JPS60501178A - 抗原抗体検出剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 抗原抗体検出剤 本発明は、抗体と親和性を有する酵素およびたんば〈質をベースとする抗原抗体 複合物検出剤およびその製造方法に関する。

免疫学的分析法は特異性が高くかつ抗原抗体複合物形成比が化学量論的であるた め、診断上標準的な方法とされる。もつとも多用されている定量分析法としては ＲＩＡ　（ラジオイムノアッセイ）およびＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベン トア・シャイ）が挙げられる。４１１Ａでは、試料中における量が不明の非標識 抗体による放射標識抗体の放射能の低下（低減）を測定することにより、抗原を 定量する。ＥＬＩＳＡでは、カスケード／抗原／抗体複合物における酵素アッセ イにより抗原を定量する。

第一の方法（ＲＩ　Ａ）はきわめて高感度ではあるが、放射標識物質を用いた作 業用に特殊な設備や装置が必要であり、また放射性廃棄物処分の問題もある。

ＥＬＩＳＡはＲＩＡよりも感度は劣るが、より安価でありまた技術的にも容易で 時間がかからない。

ＥＬＩＳＡはいくつかの段階より成る。まず疎水的゛　相互作用または共有結合 によって過剰のプローブ抗原特異的抗体（第１抗体）を固体マトリ−２クスと結 合させる。こうして固定した抗体をつぎに試料共に培養することにより、抗原抗 体複合体の形で抗原をマトリックスと結合させる。マトリツクスに固定した複合 体を、抗原特異的ではあるが結合はしていない抗体（第２抗体）と共に再度培養 することにより、抗原濃度に相当する量の遊離抗体をマトリックス固定複合物と 結合させる。余剰分を洗浄して除いた後、複合物を第３抗体と共に培養する。こ の第３抗体は、未固定抗体の重鎖中の所定の部位（Ｆｏ部位と呼ばれる酵素結合 部位）と相互作用を行なう（酵素抱合、Ｆｏ特異的抗体：マーカー抗体）。酵素 テストによって、結合マーカー抗体を定量する。ＥＬＩ　ＳＡの変種のひとつに 、抗原をマトリックスと直接結合させる方法がある。ＥＬＩＳＡの特徴は、酵素 抱合マーカー抗体により抗原抗体複合物を酵素的に検出する点にある。マーカー 酵素と抗体との結合は、両たんば〈質分子の共有結合によって実施する。この結 合は非特異的である。すなわち、酵素のどの部分が抗体のどのドメインと反応す るかは予測できない。したがって化学結合の過程において、利用可能な抗体の一 部と結合すべき酵素の一部とが共に不活性化されることは避けられない、このよ うな不活性複合物は一般に活性複合物と分離できないため、ＥＬＩＳＡの複合駒 形成度とシグナル強度とを低下させる。西独特許公開公報第２４３０３５７号記 載の免疫グロブリンまたは抗原定量方法においては、化学抱合プロティンＡ酵素 複合物が使用されている。またプロ°ｉインＡの部分はこのマーカー酵素の製造 に使用できると述べられている。ただしこのタイプのマーカー酵素は、上記のＥ ＬＩ　ＳＡの短所（特に酵素のプロティンＡとの非特異的結合に関して）を持つ 。

したがって本発明の目的は、不活性複合体の問題を避け、かつマーカー酵素と抗 原との直接結合を可能にする検出剤の提供にある０本発明によれば、遺伝的方法 もしくは遺伝子工学によって抗体結合たんばく質と融合させた検出剤を用いるこ とによって、この問題を解決することができる。本発明により検出剤の好ましい 実施例は、請求の範囲第２項および第３項に記載されている。また請求の範囲第 ４項乃至第８項は、本発明による検′°出剤の製造方法に関するものである。

本発明によれば、ＥＬＩ　ＳＡにおける酵素抱合Ｆ。

特異的抗体の代わりに融合たんばく質を用いる。融合たんばく質を製造するには 、抗体結合たんばく質［たとえば黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕ ｓ　ａｕｒｅｕｓ　）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｐ ｉｄｅｓ＋ｉｓ　）またはその他の細菌のプロティンＡ】を酵素の非不可欠部位 に抱合させる。たんばく質の一抗体結合部位のみを酵素に挿入するのが好ましい 。融合たんば〈質の酵素部分は、一般にＥＬＩ　ＳＡに使用できるとわかってい る酵素（例えばβ−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオ キシダーゼ、ルシフェラーゼなど）を利用できる。酵素の抗体結合たんばく質と の融合は、既知の遺伝学的もしくは遺伝子工学的方法に準じて行なうのが好まし い。

こうして得たハイブリッド分子は不活性抱合体を伴わないため、特異性を損なう ことなしはテストの感度を上昇させる。

添付の各図は本発明の詳細な説用するものである。

第１図ニブロチインＡおよびβ−ガラクトシダーゼより成る本発明のハイブリッ ド分子の製造。

第２図ａ）およびｂ）：ハイブリッド分子による抗原抗体複合体の検出。

第３図：Ｆ　結合β−ガラクトシダーゼを製造するクローンの同定。

黄色ブドウ球菌由来のプロティンＡのＦ　特異的部位をβ−ガラクトシダーゼに 融合させることにより、抗体のＦ　部位に対して高度の親和性を有する機能酵素 分子を形成するのが好ましい（第１図）。このハイブリッド分子はＥＬＩＳＡに おける第三抗体に代わるものである。

プロティンＡが好ましい理由としては、諸種のＩｇ６分子のＦ　部位に対して高 度の親和性を有する抗体結合たんばく質である点、およびいくつかの同一（もし くは少なくとも類似した）結合部位を有する点が挙げられる。したがって本発明 によるマーカー抗体代替物質の形成においては、完璧な遺伝子をクローン化する 必要はなく、結合部位中のひとつに対する遺伝子コード部分をクローン化すれば 充分である。プロティンＡと抗体との結合は抗原結合部位に変化をもたらさない ため、プロティンＡ結合抗体は正常な抗原抗体複合物を形成することができる。

酵素ではβ−ガラクトシダーゼが好ましい理由としては、グリコシドの糖部分に 酵素特異性が存在する点が挙げられる。したがってこの酵素は高感度色素アッセ イに使用可能な異なるアルコール部分を有するガラクトシドを分割する。さらに この酵素の７ミノ末端はその活性において不可欠ではないため、除去もしくは置 換されても酵素活性は損なわれない、この特性は、分子生物学における融合たん ばく質による遺伝制御要因の測定に利用されることが多い。

ＦＣ結合がガラクトシダーゼの形成は、いくつかの段階より成る既知の遺伝学的 もしくは遺伝子工学的方法に準じて実施できる０例えばプロティンＡ生産ブドウ 球菌のＤＮＡを単離し、約３０００−５００００個の塩基対（−結合部位のサイ ズにほぼ相当する）より成るフラグメントに分割する。このＤＮＡフラグメント を５部のガラクトシダーゼ遺伝子中にクローン化する。クローンをスクリーニン グするには、抗体分子を非特異的にフィルターと結合させて溶解細菌クローンと 共に培養する。クローンのひとつが抗体結合ガラクトシダーゼを生産する場合は 、酵素分子が結合部位を経てフィルターに付着したわけであり、酵素反応による 検出が可能である（第３図）。

抗原−特異 結合部位 抗体結合膜 ＦＩＧ、３ 国際調査報告特表昭６（１−５０１１７８（４）１頁の続き ＱＩｎｔ、ＣＩ、４　識別記号　庁内整理番号箔　明　者　ペトリ　トーマス　 ドイツ連邦共和国、ユトラーセ　５

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）抗体と親和性を有する酵素およびたんば〈質をベースとする抗原抗体複合物 検出剤において、遺伝学的もしくは遺伝子工学的技法によって抗体結合たんばく 質と融合させた酵素を必須成分とすることを特徴とする検出剤。 ２）請求の範囲第１項記載の検出剤において、酵素を抗体結合たんば〈質の抗体 結合部位に融合させることを特徴とする検出剤。 ３）請求の範囲第１項または第２項記載の検出剤において、酵素がβ−ガラクト シダーゼまたはアルカリホスファターゼ、もしくはグルコースオキシダーゼまた はルシフェラーゼであり、たんばく質が黄色ブドウ球菌由来のプロティンＡであ ることを特徴とする検出剤。 ４）請求の範囲第１項ないし第３項のいずれかに記載の検出剤の製造方法におい て、酵素活性に不可欠ではない部位において酵素遺伝子を分割し、抗体結合たん ばく質を生産する微生物のＤＮＡな単離ならびに分割生成物を分割酵素遺伝子中 においてクローン化し、ついで得られたクローンなスクリーニングすることを特 徴とする方法。 ５）請求の範囲第４項記載の方法において、ＤＮＡ分割生成物が抗体結合たんば く質の遺伝情報の全部もしくは抗体結合ドメインの情報のみを含むことを特徴と する方法。 ８）請求の範囲第４項または第５項記載の方法において、クローンをスクリーニ ングするために溶解細菌を抗体コートフィルターに移し、酵素テストによって特 異的結合酵素分子を同定すること特徴とする方法。 ７）請求の範囲第４項ないし第６項のいずれかに記載の方法において、微生物の ＤＮＡをｔｏｏｏ−ｔｏｏｏｏ個、好ましくは３０００−５０００個のヌクレオ チド鎖な有する生成物に分割することを特徴とする方法。 ８）請求の範囲第４項ないし第７項のいずれかに記載の方法において、酵素遺伝 子としてβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を使用し、またたんばく質としてプロティ ンＡを使用することを特徴とする特許