CN106771272A - 一种动物组织中呋喃西林代谢物的检测方法及检测卡 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种动物组织中呋喃西林代谢物的检测方法及检测卡，包括检测卡和试剂，所述检测卡的表面设有胶体金试纸条，所述霉标孔的内侧设有冻干的呋喃西林代谢物的单克隆胶体金标记抗体，所述检测卡表面的顶部等距离设有对比色块，所述试剂包括去离子水，1M盐酸，衍生化试剂，提取剂，1M氢氧化钠，氯化金，双蒸水，氯金酸溶液，1%柠檬酸钠水溶液，0.1mol/L K2CO2，0.1mol/L HCL克隆溶液。本发明通过单克隆胶体金标记抗体的使用，单克隆胶体金标记抗体中金颗粒与抗体分子之间无共价键形成，使得二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金标记对抗体的特异性和亲和力影响很小，从而能够提高呋喃西林代谢物检测的准确度。

Description

一种动物组织中呋喃西林代谢物的检测方法及检测卡

技术领域

本发明涉及检测呋喃西林代谢物的技术领域，具体为一种动物组织中呋喃西林代谢物的检测方法及检测卡。

背景技术

呋喃西林是一种人工合成的广谱抗菌药，可以治疗畜牲疾病。近年来在畜牧、水产养殖中被广泛应用，但呋喃西林及其代谢物在动物源性食品中的残留可以通过食物链传递给人类，长期摄入会引起各种疾病，对人体有致癌、致畸胎等副作用，美国、澳大利亚、加拿大、日本、新加坡和欧盟等已明文规定禁止在食品工业中使用该类药物，并严格执行对水产中硝基呋喃的残留检测，日本肯定列表中已明文规定呋喃类药物在动物源性食品中不得检出，我国在2002年3月由农业部发布的《食品动物禁用的兽药及其它化合物清单》中将呋喃西林列为禁用药。

目前呋喃西林代谢物在检测后，呋喃西林代谢物检测的准确度不高，一些呋喃西林代谢物检测准确度较高的方法，检测的效率又低，使得呋喃西林代谢物检测的准确度与检测效率不能同时兼得，从而会增强呋喃西林代谢物对动物生长的影响。

发明内容

（一）解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种动物组织中呋喃西林代谢物的检测方法及检测卡，具备提高呋喃西林代谢物检测准确度的优点，解决了准确度会影响呋喃西林检测效率的问题。

（二）技术方案

为实现上述提高呋喃西林检测准确度目的，本发明提供如下技术方案：一种动物组织中呋喃西林代谢物的检测卡，包括检测卡和试剂，所述检测卡的表面设有胶体金试纸条，所述检测卡的内侧分别设有加样孔和霉标孔，所述霉标孔的内侧设有冻干的呋喃西林代谢物的单克隆胶体金标记抗体。

所述试剂包括动物组织，去离子水，1M盐酸，衍生化试剂，提取剂，1M氢氧化钠，氯化金，双蒸水，氯金酸溶液，1%柠檬酸钠水溶液，0.1mol/L K2CO2，0.1mol/L HCL克隆溶液，5% BSA，0.002mol/L pH9.0硼酸缓冲液，5%蔗糖的重悬液。

优选的，所述对比色块的底部设有限流凸块，所述限流凸块位于加样孔与霉标孔的顶部。

本发明还提供了一种动物组织中呋喃西林代谢物的检测方法，包括以下步骤：

S1、取一定的动物组织去脂肪后，用绞肉机绞碎，用镊子取1-3g待检测样品放入离心管中；

S2、采用试管量取3-5ml的去离子水，0.3-0.6ml的 1M盐酸，0.1-0.3ml的衍生化试剂，3-6ml的提取剂，0.3-0.5ml的1M氢氧化钠，将量取的3-5ml的去离子水，0.3-0.6ml的 1M盐酸，0.1-0.3ml的衍生化试剂加入离心管中，让离心管中的待检测样品与3-5ml的去离子水，0.3-0.6ml的 1M盐酸，0.1-0.3ml的衍生化试剂震荡混匀3-5min，放在55-60℃水浴条件下孵育30min，取出后依次加入3-6ml提取剂，0.3-0.5ml 1M氢氧化钠，放到离心机4000rpm2-10min震荡混匀1-3min，去上层清液待测；

S3、称取1g氯化金，将1g的氯化金一次性放入双蒸水中，配成1%的水溶液，放在4℃冰箱内保存，再取1%的氯金酸溶液10ml，配制成浓度为0.1g/l的氯金酸溶液，取0.1g/l氯金酸溶液放入锥形瓶，用恒温电磁搅拌器加热至沸腾并持续2min；

S4、将沸腾后的氯金酸溶液在100r/min磁力搅拌下加入1%柠檬酸钠水溶液2ml，保持温度和搅拌速度不变，继续搅拌加热6min，直至溶液呈透亮的酒红色，温室冷却，4℃保存备用，获取直径为20nm的胶体金溶液；

S5、用0.1mol/L K2CO2或0.1mol/L HCL调节胶体金溶液为PH9.0，将10ml胶体金溶液加入50ml烧杯中，用电磁搅拌器搅拌，逐滴加入150ul克隆溶液，平衡过夜，逐滴加入5% BSA，使BSA的最终浓度为1%，持续搅拌5min，以BSA和游离的胶体金接合，再将金标抗体溶液在常温低速3000rpm离心15min，弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀，去红色上清溶液于4℃11000rpm离心40min，溶液分为二层，透明上清和暗红色沉淀，轻吸并弃去上清液，将可流动的暗红色沉淀用0.002mol/L pH9.0硼酸缓冲液含5%蔗糖的重悬液混悬，恢复至弃上清前原体积后再离心，如此重复两到三次，以彻底除去未结合的蛋白质，最后用重悬液将沉淀悬为原体积的1/10，4℃保存备用，获取单克隆胶体金标记抗体；

S6、将单克隆胶体金标记抗体冷冻后放入检测卡的霉标孔中，取50-150ul待检测液于霉标孔中，反复吹打制孔内红色物质完全溶解，等待反应2-6min，吸取空去所有溶液滴加到检测卡的加样孔中，加样后开始计时，反应5-8min判读结果。

（三）有益效果

与现有技术相比，本发明提供了一种动物组织中呋喃西林代谢物的检测方法，具备以下有益效果：

1、本发明通过单克隆胶体金标记抗体的使用，单克隆胶体金标记抗体中金颗粒与抗体分子之间无共价键形成，使得二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金标记对抗体的特异性和亲和力影响很小，具有较高的标记率，从而能够提高呋喃西林代谢物检测的准确度。

2、本发明简化了样本前的处理方法，省去了传统方法中萃取和复溶的步骤，缩短了呋喃西林代谢物检测的时间，从而提高了检测的效率。

3、检测的过程简单，只要将检测样品放入霉标孔内溶解红色物质，在将溶解液滴进加样空中等待5-8min就观看到能够检测结果。

附图说明

图1为本发明检测卡的结构示意图。

图中：1检测卡、2胶体金试纸条、3霉标孔、4加样孔、5冻干的呋喃西林代谢物的单克隆胶体金标记抗体、6对比色块、7限流凸块。

具体实施方式

下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例一：

一种动物组织中呋喃西林代谢物的检测卡，包括检测卡和试剂，所述检测卡的表面设有胶体金试纸条，所述检测卡的内侧分别设有加样孔和霉标孔，所述霉标孔的内侧设有冻干的呋喃西林代谢物的单克隆胶体金标记抗体，所述检测卡表面的顶部等距离设有对比色块，所述对比色块的底部设有限流凸块，所述限流凸块位于加样孔与霉标孔的顶部，所述试剂包括动物组织，去离子水，1M盐酸，衍生化试剂，提取剂，1M氢氧化钠，氯化金，双蒸水，氯金酸溶液，1%柠檬酸钠水溶液，0.1mol/L K2CO2，0.1mol/L HCL克隆溶液，5% BSA，0.002mol/L pH9.0硼酸缓冲液，5%蔗糖的重悬液。

实施例二：

一种动物组织中呋喃西林代谢物的检测方法，包括以下步骤：

S1、称取鲫鱼背部组织、鸡腿部组织和鸡背部组织分别用绞肉机绞碎，用镊子取1-3g待检测样品分别放入不同离心管中；

S2、采用试管量取3-5ml的去离子水，0.3-0.6ml的 1M盐酸，0.1-0.3ml的衍生化试剂，3-6ml的提取剂，0.3-0.5ml的1M氢氧化钠，将量取的3-5ml的去离子水，0.3-0.6ml的 1M盐酸，0.1-0.3ml的衍生化试剂加入离心管中，让离心管中的待检测样品与3-5ml的去离子水，0.3-0.6ml的 1M盐酸，0.1-0.3ml的衍生化试剂震荡混匀3-5min，放在55-60℃水浴条件下孵育30min，取出后依次加入3-6ml提取剂，0.3-0.5ml 1M氢氧化钠，放到离心机4000rpm2-10min震荡混匀1-3min，去上层清液待测；

S3、称取1g氯化金，将1g的氯化金一次性放入双蒸水中，配成1%的水溶液，放在4℃冰箱内保存，再取1%的氯金酸溶液10ml，配制成浓度为0.1g/l的氯金酸溶液，取0.1g/l氯金酸溶液放入锥形瓶，用恒温电磁搅拌器加热至沸腾并持续2min；

S4、将沸腾后的氯金酸溶液在100r/min磁力搅拌下加入1%柠檬酸钠水溶液2ml，保持温度和搅拌速度不变，继续搅拌加热6min，直至溶液呈透亮的酒红色，温室冷却，4℃保存备用，获取直径为20nm的胶体金溶液；

S5、用0.1mol/L K2CO2或0.1mol/L HCL调节胶体金溶液为PH9.0，将10ml胶体金溶液加入50ml烧杯中，用电磁搅拌器搅拌，逐滴加入150ul克隆溶液，平衡过夜，逐滴加入5% BSA，使BSA的最终浓度为1%，持续搅拌5min，以BSA和游离的胶体金接合，再将金标抗体溶液在常温低速3000rpm离心15min，弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀，去红色上清溶液于4℃11000rpm离心40min，溶液分为二层，透明上清和暗红色沉淀，轻吸并弃去上清液，将可流动的暗红色沉淀用0.002mol/L pH9.0硼酸缓冲液含5%蔗糖的重悬液混悬，恢复至弃上清前原体积后再离心，如此重复两到三次，以彻底除去未结合的蛋白质，最后用重悬液将沉淀悬为原体积的1/10，4℃保存备用，获取单克隆胶体金标记抗体；

S6、将获取鲫鱼背部组织、鸡腿部组织和鸡背部组织的单克隆胶体金标记抗体冷冻后分别放入检测卡的霉标孔中，取50-150ul待检测液于霉标孔中，反复吹打制孔内红色物质完全溶解，等待反应2-6min，吸取空去所有溶液滴加到检测卡的加样孔中，加样后开始计时，反应5-8min判读结果。

判读结构如下表1所示：

表1

结果判定：检测颜色比质控颜色要深，则检测样品中呋喃西林代谢物的含量高于检测的限定，如果检测颜色比质控颜色要浅，则检测样品中呋喃西林代谢物的含量低于检测的限定，以此来判断呋喃西林代谢物的检测结果。

本发明的有益效果是：本发明通过单克隆胶体金标记抗体的使用，单克隆胶体金标记抗体中金颗粒与抗体分子之间无共价键形成，使得二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金标记对抗体的特异性和亲和力影响很小，具有较高的标记率，从而能够提高呋喃西林代谢物检测的准确度，本发明简化了样本前的处理方法，省去了传统方法中萃取和复溶的步骤，缩短了呋喃西林代谢物检测的时间，从而提高了检测的效率，检测的过程简单，只要将检测样品放入霉标孔内溶解红色物质，在将溶解液滴进加样空中等待5-8min就观看到能够检测结果。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (3)

1.一种动物组织中呋喃西林代谢物的检测卡，包括检测卡（1）和试剂，其特征在于，所述检测卡（1）的表面设有胶体金试纸条（2），所述检测卡（1）的内侧分别设有加样孔（4）和霉标孔（3），所述霉标孔（3）的内侧设有冻干的呋喃西林代谢物的单克隆胶体金标记抗体（5），所述检测卡（1）表面的顶部等距离设有对比色块（6）；

所述试剂包括动物组织，去离子水，1M盐酸，衍生化试剂，提取剂，1M氢氧化钠，氯化金，双蒸水，氯金酸溶液，1%柠檬酸钠水溶液，0.1mol/L K2CO2，0.1mol/L HCL克隆溶液，5%BSA，0.002mol/L pH9.0硼酸缓冲液，5%蔗糖的重悬液。

2.根据权利要求1所述的一种动物组织中呋喃西林代谢物的检测卡，其特征在于，所述对比色块（6）的底部设有限流凸块（7），所述限流凸块（7）位于加样孔（4）与霉标孔（3）的顶部。

3.一种动物组织中呋喃西林代谢物的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、取一定的动物组织去脂肪后，用绞肉机绞碎，用镊子取1-3g待检测样品放入离心管中；

S2、采用试管量取3-5ml的去离子水，0.3-0.6ml的 1M盐酸，0.1-0.3ml的衍生化试剂，3-6ml的提取剂，0.3-0.5ml的1M氢氧化钠，将量取的3-5ml的去离子水，0.3-0.6ml的 1M盐酸，0.1-0.3ml的衍生化试剂加入离心管中，让离心管中的待检测样品与3-5ml的去离子水，0.3-0.6ml的 1M盐酸，0.1-0.3ml的衍生化试剂震荡混匀3-5min，放在55-60℃水浴条件下孵育30min，取出后依次加入3-6ml提取剂，0.3-0.5ml 1M氢氧化钠，放到离心机4000rpm2-10min震荡混匀1-3min，去上层清液待测；

S3、称取1g氯化金，将1g的氯化金一次性放入双蒸水中，配成1%的水溶液，放在4℃冰箱内保存，再取1%的氯金酸溶液10ml，配制成浓度为0.1g/l的氯金酸溶液，取0.1g/l氯金酸溶液放入锥形瓶，用恒温电磁搅拌器加热至沸腾并持续2min；

S4、将沸腾后的氯金酸溶液在100r/min磁力搅拌下加入1%柠檬酸钠水溶液2ml，保持温度和搅拌速度不变，继续搅拌加热6min，直至溶液呈透亮的酒红色，温室冷却，4℃保存备用，获取直径为20nm的胶体金溶液；

S5、用0.1mol/L K2CO2或0.1mol/L HCL调节胶体金溶液为PH9.0，将10ml胶体金溶液加入50ml烧杯中，用电磁搅拌器搅拌，逐滴加入150ul克隆溶液，平衡过夜，逐滴加入5% BSA，使BSA的最终浓度为1%，持续搅拌5min，以BSA和游离的胶体金接合，再将金标抗体溶液在常温低速3000rpm离心15min，弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀，去红色上清溶液于4℃11000rpm离心40min，溶液分为二层，透明上清和暗红色沉淀，轻吸并弃去上清液，将可流动的暗红色沉淀用0.002mol/L pH9.0硼酸缓冲液含5%蔗糖的重悬液混悬，恢复至弃上清前原体积后再离心，如此重复两到三次，以彻底除去未结合的蛋白质，最后用重悬液将沉淀悬为原体积的1/10，4℃保存备用，获取单克隆胶体金标记抗体；

S6、将单克隆胶体金标记抗体冷冻后放入检测卡的霉标孔中，取50-150ul待检测液于霉标孔中，反复吹打制孔内红色物质完全溶解，等待反应2-6min，吸取空去所有溶液滴加到检测卡的加样孔中，加样后开始计时，反应5-8min判读结果。