JPWO2014123131A1 - １型糖尿病の早期診断マーカーであるｇａｄ抗体の高感度測定方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ＧＡＤ抗体の測定方法を提供することを課題とする。特に、従来のＥＬＩＺＡ法を超える、高感度のＧＡＤ抗体測定方法を提供することを課題とする。上記の課題を解決するために、２点結合免疫複合体転移酵素免疫測定方法（ＩＣＴ−ＥＩＡ法）を使用して、血中のＧＡＤ抗体の測定方法を構築することにより、ＥＬＩＺＡ法の３３倍以上の高感度測定が可能になった。その結果、１型糖尿病等を発症初期で検出できるようになり、的確な介入療法が実施できるようになった。
Description
本発明は、１型糖尿病の初期症状を的確に評価・診断するための評価マーカーあるＧＡＤ抗体の高感度測定方法に関するものである。
糖尿病とは、「インスリン作用の不足による慢性高血糖を主徴とし、種々の特徴的な代謝異常を伴う疾患群である。その発症には遺伝因子と環境因子がともに関与する。そして、代謝異常の長期間にわたる持続は特有の合併症を来たしやすく、動脈硬化症をも促進する。また、代謝異常の程度によって、無症状からケトアシドーシスや昏睡に至る幅広い病態を示す。」と定義されている（非特許文献１）。我が国では、糖尿病が強く疑われる人およびその可能性が否定できない状態の人（予備群）を合せると約２，２１０万人いると確定されており、今後も増加の一歩を辿ると予想されている（非特許文献２）。糖尿病には、成因によって１型糖尿病、２型糖尿病、特定の原因によるその他の糖尿病および妊娠糖尿病の４群に分類されているが、その中でも１型糖尿病患者は５〜１０％、２型糖尿病患者が９０〜９５％を占めており、ほとんどの糖尿病が２型糖尿病患者である。糖尿病の発症原因においては、各分類によって異なっているが、１型糖尿病は、インスリンを分泌する膵臓のβ細胞が破壊されることにより、インスリンの絶対的欠乏に至り発症すると考えられている。この膵β細胞破壊のメカニズムについては、まだ明確に解明されてはいないが、自己免疫反応が関与していると考えられており、その抗原として膵β細胞で特異的に発現するインスリンが重要視されている。
１型糖尿病は、自己免疫疾患の１つであるとされており、１型糖尿病患者からは数種の膵島関連自己抗体（インスリン自己抗体、ＧＡＤ （ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）抗体、ＩＡ （ｉｎｓｕｌｉｎｎｏｍａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ）−２抗体等）が検出されている。特に、これらの中で、最近注目されているのがＧＡＤ抗体である。ＧＡＤ抗体は、グルタミン酸脱炭酸酵素（ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ： ＧＡＤ）に対する自己抗体である。Ｂａｅｋｋｅｓｋｏｖらにより１型糖尿病患者血清中に膵島の６４ｋＤａの蛋白質に反応する抗体が存在することを報告され、この６４ｋＤａの蛋白質がＧＡＤであることが明らかにされている（非特許文献３）。ＧＡＤには６５ｋＤａのＧＡＤ６５と６７ｋＤａのＧＡＤ６７の２種類のアイソフォームが存在しているが、１型糖尿病患者のＧＡＤ抗体はＧＡＤ６５に対する自己抗体である（非特許文献４）。ＧＡＤ抗体の陽性率として、早期発症時では７０〜８０％と高い陽性率を示している。しかし、発症５年以降においては陽性率が５０％以下となり、１０年後では２０％と低下していく（非特許文献５）。また、ＧＡＤ抗体はインスリン自己抗体、ＩＡ−２抗体に比べて発症時期が９歳未満では７０％と陽性率は低いが、１０歳以上では９０％と陽性率が高くなり、成人でも８５％と陽性率は高い（非特許文献６）。
糖尿病患者から膵島関連自己抗体が検出された場合は、１型糖尿病と診断される。しかし、やせ形の２型糖尿病患者の中には、発症時には膵島関連自己抗体は検出されず、食事や経口血糖降下薬により治療が可能な状態を示しているが、徐々にインスリン分泌能が低下し、平均３年でインスリン依存性糖尿病（１型糖尿病）に移行する例が見られた。この時点の患者血清中には膵島関連自己抗体が単独または重複して陽性を示しており、小林らはこのような亜型の１型糖尿病を緩徐進行１型糖尿病（Ｓｌｏｗｌｙ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ＩＤＤＭ；ＳＰＩＤＤＭ）と名付けた（非特許文献７）。
ＳＰＩＤＤＭの診断基準としては、まだ確立されてはいないが、糖尿病発症後６〜１２ヶ月の間、食事療法もしくは経口血糖降下剤で治療可能であること、およびＧＡＤ抗体が陽性（非特許文献８）もしくはＧＡＤ抗体、ＩＡ−２抗体、インスリン自己抗体の中から１つでも陽性であることとされている（非特許文献９）。ＳＰＩＤＤＭの膵島関連自己抗体陽性率は、ＧＡＤ抗体６９％、ＩＡ−２抗体３９％、インスリン自己抗体２９％であり、ＧＡＤ抗体はＩＡ−２抗体、インスリン自己抗体に比べ有意に高いことが報告されている（非特許文献９）。
上述の如く、ＧＡＤ抗体については、ＳＰＩＤＤＭにおいて陽性率が最も高く、１型糖尿病を診断する上で大変重要な診断マーカーとされている。しかし、従来の酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）では、検出感度が低いため、早期の発見または低濃度の自己抗体を検出することが困難であった。
そのため、ＧＡＤ抗体に関する、新たな高感度酵素免疫測定法の開発が期待され、早期のＳＰＩＤＤＭの発見と、インスリン療法による早期治療が望まれていた。
１型糖尿病は、自己免疫疾患の１つであるとされており、１型糖尿病患者からは数種の膵島関連自己抗体（インスリン自己抗体、ＧＡＤ （ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）抗体、ＩＡ （ｉｎｓｕｌｉｎｎｏｍａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ）−２抗体等）が検出されている。特に、これらの中で、最近注目されているのがＧＡＤ抗体である。ＧＡＤ抗体は、グルタミン酸脱炭酸酵素（ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ： ＧＡＤ）に対する自己抗体である。Ｂａｅｋｋｅｓｋｏｖらにより１型糖尿病患者血清中に膵島の６４ｋＤａの蛋白質に反応する抗体が存在することを報告され、この６４ｋＤａの蛋白質がＧＡＤであることが明らかにされている（非特許文献３）。ＧＡＤには６５ｋＤａのＧＡＤ６５と６７ｋＤａのＧＡＤ６７の２種類のアイソフォームが存在しているが、１型糖尿病患者のＧＡＤ抗体はＧＡＤ６５に対する自己抗体である（非特許文献４）。ＧＡＤ抗体の陽性率として、早期発症時では７０〜８０％と高い陽性率を示している。しかし、発症５年以降においては陽性率が５０％以下となり、１０年後では２０％と低下していく（非特許文献５）。また、ＧＡＤ抗体はインスリン自己抗体、ＩＡ−２抗体に比べて発症時期が９歳未満では７０％と陽性率は低いが、１０歳以上では９０％と陽性率が高くなり、成人でも８５％と陽性率は高い（非特許文献６）。
糖尿病患者から膵島関連自己抗体が検出された場合は、１型糖尿病と診断される。しかし、やせ形の２型糖尿病患者の中には、発症時には膵島関連自己抗体は検出されず、食事や経口血糖降下薬により治療が可能な状態を示しているが、徐々にインスリン分泌能が低下し、平均３年でインスリン依存性糖尿病（１型糖尿病）に移行する例が見られた。この時点の患者血清中には膵島関連自己抗体が単独または重複して陽性を示しており、小林らはこのような亜型の１型糖尿病を緩徐進行１型糖尿病（Ｓｌｏｗｌｙ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ＩＤＤＭ；ＳＰＩＤＤＭ）と名付けた（非特許文献７）。
ＳＰＩＤＤＭの診断基準としては、まだ確立されてはいないが、糖尿病発症後６〜１２ヶ月の間、食事療法もしくは経口血糖降下剤で治療可能であること、およびＧＡＤ抗体が陽性（非特許文献８）もしくはＧＡＤ抗体、ＩＡ−２抗体、インスリン自己抗体の中から１つでも陽性であることとされている（非特許文献９）。ＳＰＩＤＤＭの膵島関連自己抗体陽性率は、ＧＡＤ抗体６９％、ＩＡ−２抗体３９％、インスリン自己抗体２９％であり、ＧＡＤ抗体はＩＡ−２抗体、インスリン自己抗体に比べ有意に高いことが報告されている（非特許文献９）。
上述の如く、ＧＡＤ抗体については、ＳＰＩＤＤＭにおいて陽性率が最も高く、１型糖尿病を診断する上で大変重要な診断マーカーとされている。しかし、従来の酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）では、検出感度が低いため、早期の発見または低濃度の自己抗体を検出することが困難であった。
そのため、ＧＡＤ抗体に関する、新たな高感度酵素免疫測定法の開発が期待され、早期のＳＰＩＤＤＭの発見と、インスリン療法による早期治療が望まれていた。
清野 裕、南條輝志男、田嶼尚子 他：糖尿病の分類と診断基準に関する委員会報告、糖尿病 ５３巻 ６号： ４５０−４６７、 ２０１０
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田中昌一郎、粟田卓也、島田 朗 他：緩徐進行１型糖尿病 （ｓｌｏｗｌｙ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｉｎｓｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ ：ＳＰＩＤＤＭ） の臨床的特徴−日本糖尿病学会１型糖尿病調査研究委員会緩徐進行１型糖尿病分科会報告（第一報）−、糖尿病 ５４巻１号： ６５−７５、２０１１
本発明の目的は、１型糖尿病、特にＳＰＩＤＤＭに関する発症を早期に検出し、適切な生活指導や治療を行うための、ＧＡＤ抗体の高感度酵素免疫測定方法を提供することにある。
一般的に市販されているＧＡＤ抗体に対するＥＬＩＳＡキットは、第３世代のＥＬＩＳＡ法である。まず、ＧＡＤ抗原を不溶化した固相にＧＡＤ抗体を捕捉し、次いで、ビオチン標識ＧＡＤを結合させ、最後にペルオキシダーゼ標識アビジンを反応させ、酵素活性を測定する。この方法では、ペルオキシダーゼ標識アビジンの非特異シグナルが残っており、まだ高感度化が可能である。また、ＧＡＤに結合する全ての物質（ＩｇＧ以外のイムノグロブリンや結合蛋白質）を測定してしまうという問題点が残っている。
そこで、本発明者らが開発した２点結合免疫複合体転移酵素免疫測定法（Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ； 以降ＩＣＴ−ＥＩＡ法とする）を用いてＧＡＤ抗体の測定を鋭意検討することを行なった。即ち、ＩＣＴ−ＥＩＡ法とは、ＥＬＩＳＡ法における大きな問題点である、酵素標識抗原または酵素標識第２抗体の非特異的な固相への吸着を解決するため、抗原不溶化固相に捕捉または非特異的に吸着した総抗体の中から特異抗体のみを固相から外し、別の新たな固相へ転移させる方法である（Ｈａｓｈｉｄａ Ｓ， Ｈａｓｈｉｎａｋａ Ｋ ａｎｄ Ｉｓｈｉｋａｗａ Ｅ： Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ， Ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｖｏｌｕｍｅ １， Ｅｌ−ｇｅｗｅｌｙ，Ｍ．Ｒ． ｅｄ．， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｂ．Ｖ．， ４０３−４５１， １９９５）。
本発明者らは、図１に示すようにＩＣＴ−ＥＩＡ法を改良して、抗ＧＡＤＩｇＧ抗体を高感度に検出できるＩＣＴ−ＥＩＡ−１法を開発した。また、ＧＡＤを直接酵素標識するＩＣＴ−ＥＩＡ−１法に加え、抗原エピトープの立体障害を防ぐために抗ＧＡＤ ＩｇＧ抗体のＩＣＴ−ＥＩＡ−２法を開発した。その結果、本発明のＩＣＴ−ＥＩＡ−１法やＩＣＴ−ＥＩＡ−２法を使用することにより、通常のＥＬＩＳＡキットの約３３倍の高感度でＧＡＤ抗体を測定できるようになった。
更に、本発明者らは、ＩＣＴ−ＥＩＡ−２法を使用して、１型糖尿病およびＳＰＩＤＤＭの診断マーカーであるＩＡ−２抗体とインスリン自己抗体の測定を検討した。その結果、例えばインスリン自己抗体の場合、ＩＣＴ−ＥＩＡ−２法を用いれば、ＥＬＩＳＡキットに比べて１，０００倍もの高感度で検出できることが分かった。
本発明の測定方法を用いることにより、ＥＬＩＳＡキットでは、検出できなかったＳＰＩＤＤＭの患者を検出することができた。即ち、図７に示されるように、２型糖尿病患者の１７％がＳＰＩＤＤＭの患者である可能性が示された。
本発明者らは、本発明の改良ＩＣＴ−ＥＩＡ法である、ＩＣＴ−ＥＩＡ−１法とＩＣＴ−ＥＩＡ−２法を使用して、ＧＡＤ抗体とインスリン自己抗体の高感度検出法を作製することができたが、患者によっては陽性シグナルの低い例もあり、１型糖尿病およびＳＰＩＤＤＭの発症予知または診断する上で、これらの自己抗体のみを独立して測定するだけでは不十分であった。何故なら、患者の病態や病態の進捗状況により、陽性率に優劣があるからである。そこで、１型糖尿病およびＳＰＩＤＤＭの診断確度を高めるために、インスリン自己抗体およびＧＡＤ抗体の主要な２種の検出法を合体させた同時検出法を検討した。鋭意検討の結果、図８に示されるように、２種の各自己抗体の蛍光強度が合わさることで、各自己抗体の有無により、陽性者と陰性者の間で蛍光強度の差が大きくなり、陽性患者の早期の検出が可能となった。その結果、１型糖尿病およびＳＰＩＤＤＭをより精度よく発症予知または診断することができるようになった。
本発明者らは、これらの知見に基き本発明を完成した。
即ち、本発明の要旨は以下の通りである。
（１）ＧＡＤ抗体の２点結合免疫複合体転移酵素免疫測定方法（ＩＣＴ−ＥＩＡ法）であって、以下の５つの反応工程（ａ法：ＩＣＴ−ＥＩＡ−１法）または６つの反応工程（ｂ法：ＩＣＴ−ＥＩＡ−２法）で測定されることを特徴とする、ＧＡＤ抗体測定方法、
ａ）５つの反応工程：
１）ＧＡＤ抗体とＤＮＰ−ビオチン標識ＧＡＤ抗原、酵素標識ＧＡＤ抗原で免疫複合体を形成させる、
２）上記免疫複合体を抗ＤＮＰ抗体不溶化固相と反応させて、固相に免疫複合体を捕捉させる、
３）上記固相に捕捉された免疫複合体をＤＮＰ−リジンを用いて固相から溶出させる、
４）上記固相から溶出させた免疫複合体をストレプトアビジン不溶化固相と反応させ、ストレプトアビジン不溶化固相に免疫複合体を転移させる、
５）免疫複合体に含まれる標識酵素を用いて、基質と反応させ、生成物の蛍光を測定することによって免疫複合体の濃度（ＧＡＤ抗体の濃度）を測定する、または、
ｂ）６つの反応工程：
１）ＧＡＤ抗体とＤＮＰ標識ＧＡＤ抗原、ビオチン標識ＧＡＤ抗原で免疫複合体を形成させる、
２）上記免疫複合体を抗ＤＮＰ抗体不溶化固相と反応させて、固相に免疫複合体を捕捉させる、
３）上記固相に捕捉された免疫複合体と酵素標識ストレプトアビジンを反応させて、免疫複合体に酵素標識ストレプトアビジンを結合させる、
４）上記固相で酵素標識ストレプトアビジン化された免疫複合体をＤＮＰ−リジンを用いて固相から溶出させる、
５）上記固相から溶出させた免疫複合体を抗イムノグロブリン抗体不溶化固相と反応させ、抗イムノグロブリン抗体不溶化固相に免疫複合体を転移させる、
６）免疫複合体に含まれる標識酵素を用いて、基質と反応させ、生成物の蛍光を測定することによって免疫複合体の濃度（ＧＡＤ抗体の濃度）を測定する。
（２）上記６つの反応工程（ｂ法）で測定されることを特徴とする、上記（１）記載のＧＡＤ抗体測定方法。
（３）上記酵素が、β−Ｄ−ガラクトシダーゼであることを特徴とする、上記（１）または（２）に記載のＧＡＤ抗体測定方法。
（４）上記（１）〜（３）のいずれかのＧＡＤ抗体測定方法を用いて、血清中のＧＡＤ抗体の濃度を測定し、被験者の糖尿病の進行状況を評価する方法。
（５）被験者の糖尿病の進行状況を評価するために、上記（１）〜（３）のいずれかのＧＡＤ抗体測定方法を用いて、被験者血清中のＧＡＤ抗体の濃度を測定する方法。
（６）上記（１）〜（３）のいずれかのＧＡＤ抗体測定方法を用いて、血清中のＧＡＤ抗体の濃度を測定し、０．１Ｕ／ｍｌ以上の被験者を糖尿病初期であるとして、介入療法の開始時期を判断する方法。
（７）ＧＡＤ抗体の濃度が０．１Ｕ／ｍｌ以上である糖尿病初期の被験者を評価するために、上記（１）〜（３）のいずれかのＧＡＤ抗体測定方法を用いて、被験者の血清中のＧＡＤ抗体の濃度を測定する方法。
（８）ＧＡＤ抗体とインスリン自己抗体を血清中に共有する緩徐進行１型糖尿病（Ｓｌｏｗｌｙ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ＩＤＤＭ；ＳＰＩＤＤＭ）の被験者を評価するために、上記（２）のＩＣＴ−ＥＩＡ−２法で被験者血清中のＧＡＤ抗体を測定すると共に、同様のＩＣＴ−ＥＩＡ−２法でインスリン自己抗体を別個に測定する方法。
（９）１型糖尿病およびＳＰＩＤＤＭの初期患者を評価するために、インスリン自己抗体が検出できるように試剤が添加されている、上記（１）〜（３）のいずれかのＧＡＤ抗体測定方法。
そこで、本発明者らが開発した２点結合免疫複合体転移酵素免疫測定法（Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ； 以降ＩＣＴ−ＥＩＡ法とする）を用いてＧＡＤ抗体の測定を鋭意検討することを行なった。即ち、ＩＣＴ−ＥＩＡ法とは、ＥＬＩＳＡ法における大きな問題点である、酵素標識抗原または酵素標識第２抗体の非特異的な固相への吸着を解決するため、抗原不溶化固相に捕捉または非特異的に吸着した総抗体の中から特異抗体のみを固相から外し、別の新たな固相へ転移させる方法である（Ｈａｓｈｉｄａ Ｓ， Ｈａｓｈｉｎａｋａ Ｋ ａｎｄ Ｉｓｈｉｋａｗａ Ｅ： Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ， Ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｖｏｌｕｍｅ １， Ｅｌ−ｇｅｗｅｌｙ，Ｍ．Ｒ． ｅｄ．， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｂ．Ｖ．， ４０３−４５１， １９９５）。
本発明者らは、図１に示すようにＩＣＴ−ＥＩＡ法を改良して、抗ＧＡＤＩｇＧ抗体を高感度に検出できるＩＣＴ−ＥＩＡ−１法を開発した。また、ＧＡＤを直接酵素標識するＩＣＴ−ＥＩＡ−１法に加え、抗原エピトープの立体障害を防ぐために抗ＧＡＤ ＩｇＧ抗体のＩＣＴ−ＥＩＡ−２法を開発した。その結果、本発明のＩＣＴ−ＥＩＡ−１法やＩＣＴ−ＥＩＡ−２法を使用することにより、通常のＥＬＩＳＡキットの約３３倍の高感度でＧＡＤ抗体を測定できるようになった。
更に、本発明者らは、ＩＣＴ−ＥＩＡ−２法を使用して、１型糖尿病およびＳＰＩＤＤＭの診断マーカーであるＩＡ−２抗体とインスリン自己抗体の測定を検討した。その結果、例えばインスリン自己抗体の場合、ＩＣＴ−ＥＩＡ−２法を用いれば、ＥＬＩＳＡキットに比べて１，０００倍もの高感度で検出できることが分かった。
本発明の測定方法を用いることにより、ＥＬＩＳＡキットでは、検出できなかったＳＰＩＤＤＭの患者を検出することができた。即ち、図７に示されるように、２型糖尿病患者の１７％がＳＰＩＤＤＭの患者である可能性が示された。
本発明者らは、本発明の改良ＩＣＴ−ＥＩＡ法である、ＩＣＴ−ＥＩＡ−１法とＩＣＴ−ＥＩＡ−２法を使用して、ＧＡＤ抗体とインスリン自己抗体の高感度検出法を作製することができたが、患者によっては陽性シグナルの低い例もあり、１型糖尿病およびＳＰＩＤＤＭの発症予知または診断する上で、これらの自己抗体のみを独立して測定するだけでは不十分であった。何故なら、患者の病態や病態の進捗状況により、陽性率に優劣があるからである。そこで、１型糖尿病およびＳＰＩＤＤＭの診断確度を高めるために、インスリン自己抗体およびＧＡＤ抗体の主要な２種の検出法を合体させた同時検出法を検討した。鋭意検討の結果、図８に示されるように、２種の各自己抗体の蛍光強度が合わさることで、各自己抗体の有無により、陽性者と陰性者の間で蛍光強度の差が大きくなり、陽性患者の早期の検出が可能となった。その結果、１型糖尿病およびＳＰＩＤＤＭをより精度よく発症予知または診断することができるようになった。
本発明者らは、これらの知見に基き本発明を完成した。
即ち、本発明の要旨は以下の通りである。
（１）ＧＡＤ抗体の２点結合免疫複合体転移酵素免疫測定方法（ＩＣＴ−ＥＩＡ法）であって、以下の５つの反応工程（ａ法：ＩＣＴ−ＥＩＡ−１法）または６つの反応工程（ｂ法：ＩＣＴ−ＥＩＡ−２法）で測定されることを特徴とする、ＧＡＤ抗体測定方法、
ａ）５つの反応工程：
１）ＧＡＤ抗体とＤＮＰ−ビオチン標識ＧＡＤ抗原、酵素標識ＧＡＤ抗原で免疫複合体を形成させる、
２）上記免疫複合体を抗ＤＮＰ抗体不溶化固相と反応させて、固相に免疫複合体を捕捉させる、
３）上記固相に捕捉された免疫複合体をＤＮＰ−リジンを用いて固相から溶出させる、
４）上記固相から溶出させた免疫複合体をストレプトアビジン不溶化固相と反応させ、ストレプトアビジン不溶化固相に免疫複合体を転移させる、
５）免疫複合体に含まれる標識酵素を用いて、基質と反応させ、生成物の蛍光を測定することによって免疫複合体の濃度（ＧＡＤ抗体の濃度）を測定する、または、
ｂ）６つの反応工程：
１）ＧＡＤ抗体とＤＮＰ標識ＧＡＤ抗原、ビオチン標識ＧＡＤ抗原で免疫複合体を形成させる、
２）上記免疫複合体を抗ＤＮＰ抗体不溶化固相と反応させて、固相に免疫複合体を捕捉させる、
３）上記固相に捕捉された免疫複合体と酵素標識ストレプトアビジンを反応させて、免疫複合体に酵素標識ストレプトアビジンを結合させる、
４）上記固相で酵素標識ストレプトアビジン化された免疫複合体をＤＮＰ−リジンを用いて固相から溶出させる、
５）上記固相から溶出させた免疫複合体を抗イムノグロブリン抗体不溶化固相と反応させ、抗イムノグロブリン抗体不溶化固相に免疫複合体を転移させる、
６）免疫複合体に含まれる標識酵素を用いて、基質と反応させ、生成物の蛍光を測定することによって免疫複合体の濃度（ＧＡＤ抗体の濃度）を測定する。
（２）上記６つの反応工程（ｂ法）で測定されることを特徴とする、上記（１）記載のＧＡＤ抗体測定方法。
（３）上記酵素が、β−Ｄ−ガラクトシダーゼであることを特徴とする、上記（１）または（２）に記載のＧＡＤ抗体測定方法。
（４）上記（１）〜（３）のいずれかのＧＡＤ抗体測定方法を用いて、血清中のＧＡＤ抗体の濃度を測定し、被験者の糖尿病の進行状況を評価する方法。
（５）被験者の糖尿病の進行状況を評価するために、上記（１）〜（３）のいずれかのＧＡＤ抗体測定方法を用いて、被験者血清中のＧＡＤ抗体の濃度を測定する方法。
（６）上記（１）〜（３）のいずれかのＧＡＤ抗体測定方法を用いて、血清中のＧＡＤ抗体の濃度を測定し、０．１Ｕ／ｍｌ以上の被験者を糖尿病初期であるとして、介入療法の開始時期を判断する方法。
（７）ＧＡＤ抗体の濃度が０．１Ｕ／ｍｌ以上である糖尿病初期の被験者を評価するために、上記（１）〜（３）のいずれかのＧＡＤ抗体測定方法を用いて、被験者の血清中のＧＡＤ抗体の濃度を測定する方法。
（８）ＧＡＤ抗体とインスリン自己抗体を血清中に共有する緩徐進行１型糖尿病（Ｓｌｏｗｌｙ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ＩＤＤＭ；ＳＰＩＤＤＭ）の被験者を評価するために、上記（２）のＩＣＴ−ＥＩＡ−２法で被験者血清中のＧＡＤ抗体を測定すると共に、同様のＩＣＴ−ＥＩＡ−２法でインスリン自己抗体を別個に測定する方法。
（９）１型糖尿病およびＳＰＩＤＤＭの初期患者を評価するために、インスリン自己抗体が検出できるように試剤が添加されている、上記（１）〜（３）のいずれかのＧＡＤ抗体測定方法。
本発明の改良ＩＣＴ−ＥＩＡ法（ＩＣＴ−ＥＩＡ−１法およびＩＣＴ−ＥＩＡ−２法）で測定できる血清中のＧＡＤ抗体濃度は、これまでのＥＬＩＳＡ法より３３倍高感度であった。更に，ＧＡＤ抗体と反応するＧＡＤ標識体の親和性をより高めることにより、１０倍程度の高感度化ができるため、これまでのＥＬＩＳＡ法と比較して数百倍の高感度化が可能となる。これにより、本発明のＧＡＤ抗体測定方法により、１型糖尿病やＳＰＩＤＤＭに関する発症を早期に検出し、適切な生活指導や治療を行うことができるようになった。
更に、インスリン自己抗体を別個に測定することにより、精度の高い１型糖尿病やＳＰＩＤＤＭの診断が可能になる。また、操作の簡便性のために、本発明のＧＡＤ抗体測定キットの中に、インスリン自己抗体の検出試剤を添加して置くことによって、同時に２種の抗体の合計を測定できるようになる。このことにより、患者の病態や病態の進捗状況により、それぞれの抗体の陽性率に差が生まれ、発症を見落とすことを回避できる。即ち、本発明の改良ＩＣＴ−ＥＩＡ法により、１型糖尿病およびＳＰＩＤＤＭの診断確度を更に高めることができるようになる。
更に、インスリン自己抗体を別個に測定することにより、精度の高い１型糖尿病やＳＰＩＤＤＭの診断が可能になる。また、操作の簡便性のために、本発明のＧＡＤ抗体測定キットの中に、インスリン自己抗体の検出試剤を添加して置くことによって、同時に２種の抗体の合計を測定できるようになる。このことにより、患者の病態や病態の進捗状況により、それぞれの抗体の陽性率に差が生まれ、発症を見落とすことを回避できる。即ち、本発明の改良ＩＣＴ−ＥＩＡ法により、１型糖尿病およびＳＰＩＤＤＭの診断確度を更に高めることができるようになる。
図１は、本発明で使用した２点結合免疫複合体転移酵素免疫測定法（ＩＣＴ−ＥＩＡ−１法およびＩＣＴ−ＥＩＡ−２法）の手順を表した図である。
図２は、ＧＡＤ抗体に対する各ＩＣＴ−ＥＩＡ法および市販されているＥＬＩＳＡ ｋｉｔの検出感度の比較を表わした図である。健常者の血清で希釈した１型糖尿病患者血清をＩＣＴ−ＥＩＡ−１法およびＩＣＴ−ＥＩＡ−２法、市販されているＥＬＩＳＡ ｋｉｔを用いて測定し、ＧＡＤ抗体の検出感度を比較した。○はＩＣＴ−ＥＩＡ−１法、●はＩＣＴ−ＥＩＡ−２法、◇はＥＬＩＳＡ ｋｉｔによる測定を表している。
図３は、ＩＣＴ−ＥＩＡ−１法による被験者の血清中のＧＡＤ抗体レベルの測定結果を表わした図である。各対象者血清中のＧＡＤ抗体をＩＣＴ−ＥＩＡ−１法で測定した。点線はカットオフ値（蛍光強度；１．８）、ｎ．ｄは未検出を表している。●は非糖尿病対象者、◆はインスリン未治療の２型糖尿病患者、◇はインスリン治療中の２型糖尿病患者、◆はインスリン治療不明の２型糖尿病患者、□はインスリン治療中の１型糖尿病患者、■はインスリン治療不明の１型糖尿病患者を表している。黒色のマーカーは、過剰のＧＡＤ添加により、阻害された血清を表している。
図４は、ＩＣＴ−ＥＩＡ−２法による被験者の血清中のＧＡＤ抗体レベルの測定結果を表わした図である。各対象者血清中のＧＡＤ抗体をＩＣＴ−ＥＩＡ−２法で測定した。点線はカットオフ値（蛍光強度；８．１）、ｎ．ｄは未検出を表している。●は非糖尿病対象者、◆はインスリン未治療の２型糖尿病患者、◇はインスリン治療中の２型糖尿病患者、◆はインスリン治療不明の２型糖尿病患者、□はインスリン治療中の１型糖尿病患者、■はインスリン治療不明の１型糖尿病患者を表している。黒色のマーカーは、過剰のＧＡＤ添加により、阻害された血清を表している。
図５は、糖尿病患者におけるＧＡＤ抗体に対するＥＬＩＳＡ法およびＩＣＴ−ＥＩＡ−１法の相関性を表わした図である。
図６は、糖尿病患者におけるＧＡＤ抗体に対するＥＬＩＳＡ法およびＩＣＴ−ＥＩＡ−２法の相関性を表わした図である。
図７は、ＩＣＴ−ＥＩＡ−２法およびＥＬＩＳＡキットによるインスリン自己抗体およびＧＡＤ抗体の陽性率をまとめた図である。ＩＣＴ−ＥＩＡ−２法を使用して評価した場合、２型糖尿病患者ではインスリン自己抗体およびＧＡＤ抗体を共に有していたのは、１７％（５名）、１型糖尿病患者ではインスリン自己抗体およびＧＡＤ抗体をともに有していたのは、５２％（１１名）であった。また、ＥＬＩＳＡキットを使用した場合、２型糖尿病患者ではインスリン自己抗体およびＧＡＤ抗体をともに有していたのは、７％（２名）、１型糖尿病患者ではインスリン自己抗体およびＧＡＤ抗体をともに有していたのは、１３％（３名）であった。特に、２型糖尿病と診断された患者の５名からインスリン自己抗体およびＧＡＤ抗体を検出されたことから、これらの患者はＳＰＩＤＤＭであると思われた。
図８は、インスリン自己抗体およびＧＡＤ抗体に対するＩＣＴ−ＥＩＡ−２法の同時検出の操作手順を表わした図である。即ち、本発明の同時検出法では、インスリン自己抗体およびＧＡＤ抗体の各標識体を１つに合わせた検出系を用いることにより、１回の測定で各自己抗体の合計のシグナルを検出することができる。また、２種の各自己抗体の蛍光強度が合わさることで、各自己抗体の有無により、陽性者と陰性者の間で蛍光強度の差が大きく開くので、これらの自己抗体陽性患者の早期の検出が容易である。従って、陽性血清の場合には、更に個々の自己抗体の検査を行い、自己抗体の種類を同定し、解析を行い、同定できるので、より一層１型糖尿病およびＳＰＩＤＤＭを正確に発症予知または診断することができる。
図９は、ＩＣＴ−ＥＩＡ−２法およびＩＣＴ−ＥＩＡ−１法、ＥＬＩＳＡキットによるインスリン自己抗体の検出感度の比較を表わした図である。健常者のインスリン除去血清で希釈した１型糖尿病患者の血清をＩＣＴ−ＥＩＡ法とＥＬＩＳＡキットを用いて測定し、検出感度を比較した。●はＩＣＴ−ＥＩＡ−２法、○はＩＣＴ−ＥＩＡ−１法、◇はＥＬＩＳＡキットによる測定を表している。なお、上図は、全てのシグナルを、下図は特異シグナルとして表した。
図２は、ＧＡＤ抗体に対する各ＩＣＴ−ＥＩＡ法および市販されているＥＬＩＳＡ ｋｉｔの検出感度の比較を表わした図である。健常者の血清で希釈した１型糖尿病患者血清をＩＣＴ−ＥＩＡ−１法およびＩＣＴ−ＥＩＡ−２法、市販されているＥＬＩＳＡ ｋｉｔを用いて測定し、ＧＡＤ抗体の検出感度を比較した。○はＩＣＴ−ＥＩＡ−１法、●はＩＣＴ−ＥＩＡ−２法、◇はＥＬＩＳＡ ｋｉｔによる測定を表している。
図３は、ＩＣＴ−ＥＩＡ−１法による被験者の血清中のＧＡＤ抗体レベルの測定結果を表わした図である。各対象者血清中のＧＡＤ抗体をＩＣＴ−ＥＩＡ−１法で測定した。点線はカットオフ値（蛍光強度；１．８）、ｎ．ｄは未検出を表している。●は非糖尿病対象者、◆はインスリン未治療の２型糖尿病患者、◇はインスリン治療中の２型糖尿病患者、◆はインスリン治療不明の２型糖尿病患者、□はインスリン治療中の１型糖尿病患者、■はインスリン治療不明の１型糖尿病患者を表している。黒色のマーカーは、過剰のＧＡＤ添加により、阻害された血清を表している。
図４は、ＩＣＴ−ＥＩＡ−２法による被験者の血清中のＧＡＤ抗体レベルの測定結果を表わした図である。各対象者血清中のＧＡＤ抗体をＩＣＴ−ＥＩＡ−２法で測定した。点線はカットオフ値（蛍光強度；８．１）、ｎ．ｄは未検出を表している。●は非糖尿病対象者、◆はインスリン未治療の２型糖尿病患者、◇はインスリン治療中の２型糖尿病患者、◆はインスリン治療不明の２型糖尿病患者、□はインスリン治療中の１型糖尿病患者、■はインスリン治療不明の１型糖尿病患者を表している。黒色のマーカーは、過剰のＧＡＤ添加により、阻害された血清を表している。
図５は、糖尿病患者におけるＧＡＤ抗体に対するＥＬＩＳＡ法およびＩＣＴ−ＥＩＡ−１法の相関性を表わした図である。
図６は、糖尿病患者におけるＧＡＤ抗体に対するＥＬＩＳＡ法およびＩＣＴ−ＥＩＡ−２法の相関性を表わした図である。
図７は、ＩＣＴ−ＥＩＡ−２法およびＥＬＩＳＡキットによるインスリン自己抗体およびＧＡＤ抗体の陽性率をまとめた図である。ＩＣＴ−ＥＩＡ−２法を使用して評価した場合、２型糖尿病患者ではインスリン自己抗体およびＧＡＤ抗体を共に有していたのは、１７％（５名）、１型糖尿病患者ではインスリン自己抗体およびＧＡＤ抗体をともに有していたのは、５２％（１１名）であった。また、ＥＬＩＳＡキットを使用した場合、２型糖尿病患者ではインスリン自己抗体およびＧＡＤ抗体をともに有していたのは、７％（２名）、１型糖尿病患者ではインスリン自己抗体およびＧＡＤ抗体をともに有していたのは、１３％（３名）であった。特に、２型糖尿病と診断された患者の５名からインスリン自己抗体およびＧＡＤ抗体を検出されたことから、これらの患者はＳＰＩＤＤＭであると思われた。
図８は、インスリン自己抗体およびＧＡＤ抗体に対するＩＣＴ−ＥＩＡ−２法の同時検出の操作手順を表わした図である。即ち、本発明の同時検出法では、インスリン自己抗体およびＧＡＤ抗体の各標識体を１つに合わせた検出系を用いることにより、１回の測定で各自己抗体の合計のシグナルを検出することができる。また、２種の各自己抗体の蛍光強度が合わさることで、各自己抗体の有無により、陽性者と陰性者の間で蛍光強度の差が大きく開くので、これらの自己抗体陽性患者の早期の検出が容易である。従って、陽性血清の場合には、更に個々の自己抗体の検査を行い、自己抗体の種類を同定し、解析を行い、同定できるので、より一層１型糖尿病およびＳＰＩＤＤＭを正確に発症予知または診断することができる。
図９は、ＩＣＴ−ＥＩＡ−２法およびＩＣＴ−ＥＩＡ−１法、ＥＬＩＳＡキットによるインスリン自己抗体の検出感度の比較を表わした図である。健常者のインスリン除去血清で希釈した１型糖尿病患者の血清をＩＣＴ−ＥＩＡ法とＥＬＩＳＡキットを用いて測定し、検出感度を比較した。●はＩＣＴ−ＥＩＡ−２法、○はＩＣＴ−ＥＩＡ−１法、◇はＥＬＩＳＡキットによる測定を表している。なお、上図は、全てのシグナルを、下図は特異シグナルとして表した。
本発明の「免疫複合体転移酵素免疫測定方法（ＩＣＴ−ＥＩＡ法）」とは、非競合法（サンドイッチ）エンザイムイムノアッセイ法（ＥＩＡ）の高感度化した改良方法に関するものである（非特許文献１参照）。図１に示すように、ＩＣＴ−ＥＩＡ法では、使用する抗体の非特異吸着（バックグランド）を下げることができたので、多くの高分子生理活性物質のａｍｏｌレベル以下（ｚｍｏｌ）の測定が可能となっている（Ｈａｓｈｉｄａ Ｓ，ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｖｏｌｕｍｅ １，（１９９５） ｐｐ４０３−４５１，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｂ．Ｖ．， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ参照）。
本発明の「ＧＡＤ抗体」とは、グルタミン酸脱炭酸酵素（ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ：ＧＡＤ）に対する自己抗体である。ＧＡＤはＬ−グルタミン酸からγ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）を合成する酵素であり、脳や膵島β細胞に多く発現している。膵島β細胞におけるＧＡＢＡの役割はインスリンの合成や分泌の調整を担っていると考えられている。ＧＡＤ抗体は１型糖尿病を発症する数年前に出現しており、ＧＡＤ抗体の発症予知率は６０％以上と高い（Ｋａｗａｓａｋｉ Ｅ， Ｇｉｌｌ ＲＧ， Ｅｉｓｅｎｂａｒｔｈ ＧＳ： Ｔｙｐｅ １ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ． ｉｎ： Ｇ．Ｓ． Ｅｉｓｅｎｂａｒｔｈ （Ｅｄ．） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ．， Ｒ．Ｇ． Ｌａｎｄｅｓ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ａｕｓｔｉｎ， Ｔｅｘａｓ， １４９−１８２， １９９９）。また１型糖尿病発症時の陽性率は７０〜８０％である（春日明、丸山太郎、小澤ゆか子他：日本人糖尿病患者におけるＧＡＤ６５抗体の検討−新規測定法， ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙを用いて−、糖尿病３９巻７号：４９７−５０２、１９９６）。一方、ＳＰＩＤＤＭでは陽性率がほぼ１００％である。そのため、ＳＰＩＤＤＭの検出において、ＧＡＤ抗体の測定は重要となっている（川崎英二、江口勝美：抗ＧＡＤ抗体、日本臨牀、６６巻増刊号４、２９５−３００、２００８）。
本発明の「酵素」とは、蛍光による濃度測定を行うため、基質の分解物が蛍光を出すようなせる酵素であれは、特に限定されることはないが、例えば、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ホース・ラデイッシュ・ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼを挙げることができる。
本発明の「インスリン自己抗体」とは、インスリンに対する抗体であり、膵β細胞に特異的な抗体である。インスリン自己抗体は、１型糖尿病発症予知マーカーとして有用であり、インスリン自己抗体が陽性ならば、将来インスリン依存性糖尿病に移行する可能性があると考えられている。例えば、インスリン自己抗体の陽性率は発症年齢で異なり、小児発症の１型糖尿病では約７０％を示している。
本発明の「糖尿病の進行状況を評価する方法」とは、血清中のＧＡＤ抗体の濃度やインスリン自己抗体の濃度を測定することにより、被験者の糖尿病性疾患の進行状況を的確に評価する方法である。この評価方法により、被験者の糖尿病性疾患の進行を抑制し改善するための治療剤の投与や生活指導等の介入療法が的確に行なえるようになる。例えば、ＧＡＤ抗体の場合、血清中のＧＡＤ抗体の濃度が０．１Ｕ／ｍｌ以上であれば、糖尿病初期であると診断して、介入療法を開始し、糖尿病の進行を抑制・改善することを行う。
本発明の「介入療法」とは、プロトコールに基づく生活習慣（食事・身体活動中心）の改善またはインスリン療法を言う。即ち、食事療法や運動療法を生活習慣の中に取り入れ、必要カロリーと消費カロリーのコントロールを行なうものであり、精神的なストレスを軽減するよう指導して、糖尿病の発症にかかわる要因を削除軽減することを行なう。更には、初期症状のＳＰＩＤＤＭ患者に対しては、出来るだけ早期にインスリン療法を行なうことを介入療法として含むものである。上記の糖尿病性疾患の進行度評価方法を用いて、早期の介入療法を開始することにより、インスリン分泌能の低下を抑制、回避し、症状を改善することができる。
本発明の「ＧＡＤ抗体」とは、グルタミン酸脱炭酸酵素（ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ：ＧＡＤ）に対する自己抗体である。ＧＡＤはＬ−グルタミン酸からγ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）を合成する酵素であり、脳や膵島β細胞に多く発現している。膵島β細胞におけるＧＡＢＡの役割はインスリンの合成や分泌の調整を担っていると考えられている。ＧＡＤ抗体は１型糖尿病を発症する数年前に出現しており、ＧＡＤ抗体の発症予知率は６０％以上と高い（Ｋａｗａｓａｋｉ Ｅ， Ｇｉｌｌ ＲＧ， Ｅｉｓｅｎｂａｒｔｈ ＧＳ： Ｔｙｐｅ １ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ． ｉｎ： Ｇ．Ｓ． Ｅｉｓｅｎｂａｒｔｈ （Ｅｄ．） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ．， Ｒ．Ｇ． Ｌａｎｄｅｓ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ａｕｓｔｉｎ， Ｔｅｘａｓ， １４９−１８２， １９９９）。また１型糖尿病発症時の陽性率は７０〜８０％である（春日明、丸山太郎、小澤ゆか子他：日本人糖尿病患者におけるＧＡＤ６５抗体の検討−新規測定法， ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙを用いて−、糖尿病３９巻７号：４９７−５０２、１９９６）。一方、ＳＰＩＤＤＭでは陽性率がほぼ１００％である。そのため、ＳＰＩＤＤＭの検出において、ＧＡＤ抗体の測定は重要となっている（川崎英二、江口勝美：抗ＧＡＤ抗体、日本臨牀、６６巻増刊号４、２９５−３００、２００８）。
本発明の「酵素」とは、蛍光による濃度測定を行うため、基質の分解物が蛍光を出すようなせる酵素であれは、特に限定されることはないが、例えば、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ホース・ラデイッシュ・ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼを挙げることができる。
本発明の「インスリン自己抗体」とは、インスリンに対する抗体であり、膵β細胞に特異的な抗体である。インスリン自己抗体は、１型糖尿病発症予知マーカーとして有用であり、インスリン自己抗体が陽性ならば、将来インスリン依存性糖尿病に移行する可能性があると考えられている。例えば、インスリン自己抗体の陽性率は発症年齢で異なり、小児発症の１型糖尿病では約７０％を示している。
本発明の「糖尿病の進行状況を評価する方法」とは、血清中のＧＡＤ抗体の濃度やインスリン自己抗体の濃度を測定することにより、被験者の糖尿病性疾患の進行状況を的確に評価する方法である。この評価方法により、被験者の糖尿病性疾患の進行を抑制し改善するための治療剤の投与や生活指導等の介入療法が的確に行なえるようになる。例えば、ＧＡＤ抗体の場合、血清中のＧＡＤ抗体の濃度が０．１Ｕ／ｍｌ以上であれば、糖尿病初期であると診断して、介入療法を開始し、糖尿病の進行を抑制・改善することを行う。
本発明の「介入療法」とは、プロトコールに基づく生活習慣（食事・身体活動中心）の改善またはインスリン療法を言う。即ち、食事療法や運動療法を生活習慣の中に取り入れ、必要カロリーと消費カロリーのコントロールを行なうものであり、精神的なストレスを軽減するよう指導して、糖尿病の発症にかかわる要因を削除軽減することを行なう。更には、初期症状のＳＰＩＤＤＭ患者に対しては、出来るだけ早期にインスリン療法を行なうことを介入療法として含むものである。上記の糖尿病性疾患の進行度評価方法を用いて、早期の介入療法を開始することにより、インスリン分泌能の低下を抑制、回避し、症状を改善することができる。
次に実施例を挙げて本発明を更に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（実施例１）ＧＡＤ抗体に対するＩＣＴ−ＥＩＡ法
（１）試薬類
ａ）一般試薬：
牛血清アルブミン（ＢＳＡ）は、ナカライテスク（京都）より、ストレプトアビジンは和光純薬工業（大阪）より購入した。この他の一般試薬はナカライテスクおよび和光純薬工業より購入した。
ｂ）抗体：
ウサギ抗２，４−ジニトロフェニル基（ＤＮＰ）−ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）血清は、シバヤギ社（群馬）より購入した。
ｂ）抗原：
リコビナント・ヒト・ＧＡＤ６５は、ＲＳＲ Ｌｉｍｉｔｅｄ （Ｃａｒｄｉｆｆ， ＵＫ）より購入した。
ｃ）緩衝液：
０．１Ｍ ＮａＣｌ， ０．１％ ＢＳＡ， １ｍＭ ＭｇＣｌ２および０．１％ ＮａＮ３を含む０．０１Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ７．０）を緩衝液Ａ、０．４Ｍ ＮａＣｌ， ０．１％ ＢＳＡ， １ｍＭ ＭｇＣｌ２および０．１％ ＮａＮ３を含む０．０１Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ７．０）を緩衝液Ｂ、０．１Ｍ ＮａＣｌ， ０．０１％ ＢＳＡ， １ｍＭ ＭｇＣｌ２および０．１％ ＮａＮ３を含む０．０１Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ７．０）を緩衝液Ｃ、０．１Ｍ ＮａＣｌを含む０．０１Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ７．０）を緩衝液Ｄ、５ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ６．０）を緩衝液Ｅとした。
ｄ）ＥＬＩＳＡキット：
ＧＡＤ抗体のＥＬＩＳＡキットは、ＲＳＲ Ｌｉｍｉｔｅｄ （Ｃａｒｄｉｆｆ， ＵＫ）より購入した。
（２）標識化抗原等
ａ）ＤＮＰ化標識ＧＡＤ，β−Ｄ−ガラクトシダーゼ標識ＧＡＤ：
１）チオール基導入ＧＡＤの調製：
０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ８．５ に溶解されているＧＡＤ溶液０．４ｍｇ ／ ０．４８ｍｌにＤＭＦで溶解した１３ｍＭ ＳＡＴＡ １０μｌを加え、３０℃、３０分間インキュベーションした。インキュベーション後、反応液に４Ｍ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｍｉｎｅ １０μｌを加え、３０℃、５分間インキュベーションした。インキュベーション後、反応液は、緩衝液Ｅにより平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０ （５ｍｌ） カラムによる遠心脱塩法を用い（文献）、過剰の試薬を取り除き、得られたチオール基導入ＧＡＤは、以下の標識に供した。ＧＡＤ１分子当たり４．０分子のチオール基が導入された。
２）マレイミド基導入ＤＮＰの調製：
ＤＮＰ−Ｌｙｓ １．８ｍｇをＤＭＦ ０．１８ｍｌに溶解後、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ７．０）０．７２ｍｌを加え、ＤＭＦに溶解した ４ｍＭ ＥＭＣＳ ０．１ｍｌを加え、３０℃、３０分間インキュベーションし、マレイミド基導入ＤＮＰ−Ｌｙｓを調整した。
３）マレイミド基導入β−Ｄ−ガラクトシダーゼの調製：
β−Ｄ−ガラクトシダーゼ ３ｍｇを緩衝液Ｅ ０．５２ｍｌに溶解し、ＤＭＦに溶解した５０ｍＭ Ｎ，Ｎ’−（ｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅ） ｄｉｍａｌｅｉｍｉｄｅ（ＯＰＤＭ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）２６．３μｌを加え、３０℃、３０分間インキュベーションした。インキュベーション後、反応液は、緩衝液Ｅにより平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０（５ｍｌ）カラムによる遠心脱塩法を用い（文献）、過剰の試薬を取り除き、得られたマレイミド基導入β−Ｄ−ガラクトシダーゼは、以下の標識に供した。β−Ｄ−ガラクトシダーゼ１分子当たり１５．６分子のマレイミド基が導入された。
４）ＤＮＰ化標識ＧＡＤの調整：
マレイミド基を導入したＤＮＰとチオール基を導入したＧＡＤをそれぞれ、１６０μＭと１７μＭになるように混合し、４℃、１７時間インキュベーションした。インキュベーション後、反応液に緩衝液Ｅに溶解した１００ｍＭ ＭＥ １０μｌを加え、３０℃、５分間インキュベーション後、１００ｍＭ ＮＥＭ ２０μｌを加え、３０℃、５分間インキュベーションし、未反応のチオール基およびマレイミド基をブロックした。反応液は０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ７．０）により平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０ （５ｍｌ） カラムによる遠心脱塩法を用い（文献）、過剰の試薬を取り除き、ＤＮＰ化標識抗原コンジュゲート（捕捉用）を得た。
５）β−Ｄ−ガラクトシダーゼ標識ＧＡＤの調整：
マレイミド基を導入したβ−Ｄ−ガラクトシダーゼとチオール基を導入したＧＡＤをそれぞれ、３．４μＭと８．５μＭになるように混合し、４℃、１７時間インキュベーションした。インキュベーション後、反応液に緩衝液Ｅに溶解した１００ｍＭ ＭＥ １０μｌを加え、３０℃、５分間インキュベーション後、１００ｍＭ ＮＥＭ ２０μｌを加え、３０℃、５分間インキュベーションし、未反応のチオール基およびマレイミド基をブロックした。次いで、反応液を緩衝液Ｃにより平衡化したＵｌｔｒｏｇｅｌ ＡｃＡ２２（１．５×４５ｃｍ）に添加し、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ標識抗原コンジュゲート（検出用）を得た。
ｂ）ＤＮＰ化ビオチン化標識ＧＡＤ：
１）チオール基導入ＧＡＤの調製：
０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ８．５ に溶解されているＧＡＤ溶液０．４ｍｇ ／ ０．４８ｍｌにＤＭＦで溶解した１３ｍＭ ＳＡＴＡ １０μｌを加え、３０℃、３０分間インキュベーションした。インキュベーション後、反応液に４Ｍ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｍｉｎｅ １０μｌを加え、３０℃、５分間インキュベーションした。インキュベーション後、反応液は、緩衝液Ｅにより平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０ （５ｍｌ） カラムによる遠心脱塩法を用い（文献）、過剰の試薬を取り除き、得られたチオール基導入ＧＡＤは、以下の標識に供した。ＧＡＤ１分子当たり４．２分子のチオール基が導入された。
２）マレイミド基導入ＤＮＰの調製：
ＤＮＰ−Ｌｙｓ １．０ｍｇをＤＭＦ ０．１ｍｌに溶解後、０．１Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ７．０）０．８ｍｌを加え、ＤＭＦに溶解した０．６ｍＭ ＥＭＣＳ ０．１ｍｌを加え、３０℃、３０分間インキュベーションし、マレイミド基導入ＤＮＰ−Ｌｙｓを調整した。
３）マレイミド基導入ビオチンの調製：
ビオチン−Ｌｙｓ １．０ｍｇに０．１Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ７．０）０．９ｍｌを加え、ＤＭＦに溶解した０．２ｍＭ ＥＭＣＳ ０．１ｍｌを加え、３０℃、３０分間インキュベーションし、マレイミド基導入ビオチン−Ｌｙｓを調整した。
４）ＤＮＰ化ビオチン化標識ＧＡＤの調整：
マレイミド基を導入したＤＮＰとマレイミド基を導入したビオチンを同量の割合で合せ、マレイミド基導入ＤＮＰとマレイミド基導入ビオチンの混合液を作成した。混合液およびチオール基を導入したＧＡＤをそれぞれ、７８μＭと１９μＭになるように混合し、４℃、１７時間インキュベーションした。インキュベーション後、反応液に緩衝液Ｅに溶解した１００ｍＭ ＭＥ １０μｌを加え、３０℃、５分間インキュベーション後、１００ｍＭ ＮＥＭ ２０μｌを加え、３０℃、５分間インキュベーションし、未反応のチオール基およびマレイミド基をブロックした。反応液は透析用セルロースチューブ（三光純薬株式会社 東京）を用い、緩衝液（０．１Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液 ｐＨ ７．０）に対して透析を行い、過剰の試薬を取り除き、ＤＮＰ化ビオチン化標識抗原コンジュゲート（捕捉用）を得た。ＧＡＤ１分子当たり１．３分子のＤＮＰおよび２．９分子のビオチンが導入された。
（３）実験材料等
ａ）固相の調製：
アフィニティー精製した抗ＤＮＰ−ＩｇＧおよび抗ｈｕｍａｎ ＩｇＧ−ＩｇＧは、直径６．４ｍｍのポリスチレンビーズ（イムノケミカル、岡山）と一夜室温で浸漬後、緩衝液Ａで洗浄し、４℃で保存した。ビオチン化ＢＳＡは、直径６．４ｍｍのポリスチレンビーズと一夜室温で浸漬後、０．１Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ７．５）で洗浄し、さらにストレプトアビジン溶液に一夜室温で浸漬後、緩衝液Ａで洗浄し、４℃で保存した。
ｂ）血液サンプル：
血清サンプルは、１２時間絶食後の早朝空腹時に採血し（ＮＩＰＲＯ， ２２Ｇ ホルダー付， 大阪）、室温３０分静置後、遠心分離機（テーブルトップ 冷却遠心機 ２８００ ＫＵＢＯＴＡ， 株式会社久保田製作所， 東京）で３０００ｒｐｍ、１０分遠心し、血清を得た。血清はマイナス２０℃で保存した。
ｃ）デキストラン−チャーコールの調整：
チャーコール（ナカライテスク）１．２ｇを蒸留水で数回洗浄後、蒸留水で１０ｍｌにした。これにデキストラン（Ｓｉｇｍａ）０．３ｇを加えて撹拌した。次に、メチルセルロース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃ）３０ｍｇを緩衝液Ａ １０ｍｌの上に載せ、撹拌せずに４℃で１６時間かけて溶解させた。調製したデキストラン−チャーコール液にメチルセルロース液を同じ割合で混合し、１５分間撹拌してデキストラン−チャーコール（以降ＤＣとする）液とし、４℃で保存した。
ｄ）ＤＣ液による血清処理：
血清５０μｌに緩衝液Ａ １５０μｌを加えて希釈後、さらに０．４Ｍ ＨＣｌを１３．６μｌ加えて酸性化した。１分後、上記のＤＣ液を７２．８μｌ加え、６分間振盪した後、０．４Ｍ ＮａＯＨを１３．６μｌ加えて中和した。中和後１５００×ｇ， １５分間遠心し、上清を取り出して、この上清をさらにもう１回同様に遠心し、完全にＤＣを除いた後、４℃で保存した。
（４）方法
ａ）ＧＡＤ抗体に対するＩＣＴ−ＥＩＡ−１法：
２０倍希釈した血清（１００μｌ）とＤＮＰ化標識ＧＡＤおよびβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ標識ＧＡＤ、１．０μＭ 不活性β−Ｄ−ガラクトシダーゼを緩衝液Ａに溶解した混合液（１００μｌ）を混合し、４℃、１６時間インキュベーションして、酵素標識抗原・ＧＡＤ抗体・補足用標識抗原の３者からなる免疫複合体を形成された。次いで、この反応液にアフィニティー精製抗ＤＮＰ−ＩｇＧ不溶化固相ポリスチレンビーズ１個を加え、０．５時間反応させてビーズ上に免疫複合体を補足した。このビーズを緩衝液Ｃ（２ｍｌ）で２回洗浄後、緩衝液Ａに溶解した２ｍＭ ＤＮＰ−Ｌｙｓ（１５０μｌ）と０．５時間反応させビーズから免疫複合体を溶出させた。抗ＤＮＰ−ＩｇＧ不溶化固相ポリスチレンビーズを除去した後、溶出液にアフィニティー精製抗ｈｕｍａｎ ＩｇＧ−ＩｇＧ不溶化固相ポリスチレンビーズ１個を加え、さらに０．５時間反応させ、第２のビーズ上に免疫複合体を転移させた。ビーズとの反応はすべて２５℃で２１０回／分の振盪下に行った。再びビーズを緩衝液Ｃ（２ｍｌ）で３回洗浄後、ビーズ上に転移させたβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性を０．２ｍＭ ４−Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（蛍光基質； ４ＭＵＧ）（２００μｌ）を用いて３０℃でインキュベーションし、０．１Ｍ グリシンナトリウム緩衝液（ｐＨ １０．５）（２ｍｌ）を加え反応を停止後、蛍光分光光度計（Ｆ−２５００、日立）を用いて測定した。なお、励起波長３６０ｎｍ、蛍光波長４５０ｎｍを用い、蛍光強度は１０−８Ｍ ４ＭＵを１００として換算した。
ｂ）ＧＡＤ抗体に対するＩＣＴ−ＥＩＡ−２法：
２０倍希釈した希釈血清（１００μｌ）にＤＮＰ標識ＧＡＤとビオチン標識ＧＡＤ、１．０μＭ 不活性β−Ｄ−ガラクトシダーゼを緩衝液Ｂに溶解した混合液（１００μｌ）を加えて混合し、４℃、１６時間インキュベーションして、ＤＮＰ標識抗原・自己抗体・Ｂｉｏｃｙｔｉｎ標識抗原の３者からなる免疫複合体を形成した。次いで、この反応液にアフィニティー精製抗ＤＮＰ−ＩｇＧ不溶化ポリスチレンビーズ１個を加え、０．５時間反応させてビーズ上に免疫複合体を補足した。その後、溶液のみを吸い出し、そこにストレプトアビジン標識酵素を１００μｌ添加し、さらに０．５時間反応させてビオチン標識ＧＡＤとストレプトアビジン標識酵素を結合させた。このビーズを緩衝液Ｃ（２ｍｌ）で２回洗浄後、緩衝液Ａに溶解した２ｍＭ ＤＮＰ−Ｌｙｓ（１５０μｌ）と０．５時間反応させビーズから免疫複合体を溶出させた。抗ＤＮＰ−ＩｇＧ不溶化固相ポリスチレンビーズを除去した後、溶出液にアフィニティー精製抗ｈｕｍａｎ ＩｇＧ−ＩｇＧ不溶化固相ポリスチレンビーズ１個を加え、さらに０．５時間反応させ、第２のビーズ上に免疫複合体を転移させた。ビーズとの反応は、すべて２５℃で２１０回／分の振盪下に行った。再びビーズを緩衝液Ｃ（２ｍｌ）で３回洗浄後、ビーズ上に転移させたβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性を０．２ｍＭ ４−Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（蛍光基質； ４ＭＵＧ）（２００μｌ）を用いて３０℃でインキュベーションし、０．１Ｍ グリシンナトリウム緩衝液（ｐＨ １０．５）（２ｍｌ）を加え反応を停止後、蛍光分光光度計（Ｆ−２５００、日立）を用いて測定した。なお、励起波長３６０ｎｍ、蛍光波長４５０ｎｍを用い、蛍光強度は１０−８Ｍ ４ＭＵを１００として換算した。
（実施例２）ＩＣＴ−ＥＩＡ−１法およびＩＣＴ−ＥＩＡ−２法、ＥＬＩＳＡ法の検出感度の比較
（１）対象者等
ａ）対象者：
非糖尿病対象者（７３名）、高インスリン血症患者（９名）、抗甲状腺剤（メチマゾール）投与中のバセドウ病患者（３０名）、橋本病（２０名）、２型糖尿病患者（３０名； インスリン未治療： ７名、インスリン治療中： １５名、インスリン治療不明： ８名）、１型糖尿病患者（２４名； インスリン治療中： ２１名、インスリン治療不明： ３名）から試料を採取した。
ｂ）インフォームドコンセント：
本研究で行った試験については、徳島文理大学倫理委員会（承認番号 第４号）の承認を得て行った。対象者にはインフォームドコンセントを行い、同意を得た上で試験を実施した。
ｃ）統計処理
カットオフ値の設定は、非糖尿病対象者の蛍光強度の平均値＋２ＳＤとした。また、２変量間の相関関係については、Ｓｐｅａｍａｎの順位相関係数を算出した。統計解析には、ＳＰＳＳ２０．０．０を用い、統計学的有意水準を５％に設定した。
（２）血清使用量の検討
ＩＣＴ−ＥＩＡ−１法およびＩＣＴ−ＥＩＡ−２法の血清使用量を１型糖尿病患者血清を用いて検討を行った。１型糖尿病患者血清の希釈には、健常者の血清を用いた。
ＩＣＴ−ＥＩＡ−１法は健常者血清１００μｌ中に１型糖尿病患者血清をそれぞれ１０μｌ、２０μｌ、３０μｌ、５０μｌ含まれているように調製した。その結果、ＩＣＴ−ＥＩＡ−１法は２０μｌまでは比例的に蛍光強度の増加がみられたが、２０μｌ以降で蛍光強度の大きな増加が見られなかった。また、２０μｌまで蛍光強度の上昇は確認できたが、１０μｌの蛍光強度と比べて１．３倍しか差は見られなかった。このことから、ＩＣＴ−ＥＩＡ−１法による血清の最大使用量を１０μｌとした。ただし、本試験では各対象者の血清の残量が少ないことから、各対象者のＧＡＤ抗体の測定には使用血清量を５μｌとすることにした。
ＩＣＴ−ＥＩＡ−２法は健常者血清１００μｌ中に１型糖尿病患者血清をそれぞれ１μｌ、２μｌ、５μｌ、１０μｌ、２０μｌ、３０μｌ、４０μｌ、５０μｌ含まれているように調製した。その結果、ＩＣＴ−ＥＩＡ−２法は５μｌまでは蛍光強度の増加がみられたが、５μｌ以降で蛍光強度の減少傾向が見られた。このことから、ＩＣＴ−ＥＩＡ−２法による血清の最大使用量を５μｌとした。
（３）本願発明方法とＥＬＩＳＡ法との検出感度比較
ＩＣＴ−ＥＩＡ−１法およびＩＣＴ−ＥＩＡ−２法、第１世代ＥＬＩＳＡ法、第２世代ＥＬＩＳＡ法、第３世代ＥＬＩＳＡ法、第３世代改良型ＥＬＩＳＡ法、ＥＬＩＳＡ ｋｉｔの他にＩＣＴ−ＥＩＡ−３法（ＤＮＰ−ビオチン標識ＧＡＤおよびＧＡＤ抗体、酵素標識ＧＡＤの３者から免疫複合体を形成させる）によるＧＡＤ抗体の検出感度についてＧＡＤ抗体陽性糖尿病血清を用いて比較した。なお、ＧＡＤ抗体陽性糖尿病血清の希釈には、健常者の血清を用いた。
なお、第１世代ＥＬＩＳＡ法、第２世代ＥＬＩＳＡ法、第３世代ＥＬＩＳＡ法とは、以下のことを言う。第１世代のＥＬＩＳＡ法とは、固相に不溶化させた抗原により血清中の測定すべき特異抗体を捕捉し、次いでこの特異抗体に酵素標識した抗イムノグロブリン抗体（第２抗体）を反応させて標識し、最後に酵素活性を測定する方法である。しかし、血清中の多量に存在する非特異抗体が固相に非特異的に吸着し、この非特異抗体と酵素標識第２抗体が結合し、この酵素の酵素活性も一緒に測定してしまうことから、バックグラウンドが高くなり、微量の特異抗体を測定することが困難となる。そこで、この第１世代の欠点を補うべく第２世代のＥＬＩＳＡ法が開発されている。
第２世代のＥＬＩＳＡ法とは、固相に不溶化させた第２抗体により、まず血清中の測定すべき特異抗体も含めた総イムノグロブリンを捕捉する。次いでこの捕捉された総抗体中の特異抗体に酵素標識抗原を反応させ、最後に、酵素活性を測定する方法である。しかし、この方法でも、酵素標識抗原が固相に吸着することから、バックグラウンドが高いままであった。また、固相に不溶化させた第２抗体は、測定すべき特異抗体以外の非特異抗体をも捕捉してしまうことから、固相上の第２抗体量に限界があり、血清試料を少量しか使用することができない。そこで、さらに第３世代のＥＬＩＳＡ法が開発されている。
第３世代のＥＬＩＳＡ法とは、固相に不溶化させた抗原により、まず血清中の測定すべき特異抗体を捕捉し、次いでこの捕捉された特異抗体に酵素標識抗原を反応させ、最後に、酵素活性を測定する方法である。しかし、この方法においても第２世代より検出感度は向上されたが、まだバックグランドが高い状態であった。また、この方法では全てのサブクラスの抗体や抗体以外の抗原結合物質も検出してしまうため、自己抗体であるかの判断が困難である。
今回、第１世代ＥＬＩＳＡ法および第２世代ＥＬＩＳＡ法を用いた場合では、ＧＡＤ抗体を検出することはできなかった。第３世代ＥＬＩＳＡ法および第３世代改良型ＥＬＩＳＡ法による検出感度は、１０Ｕ／ｍｌおよび１００Ｕ／ｍｌであり、第３世代改良型ＥＬＩＳＡ法の方が第３世代ＥＬＩＳＡ法より１０倍高感度であった。
第３世代改良型ＥＬＩＳＡ法およびＥＬＩＳＡ ｋｉｔの検出感度では、ともに１０Ｕ／ｍｌであったが、第３世代改良型ＥＬＩＳＡ法のＮｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃの蛍光強度が高いものであった。
一方、ＩＣＴ−ＥＩＡ−１法およびＩＣＴ−ＥＩＡ−２法による検出感度は、ともに０．３Ｕ／ｍｌであり、ＥＬＩＳＡ ｋｉｔに比べ、３０倍高感度であった（図２参照）。また、ＩＣＴ−ＥＩＡ−１法およびＩＣＴ−ＥＩＡ−２法を比較したところ、検出感度は同じではあったが、蛍光強度のＳｐｅｃｉｆｉｃ ／ Ｎｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃ比（Ｓ／Ｎ比）では、ＩＣＴ−ＥＩＡ−１法が高く、蛍光強度値においてもＧＡＤ抗体の高濃度領域ではＩＣＴ−ＥＩＡ−１法が高い値を示した。
（実施例３）ＩＣＴ−ＥＩＡ−１法およびＩＣＴ−ＥＩＡ−２法の特異性検討
（１）十分な阻害効果を得る為のＧＡＤ添加量の検討
ＩＣＴ−ＥＩＡ−１法およびＩＣＴ−ＥＩＡ−２法の特異性を検討するため、高濃度のＧＡＤ溶液の添加を行うが、ＧＡＤは非常に高価で貴重なため、ＧＡＤ溶液の添加量の検討を行った。
ＩＣＴ−ＥＩＡ−１法を用いてＧＡＤの添加量をそれぞれ０．１、０．３、１．０、３．０ｐｍｏｌ／ｔｕｂｅになるように添加した。その結果、３．０ｐｍｏｌ／ｔｕｂｅで８０％以上の阻害が確認された。このことから、以降の特異性試験において、ＧＡＤ溶液の添加量は３．０ｐｍｏｌ／ｔｕｂｅになるように添加することとした。
（２）ＩＣＴ−ＥＩＡ−１法およびＩＣＴ−ＥＩＡ−２法の特異性検討
ＩＣＴ−ＥＩＡ−１法およびＩＣＴ−ＥＩＡ−２法の特異性を１型糖尿病患者血清と同じく自己免疫疾患であるバセドウ病ならびに橋本病患者血清を用いて検討した。その結果を以下の表１に示す。
上記表１に示されるように、１型糖尿病患者血清は、過剰のＧＡＤ添加により、ＩＣＴ−ＥＩＡ−１法およびＩＣＴ−ＥＩＡ−２法共に蛍光強度が９９％以上の低下が見られた。一方、バセドウ病患者血清では、ＩＣＴ−ＥＩＡ−１法およびＩＣＴ−ＥＩＡ−２法共に蛍光強度の低下がほとんど見られなかった。このことから、ＩＣＴ−ＥＩＡ−１法およびＩＣＴ−ＥＩＡ−２法は本法によりＧＡＤ抗体が特異的に測定されていることが示された。
（実施例４）ＩＣＴ−ＥＩＡ−１法およびＩＣＴ−ＥＩＡ−２法の再現性
５０、１００倍に希釈した１型糖尿病患者血清を用いてＩＣＴ−ＥＩＡ−１法の同時再現性を検討した。その結果を以下の表２に示す。
上記表２に示すように、同時再現性は４．８〜５．４％（ｎ＝１０）と良好であった。
また、同じく５０、１００倍に希釈した１型糖尿病患者血清を用いてＩＣＴ−ＥＩＡ−２法の同時再現性を検討した。その結果も上記表２に示されるごとく、同時再現性は４．８〜５．２％（ｎ＝１０）と良好であった。
（実施例５）ＩＣＴ−ＥＩＡ法によるＧＡＤ抗体の検出評価
（１）ＩＣＴ−ＥＩＡ−１法によるＧＡＤ抗体の検出
非糖尿病対象者（３２名）、２型糖尿病患者（３０名）、１型糖尿病患者（２３名）の血清をＩＣＴ−ＥＩＡ−１法を用い測定した（図３を参照）。カットオフ値を蛍光強度１．８とした。
その結果、カットオフ値を越える蛍光強度を示したのは、非糖尿病対象者では１／３３名であった。２型糖尿病患者では３／２９名であった。一方、１型糖尿病患者では１１／２２名であった。
カットオフ値を越えた対象者に対して上記実施例２（１）と同様の手法により、陽性の確認を行った。なお、血清に過剰量のＧＡＤを添加し、蛍光強度が５０％以上阻害されたものを陽性と判断した。ただし、阻害率が５０％以上でなくとも、蛍光強度がカットオフ値の３倍以上で、阻害率が５０％に近ければ、それも陽性と判断することにした。その結果、２型糖尿病患者の４名中３名は４８〜１００％、１型糖尿病患者の１３名中１３名は４０〜１００％阻害された。また、非糖尿病対象者の１名は阻害されなかった。その結果、カットオフ値を越えた対象者の中で非糖尿病対象者および２型糖尿病患者の１部を除くほとんどの対象者が陽性であることが示された。その結果を表３に示す。
また、対象者血清に高濃度ＧＡＤを添加していないときの蛍光強度から高濃度ＧＡＤを添加したときの蛍光強度を減じ、特異ＧＡＤ抗体値（以降、特異シグナルとする）として表すこととした。この際のカットオフ値を０．７とした。
その結果、カットオフ値を越える蛍光強度を示したのは、非糖尿病対象者では０／３２名、２型糖尿病患者では９／３０名であった。一方、１型糖尿病患者では１７／２３名であった。
（２）ＩＣＴ−ＥＩＡ−２法によるＧＡＤ抗体の検出
非糖尿病対象者（３４名）、２型糖尿病患者（２９名）、１型糖尿病患者（２２名）の血清をＩＣＴ−ＥＩＡ−２法を用い測定した（図４参照）。カットオフ値を蛍光強度８．１とした。
その結果、カットオフ値を越える蛍光強度を示したのは、非糖尿病対象者では３／３４名であった。２型糖尿病患者では１／２９名であった。一方、１型糖尿病患者では１０／２２名であった。
カットオフ値を越えた対象者に対して実施例２（１）と同様の手法により、陽性の確認を行った。なお、判定はＩＣＴ−ＥＩＡ−１法と同様の基準で行った。その結果、２型糖尿病患者の１名は９４％、１型糖尿病患者の１０名は８８〜１００％阻害された。また、非糖尿病対象者の３名はほとんど阻害されなかった。その結果、カットオフ値を越えた対象者の中で非糖尿病対象者を除くほとんどの対象者が陽性であることが示された（表３参照）。
また、上記（１）と同じく特異シグナルを求めた。カットオフ値を蛍光強度０．４とした。
その結果、カットオフ値を越える蛍光強度を示したのは、非糖尿病対象者では０／３４名であった。２型糖尿病患者では２３／２９名であった。一方、１型糖尿病患者では１７／２２名であった。
（実施例５）ＥＬＩＳＡ法およびＩＣＴ−ＥＩＡ−１法またはＩＣＴ−ＥＩＡ−２法の相関関係
１型糖尿病患者および２型糖尿病患者の結果からＥＬＩＳＡ法およびＩＣＴ−ＥＩＡ−１法またはＩＣＴ−ＥＩＡ−２法との間で相関関係を検討した。ＩＣＴ−ＥＩＡ法では特異シグナルを用い、特異シグナルが未検出であったものは、ＩＣＴ−ＥＩＡ法およびＥＬＩＳＡ法ともに除外して相関関係の検討を行った。その結果、ＥＬＩＳＡ法およびＩＣＴ−ＥＩＡ−１法との間で有意な相関関係（ｒ＝０．５５５、ｐ＜０．０００）がみられた（図５参照）。また、ＩＣＴ−ＥＩＡ−１法およびＥＬＩＳＡ法ともに陽性であった患者のみで相関関係を検討した結果、さらに有意な相関関係（ｒ＝０．７９４、ｐ＜０．０００）がみられた。
ＥＬＩＳＡ法およびＩＣＴ−ＥＩＡ−２法との間でも有意な相関関係（ｒ＝０．４９４、ｐ＜０．００１）がみられた（図６参照）。また、ＩＣＴ−ＥＩＡ−２法およびＥＬＩＳＡ法ともに陽性であった患者のみで相関関係を検討した結果、さらに有意な相関関係（ｒ＝０．７８６、ｐ＜０．０００）がみられた。
ＥＬＩＳＡ法では１型糖尿病患者（２２名）と２型糖尿病患者（２９名）の中から計３１名の陽性者を検出したが、ＥＩＣＴ−ＥＩＡ−１法では、ＥＬＩＳＡ法で陰性とされていた中から８名の陽性者を検出し、ＩＣＴ−ＥＩＡ−２法では、１６名の陽性者を検出することができた。その結果を以下の表４に示す。
（参考例１）ＥＬＩＳＡ法によるＧＡＤ抗体の検出
非糖尿病対象者（３４名）、２型糖尿病患者（２９名）、１型糖尿病患者（２２名）の血清をＥＬＩＳＡキットで測定した。カットオフ値を吸光度０．１０とした。その結果、カットオフ値を越える吸光度を示したのは、非糖尿病対象者では１／３４名であった。２型糖尿病患者では１４／２９名であった。一方、１型糖尿病患者では１７／２２名であった（表３参照）。
（実施例６）ＩＣＴ−ＥＩＡ−２法によるインスリン自己抗体の検出感度
（１）検討サンプル：
インスリン自己抗体陽性者の血清を用いて比較した。
（２）検出方法：
公知文献（Ｃｌｉ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１２，４５（１３−１４）：１０８６−９１）に記載の方法に準じて、上記のインスリン自己抗体を測定した。
上記文献方法は、ＩＣＴ−ＥＩＡ−１法の問題点であったインスリン標識体と抗体との立体障害を減じるために、インスリンを低分子ＤＮＰやビオチンで標識し、次にこれらの標識体と抗体を反応させて免疫複合体を形成させておくことに特徴がある。
健常者のインスリン除去血清で希釈したインスリン自己抗体陽性者（１型糖尿病患者）の血清を上記文献方法とＥＬＩＳＡキットを用いて測定し、検出感度を比較した。
（３）検出感度：
図９に示されるように、ＥＬＩＳＡキットに対してＩＣＴ−ＥＩＡ−２法は、インスリン自己応対を１，０００倍高感度に検出することができた。また、ＩＣＴ−ＥＩＡ−１法と比較すると１０倍高感度であった。
（実施例７）インスリン自己抗体およびＧＡＤ抗体に対するＩＣＴ−ＥＩＡ−２法の同時検出方法
本同時検出法では、図８に示されるように、インスリン自己抗体およびＧＡＤ抗体用の各標識体を１つに合わせた検出系を使用する。本検出方法で使用されるＩＣＴ−ＥＩＡ−２法は、その特徴の１つでもあるが、標識抗原を換えれば、同じ固相および同じ操作で種々の抗体が検出できる。そこで、インスリン自己抗体およびＧＡＤ抗体用の２種の各標識抗原等の使用試剤を一つにして使用することにより、１回の測定で各自己抗体の合計のシグナルを検出することができる。
また、２種の各自己抗体の蛍光強度が合わさることで、各自己抗体の有無により、陽性者と陰性者の間で蛍光強度の差が大きく開くので、これらの自己抗体陽性患者の早期の検出が容易になる。
以上のことから、より一層１型糖尿病およびＳＰＩＤＤＭを正確に発症予知または診断ができるようになる。
（実施例１）ＧＡＤ抗体に対するＩＣＴ−ＥＩＡ法
（１）試薬類
ａ）一般試薬：
牛血清アルブミン（ＢＳＡ）は、ナカライテスク（京都）より、ストレプトアビジンは和光純薬工業（大阪）より購入した。この他の一般試薬はナカライテスクおよび和光純薬工業より購入した。
ｂ）抗体：
ウサギ抗２，４−ジニトロフェニル基（ＤＮＰ）−ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）血清は、シバヤギ社（群馬）より購入した。
ｂ）抗原：
リコビナント・ヒト・ＧＡＤ６５は、ＲＳＲ Ｌｉｍｉｔｅｄ （Ｃａｒｄｉｆｆ， ＵＫ）より購入した。
ｃ）緩衝液：
０．１Ｍ ＮａＣｌ， ０．１％ ＢＳＡ， １ｍＭ ＭｇＣｌ２および０．１％ ＮａＮ３を含む０．０１Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ７．０）を緩衝液Ａ、０．４Ｍ ＮａＣｌ， ０．１％ ＢＳＡ， １ｍＭ ＭｇＣｌ２および０．１％ ＮａＮ３を含む０．０１Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ７．０）を緩衝液Ｂ、０．１Ｍ ＮａＣｌ， ０．０１％ ＢＳＡ， １ｍＭ ＭｇＣｌ２および０．１％ ＮａＮ３を含む０．０１Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ７．０）を緩衝液Ｃ、０．１Ｍ ＮａＣｌを含む０．０１Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ７．０）を緩衝液Ｄ、５ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ６．０）を緩衝液Ｅとした。
ｄ）ＥＬＩＳＡキット：
ＧＡＤ抗体のＥＬＩＳＡキットは、ＲＳＲ Ｌｉｍｉｔｅｄ （Ｃａｒｄｉｆｆ， ＵＫ）より購入した。
（２）標識化抗原等
ａ）ＤＮＰ化標識ＧＡＤ，β−Ｄ−ガラクトシダーゼ標識ＧＡＤ：
１）チオール基導入ＧＡＤの調製：
０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ８．５ に溶解されているＧＡＤ溶液０．４ｍｇ ／ ０．４８ｍｌにＤＭＦで溶解した１３ｍＭ ＳＡＴＡ １０μｌを加え、３０℃、３０分間インキュベーションした。インキュベーション後、反応液に４Ｍ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｍｉｎｅ １０μｌを加え、３０℃、５分間インキュベーションした。インキュベーション後、反応液は、緩衝液Ｅにより平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０ （５ｍｌ） カラムによる遠心脱塩法を用い（文献）、過剰の試薬を取り除き、得られたチオール基導入ＧＡＤは、以下の標識に供した。ＧＡＤ１分子当たり４．０分子のチオール基が導入された。
２）マレイミド基導入ＤＮＰの調製：
ＤＮＰ−Ｌｙｓ １．８ｍｇをＤＭＦ ０．１８ｍｌに溶解後、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ７．０）０．７２ｍｌを加え、ＤＭＦに溶解した ４ｍＭ ＥＭＣＳ ０．１ｍｌを加え、３０℃、３０分間インキュベーションし、マレイミド基導入ＤＮＰ−Ｌｙｓを調整した。
３）マレイミド基導入β−Ｄ−ガラクトシダーゼの調製：
β−Ｄ−ガラクトシダーゼ ３ｍｇを緩衝液Ｅ ０．５２ｍｌに溶解し、ＤＭＦに溶解した５０ｍＭ Ｎ，Ｎ’−（ｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅ） ｄｉｍａｌｅｉｍｉｄｅ（ＯＰＤＭ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）２６．３μｌを加え、３０℃、３０分間インキュベーションした。インキュベーション後、反応液は、緩衝液Ｅにより平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０（５ｍｌ）カラムによる遠心脱塩法を用い（文献）、過剰の試薬を取り除き、得られたマレイミド基導入β−Ｄ−ガラクトシダーゼは、以下の標識に供した。β−Ｄ−ガラクトシダーゼ１分子当たり１５．６分子のマレイミド基が導入された。
４）ＤＮＰ化標識ＧＡＤの調整：
マレイミド基を導入したＤＮＰとチオール基を導入したＧＡＤをそれぞれ、１６０μＭと１７μＭになるように混合し、４℃、１７時間インキュベーションした。インキュベーション後、反応液に緩衝液Ｅに溶解した１００ｍＭ ＭＥ １０μｌを加え、３０℃、５分間インキュベーション後、１００ｍＭ ＮＥＭ ２０μｌを加え、３０℃、５分間インキュベーションし、未反応のチオール基およびマレイミド基をブロックした。反応液は０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ７．０）により平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０ （５ｍｌ） カラムによる遠心脱塩法を用い（文献）、過剰の試薬を取り除き、ＤＮＰ化標識抗原コンジュゲート（捕捉用）を得た。
５）β−Ｄ−ガラクトシダーゼ標識ＧＡＤの調整：
マレイミド基を導入したβ−Ｄ−ガラクトシダーゼとチオール基を導入したＧＡＤをそれぞれ、３．４μＭと８．５μＭになるように混合し、４℃、１７時間インキュベーションした。インキュベーション後、反応液に緩衝液Ｅに溶解した１００ｍＭ ＭＥ １０μｌを加え、３０℃、５分間インキュベーション後、１００ｍＭ ＮＥＭ ２０μｌを加え、３０℃、５分間インキュベーションし、未反応のチオール基およびマレイミド基をブロックした。次いで、反応液を緩衝液Ｃにより平衡化したＵｌｔｒｏｇｅｌ ＡｃＡ２２（１．５×４５ｃｍ）に添加し、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ標識抗原コンジュゲート（検出用）を得た。
ｂ）ＤＮＰ化ビオチン化標識ＧＡＤ：
１）チオール基導入ＧＡＤの調製：
０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ８．５ に溶解されているＧＡＤ溶液０．４ｍｇ ／ ０．４８ｍｌにＤＭＦで溶解した１３ｍＭ ＳＡＴＡ １０μｌを加え、３０℃、３０分間インキュベーションした。インキュベーション後、反応液に４Ｍ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｍｉｎｅ １０μｌを加え、３０℃、５分間インキュベーションした。インキュベーション後、反応液は、緩衝液Ｅにより平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０ （５ｍｌ） カラムによる遠心脱塩法を用い（文献）、過剰の試薬を取り除き、得られたチオール基導入ＧＡＤは、以下の標識に供した。ＧＡＤ１分子当たり４．２分子のチオール基が導入された。
２）マレイミド基導入ＤＮＰの調製：
ＤＮＰ−Ｌｙｓ １．０ｍｇをＤＭＦ ０．１ｍｌに溶解後、０．１Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ７．０）０．８ｍｌを加え、ＤＭＦに溶解した０．６ｍＭ ＥＭＣＳ ０．１ｍｌを加え、３０℃、３０分間インキュベーションし、マレイミド基導入ＤＮＰ−Ｌｙｓを調整した。
３）マレイミド基導入ビオチンの調製：
ビオチン−Ｌｙｓ １．０ｍｇに０．１Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ７．０）０．９ｍｌを加え、ＤＭＦに溶解した０．２ｍＭ ＥＭＣＳ ０．１ｍｌを加え、３０℃、３０分間インキュベーションし、マレイミド基導入ビオチン−Ｌｙｓを調整した。
４）ＤＮＰ化ビオチン化標識ＧＡＤの調整：
マレイミド基を導入したＤＮＰとマレイミド基を導入したビオチンを同量の割合で合せ、マレイミド基導入ＤＮＰとマレイミド基導入ビオチンの混合液を作成した。混合液およびチオール基を導入したＧＡＤをそれぞれ、７８μＭと１９μＭになるように混合し、４℃、１７時間インキュベーションした。インキュベーション後、反応液に緩衝液Ｅに溶解した１００ｍＭ ＭＥ １０μｌを加え、３０℃、５分間インキュベーション後、１００ｍＭ ＮＥＭ ２０μｌを加え、３０℃、５分間インキュベーションし、未反応のチオール基およびマレイミド基をブロックした。反応液は透析用セルロースチューブ（三光純薬株式会社 東京）を用い、緩衝液（０．１Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液 ｐＨ ７．０）に対して透析を行い、過剰の試薬を取り除き、ＤＮＰ化ビオチン化標識抗原コンジュゲート（捕捉用）を得た。ＧＡＤ１分子当たり１．３分子のＤＮＰおよび２．９分子のビオチンが導入された。
（３）実験材料等
ａ）固相の調製：
アフィニティー精製した抗ＤＮＰ−ＩｇＧおよび抗ｈｕｍａｎ ＩｇＧ−ＩｇＧは、直径６．４ｍｍのポリスチレンビーズ（イムノケミカル、岡山）と一夜室温で浸漬後、緩衝液Ａで洗浄し、４℃で保存した。ビオチン化ＢＳＡは、直径６．４ｍｍのポリスチレンビーズと一夜室温で浸漬後、０．１Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ７．５）で洗浄し、さらにストレプトアビジン溶液に一夜室温で浸漬後、緩衝液Ａで洗浄し、４℃で保存した。
ｂ）血液サンプル：
血清サンプルは、１２時間絶食後の早朝空腹時に採血し（ＮＩＰＲＯ， ２２Ｇ ホルダー付， 大阪）、室温３０分静置後、遠心分離機（テーブルトップ 冷却遠心機 ２８００ ＫＵＢＯＴＡ， 株式会社久保田製作所， 東京）で３０００ｒｐｍ、１０分遠心し、血清を得た。血清はマイナス２０℃で保存した。
ｃ）デキストラン−チャーコールの調整：
チャーコール（ナカライテスク）１．２ｇを蒸留水で数回洗浄後、蒸留水で１０ｍｌにした。これにデキストラン（Ｓｉｇｍａ）０．３ｇを加えて撹拌した。次に、メチルセルロース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃ）３０ｍｇを緩衝液Ａ １０ｍｌの上に載せ、撹拌せずに４℃で１６時間かけて溶解させた。調製したデキストラン−チャーコール液にメチルセルロース液を同じ割合で混合し、１５分間撹拌してデキストラン−チャーコール（以降ＤＣとする）液とし、４℃で保存した。
ｄ）ＤＣ液による血清処理：
血清５０μｌに緩衝液Ａ １５０μｌを加えて希釈後、さらに０．４Ｍ ＨＣｌを１３．６μｌ加えて酸性化した。１分後、上記のＤＣ液を７２．８μｌ加え、６分間振盪した後、０．４Ｍ ＮａＯＨを１３．６μｌ加えて中和した。中和後１５００×ｇ， １５分間遠心し、上清を取り出して、この上清をさらにもう１回同様に遠心し、完全にＤＣを除いた後、４℃で保存した。
（４）方法
ａ）ＧＡＤ抗体に対するＩＣＴ−ＥＩＡ−１法：
２０倍希釈した血清（１００μｌ）とＤＮＰ化標識ＧＡＤおよびβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ標識ＧＡＤ、１．０μＭ 不活性β−Ｄ−ガラクトシダーゼを緩衝液Ａに溶解した混合液（１００μｌ）を混合し、４℃、１６時間インキュベーションして、酵素標識抗原・ＧＡＤ抗体・補足用標識抗原の３者からなる免疫複合体を形成された。次いで、この反応液にアフィニティー精製抗ＤＮＰ−ＩｇＧ不溶化固相ポリスチレンビーズ１個を加え、０．５時間反応させてビーズ上に免疫複合体を補足した。このビーズを緩衝液Ｃ（２ｍｌ）で２回洗浄後、緩衝液Ａに溶解した２ｍＭ ＤＮＰ−Ｌｙｓ（１５０μｌ）と０．５時間反応させビーズから免疫複合体を溶出させた。抗ＤＮＰ−ＩｇＧ不溶化固相ポリスチレンビーズを除去した後、溶出液にアフィニティー精製抗ｈｕｍａｎ ＩｇＧ−ＩｇＧ不溶化固相ポリスチレンビーズ１個を加え、さらに０．５時間反応させ、第２のビーズ上に免疫複合体を転移させた。ビーズとの反応はすべて２５℃で２１０回／分の振盪下に行った。再びビーズを緩衝液Ｃ（２ｍｌ）で３回洗浄後、ビーズ上に転移させたβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性を０．２ｍＭ ４−Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（蛍光基質； ４ＭＵＧ）（２００μｌ）を用いて３０℃でインキュベーションし、０．１Ｍ グリシンナトリウム緩衝液（ｐＨ １０．５）（２ｍｌ）を加え反応を停止後、蛍光分光光度計（Ｆ−２５００、日立）を用いて測定した。なお、励起波長３６０ｎｍ、蛍光波長４５０ｎｍを用い、蛍光強度は１０−８Ｍ ４ＭＵを１００として換算した。
ｂ）ＧＡＤ抗体に対するＩＣＴ−ＥＩＡ−２法：
２０倍希釈した希釈血清（１００μｌ）にＤＮＰ標識ＧＡＤとビオチン標識ＧＡＤ、１．０μＭ 不活性β−Ｄ−ガラクトシダーゼを緩衝液Ｂに溶解した混合液（１００μｌ）を加えて混合し、４℃、１６時間インキュベーションして、ＤＮＰ標識抗原・自己抗体・Ｂｉｏｃｙｔｉｎ標識抗原の３者からなる免疫複合体を形成した。次いで、この反応液にアフィニティー精製抗ＤＮＰ−ＩｇＧ不溶化ポリスチレンビーズ１個を加え、０．５時間反応させてビーズ上に免疫複合体を補足した。その後、溶液のみを吸い出し、そこにストレプトアビジン標識酵素を１００μｌ添加し、さらに０．５時間反応させてビオチン標識ＧＡＤとストレプトアビジン標識酵素を結合させた。このビーズを緩衝液Ｃ（２ｍｌ）で２回洗浄後、緩衝液Ａに溶解した２ｍＭ ＤＮＰ−Ｌｙｓ（１５０μｌ）と０．５時間反応させビーズから免疫複合体を溶出させた。抗ＤＮＰ−ＩｇＧ不溶化固相ポリスチレンビーズを除去した後、溶出液にアフィニティー精製抗ｈｕｍａｎ ＩｇＧ−ＩｇＧ不溶化固相ポリスチレンビーズ１個を加え、さらに０．５時間反応させ、第２のビーズ上に免疫複合体を転移させた。ビーズとの反応は、すべて２５℃で２１０回／分の振盪下に行った。再びビーズを緩衝液Ｃ（２ｍｌ）で３回洗浄後、ビーズ上に転移させたβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性を０．２ｍＭ ４−Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（蛍光基質； ４ＭＵＧ）（２００μｌ）を用いて３０℃でインキュベーションし、０．１Ｍ グリシンナトリウム緩衝液（ｐＨ １０．５）（２ｍｌ）を加え反応を停止後、蛍光分光光度計（Ｆ−２５００、日立）を用いて測定した。なお、励起波長３６０ｎｍ、蛍光波長４５０ｎｍを用い、蛍光強度は１０−８Ｍ ４ＭＵを１００として換算した。
（実施例２）ＩＣＴ−ＥＩＡ−１法およびＩＣＴ−ＥＩＡ−２法、ＥＬＩＳＡ法の検出感度の比較
（１）対象者等
ａ）対象者：
非糖尿病対象者（７３名）、高インスリン血症患者（９名）、抗甲状腺剤（メチマゾール）投与中のバセドウ病患者（３０名）、橋本病（２０名）、２型糖尿病患者（３０名； インスリン未治療： ７名、インスリン治療中： １５名、インスリン治療不明： ８名）、１型糖尿病患者（２４名； インスリン治療中： ２１名、インスリン治療不明： ３名）から試料を採取した。
ｂ）インフォームドコンセント：
本研究で行った試験については、徳島文理大学倫理委員会（承認番号 第４号）の承認を得て行った。対象者にはインフォームドコンセントを行い、同意を得た上で試験を実施した。
ｃ）統計処理
カットオフ値の設定は、非糖尿病対象者の蛍光強度の平均値＋２ＳＤとした。また、２変量間の相関関係については、Ｓｐｅａｍａｎの順位相関係数を算出した。統計解析には、ＳＰＳＳ２０．０．０を用い、統計学的有意水準を５％に設定した。
（２）血清使用量の検討
ＩＣＴ−ＥＩＡ−１法およびＩＣＴ−ＥＩＡ−２法の血清使用量を１型糖尿病患者血清を用いて検討を行った。１型糖尿病患者血清の希釈には、健常者の血清を用いた。
ＩＣＴ−ＥＩＡ−１法は健常者血清１００μｌ中に１型糖尿病患者血清をそれぞれ１０μｌ、２０μｌ、３０μｌ、５０μｌ含まれているように調製した。その結果、ＩＣＴ−ＥＩＡ−１法は２０μｌまでは比例的に蛍光強度の増加がみられたが、２０μｌ以降で蛍光強度の大きな増加が見られなかった。また、２０μｌまで蛍光強度の上昇は確認できたが、１０μｌの蛍光強度と比べて１．３倍しか差は見られなかった。このことから、ＩＣＴ−ＥＩＡ−１法による血清の最大使用量を１０μｌとした。ただし、本試験では各対象者の血清の残量が少ないことから、各対象者のＧＡＤ抗体の測定には使用血清量を５μｌとすることにした。
ＩＣＴ−ＥＩＡ−２法は健常者血清１００μｌ中に１型糖尿病患者血清をそれぞれ１μｌ、２μｌ、５μｌ、１０μｌ、２０μｌ、３０μｌ、４０μｌ、５０μｌ含まれているように調製した。その結果、ＩＣＴ−ＥＩＡ−２法は５μｌまでは蛍光強度の増加がみられたが、５μｌ以降で蛍光強度の減少傾向が見られた。このことから、ＩＣＴ−ＥＩＡ−２法による血清の最大使用量を５μｌとした。
（３）本願発明方法とＥＬＩＳＡ法との検出感度比較
ＩＣＴ−ＥＩＡ−１法およびＩＣＴ−ＥＩＡ−２法、第１世代ＥＬＩＳＡ法、第２世代ＥＬＩＳＡ法、第３世代ＥＬＩＳＡ法、第３世代改良型ＥＬＩＳＡ法、ＥＬＩＳＡ ｋｉｔの他にＩＣＴ−ＥＩＡ−３法（ＤＮＰ−ビオチン標識ＧＡＤおよびＧＡＤ抗体、酵素標識ＧＡＤの３者から免疫複合体を形成させる）によるＧＡＤ抗体の検出感度についてＧＡＤ抗体陽性糖尿病血清を用いて比較した。なお、ＧＡＤ抗体陽性糖尿病血清の希釈には、健常者の血清を用いた。
なお、第１世代ＥＬＩＳＡ法、第２世代ＥＬＩＳＡ法、第３世代ＥＬＩＳＡ法とは、以下のことを言う。第１世代のＥＬＩＳＡ法とは、固相に不溶化させた抗原により血清中の測定すべき特異抗体を捕捉し、次いでこの特異抗体に酵素標識した抗イムノグロブリン抗体（第２抗体）を反応させて標識し、最後に酵素活性を測定する方法である。しかし、血清中の多量に存在する非特異抗体が固相に非特異的に吸着し、この非特異抗体と酵素標識第２抗体が結合し、この酵素の酵素活性も一緒に測定してしまうことから、バックグラウンドが高くなり、微量の特異抗体を測定することが困難となる。そこで、この第１世代の欠点を補うべく第２世代のＥＬＩＳＡ法が開発されている。
第２世代のＥＬＩＳＡ法とは、固相に不溶化させた第２抗体により、まず血清中の測定すべき特異抗体も含めた総イムノグロブリンを捕捉する。次いでこの捕捉された総抗体中の特異抗体に酵素標識抗原を反応させ、最後に、酵素活性を測定する方法である。しかし、この方法でも、酵素標識抗原が固相に吸着することから、バックグラウンドが高いままであった。また、固相に不溶化させた第２抗体は、測定すべき特異抗体以外の非特異抗体をも捕捉してしまうことから、固相上の第２抗体量に限界があり、血清試料を少量しか使用することができない。そこで、さらに第３世代のＥＬＩＳＡ法が開発されている。
第３世代のＥＬＩＳＡ法とは、固相に不溶化させた抗原により、まず血清中の測定すべき特異抗体を捕捉し、次いでこの捕捉された特異抗体に酵素標識抗原を反応させ、最後に、酵素活性を測定する方法である。しかし、この方法においても第２世代より検出感度は向上されたが、まだバックグランドが高い状態であった。また、この方法では全てのサブクラスの抗体や抗体以外の抗原結合物質も検出してしまうため、自己抗体であるかの判断が困難である。
今回、第１世代ＥＬＩＳＡ法および第２世代ＥＬＩＳＡ法を用いた場合では、ＧＡＤ抗体を検出することはできなかった。第３世代ＥＬＩＳＡ法および第３世代改良型ＥＬＩＳＡ法による検出感度は、１０Ｕ／ｍｌおよび１００Ｕ／ｍｌであり、第３世代改良型ＥＬＩＳＡ法の方が第３世代ＥＬＩＳＡ法より１０倍高感度であった。
第３世代改良型ＥＬＩＳＡ法およびＥＬＩＳＡ ｋｉｔの検出感度では、ともに１０Ｕ／ｍｌであったが、第３世代改良型ＥＬＩＳＡ法のＮｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃの蛍光強度が高いものであった。
一方、ＩＣＴ−ＥＩＡ−１法およびＩＣＴ−ＥＩＡ−２法による検出感度は、ともに０．３Ｕ／ｍｌであり、ＥＬＩＳＡ ｋｉｔに比べ、３０倍高感度であった（図２参照）。また、ＩＣＴ−ＥＩＡ−１法およびＩＣＴ−ＥＩＡ−２法を比較したところ、検出感度は同じではあったが、蛍光強度のＳｐｅｃｉｆｉｃ ／ Ｎｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃ比（Ｓ／Ｎ比）では、ＩＣＴ−ＥＩＡ−１法が高く、蛍光強度値においてもＧＡＤ抗体の高濃度領域ではＩＣＴ−ＥＩＡ−１法が高い値を示した。
（実施例３）ＩＣＴ−ＥＩＡ−１法およびＩＣＴ−ＥＩＡ−２法の特異性検討
（１）十分な阻害効果を得る為のＧＡＤ添加量の検討
ＩＣＴ−ＥＩＡ−１法およびＩＣＴ−ＥＩＡ−２法の特異性を検討するため、高濃度のＧＡＤ溶液の添加を行うが、ＧＡＤは非常に高価で貴重なため、ＧＡＤ溶液の添加量の検討を行った。
ＩＣＴ−ＥＩＡ−１法を用いてＧＡＤの添加量をそれぞれ０．１、０．３、１．０、３．０ｐｍｏｌ／ｔｕｂｅになるように添加した。その結果、３．０ｐｍｏｌ／ｔｕｂｅで８０％以上の阻害が確認された。このことから、以降の特異性試験において、ＧＡＤ溶液の添加量は３．０ｐｍｏｌ／ｔｕｂｅになるように添加することとした。
（２）ＩＣＴ−ＥＩＡ−１法およびＩＣＴ−ＥＩＡ−２法の特異性検討
ＩＣＴ−ＥＩＡ−１法およびＩＣＴ−ＥＩＡ−２法の特異性を１型糖尿病患者血清と同じく自己免疫疾患であるバセドウ病ならびに橋本病患者血清を用いて検討した。その結果を以下の表１に示す。
（実施例４）ＩＣＴ−ＥＩＡ−１法およびＩＣＴ−ＥＩＡ−２法の再現性
５０、１００倍に希釈した１型糖尿病患者血清を用いてＩＣＴ−ＥＩＡ−１法の同時再現性を検討した。その結果を以下の表２に示す。
また、同じく５０、１００倍に希釈した１型糖尿病患者血清を用いてＩＣＴ−ＥＩＡ−２法の同時再現性を検討した。その結果も上記表２に示されるごとく、同時再現性は４．８〜５．２％（ｎ＝１０）と良好であった。
（実施例５）ＩＣＴ−ＥＩＡ法によるＧＡＤ抗体の検出評価
（１）ＩＣＴ−ＥＩＡ−１法によるＧＡＤ抗体の検出
非糖尿病対象者（３２名）、２型糖尿病患者（３０名）、１型糖尿病患者（２３名）の血清をＩＣＴ−ＥＩＡ−１法を用い測定した（図３を参照）。カットオフ値を蛍光強度１．８とした。
その結果、カットオフ値を越える蛍光強度を示したのは、非糖尿病対象者では１／３３名であった。２型糖尿病患者では３／２９名であった。一方、１型糖尿病患者では１１／２２名であった。
カットオフ値を越えた対象者に対して上記実施例２（１）と同様の手法により、陽性の確認を行った。なお、血清に過剰量のＧＡＤを添加し、蛍光強度が５０％以上阻害されたものを陽性と判断した。ただし、阻害率が５０％以上でなくとも、蛍光強度がカットオフ値の３倍以上で、阻害率が５０％に近ければ、それも陽性と判断することにした。その結果、２型糖尿病患者の４名中３名は４８〜１００％、１型糖尿病患者の１３名中１３名は４０〜１００％阻害された。また、非糖尿病対象者の１名は阻害されなかった。その結果、カットオフ値を越えた対象者の中で非糖尿病対象者および２型糖尿病患者の１部を除くほとんどの対象者が陽性であることが示された。その結果を表３に示す。
その結果、カットオフ値を越える蛍光強度を示したのは、非糖尿病対象者では０／３２名、２型糖尿病患者では９／３０名であった。一方、１型糖尿病患者では１７／２３名であった。
（２）ＩＣＴ−ＥＩＡ−２法によるＧＡＤ抗体の検出
非糖尿病対象者（３４名）、２型糖尿病患者（２９名）、１型糖尿病患者（２２名）の血清をＩＣＴ−ＥＩＡ−２法を用い測定した（図４参照）。カットオフ値を蛍光強度８．１とした。
その結果、カットオフ値を越える蛍光強度を示したのは、非糖尿病対象者では３／３４名であった。２型糖尿病患者では１／２９名であった。一方、１型糖尿病患者では１０／２２名であった。
カットオフ値を越えた対象者に対して実施例２（１）と同様の手法により、陽性の確認を行った。なお、判定はＩＣＴ−ＥＩＡ−１法と同様の基準で行った。その結果、２型糖尿病患者の１名は９４％、１型糖尿病患者の１０名は８８〜１００％阻害された。また、非糖尿病対象者の３名はほとんど阻害されなかった。その結果、カットオフ値を越えた対象者の中で非糖尿病対象者を除くほとんどの対象者が陽性であることが示された（表３参照）。
また、上記（１）と同じく特異シグナルを求めた。カットオフ値を蛍光強度０．４とした。
その結果、カットオフ値を越える蛍光強度を示したのは、非糖尿病対象者では０／３４名であった。２型糖尿病患者では２３／２９名であった。一方、１型糖尿病患者では１７／２２名であった。
（実施例５）ＥＬＩＳＡ法およびＩＣＴ−ＥＩＡ−１法またはＩＣＴ−ＥＩＡ−２法の相関関係
１型糖尿病患者および２型糖尿病患者の結果からＥＬＩＳＡ法およびＩＣＴ−ＥＩＡ−１法またはＩＣＴ−ＥＩＡ−２法との間で相関関係を検討した。ＩＣＴ−ＥＩＡ法では特異シグナルを用い、特異シグナルが未検出であったものは、ＩＣＴ−ＥＩＡ法およびＥＬＩＳＡ法ともに除外して相関関係の検討を行った。その結果、ＥＬＩＳＡ法およびＩＣＴ−ＥＩＡ−１法との間で有意な相関関係（ｒ＝０．５５５、ｐ＜０．０００）がみられた（図５参照）。また、ＩＣＴ−ＥＩＡ−１法およびＥＬＩＳＡ法ともに陽性であった患者のみで相関関係を検討した結果、さらに有意な相関関係（ｒ＝０．７９４、ｐ＜０．０００）がみられた。
ＥＬＩＳＡ法およびＩＣＴ−ＥＩＡ−２法との間でも有意な相関関係（ｒ＝０．４９４、ｐ＜０．００１）がみられた（図６参照）。また、ＩＣＴ−ＥＩＡ−２法およびＥＬＩＳＡ法ともに陽性であった患者のみで相関関係を検討した結果、さらに有意な相関関係（ｒ＝０．７８６、ｐ＜０．０００）がみられた。
ＥＬＩＳＡ法では１型糖尿病患者（２２名）と２型糖尿病患者（２９名）の中から計３１名の陽性者を検出したが、ＥＩＣＴ−ＥＩＡ−１法では、ＥＬＩＳＡ法で陰性とされていた中から８名の陽性者を検出し、ＩＣＴ−ＥＩＡ−２法では、１６名の陽性者を検出することができた。その結果を以下の表４に示す。
非糖尿病対象者（３４名）、２型糖尿病患者（２９名）、１型糖尿病患者（２２名）の血清をＥＬＩＳＡキットで測定した。カットオフ値を吸光度０．１０とした。その結果、カットオフ値を越える吸光度を示したのは、非糖尿病対象者では１／３４名であった。２型糖尿病患者では１４／２９名であった。一方、１型糖尿病患者では１７／２２名であった（表３参照）。
（実施例６）ＩＣＴ−ＥＩＡ−２法によるインスリン自己抗体の検出感度
（１）検討サンプル：
インスリン自己抗体陽性者の血清を用いて比較した。
（２）検出方法：
公知文献（Ｃｌｉ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１２，４５（１３−１４）：１０８６−９１）に記載の方法に準じて、上記のインスリン自己抗体を測定した。
上記文献方法は、ＩＣＴ−ＥＩＡ−１法の問題点であったインスリン標識体と抗体との立体障害を減じるために、インスリンを低分子ＤＮＰやビオチンで標識し、次にこれらの標識体と抗体を反応させて免疫複合体を形成させておくことに特徴がある。
健常者のインスリン除去血清で希釈したインスリン自己抗体陽性者（１型糖尿病患者）の血清を上記文献方法とＥＬＩＳＡキットを用いて測定し、検出感度を比較した。
（３）検出感度：
図９に示されるように、ＥＬＩＳＡキットに対してＩＣＴ−ＥＩＡ−２法は、インスリン自己応対を１，０００倍高感度に検出することができた。また、ＩＣＴ−ＥＩＡ−１法と比較すると１０倍高感度であった。
（実施例７）インスリン自己抗体およびＧＡＤ抗体に対するＩＣＴ−ＥＩＡ−２法の同時検出方法
本同時検出法では、図８に示されるように、インスリン自己抗体およびＧＡＤ抗体用の各標識体を１つに合わせた検出系を使用する。本検出方法で使用されるＩＣＴ−ＥＩＡ−２法は、その特徴の１つでもあるが、標識抗原を換えれば、同じ固相および同じ操作で種々の抗体が検出できる。そこで、インスリン自己抗体およびＧＡＤ抗体用の２種の各標識抗原等の使用試剤を一つにして使用することにより、１回の測定で各自己抗体の合計のシグナルを検出することができる。
また、２種の各自己抗体の蛍光強度が合わさることで、各自己抗体の有無により、陽性者と陰性者の間で蛍光強度の差が大きく開くので、これらの自己抗体陽性患者の早期の検出が容易になる。
以上のことから、より一層１型糖尿病およびＳＰＩＤＤＭを正確に発症予知または診断ができるようになる。
本発明のＧＡＤ抗体測定方法は、従来のＥＬＩＳＡ法の３０倍以上の高感度でのＧＡＤ抗体の検出と測定が可能になる方法である。それ故、本発明を用いて、１型糖尿病や緩徐進行１型糖尿病（ＳＰＩＤＤＭ）の発症初期を検出、診断することができるようになった。そして、食事や運動等の生活改善および早期にインスリン療法を実施することにより、治療又は症状進行の阻止を図ることができる。このように、本発明のＧＡＤ抗体測定方法により、１型糖尿病や緩徐進行１型糖尿病の初期症状を診断し、これらの進行をより初期の段階で阻止できるようになった。
また、インスリン自己抗体およびＧＡＤ抗体に対する標識抗原等の使用試剤を一つにして使用することにより、より一層１型糖尿病およびＳＰＩＤＤＭを正確に発症予知または診断ができるようになっている。
また、インスリン自己抗体およびＧＡＤ抗体に対する標識抗原等の使用試剤を一つにして使用することにより、より一層１型糖尿病およびＳＰＩＤＤＭを正確に発症予知または診断ができるようになっている。
Claims (3)
- ＧＡＤ抗体の２点結合免疫複合体転移酵素免疫測定方法（ＩＣＴ−ＥＩＡ法）であって、以下の５つの反応工程（ａ法）または６つの反応工程（ｂ法）で測定されることを特徴とする、ＧＡＤ抗体測定方法、
ａ）５つの反応工程：
１）ＧＡＤ抗体とＤＮＰ−ビオチン標識ＧＡＤ抗原、酵素標識ＧＡＤ抗原で免疫複合体を形成させる、
２）上記免疫複合体を抗ＤＮＰ抗体不溶化固相と反応させて、固相に免疫複合体を捕捉させる、
３）上記固相に捕捉された免疫複合体をＤＮＰ−リジンを用いて固相から溶出させる、
４）上記固相から溶出させた免疫複合体をストレプトアビジン不溶化固相と反応させ、ストレプトアビジン不溶化固相に免疫複合体を転移させる、
５）免疫複合体に含まれる標識酵素を用いて、基質と反応させ、生成物の蛍光を測定することによって免疫複合体の濃度（ＧＡＤ抗体の濃度）を測定する、または、
ｂ）６つの反応工程：
１）ＧＡＤ抗体とＤＮＰ標識ＧＡＤ抗原、ビオチン標識ＧＡＤ抗原で免疫複合体を形成させる、
２）上記免疫複合体を抗ＤＮＰ抗体不溶化固相と反応させて、固相に免疫複合体を捕捉させる、
３）上記固相に捕捉された免疫複合体と酵素標識ストレプトアビジンを反応させて、免疫複合体に酵素標識ストレプトアビジンを結合させる、
４）上記固相で酵素標識ストレプトアビジン化された免疫複合体をＤＮＰ−リジンを用いて固相から溶出させる、
５）上記固相から溶出させた免疫複合体を抗イムノグロブリン抗体不溶化固相と反応させ、抗イムノグロブリン抗体不溶化固相に免疫複合体を転移させる、
６）免疫複合体に含まれる標識酵素を用いて、基質と反応させ、生成物の蛍光を測定することによって免疫複合体の濃度（ＧＡＤ抗体の濃度）を測定する。 - 上記６つの反応工程（ｂ法）で測定されることを特徴とする、請求項１記載のＧＡＤ抗体測定方法。
- 上記酵素が、β−Ｄ−ガラクトシダーゼであることを特徴とする、請求項１または２に記載のＧＡＤ抗体測定方法。
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