JP2010175444A - 抗原の検出方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】試料中に含まれる抗原を検出対象とする抗原の検出方法であって、抗原に対する抗体を、化学反応によって抗体と可逆的に結合解離可能な置換基との反応により、固相の表面に結合させて固定化する抗体固定化工程と、抗原を含む試料と抗体を固定化した固相とを接触させ、抗原を抗体に結合させる抗原反応工程と、標識部分を含む抗原に対する標識化抗体を、抗体に結合させた抗原に結合させる標識化工程と、置換基により形成された結合部分の解離反応により、抗体と抗原と標識化抗体とを含む複合体を固相から分離する分離工程と、分離された複合体における標識部分を検出することによって、抗原を検出する検出工程と、を含む抗原の検出方法である。
【選択図】図1
Description
抗体固定化用固相作製工程では、検出対象の抗原18に対する抗体14と化学反応によって可逆的に結合解離可能な置換基Xを有する化合物R−Xを、固相10の表面へ結合させる。
a.市販ストレプトアビジン固定化プレートの利用による結合
水溶性のビオチンラベル化剤(例えば、Dojindo.Biotin−AC5 Sulfo−OSu、PIERCE Sulfo−NHS−LC−Biotin、下記構造式参照)をPBSバッファ中で反応させ、m位にビオチン化されたフェニルボロン酸誘導体を得る。このビオチン化されたフェニルボロン酸誘導体を、ストレプトアビジン固定化プレート上にて反応させ、ビオチン−ストレプトアビジン複合体を形成させて、基板上にフェニルボロン酸を固定化する。市販ストレプトアビジン固定化プレートは、Nunc社などから購入することができる。反応温度、反応時間などの反応条件は、適宜選択すればよい。
PEGポリマ構造を含むスペーサを介して求電子性官能基が存在しているプレートを用いて、m−アミノフェニルボロン酸(下記構造式参照)含有溶液とインキュベートさせることにより、同化合物のアミノ基と結合させることができる。反応温度、反応時間などの反応条件は、適宜選択すればよい。なお、未反応の官能基はトリエタノールアミンバッファなどでブロッキングしてもよい。求電子性官能基を有するプレートは、Nunc社から購入することができる(Nuncイモビライザ(求電子性官能基:アミノ基))。
アミノ基を表面に有するプレートを用いる場合、両端にNHS活性エステルを有する2官能性化合物(例えば、bis(sulfosuccinimidyl)suberate(下記構造式参照)など)を用い、m−アミノフェニルボロン酸のアミノ基とプレート上のアミノ基とをリンカを介して結合させる。また、両端にフォルミル基を有するグルタルアルデヒド(下記構造式参照)を用い、プレート上のアミノ基と一方のフォルミル基とでアルジミンを形成させ、同様にm−アミノフェニルボロン酸のアミノ基と他方のフォルミル基と反応させてアミノフェニルボロン酸をプレートに結合させてもよい。反応温度、反応時間などの反応条件は、適宜選択すればよい。
カルボキシル基を有するプレートを用いる場合、プレート上のカルボキシル基に、水溶性のカルボジイミド(例えば、EDAC(1−ethyl−3−(3−dimethylaminoethyl)carbodiimide(下記構造式参照))を反応させ、活性中間体を得た後、m−アミノフェニルボロン酸をさらに反応、結合させる。反応温度、反応時間などの反応条件は、適宜選択すればよい。
a.アミノ基を有するガラスプレートの利用による結合
ガラス表面にアミノ基を有するプレートを使用する場合、上記I−1のcの方法を利用することができる。同プレートは市販スライドグラスを十分洗浄後、3−aminopropyltriethoxysilane(下記構造式参照)などのシランカップリング剤を用いて作製が可能である。
[1.抗体固定化工程]
抗体固定化工程では、検出対象の抗原18に対する抗体14を、化学反応によって抗体14と可逆的に結合解離可能な置換基との反応により、固相10の表面に結合させて固定化する。
定法と同様に、PBSバッファ(pH8.0前後)などにより洗浄を実施してもよい。これにより、未反応の抗体などを除去することができる。
必要に応じて、定法と同様に、BSA(PBSバッファなどで溶解)などのブロッキング剤で固相表面のブロッキングを行ってもよい。ブロッキングは、抗原抗体反応に関与しないタンパク質などで固相表面を覆い、後の工程で作用させる抗原や抗体などが固相表面に吸着されるのを防ぐ目的で行われる。ブロッキング剤は、糖鎖を含まないタンパク質から構成されるものが好ましい。なお、抗体固定化工程において、BSAなどのブロッキング剤を添加することによって、抗体固定化およびブロッキングを同時に行うこともできる。
ブロッキング工程後に、PBSTバッファ(PBS+0.5% Tween20)などを用いて、洗浄を実施してもよい。これにより、未結合のブロッキング剤などを除去することができる。ブロッキングを行わない場合は、本洗浄工程を省略することができる。
抗原反応工程では、検出対象となる抗原18を含む試料と、抗体14を固定化した固相10とを接触させ、抗原18を抗体14に反応させ、結合させる。
抗原反応工程後に、4の洗浄工程と同様に、PBSTバッファ(PBS+0.5% Tween20)などを用いて、洗浄を実施してもよい。これにより、未反応の抗原などを除去することができる。
標識化工程では、標識部分22を含む、抗原18に対する標識化抗体20を、抗体14に結合させた抗原18に結合させる。
標識化工程後に、4の洗浄工程と同様に、PBSTバッファ(PBS+0.05% Tween20)などを用いて、洗浄を実施してもよい。これにより、未反応の標識化抗体などを除去することができる。
分離工程では、置換基Xにより形成された結合部分16の解離反応により、抗体14と抗原18と標識化抗体20とを含む抗体−抗原−標識化抗体複合体24を固相10から分離する。
検出工程では、分離された複合体24における標識部分22を検出することによって、抗原18を検出する。分離工程で回収した溶液について、標識部分に応じて、酵素活性、蛍光強度などを測定する。酵素活性測定でバッファ交換が必要な場合は、スピンカラムなどを用いると迅速に行うことができる。
図6の方法における抗体反応工程では、抗原18に対する2次抗体28を、抗体(1次抗体)14に結合させた抗原18に結合させる。このとき、2次抗体28は、固相10に固定化した抗体(1次抗体)14とは別の抗体であり、抗原18の抗体(1次抗体)14とは異なる部位に結合するものである。
抗体反応工程後に、4の洗浄工程と同様に、PBSTバッファ(PBS+0.05% Tween20)などを用いて、洗浄を実施してもよい。これにより、未反応の2次抗体などを除去することができる。
Claims (4)
- 試料中に含まれる抗原を検出対象とする抗原の検出方法であって、
前記抗原に対する抗体を、化学反応によって前記抗体と可逆的に結合解離可能な置換基との反応を利用して、固相の表面に結合させて固定化する抗体固定化工程と、
前記抗原を含む試料と前記抗体を固定化した固相とを接触させ、前記抗原を前記抗体に結合させる抗原反応工程と、
標識部分を含む前記抗原に対する標識化抗体を、前記抗体に結合させた抗原に結合させる標識化工程と、
前記置換基により形成された結合部分の解離反応により、前記抗体と前記抗原と前記標識化抗体とを含む複合体を前記固相から分離する分離工程と、
前記分離された複合体における前記標識部分を検出することによって、前記抗原を検出する検出工程と、
を含むことを特徴とする抗原の検出方法。 - 試料中に含まれる抗原を検出対象とする抗原の検出方法であって、
前記抗原に対する1次抗体を、化学反応によって前記1次抗体と可逆的に結合解離可能な置換基との反応を利用して、固相の表面に結合させて固定化する抗体固定化工程と、
前記抗原を含む試料と前記1次抗体を固定化した固相とを接触させ、前記抗原を前記1次抗体に結合させる抗原反応工程と、
2次抗体を前記1次抗体に結合させた抗原に結合させる抗体反応工程と、
標識部分を含む標識化抗体を、前記抗原に結合させた2次抗体に結合させる標識化工程と、
前記置換基により形成された結合部分の解離反応により、前記1次抗体と前記抗原と前記2次抗体と前記標識化抗体とを含む複合体を前記固相から分離する分離工程と、
前記分離された複合体における前記標識部分を検出することによって、前記抗原を検出する検出工程と、
を含むことを特徴とする抗原の検出方法。 - 請求項1または2に記載の抗原の検出方法であって、
前記置換基が、ジヒドロキシボリル基であり、前記抗体に含まれる糖残基のジオール部分と前記ジヒドロキシボリル基との可逆的な反応により、前記抗体の固定化および前記複合体の分離を行うことを特徴とする抗原の検出方法。 - 請求項1〜3のいずれか1項に記載の抗原の検出方法であって、
前記標識部分が、酵素、蛍光物質および発光物質のうち少なくとも1つであることを特徴とする抗原の検出方法。
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