JP6198040B2 - プローブ修飾ナノ粒子を用いた有害微生物の高感度バイオセンシングシステム - Google Patents
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Description
[1]検査試料中の標的微生物を検出するための方法であって、
(1)検査試料からDNAを抽出し、かつ抽出したDNAを一本鎖DNAに解離させる工程、
(2)得られた一本鎖DNAと、標的微生物のDNAの一鎖中の第1の領域の塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有する第1のプローブが表面に担持されておりかつ磁性を有する少なくとも1つの第1の粒子と、該一鎖中の第1の領域とは重複しない第2の領域の塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有する第2のプローブおよび電気化学的活性物質が表面に担持されている非磁性金属ナノ粒子からなる少なくとも1つの第2の粒子とを、該一本鎖DNA中にある第1の領域と第1のプローブとの間、および、該一本鎖DNA中にある第2の領域と第2のプローブとの間のハイブリダイゼーションを許容する条件下において接触させ、それにより該一本鎖DNAを介して第1の粒子と第2の粒子とが連結された複合体を形成させる工程、
(3)磁気的相互作用を介して該複合体を回収する工程、
(4)回収した複合体を電気化学測定に供し、それにより該電気化学的活性物質を検出する工程
を含む、前記方法。
[2]第1の粒子の平均粒径が100〜500nmであり、かつ、第2の粒子の平均粒径が10〜100nmである、上記[1]に記載の方法。
[3]非磁性金属ナノ粒子が金ナノ粒子である、上記[1]または[2]に記載の方法。
[4]電気化学的活性物質がフェロセンである、上記[1]〜[3]のいずれか1つに記載の方法。
[5]第1のプローブが20〜100塩基のオリゴヌクレオチドであり、かつ、第2のプローブが20〜100塩基のオリゴヌクレオチドである、上記[1]〜[4]のいずれか1つに記載の方法。
[6]前記(4)の工程が、回収した複合体の存在下、該電気化学的活性物質の酸化電位において酸化酵素による基質の酸化反応を生じさせるか、または、該電気化学的活性物質の還元電位において還元酵素による基質の還元反応を生じさせ、それにより発生した電流を測定することを含む、上記[1]〜[5]のいずれか1つに記載の方法。
[7]基質がL−プロリンであり、かつ、酸化酵素がL−プロリン脱水素酵素である、上記[6]に記載の方法。
[8]標的微生物が、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、カンピロバクター属菌、サルモネラ属菌、腸管出血性大腸菌、ビブリオ属菌、レジオネラ属菌およびセレウス菌からなる群から選択される1以上の微生物である、上記[1]〜[7]のいずれか1つに記載の方法。
[9](1)標的微生物のDNAの一鎖中の第1の領域の塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有する第1のプローブが表面に担持されておりかつ磁性を有する少なくとも1つの第1の粒子と、(2)該一鎖中の第1の領域とは重複しない第2の領域の塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有する第2のプローブおよび電気化学的活性物質が表面に担持されている非磁性金属ナノ粒子からなる少なくとも1つの第2の粒子とを組み合わせてなる、検査試料中の標的微生物の検出用試薬キット。
[10]第1の粒子の平均粒径が100〜500nmであり、かつ、第2の粒子の平均粒径が10〜100nmである、上記[9]に記載の試薬キット。
[11]非磁性金属ナノ粒子が金ナノ粒子である、上記[9]または[10]に記載の試薬キット。
[12]電気化学的活性物質がフェロセンである、上記[9]〜[11]のいずれか1つに記載の試薬キット。
[13]第1のプローブが20〜100塩基のオリゴヌクレオチドであり、かつ、第2のプローブが20〜100塩基のオリゴヌクレオチドである、上記[9]〜[12]のいずれか1つに記載の試薬キット。
[14]酸化酵素および基質、または、還元酵素および基質を更に含む、上記[9]〜[13]のいずれか1つに記載の試薬キット。
[15]基質がL−プロリンであり、かつ、酸化酵素がL−プロリン脱水素酵素である、上記[14]に記載の試薬キット。
[16]標的微生物が、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、カンピロバクター属菌、サルモネラ属菌、腸管出血性大腸菌、ビブリオ属菌、レジオネラ属菌およびセレウス菌からなる群から選択される1以上の微生物である、上記[9]〜[15]のいずれか1つに記載の試薬キット。
検査試料からのDNAの抽出は、自体公知の方法に従って行うことができ、例えばフェノール抽出法、フェノール・クロロホルム抽出法、アルカリ溶解法、ボイル法等を用いることができる。また、市販のDNA抽出キットや核酸自動抽出装置を用いてDNAを抽出する方法が挙げられる。
工程(2)では、得られた一本鎖DNAと、上記の第1のプローブが表面に担持されておりかつ磁性を有する少なくとも1つの第1の粒子と、上記の第2のプローブおよび電気化学的活性物質が表面に担持されている非磁性金属ナノ粒子からなる少なくとも1つの第2の粒子とを適切な溶液中で接触させ、該一本鎖DNAを介して第1の粒子と第2の粒子とが連結された複合体を形成させる。
第1の領域の塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するプローブとしては、例えば、第1の領域の塩基配列に相補的な塩基配列と約70%以上、好ましくは約80%以上、より好ましくは約90%以上、更により好ましくは約95%以上、特に好ましくは約97%以上、最も好ましくは100%の相同性を有する塩基配列を含有する核酸などが挙げられる。本明細書における核酸配列の相同性は、例えば、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool) を用い、以下の条件 (期待値=10; ギャップを許す; フィルタリング=ON; マッチスコア=1; ミスマッチスコア=-3) にて計算することができる。
第2の領域の塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するプローブとしては、例えば、第2の領域の塩基配列に相補的な塩基配列と約70%以上、好ましくは約80%以上、より好ましくは約90%以上、更により好ましくは約95%以上、特に好ましくは約97%以上、最も好ましくは約100%の相同性を有する塩基配列を含有する核酸などが挙げられる。核酸配列の相同性は、上記と同様にして計算することができる。
工程(3)では、磁気的相互作用を介して複合体が回収される。回収は、例えば以下の通りに行うことができる。ハイブリダイゼーション後の反応液を含むマイクロチューブ等の容器の外側からマグネットを近付けて、第1の粒子との磁気的引力を生じさせ、それにより複合体を容器の壁面に吸着させる。その状態で溶液を廃棄する。不純物を排除するために、溶液廃棄後の容器内にリン酸カリウム緩衝液等の洗浄液を加えた後、上記と同様の磁気的分離を再度行うことが好ましい。
工程(4)では、回収した複合体を電気化学測定に供し、それにより電気化学的活性物質を検出する。電気化学測定法は、電気化学的活性物質の検出が可能である限り、特に制限されない。作用極および対極からなる2電極方式を用いてもよいし、作用極、参照極および対極からなる3電極方式を用いてもよい。測定の信頼性を高めるために、3電極方式が好ましい。好ましい電極材料としては、例えば、作用極のためには白金、金、炭素、参照極のためには銀/塩化銀、対極のためには白金、金、炭素が挙げられる。また、カーボンナノチューブ、カーボンマイクロコイル、カーボンナノホーン、フラーレン、デンドリマーおよびそれらの誘導体等のカーボン材料を用いることもできる。これらのカーボン材料は、それらの独特の特性(構造、導電性等)から電極材料に適しており、電極感度の増大をもたらし得る。所定の期間、所定の電位をスクリーンプリント電極にかけてバックグラウンドを安定化させてから測定を行うことが好ましい。バックグラウンドの安定後、適当な緩衝液(例:50mM リン酸カリウム緩衝液(pH 6.5))中に懸濁させたハイブリダイゼーション産物を電極に滴下し、電流を測定することができる。ハイブリダイゼーション産物の代わりに緩衝液のみを滴下して同様に電流を測定した時の電流値をバックグラウンドとし、サンプルにおいて観測された電流からバックグラウンドを差し引くことが好ましい。
MRSA
試験用のMRSAとしては、ATCC-70060 (ATCCTM)(関東化学より購入)を用いた。
プローブ
プローブの設計は、DNA Data Bank of Japan (DDBJ)等のゲノムDNAデータベースに登録されたMRSA DNAの配列情報に基づいて行った。MRSAのmecA領域の一部分と完全に相補的な塩基配列を有する以下の2種類のプローブを合成した。
DNAプローブ1:5’-TCTGGAACTTGTTGAGCAGAGGTTC-3’ (配列番号:1)
DNAプローブ2:5’-GCTTTGGTCTTTCTGCATTCCTGG-3’ (配列番号:2)
磁性ナノ粒子(MNP)-DNAプローブ1コンジュゲート
MNPの表面にDNAプローブ1が担持されたMNP-DNAプローブ1コンジュゲートを以下の通りに作製した。
MNPとしては、Therma-Max LAm Amine (Wako)を用いた。MNP (1mg)とSulfo-SMCC(300μg; Thermo Scientific)とを100mM リン酸緩衝液(pH 7.2)中、室温で2時間静置することにより、MNPのアミノ基とSulfo-SMCCのN-ヒドロキシコハク酸活性化エステルとを縮合させた。洗浄後、チオール化したDNAプローブ1 (5nmol)を加え、室温で8時間静置することにより、縮合物中のSulfo-SMCCに由来するマレイミド基をDNAプローブ1のチオール基と反応させ、MNP-DNAプローブ1コンジュゲートを得た。
金ナノ粒子(AuNP)-DNAプローブ2-フェロセンコンジュゲート
AuNPの表面にDNAプローブ2およびフェロセンが担持されたAuNP-DNAプローブ2-フェロセンコンジュゲートを以下の通りに作製した。
AuNPとしては、Gold colloid (15nm)(British BioCell International)を用いた。AuNP (500μg)と、チオール化したDNAプローブ2 (4nmol)と、11-フェロセニル-1-ウンデカンチオール (400nmol)とを水:エタノール中、室温で48時間撹拌し、チオールの金に対する自己組織化によりAuNP-DNAプローブ2-フェロセンコンジュゲートを得た。
MRSAを溶菌し、フェノール・クロロホルム等により2本鎖ゲノムDNAを抽出した。抽出した2本鎖DNA (100μl)にMNP-DNAプローブ1コンジュゲートおよびAuNP-DNAプローブ2-フェロセンコンジュゲート(各3μl)を加えた後、熱処理(95℃, 10分)により2本鎖DNAを変性させ、1本鎖DNAにした。その後、45℃で2時間ハイブリダイゼーションさせた。42℃において、ハイブリダイゼーション産物を磁気分離した状態で溶液を除去した後、50mM リン酸カリウム緩衝液(pH 6.5)で洗浄を行い、再び磁気分離を行い、ハイブリダイゼーション産物を回収した。
ハイブリダイゼーションを確認するために、PCRを行った。PCRは以下の手順で行った。
回収したハイブリダイゼーション産物を超純水にて3回洗浄したものをPCRのために用いた。PCR用の反応混合液の組成は以下の通りである。
PCR後のサンプルをアガロースゲルで電気泳動し、増幅されたDNA断片を確認した。電気泳動の結果を図1に示す。図1中、Mのレーンはマーカーに対応し、1および2のレーンはそれぞれ40.2μgおよび26.7μgのゲノムDNAと修飾ナノ粒子とをハイブリダイゼーションさせたものに対応し、3のレーンは24.6μgのゲノムDNA、4のレーンは修飾ナノ粒子のみで同様にハイブリダイゼーションの操作を行ったものに対応する。結果は、ハイブリダイゼーションさせたレーン1、2は146塩基対の位置にバンドが現れ、ハイブリダイゼーションさせていない3、4はバンドが現れなかったことを示している。これにより、本研究で合成したプローブ修飾ナノ粒子を用いることで、ハイブリダイゼーションが生じることや、ハイブリダイゼーション産物を分離、抽出できたことが確認された。
電気化学測定は、対極、参照極および作用極を有するスクリーンプリント電極(アズバイオ社)(電位制御装置:BAS社 Model 800B)を使用する3電極方式で行った。本研究では、フェロセンを酸化させ、この時の電子移動を電極で検知するというシステムを採用した。また、この電流を増幅するためにL-プロリンとL-プロリン脱水素酵素を電極上へドロップするドロップ法を使用した。基質と酵素の触媒反応により生じる電子が酸化体のフェロセンと反応することで、還元体のフェロセンを増やすことができる。そのため、フェロセンの酸化電位を印加することで、より多くの電子を電極に流すことが可能となる。図2には、基質および酵素を使用した場合と使用していない場合のサイクリックボルタンメトリーを示している。この図は、基質と酵素を用いることで、電流値を増幅できることを示している。
スクリーンプリント電極に+0.25Vの印加電位(vs. Ag/AgCl)を40分かけてバックグラウンドを安定させた。電極上に、50mMリン酸カリウム緩衝液(pH 6.5) 10μlへ懸濁させたハイブリダイゼーション産物を滴下し、電流が安定した後に、100mM L-プロリン2μlおよび342pM L-プロリン脱水素酵素2μlを混合したものを滴下し、フェロセンの酸化による電流応答を測定した。電流応答は、基質および酵素の滴下前と滴下から100秒後の電流値の差をΔiとし、また、ハイブリダイゼーション産物の代わりに50mMリン酸緩衝液(pH 6.5)を滴下し、その後同様に測定した時の電流値をバックグラウンドとし、サンプルにおいて観測されたΔiから差し引くことでサンプルの電流応答とした。電流応答の結果を下記表2および図3に示す。
Claims (12)
- 検査試料中の標的微生物を検出するための方法であって、
(1)検査試料からDNAを抽出し、かつ抽出したDNAを一本鎖DNAに解離させる工程、
(2)得られた一本鎖DNAと、標的微生物のDNAの一鎖中の第1の領域の塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有する第1のプローブが表面に担持されておりかつ磁性を有する少なくとも1つの第1の粒子と、該一鎖中の第1の領域とは重複しない第2の領域の塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有する第2のプローブおよびフェロセンが表面に担持されている非磁性金属ナノ粒子からなる少なくとも1つの第2の粒子とを、該一本鎖DNA中にある第1の領域と第1のプローブとの間、および、該一本鎖DNA中にある第2の領域と第2のプローブとの間のハイブリダイゼーションを許容する条件下において接触させ、それにより該一本鎖DNAを介して第1の粒子と第2の粒子とが連結された複合体を形成させる工程、
(3)磁気的相互作用を介して該複合体を回収する工程、
(4)回収した複合体を電気化学測定に供し、それによりフェロセンを検出する工程
を含み、
前記(4)の工程が、回収した複合体の存在下、フェロセンの酸化電位においてL−プロリン脱水素酵素によるL−プロリンの酸化反応を生じさせ、それにより発生した電流を測定することを含む、前記方法。 - 第1の粒子の平均粒径が100〜500nmであり、かつ、第2の粒子の平均粒径が10〜100nmである、請求項1に記載の方法。
- 非磁性金属ナノ粒子が金ナノ粒子である、請求項1または2に記載の方法。
- 第1のプローブが20〜100塩基のオリゴヌクレオチドであり、かつ、第2のプローブが20〜100塩基のオリゴヌクレオチドである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 第1の領域と第2の領域とが、標的微生物のDNAの該一鎖中で50〜20000塩基離れた位置に存在する、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 標的微生物が、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、カンピロバクター属菌、サルモネラ属菌、腸管出血性大腸菌、ビブリオ属菌、レジオネラ属菌およびセレウス菌からなる群から選択される1以上の微生物である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- (1)標的微生物のDNAの一鎖中の第1の領域の塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有する第1のプローブが表面に担持されておりかつ磁性を有する少なくとも1つの第1の粒子と、(2)該一鎖中の第1の領域とは重複しない第2の領域の塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有する第2のプローブおよびフェロセンが表面に担持されている非磁性金属ナノ粒子からなる少なくとも1つの第2の粒子と、(3)L−プロリン脱水素酵素およびL−プロリンとを組み合わせてなる、検査試料中の標的微生物の検出用試薬キット。
- 第1の粒子の平均粒径が100〜500nmであり、かつ、第2の粒子の平均粒径が10〜100nmである、請求項7に記載の試薬キット。
- 非磁性金属ナノ粒子が金ナノ粒子である、請求項7または8に記載の試薬キット。
- 第1のプローブが20〜100塩基のオリゴヌクレオチドであり、かつ、第2のプローブが20〜100塩基のオリゴヌクレオチドである、請求項7〜9のいずれか1項に記載の試薬キット。
- 第1の領域と第2の領域とが、標的微生物のDNAの該一鎖中で50〜20000塩基離れた位置に存在する、請求項7〜10のいずれか1項に記載の試薬キット。
- 標的微生物が、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、カンピロバクター属菌、サルモネラ属菌、腸管出血性大腸菌、ビブリオ属菌、レジオネラ属菌およびセレウス菌からなる群から選択される1以上の微生物である、請求項7〜11のいずれか1項に記載の試薬キット。
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