CN101320037A

CN101320037A - 快速检测呋喃西林代谢物的胶体金层析试纸条的制备方法

Info

Publication number: CN101320037A
Application number: CN 200810022138
Authority: CN
Inventors: 胥传来; 徐一平; 刘丽强
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2008-06-25
Filing date: 2008-06-25
Publication date: 2008-12-10
Anticipated expiration: 2028-06-25
Also published as: CN101320037B

Abstract

快速检测呋喃西林代谢物的胶体金层析试纸条的制备方法，属于检测技术领域。本发明是含有衬板和在衬板上依次衔接的样品垫、金标结合垫、包被膜、吸水垫组成，金标结合垫为吸附呋喃西林代谢物SEM衍生物金标抗体的玻璃纤维棉，在包被膜上有用SEM衍生物偶联载体蛋白的溶液印制的检测线(T)，用羊抗兔IgG溶液印制的控制线(C)，两条线平行排列。该胶体金层析检测试纸条以胶体金标记高亲和力的多克隆抗体为基础制备而成，本试纸条特异性强，敏感性高，检出最低限量可达到5ppb；简便、快速、时效性强，无需任何其它试剂和仪器，可现场操作，试纸条加入被检样品液后，在15分钟内即可判定检测结果；结果显示形象、直观、准确；节省费用，适用范围广，便于推广。

Description

快速检测呋喃西林代谢物的胶体金层析试纸条的制备方法

技术领域

快速检测呋喃西林代谢物的胶体金层析试纸条的制备方法，属于检测技术领域。

背景技术

硝基呋喃类抗生素(Nitrofuran antibiotics)主要是指呋喃唑酮(Furazolidone)，呋喃西林(Nitrofurazone)，呋喃妥因(Furantoin)和呋喃它酮(Furaltadone)，为一类广谱抗生素，对革兰阳性及阴性菌均有一定抗菌作用。呋喃西林(Furantoin)，是一种人工合成的硝基呋喃类广谱抗菌药物，对多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌及某些原虫和真菌具有抑制或杀灭效果，而且药效稳定，在畜禽和水产养殖中得到了广泛的应用。硝基呋喃类药物及其对应的代谢产物有呋喃唑酮(AOZ)、呋喃它酮(AMOZ)、呋喃西林(SEM)和呋喃妥因(AHD)。硝基呋喃类药物在动物体内代谢很快，在组织中结合的代谢产物滞留时间长。动物服用呋喃类药物后，原药分子在动物体内迅速代谢，其在体内的稳定性不超过几小时；代谢的部分化合物分子与细胞膜蛋白结合成为结合态，结合态可长期保持稳定，从而延缓原药在体内的清除速度。而普通的食品加工方法(如烧烤、微波加工、烹调等)难以使蛋白结合态呋喃唑酮残留物大量降解，食用含有该残留物的肉制品会对人体产生一定的毒副作用。

硝基呋喃类药物对畜禽有一定毒性，同时硝基呋喃类药物也是一类具有潜在致癌和诱导有机体产生突变的物质。由于硝基呋喃类抗生素在体内代谢迅速，而代谢产物与蛋白结合形成稳定化合物，但这些代谢物可以在弱酸性条件下(如人类胃液的酸性条件)从蛋白质中释放出来，因此当人类吃了含有硝基呋喃类抗生素残留的食品，这些代谢物就可以在人类的胃液的酸性条件下从蛋白质中释放出来而被人体吸收，从而对人类健康造成严重的危害。

1990年7月欧盟颁布2377/90/EEC条例，将硝基呋喃类药物及其代谢产物列为A类禁用药物。自1995年起欧盟全面规定禁止使用呋喃类抗菌物质，在动物源性食品中呋喃类残留物的检出限为不得检出。欧盟(EU)从1997年开始将所有的硝基呋喃类抗生素全部列为违禁药物。2004年美国FDA公布了禁止在进口动物源性食品中使用的11种药物名单，其中包括呋喃西林和呋喃唑酮。我国农业部文件农牧发[2002]1号也规定动物源性食品中呋喃唑酮的检出限为不得检出。目前国内外都对呋喃类物质的控制相当严格，各国对于测定的标准都有明确的规定。尽管如此，但是由于其药效确切，价格低廉，目前在畜牧和水产养殖中违禁使用现象仍较严重。

由于呋喃类药物在动物体内快速代谢，代谢物与组织蛋白结合物在体内滞留时间长，因此检测呋喃类药物残留的最佳方法是检测其代谢物而非检测原药。

目前，检测呋喃西林代谢物(SEM)的方法主要有仪器分析法和酶联免疫分析法(ELISA)。仪器分析法主要是有高效液相色谱(HPLC)、液相色谱一质谱法(LC-MS)、液相色谱一串联质谱法(LC-MS/MS)。仪器分析法灵敏度高，结果准确，但是样品需经一系列复杂的处理净化，繁琐费时，所需仪器设备价格昂贵，而且只有特定的专业技术人员才能操作，不能进行现场检测，时效性差，难以推广。ELISA法以竞争性酶联免疫反应为检测原理，缩短了检测时间，可以定性定量检测。但ELISA方法需要配套的酶标仪和配套试剂，操作过程仍较复杂，而且国内现处在研发阶段，进口国外产品价格昂贵，因而ELISA方法的应用受到了较大限制。

发明内容

本发明的目的：针对现有检测呋喃西林代谢物SEM的技术的不足和缺限，提供一种快速检测呋喃西林代谢物的金标层析试纸条的制备方法，使其能更加快速、灵敏、简便地检测呋喃西林代谢物残留。

本发明的技术方案：一种呋喃西林代谢物胶体金层析检测试纸条的制备方法，含有衬板和在衬板上依次衔接的样品垫、金标结合垫、包被膜、吸水垫，金标结合垫为吸附呋喃西林代谢物SEM衍生物金标抗体的玻璃纤维棉，在包被膜上有用SEM衍生物偶联载体蛋白的溶液印制的直线式隐形检测线T线，用羊抗兔IgG溶液印制的直线式隐形控制线C线，两条线平行排列。

所述的衬板为不吸水的韧性材料，选用硬质塑胶条，或不吸水硬纸条；所述的样品垫选用玻璃纤维棉，或尼龙膜，或聚偏二氟乙烯膜，或聚酯膜；所述的吸水垫选用吸水能力较强的吸水滤纸或滤油纸；所述的包被膜选用硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜。

所述的SEM衍生物金标抗体为胶体金标记的SEM衍生物多克隆抗体；所述的偶联SEM衍生物的载体蛋白选用牛血清白蛋白BSA，或卵清蛋白OVA。

本发明的有益效果：本检测试纸条具有下列优点：

①特异性强，敏感性高。该胶体金层析检测试纸条以胶体金标记高亲和力的多克隆抗体为基础制备而成，金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无共价键形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金标记对抗体的特异性和亲和力影响很小，且具有较高的标记率。因此，试纸条具有较强的特异性和较高的敏感性，检出最低限量可达到5ppb。

②简便、快速、时效性强。使用胶体金层析检测试纸条和试纸卡，无需任何其它试剂和仪器，可现场操作，试纸条加入被检样品液后，在15分钟内即可判定检测结果。

③结果显示形象、直观、准确。检测试纸条均以显示红色线T线和C线作为检测结果阳性和阴性标记，即在包被膜上显示一条红色线C线时，表示在被检样品中含有被检物，显示两条红色线T线和C线时，表示在被检样品中不含被检物。结果判定形象、直观、准确，简单明了，不易出现假阳性和假阴性等人为误判。

④节省费用，适用范围广，便于推广。使用检测试纸条，比用仪器分析和ELISA试剂盒的费用大幅下降。另外，试纸条的适用范围广，可满足不同层次人员需要，包括专业检验，海关检疫，卫生检疫，质量监测，加工企业和养殖场户等，便于推广应用，具有广阔的市场前景和明显的经济、社会效益。

附图说明

图1、呋喃西林代谢物胶体金层析检测试纸条剖面结构示意图。

图2、呋喃西林代谢物胶体金层析检测试纸条俯视结构示意图。

具体实施方式

实施例1：制备呋喃西林代谢物检测试纸条。

首先需要制备偶联呋喃西林代谢物衍生物载体蛋白，用于制备相应的检测线(T线)和抗体；而且需要制备呋喃西林代谢物衍生物金标抗体，用于制备相应的金标抗体纤维棉；另外需要制备羊抗兔IgG抗体，用于制备控制线(C线)。

1、SEM衍生物与载体蛋白偶联

活性酯法：将SEM对醛基苯甲酸衍生物(CPSEM)与载体蛋白BSA进行偶联制备人工结合抗原CPSEM-BSA。具体制备方法如下：

(1)取CPSEM 20.7mg(0.1mmol)，N-羟基琥珀酰亚胺NHS 17.25mg(0.15mmol)，二环己基碳二亚胺DCC 30.9mg(0.15mmol)溶解于2mL的DMF中，室温下搅拌18小时，4500r/min离心后弃沉淀，清液为活性酯中间体，为A液；

(2)将134mg的BSA(2μmol)溶解于10mL的PBS(0.1M，pH8.0)中，为B液；

(3)将A液逐滴滴入B液中，溶液维持在4℃，所有的A液加入后，继续搅拌4小时；

(4)透析：透析袋前处理：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸10min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；

将(3)反应液转移到透析袋中，用PBS(0.01M，pH7.4)透析3天，每天换水两次；

(5)透析完后，离心取上清液，4℃冷藏待用；

混合酸酐法：

(1)17.24mg的CPSEM(0.083mmol)搅拌溶解于1800μL的DMF中，4℃下加入20μL的三正丁胺，继续搅拌30min后加入11.2μL的氯甲酸异丁酯，继续搅拌反应1h，为A液；

(2)将53.7mg的OVA搅拌溶解于6mL的硼酸盐缓冲液(0.2M，pH9.0)中，放入4℃的冰箱预冷30min，为B液；

(3)4℃下，将A液逐滴滴入B液中，并在4℃下搅拌过夜；

将(3)反应液转移到透析袋中，用超纯水透析3天，每天换水两次；

(5)透析完后离心取上清液，4℃冷藏待用；

2、抗SEM衍生物多克隆抗体的制备

用SEM衍生物载体蛋白结合抗原免疫白兔，制得抗SEM衍生物多克隆抗体，-20℃冻存备用。

3、SEM衍生物金标抗体和金标物结合垫的制备

柠檬酸三钠还原法制备胶体金：由于氯化金极易吸湿，因此使用小剂量封装的氯化金时，必须一次配完。将1g的氯化金一次溶解于双蒸水中配成1％的水溶液。放在4℃冰箱内保存，保存时间长达几个月至1年左右。再取1％的氯金酸溶液10mL，配制成浓度为0.1g/L的氯金酸溶液。取0.1g/L氯金酸溶液50mL放入锥形瓶，用恒温电磁搅拌器加热至沸腾并持续2min，在100r/min磁力搅拌下，加入1％柠檬酸三钠水溶液2mL，保持温度和搅拌速度不变，继续搅拌加热6min，直至溶液呈透亮的酒红色。室温冷却，4℃保存备用。获得直径为20nm的胶体金溶液。

用0.1mol/L K₂CO₃或0.1mol/L HCl调节胶体金溶液为pH 9.0，将10mL胶体金溶液加入50mL烧杯中，用电磁搅拌器250rpm搅拌，逐滴加入150μL多克隆抗体溶液，平衡过夜。逐滴加入5％BSA，使BSA的终浓度为1％，持续搅拌5min，以BSA和游离的胶体金结合。再将金标抗体溶液常温低速(3000rpm)离心15min，弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀。取红色上清溶液于4℃以11000rpm离心40min。溶液分为二层：透明上清，管底可流动的暗红色沉淀。轻吸并弃去上清液，将可流动的暗红色沉淀用重悬液(0.002mol/L pH9.0硼酸缓冲液含5％蔗糖)混悬，恢复至弃上清前原体积后再离心。如此重复2～4次。以彻底除去未结合的蛋白质。最后用重悬液将沉淀混悬为原体积的1/10，4℃保存备用，获得SEM衍生物胶体金标记抗体。

将1∶100～500稀释的胶体金标记抗体吸附于精制玻璃纤维棉中，37℃干燥，制备SEM衍生物金标物结合垫。

4、胶体金层析试纸条检测反应原理

氨基脲(SEM)，呋喃西林代谢物，因为分子量仅为75，属于小分子物质。与硝基呋喃类其余代谢物检测一样，抗体对游离SEM不能捕获，需要检测其苯甲醛衍生物PSEM。本发明采用竞争法，即样品中的PSEM和固定在包被膜上的包被抗原CPSEM-OVA竞争胶体金标记的抗CPSEM多克隆抗体。

当试纸条以样品垫末端浸入样本溶液后，样品溶液沿着试纸条通过毛细作用从下往上泳动，溶解金标垫上干燥的金标抗体，若待测样品中不存在待测药物PSEM，则金标抗体会直接泳动到检测线和硝酸纤维膜上的CPSEM-OVA发生免疫反应，从而胶体金颗粒发生聚集，形成红色的线条，然后其他未结合的金标抗体继续通过毛细管作用向前泳动，与控制线上的羊抗兔二抗发生第二次免疫反应，同样形成红色线条，这样包被膜上就会有两条红色线条，表示样品为阴性。若待测样品中存在待测药品PSEM，则金标抗体首先会和样品中的检测物发生免疫反应，当未发生反应的金标抗体有剩余时，才会在检测线上与CPSEM-OVA发生免疫反应，形成红色线条，其颜色强度弱于阴性时的线条强度；而当金标抗体全部和样品中的PSEM发生免疫结合时，就不会再有抗体与控制线包被原结合，从而检测线就不会有红色线条出现。控制线是为检验金标免疫层析方法本身是否有效而设定的，所以无论样品中是否存在待测药物PSEM，控制线都应该显现。如果控制线不显色，则说明试纸条失效。

实施例2、制备检测试纸条。把浓度1mg/mL的包被抗原及羊抗兔IgG喷在包被膜上，分别作为检测线(T)和控制线(C)，在37℃烘箱干燥10min。以同样方法，将浓度0.2mg/mL的金标抗体包被在结合垫上。试纸条组成为一个衬板，在其上按顺序粘上样品垫、胶体金结合垫、包被膜和吸水垫。将贴好的板切割成3mm宽的条，然后将试纸条与干燥剂一起装入铝箔袋内密封保存。

实施例3、试纸条的检测方法。

检测样品前处理：取1g猪肉组织均质物，加入5mL蒸馏水，1M的HCl 0.5mL和0.01M的苯甲醛(乙醇溶液)100μL，充分振荡，置于60℃过夜。然后加入1M的K₂HPO₄5mL，1M的NaOH 0.4mL以及5mL的乙酸乙酯，剧烈振荡30秒。室温下4000rpm离心10分钟，然后取2.5mL乙酸乙酯上清液转移到新容器中。在45℃下用氮气将其吹干，然后用正己烷重新溶解后与1mL的0.01MPBST(pH7.4，0.05％Tween-20)混匀。室温下4000rpm离心10分钟，最后取底部水相测定。

检测操作方法：将SEM胶体金层析检测试纸条样品端插入待测样品液中，插入深度不超过标记线，约10～20秒钟取出检测试纸条，水平放置，15分钟左右观察判定检测结果。

结果判定：如果在包被膜上仅有C线一条红线显现，表示检测结果为阳性，说明在待测样品中含有PSEM；如果在包被膜上C线和T线两条红线都显现，表示检测结果为阴性，说明在待测样品中不含PSEM或含量低于检测限；如果在包被膜上C线红线不显现，则表明试纸条已失效。

Claims

1.一种呋喃西林代谢物胶体金层析检测试纸条的制备方法，其特征是含有衬板和在衬板上依次衔接的样品垫、金标结合垫、包被膜、吸水垫，金标结合垫为吸附呋喃西林代谢物SEM衍生物金标抗体的玻璃纤维棉，在包被膜上有用SEM衍生物偶联载体蛋白的溶液印制的直线式隐形检测线T线，用羊抗兔IgG溶液印制的直线式隐形控制线C线，两条线平行排列。

2.根据权利要求1中所述的试纸条的制备方法，其特征是：所述的衬板为不吸水的韧性材料，选用硬质塑胶条，或不吸水硬纸条；所述的样品垫选用玻璃纤维棉，或尼龙膜，或聚偏二氟乙烯膜，或聚酯膜；所述的吸水垫选用吸水能力较强的吸水滤纸或滤油纸；所述的包被膜选用硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜。

3.根据权利要求1中所述的试纸条的制备方法，其特征是：所述的SEM衍生物金标抗体为胶体金标记的SEM衍生物多克隆抗体；所述的偶联SEM衍生物的载体蛋白选用牛血清白蛋白BSA，或鸡卵清白蛋白OVA。