JP2009240197A - メディエータ修飾プライマーを用いた標的dnaのバイオセンシング方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】低コストで簡便かつ高感度な標的DNAのバイオセンシング方法を提供すること。
【解決手段】電流を印加した電解液中で酵素と基質との反応によって生じる電子を酵素固定化電極に伝達するメディエータで、標的DNAのPCRプライマーを修飾し、このメディエータ修飾プライマーを用いて標的DNAをPCR増幅し、酵素固定化電極を備えた電解液中にPCR産物と基質を添加し、この電解液に電流を印加して酵素固定化電極からの電気信号を測定し、電気信号が検出された場合に、分析試料中に標的DNAが存在すると判定する。
【選択図】図3
【解決手段】電流を印加した電解液中で酵素と基質との反応によって生じる電子を酵素固定化電極に伝達するメディエータで、標的DNAのPCRプライマーを修飾し、このメディエータ修飾プライマーを用いて標的DNAをPCR増幅し、酵素固定化電極を備えた電解液中にPCR産物と基質を添加し、この電解液に電流を印加して酵素固定化電極からの電気信号を測定し、電気信号が検出された場合に、分析試料中に標的DNAが存在すると判定する。
【選択図】図3
Description
本発明は、電気的信号検出によって標的DNAを高感度で検出するためのバイオセンシング方法に関する。
バイオセンシングと呼ばれる生体分子間相互作用の検出は、医療、環境、創薬分野への応用が望まれており、特に、昨今のゲノム分野の発展に伴い、DNAセンシングが注目されている。
例えば、現在、遺伝子DNA中の一塩基レベルの変異が特定の疾患に関与することから、一塩基多型(SNPs)の解析が進んでいるとともに、個人のSNPs情報を基にした新薬開発や、テーラーメード医療が重要な分野の一つとなっている。また、環境測定分野においても、有害微生物の検出法として広く利用されている。
現在、DNAセンシングにおいては、生体分子間相互作用の検出に蛍光物質や発光物質をマーカーとして用いる方法が主流である。例えば、蛍光標識したターゲットDNAをプローブとハイブリダイゼーションさせ、蛍光発光の有無を光学的に検出することによって、プローブとターゲットとの相互作用を検出することが行なわれている。しかしながら、この方法は、蛍光標識を励起させるためのレーザー装置や発光した蛍光を画像化し解析する装置が必要であるため、操作性及びコスト面で実用化に問題があり、必ずしも広く普及していない。
そこで、近年、遺伝子解析の迅速化、解析装置の簡略化および低コスト化を図るため、電気化学的にDNAを検出する方法についての研究が行なわれている。
例えば、特許文献1には、メディエータおよび酵素層を有する電極上に、キャプチャープローブ、ターゲットDNA、脱水素酵素などの酵素を結合させたレポータープローブをこの順で結合させ、酵素反応によって生じた電子の授受を、電極上のメディエータ層を介して電極に伝達することで、DNAセンシングを行なうことが開示されている。
特開2005−69836号公報
しかしながら、特許文献1の方法においては、メディエータを電極上に積層させる必要があり、さらに、アビジン−ビオチン相互作用などを用いて、電極上にキャプチャープローブを固定する必要があることから、操作に手間を要するものであった。
また、キャプチャープローブ、ターゲットDNA、レポータープローブのハイブリダイゼーション効率に問題があり、酵素反応により生じる電子が電極に伝達されにくいため、シグナルが弱く、検出感度が十分でないという問題もあった。
本発明は、以上の通りの事情に鑑みてなされたものであり、低コストで簡便かつ高感度な標的DNAのバイオセンシング方法を提供することを課題としている。
本発明は、上記の課題を解決するために、第1に、分析試料中の標的DNAの存在を判定する方法であって、1)電流を印加した電解液中で酵素と基質との反応によって生じる電子を酵素固定化電極に伝達するメディエータで、標的DNAのPCRプライマーを修飾し、2)メディエータ修飾プライマーを用いて標的DNAをPCR増幅し、3)酵素固定化電極を備えた電解液中にPCR産物と基質を添加し、4)電解液に電流を印加して酵素固定化電極からの電気信号を測定し、5)電気信号が検出された場合に、分析試料中に標的DNAが存在すると判定することを特徴とする標的DNAのバイオセンシング方法を提供し、第2に、メディエータは、フェロセン誘導体である前記第1の標的DNAのバイオセンシング方法を提供し、第3に、電極に固定される酵素が超高熱菌由来の酵素である前記第1、2の標的DNAのバイオセンシング方法を提供する。
さらに、第4には、分析試料中の標的DNAの存在を判定するフローインジェクションシステムであって、1)電流を印加した電解液中で酵素と基質との反応によって生じる電子を酵素固定化電極に伝達するメディエータで、標的DNAのPCRプライマーを修飾し、このメディエータ修飾プライマーを用いて標的DNAをPCR増幅して得たPCR産物と基質とを酵素固定化電極を備えた電解液中に添加し、2)この電解液に電流を印加して酵素固定化電極からの電気信号を測定し、3)電気信号が検出された場合に分析試料中に標的DNAが存在すると判定するフローインジェクションシステムを提供し、第5には、メディエータは、フェロセン誘導体である前記第4のフローインジェクションシステムを提供し、第6には、電極に固定される酵素が超高熱菌由来の酵素である前記第4または第5のフローインジェクションシステムを提供する。
本発明の標的DNAのバイオセンシング方法によれば、酵素反応により生じる電子が、PCRによって増幅されている標的DNAの修飾メディエータを介して電極に伝達されるため、試料中の標的DNAを電気化学的に高い検出感度で検出することができる。さらに、電極上にプローブを固定する操作や標的DNAとプローブとのハイブリダイゼーションを行なう必要もないため、簡便な操作で標的DNAを検出することが可能になる。
本発明の標的DNAのバイオセンシング方法は、分析試料中の標的DNAの存在を判定する方法であって、電極に固定された酵素と基質が反応することで生じる電子がメディエータを介して効果的に酵素固定化電極に伝達されるようにすることで、標的DNAの存在の判定を高感度で行なうものである。
本発明の方法においては、電極として酵素固定化電極を使用する。電極の材料は、通常、電極として用いられるものを使用することができ、例えば、グラファイト、カーボン、カーボンファブリック等、アルミニウム、銅、金、白金、銀等の金属又は合金、SnO2、In2O3、WO3、TiO2等、導電性酸化物等種々の材料の単層又は2種以上の積層構造が挙げられる。電極の膜厚、大きさ及び形状等は特に限定されるものではなく、使用するメディエータ、酵素の種類などに応じて適宜決定することができる。
そして、この電極の表面に固定される酵素は、例えばL-プロリン脱水素酵素、アルコール脱水素酵素などの色素依存性脱水素酵素、乳酸脱水素酵素などのNAD(P)依存型脱水素酵素の他に、アルコール酸化酵素などの補因子としてフラビン類を有するような酸化還元酵素を使用することができる。
さらに、同様の性質を持つ酵素としては超好熱菌由来の酵素を使用することもできる。一般に超好熱菌由来の酵素は熱安定性に極めてすぐれており、タンパク質としても安定であるため変性しにくいという特長を有している。よって常温で長期間(1ヶ月から12ヶ月以上)安定であり、電極に固定した状態で長期間使用することができる。
上記の酵素を電極上に固定する方法としては、例えば、交互積層法などの公知の方法を用いることが可能である。
交互積層法を用いて電極に酵素を固定する場合には、電極表面を活性化することにより正または負に帯電させ、さらに、酵素を負又は正に帯電させ、これを電極表面に接触させることにより、正と負との電荷の間の相互作用を通して酵素を電極表面に固定することができる。
このようにして形成された酵素固定化電極は、酵素と反応する基質および所定の工程を経た分析試料が添加された電解液中に配置される。
電解液中に添加される基質は、電極に固定される酵素に応じて、アミノ酸などを適宜選択することができ、例えば、L−プロリン脱水化酵素を電極に固定した場合には、基質としてL−プロリンを選択することができる。
そして、分析試料は、標的DNAのPCR増幅を行った後、電解液中に添加される。
具体的には、以下のようにして標的DNAのPCR増幅を行なう。
第1に、標的DNAのPCRプライマーをメディエータで修飾する。メディエータとしては、標的DNAのPCRプライマーと結合することができ、電極と酵素との間で電子を授受し得る電子移動媒体として機能するもので、酵素反応に悪影響を与えないものであれば、どのようなものでも使用することができる。例えば、フェロセン、ベンゾキノン、キノン、メナジオンの誘導体等の酸化還元性の有機又は無機化合物の1種あるいは2種以上の組み合わせが挙げられる。なかでも、水や水溶性有機溶媒(低級アルコール等)に溶解し、取り扱いが容易であるもの、電子移動媒体としての機能が安定しているものが好ましく、例えば、フェロセン誘導体が好適に用いられる。
メディエータによる修飾は、例えば、ペプチド合成試薬を用いることで行なうことができる。また、アルデヒド誘導体などを直接、末端アミノ化修飾したプライマーと共有結合することで修飾することもでき、さらに、市販のタンパク質修飾試薬キット、例えば、Abgent社CouplageTM Conjugation Kitsなどを用いることもできる。
そして、例えば、メディエータとして、Fc−COOH(フェロセンカルボン酸)を用いる場合には、図1に示すように、Fc−COOHをメタノールに溶解させた後、ペプチド合成試薬であるCDI(1,1’−Carbonyldiimidazole)を添加し、ここに、3’末端アミノ化修飾したプライマーを添加して反応させることで、オリゴヌクレオチドの3’末端にフェロセンを修飾することができる。さらに、未反応のFc−COOHは、透析を行うことにより除去することができる。
第2に、前記のように作成したメディエータ修飾プライマーを用いて、標的DNAをPCR増幅する。図2は、本発明の方法において、標的DNAの増幅、精製の工程を示す模式図である。
第2に、前記のように作成したメディエータ修飾プライマーを用いて、標的DNAをPCR増幅する。図2は、本発明の方法において、標的DNAの増幅、精製の工程を示す模式図である。
PCR増幅は、一般的な方法でよく、メディエータ修飾プライマー1、および非修飾プライマー2、DNAポリメラーゼ、緩衝液、dNTP等を加えて、サーマルサイクラーなどによって標的DNA3を増幅することができる。そして、メディエータ修飾プライマー1を用いることで、メディエータ修飾された標的DNAを増幅させることができる。
さらに、PCR増幅において未反応で一本鎖のまま残存するメディエータ修飾プライマーは、例えば、PCR用のスピンカラムによる精製、透析、限外ろ過などの方法によって除去することができる。
このように、前記第1、第2の工程を経ることで、分析試料中に標的DNAが存在する場合には、PCR産物としてメディエータ修飾された標的DNAの増幅産物が生成される。
そして、このPCR産物と基質とを酵素固定化電極を備えた電解液に添加し、この電解液に電流を印加して酵素固定化電極から電気信号を測定する。
このように、前記第1、第2の工程を経ることで、分析試料中に標的DNAが存在する場合には、PCR産物としてメディエータ修飾された標的DNAの増幅産物が生成される。
そして、このPCR産物と基質とを酵素固定化電極を備えた電解液に添加し、この電解液に電流を印加して酵素固定化電極から電気信号を測定する。
図3は、PCR産物と基質の存在下で、電解液に電流を印加した際の反応を示す模式図である。電解液に電流を印加すると、酵素4と基質5の反応によって生成物6と電子が生じる。この電子は、電解質中に大量に存在するPCR産物のメディエータ7の酸化還元反応を介して酵素固定化電極8に伝達され、大きな電気シグナルとなって検知されることで、高感度に標的DNAを検出することができる。このとき、メディエータ7は酵素固定化電極8上で増幅しており、これによって検出感度が向上する。
一方、分析試料中に標的DNAが含まれていない場合には、メディエータ修飾プライマーを用いてPCR増幅を行っても、メディエータ修飾プライマーは未反応で一本鎖のままであり、スピンカラム等により除去されるため、酵素と基質の反応により生じる電子は電極に伝達されない。したがって、電気シグナルは検出されず、分析試料中に標的DNAが含まれていないことを確認することができる。
さらに、本発明のDNAセンシング方法は、バッチ式によっても実施することができるが、好ましくは、例えば、図4に例示するようなフローインジェクションシステムにより行なうことができる。
酵素固定化電極8を反応セル内9に配置し、前記のようにして作成したメディエータ修飾プライマーを用いた標的DNAのPCR増幅及びスピンカラムなどによる精製を経た分析試料と、電極8に固定された酵素4と反応する基質を内径0.5〜1.0mm程度の樹脂製細管の中に注入する。そして、反応セル内9で電圧を印加し、酵素4と基質を反応させ、この反応によって生じた電子を増幅された標的DNAのメディエータ7を介して電極8に伝達することによって、電気化学的に標的DNAを検出することができる。
このフローインジェクションシステムにおいては、その他の一般的なフローインジェクションを構成する装置、具体的には、ポンプ10、インジェクター、チューブ、記録計、ポテンショスタット11、電流量を測定するコンピュータ12などが備えられていることが好ましい。
そして、本発明のフローインジェクションシステムによれば、標的DNAの検出を自動的に行なうことができ、迅速かつ高精度に標的DNAの検出が可能になる。
<修飾プライマーの作成>
レジオネラ属菌を検出対象とした検出系を構築した。PCRに使用する修飾プライマーは、レジオネラ属菌の鉄取り込み調節因子ferric uptake regulation (fur)領域を部分的に増幅するものであり、センスプライマーおよびアンチセンスプライマーの2つのプライマーを設計した。
レジオネラ属菌を検出対象とした検出系を構築した。PCRに使用する修飾プライマーは、レジオネラ属菌の鉄取り込み調節因子ferric uptake regulation (fur)領域を部分的に増幅するものであり、センスプライマーおよびアンチセンスプライマーの2つのプライマーを設計した。
そして、メディエータとして、Fc−COOH 8 mg (35μmol)を5 mlメタノールに溶解し、ペプチド合成試薬であるCDI 17 mg (105μmol)を添加し、室温で1時間攪拌することにより、Fc−COOH のカルボキシル基を活性化させた。ここに、pH 7.0に調整した末端アミノ化修飾したプライマー20μmol 含む水溶液1 mlを添加し、1時間攪拌し反応させ、オリゴヌクレオチド3’末端−フェロセン修飾プライマーを作成した。そして、約12時間蒸留水で透析を行うことにより未反応のFc−COOH を除去した。さらに、凍結乾燥することで水分を除去した。
<PCRによる標的DNAの増幅>
3’末端−フェロセン修飾プライマー、アンチセンスプライマーを用いて、標的DNAを増幅させた。
<PCRによる標的DNAの増幅>
3’末端−フェロセン修飾プライマー、アンチセンスプライマーを用いて、標的DNAを増幅させた。
0.2 mlのPCRチューブに全量が50μlになるように10×PCR buffer 5μl, KOD Dash 0.5μl, レジオネラ属菌を含む試料液 5μl, プライマー1μl×2, dNTP 5μlを添加し、サーマルサイクラーにてPCR増幅反応を行った。
PCRのサイクル条件を、表1に示す。
増幅サンプルはPCR用のスピンカラムにより精製することで、1本鎖のまま残存するフェロセン修飾プライマーを除去した。
<酵素固定化カーボンプリント電極の調製>
カーボンプリント電極をメタノールにて洗浄した後、2.5% K2Cr2O7 in 10% HKO3溶液に浸し、10秒間、+1.2Vの電位をかけて電解酸化することで電極表面の炭素を酸化、カルボキシル基を導入した。このカルボキシル基を介してペプチド合成試薬Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimido HCl (EDC)を用いてL-プロリン脱水素酵素を電極に固定化した。
<電気化学反応>
L-プロリンを基質として大過剰に存在させ、酵素固定化電極を、表2に示す電気化学測定用反応液中で、+0.5 V(vs. Ag/AgCl)の印加電圧を与え、攪拌させながら、基質1M L-プロリンにPCR増幅産物を0.1 mlづつ添加し、電流応答の測定を行った。
<酵素固定化カーボンプリント電極の調製>
カーボンプリント電極をメタノールにて洗浄した後、2.5% K2Cr2O7 in 10% HKO3溶液に浸し、10秒間、+1.2Vの電位をかけて電解酸化することで電極表面の炭素を酸化、カルボキシル基を導入した。このカルボキシル基を介してペプチド合成試薬Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimido HCl (EDC)を用いてL-プロリン脱水素酵素を電極に固定化した。
<電気化学反応>
L-プロリンを基質として大過剰に存在させ、酵素固定化電極を、表2に示す電気化学測定用反応液中で、+0.5 V(vs. Ag/AgCl)の印加電圧を与え、攪拌させながら、基質1M L-プロリンにPCR増幅産物を0.1 mlづつ添加し、電流応答の測定を行った。
<結果>
電流応答の結果を、図5に示す。基質であるL-プロリンに対する電流応答が見られ、この電流応答はPCR増幅産物の量に依存していることがわかった。そして、本発明の方法によれば、分析試料中含まれている標的DNAを簡便に高感度で検出することができることが明らかになった。
電流応答の結果を、図5に示す。基質であるL-プロリンに対する電流応答が見られ、この電流応答はPCR増幅産物の量に依存していることがわかった。そして、本発明の方法によれば、分析試料中含まれている標的DNAを簡便に高感度で検出することができることが明らかになった。
1 メディエータ修飾プライマー
2 非修飾プライマー
3 標的DNA
4 酵素
5 基質
6 生成物
7 メディエータ
8 電極
9 反応セル
10 ポンプ
11 ポテンショスタット
12 コンピュータ
2 非修飾プライマー
3 標的DNA
4 酵素
5 基質
6 生成物
7 メディエータ
8 電極
9 反応セル
10 ポンプ
11 ポテンショスタット
12 コンピュータ
Claims (6)
- 分析試料中の標的DNAの存在を判定する方法であって、
1)電流を印加した電解液中で酵素と基質との反応によって生じる電子を酵素固定化電極に伝達するメディエータで、標的DNAのPCRプライマーを修飾し、
2)メディエータ修飾プライマーを用いて標的DNAをPCR増幅し、
3)酵素固定化電極を備えた電解液中にPCR産物と基質を添加し、
4)電解液に電流を印加して酵素固定化電極からの電気信号を測定し、
5)電気信号が検出された場合に、分析試料中に標的DNAが存在すると判定する
ことを特徴とする標的DNAのバイオセンシング方法。 - メディエータは、フェロセン誘導体であることを特徴とする請求項1の標的DNAのバイオセンシング方法。
- 電極に固定される酵素が超好熱菌由来の酵素であることを特徴とする請求項1または2の標的DNAのバイオセンシング方法。
- 分析試料中の標的DNAの存在を判定するフローインジェクションシステムであって、
1)電流を印加した電解液中で酵素と基質との反応によって生じる電子を酵素固定化電極に伝達するメディエータで、標的DNAのPCRプライマーを修飾し、このメディエータ修飾プライマーを用いて標的DNAをPCR増幅して得たPCR産物と基質とを酵素固定化電極を備えた電解液中に添加し、
2)この電解液に電流を印加して酵素固定化電極からの電気信号を測定し、
3)電気信号が検出された場合に、分析試料中に標的DNAが存在すると判定することを特徴とするフローインジェクションシステム。 - メディエータは、フェロセン誘導体であることを特徴とする請求項4のフローインジェクションシステム。
- 電極に固定される酵素が超好熱菌由来の酵素であることを特徴とする請求項4または5のフローインジェクションシステム。
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---|---|---|---|
JP2008089444A JP2009240197A (ja) | 2008-03-31 | 2008-03-31 | メディエータ修飾プライマーを用いた標的dnaのバイオセンシング方法 |
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2014226093A (ja) * | 2013-05-23 | 2014-12-08 | 国立大学法人福井大学 | プローブ修飾ナノ粒子を用いた有害微生物の高感度バイオセンシングシステム |
-
2008
- 2008-03-31 JP JP2008089444A patent/JP2009240197A/ja active Pending
Cited By (1)
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JP2014226093A (ja) * | 2013-05-23 | 2014-12-08 | 国立大学法人福井大学 | プローブ修飾ナノ粒子を用いた有害微生物の高感度バイオセンシングシステム |
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