本実施例では、脂肪酸結合タンパク質を用いて実験を行ったが、インスリン抗体、インスリンレセプター等、他のレセプターについても同様の結果が得られると考察される。また、本実施例では、脂肪酸結合タンパク質を使用したが、血液等の生体試料を使用した場合であっても、複合体以外の生体由来の成分は電気泳動により陽極側に移動する。このため、このような場合であっても、複合体を他の生体成分と良好に分離できると考察される。
　本出願は、２０１８年１０月２６日に出願された日本特許出願番号２０１８－２０１９０８号に基づいており、その開示内容は、参照され、全体として、組み入れられている。
　　２，３…電極、
　　４…試薬、
　　５…電気泳動基材、
　　６…基板、
　　７…標的物質を含むサンプル、
　　８…磁石、
　　９…標的物質－磁性粒子－標識物質の複合体。

Claims (11)

  1. 　標的物質を含むサンプルおよび前記標的物質の部位を特異的に認識する第１レセプターが固定された磁性粒子を用いて標的物質－磁性粒子の複合体を形成し、前記標的物質－磁性粒子の複合体を磁気および電気泳動により分離することを有する、標的物質の分離方法。
  2. 　標的物質－磁性粒子の複合体を含む混合物を得た後、磁気により前記標的物質－磁性粒子の複合体を所定の位置に集めた後、電気泳動を行うことで、前記混合物から前記標的物質－磁性粒子の複合体を分離する、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記電気泳動が無担体電気泳動である、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　前記サンプルは、血液、間質液および尿からなる群より選択される、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　標的物質を含むサンプルと、前記標的物質の部位を特異的に認識する第１レセプターが固定された磁性粒子と、前記標的物質の部位とは異なる部位を特異的に認識する第２レセプターが固定された標識物質と、を混合して、標的物質－磁性粒子－標識物質の複合体を含む混合物を得、磁気および電気泳動により前記標的物質－磁性粒子－標識物質の複合体を分離した後、前記標的物質－磁性粒子－標識物質の複合体のシグナル強度を検出することを有する、標的物質量の測定方法。
  6. 　標的物質－磁性粒子－標識物質の複合体を含む混合物を得た後、磁気により前記標的物質－磁性粒子－標識物質の複合体を所定に位置に集めた後、電気泳動を行うことで、前記標的物質－磁性粒子－標識物質の複合体と、未反応の第２レセプターが固定された標識物質と、を分離する、請求項５に記載の方法。
  7. 　前記電気泳動が無担体電気泳動である、請求項５または６に記載の方法。
  8. 　予め量が既知の標的物質を用いて、標的物質量に対する標的物質－磁性粒子－標識物質の複合体のシグナル強度の検量線を作成し、前記検量線および前記検出された標的物質－磁性粒子－標識物質の複合体のシグナル強度に基づいて、前記サンプル中に含まれる標的物質の量を測定する、請求項５～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 　前記標識物質は、蛍光物質、放射性同位体、酵素およびレドックス物質からなる群より選択される少なくとも一種である、請求項５～８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 　前記サンプルは、血液、間質液および尿からなる群より選択される、請求項５～９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 　標的物質の部位を特異的に認識する第１レセプターが固定されてなる磁性粒子、前記標的物質が認識する部位とは異なる部位を特異的に認識する第２レセプターが固定されてなる標識物質および磁石を含む標的物質に関与する疾患の検査キット。
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