JPH06207936A - 抗生物質の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ミルク、尿、血液の様な液体中の抗生物質
の、以下の段階 （ａ）液体媒体の流体試料、少なくとも１種類の標識を
した抗生物質結合タンパク質、及び少なくとも１種類の
固定化抗生物質を一緒に入れ、（ｂ）標識した抗生物質
結合タンパク質を固定化抗生物質に結合させ、（ｃ）固
定化抗生物質に結合していない、標識した抗生物質結合
タンパク質を除去し、（ｄ）固定化抗生物質に結合して
いる標識した抗生物質結合タンパク質の量を決定する、
を含む検出法。 【効果】 本法により微量の抗生物質の検出を容易に行
なえる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明はミルク、尿及び血液の様な液体中
の抗生物質の検出に関する。米国特許第４，２３９，８
５２号及び第４，２３９，７４５号に於いては、液体試
料を微生物の細胞の一部と一緒にインキュベートするこ
とにより、その試料中の抗生物質の存在を検出する方法
が開示されている。液体試料中の抗生物質は、何れも細
胞のレセプター部位に結合している。このインキュベー
ト段階の後、標識した抗生物質が加えられ、その抗生物
質は残存するレセプター部位に結合する。液体を細胞か
ら分離し、洗浄した後、レセプター部位に結合している
標識した抗生物質の量を決定することができる。これら
の特許の実施例に於いては、放射性の標識をした抗生物
質が用いられている。また、特許の開示で明らかにされ
た、放射性の標識をした抗生物質と試料抗生物質との間
の競合を利用する商業的に有効な試験も利用できる。こ
の方法はかなり感度の高いものであるが、熟練した人員
と高価な設備を必要とする。常時放射能の危険性がある
ことも、もう一つの欠点である。従って、特に農場及び
酪農場の労働者が日常的に利用できる、速くて容認され
る抗生物質の試験法は得られなかった。上記の米国特許
に於いては、酵素で標識した抗生物質と試料抗生物質と
の競合に基づく試験法も記載されている。米国特許第
４，２３９，８５２号の実施例２に於いては、最低限の
２０分以内にミリリットル当たり０．０５単位のペニシ
リン（＝３０ｐｐｂ）を検出することができる試験キッ
トが記載されている。より低濃度のペニシリンの検出に
は更に長い試験時間が必要である。

【０００２】ミルク中に存在する抗生物質の濃度は一般
的にかなり低いので、時間的に拘束されて、酵素標識し
た抗生物質に基づく検出法は日常のミルク試料の試験に
不利である。従って、ミルク、尿、或いは血液のような
液体中の低濃度の抗生物質を検出する為に考案された簡
単な試験法を提供することが、本発明の目的である。本
試験法に要する時間は、理想的には、およそ１５分を超
過すべきではない。本発明はミルク、尿、及び血液の様
な液体媒体中に少なくとも１種類の抗生物質を検出す
る、 （ａ）液体媒体の流体試料、少なくとも１種類の標識を
した抗生物質結合タンパク質、及び少なくとも１種類の
固定化抗生物質を一緒に入れ、（ｂ）標識した抗生物質
結合タンパク質を固定化抗生物質に結合させ、（ｃ）固
定化抗生物質に結合していない、標識した抗生物質結合
タンパク質を除去し、（ｄ）固定化抗生物質に結合して
いる標識した抗生物質結合タンパク質の量を決定するこ
とを含む方法を提供する。

【０００３】本法は、β−ラクタム類（ベンジルペニシ
リンの様なペニシリン及びセファロスポリンを含む）、
テトラサイクリン類、ゲンタマイシン、サルファメタジ
ンの様なサルファ化合物及びこれらの組み合わせなどの
多種類の抗生物質の検出に利用されても良い。固定化抗
生物質は、一般的に液体試料中に存在するものと同じで
あるが、異なっていても良い。例えば固定化抗生物質は
試料中の抗生物質の類似化合物であっても良い。もし、
固定化抗生物質と試料中の抗生物質が異なる場合には、
両者とも、結合性タンパク質との結合が可能であるべき
だ。本発明に於いて用いられる標識は、酵素或いはＦＩ
ＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）或いはＴＲ
ＩＴＣ（テトラメチルローダミンイソチオシアネート）
のような蛍光性化合物であっても良い。好ましくは、酵
素標識した抗生物質結合タンパク質が段階（ａ）で用い
られる。本発明の１つの態様に従って、１回の試験で異
なる抗生物質の組み合わせを検出する為に、測定法を利
用することができる。そのような試験では、異なる標識
をした抗生物質結合タンパク質が、固定化された数種類
の抗生物質と組み合わせて用いられる。

【０００４】意外なことに、抗生物質結合タンパク質を
酵素で標識し、試験管或いはディプスティックの様な固
相に目的の抗生物質を固定化することによって、少なく
とも５ｐｐｂのベンジルペニシリン（１ｍｇは１５９２
ｉ．ｕ．のベンジルペニシリンカリウム塩に対応する）
に感度のある試験キットが得られることが見いだされ
た。更に、そのような試験に要する時間は約１２分以内
である。該試験は安価で作業が容易であり、熟練した人
員を必要としない。インキュベートする時間を延ばせ
ば、より低濃度の検出が可能である。本発明の好ましい
態様に従って、段階（ａ）は、標識した抗生物質結合タ
ンパク質を液体試料にいれて、標識した抗生物質結合タ
ンパク質に試料中の抗生物質を結合させた後、固定化抗
生物質を加えることを含む。結合性タンパク質と液体試
料は、固定化抗生物質を加える前に、通常１〜４分間イ
ンキュベートされる。標識した抗生物質結合タンパク質
には、いかなる抗生物質結合タンパク質も含まれ、それ
らは例えば、バチルス ステアロサーモフィルス、バチ
ルス サチルス、ストレプトコッカス サーモフィル
ス、或いはエシェリキア コーライの様な抗生物質感受
性の微生物から入手可能であり、好ましくはバチルス
ステアロサーモフィルスが用いられる。また抗体のよう
な抗生物質結合タンパク質も、本発明に於いて態様化さ
れる。適切な抗体は動物の免疫によって入手可能であ
り、例えば、Ｅ．Ｈ．Ｋａｃｈａｂら、Ｔｈｅ Ｊｏｕ
ｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ．１４７巻 Ｎｏ．１ １月１日 １９９２年
３３−４１ページを参照のこと。抗生物質結合タンパ
ク質は、アフィニティークロマトグラフィー或いはゲル
ろ過の様な方法で精製されても良い。

【０００５】標識した抗生物質結合タンパク質は、固定
化抗生物質に結合するのと同様に、試料の抗生物質に結
合する為の反応部位を有している。抗生物質結合タンパ
ク質は、標識されている。タンパク質／タンパク質の相
互反応を起こす周知の可能なすべての方法を、上記の複
合体を得る為に適当に用いた。例えば、二官能基試薬を
用いることによって結合が認められた。共有結合による
相互反応の他に、異なるタンパク質間の結合は、隣接す
る表面の局部的な電荷の違い（ファンデルワールス力）
及び／或いは疎水結合に基づいている（Ｇ．Ｅ．Ｄａｖ
ｉｅｓ ａｎｄＧ．Ｒ．Ｓｔａｒｋ（１９７０年）：
「オリゴマータンパク質のサブユニット構造の研究に於
ける、架橋試薬ジメチルサブエリミデートの利用」Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、６６巻
６５１−６５６ページ；Ｆ．Ｗｏｌｄ（１９７２年）：
「二官能基試薬」Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２
５巻 ６２３−６５１ページ；Ｊ．Ｒ．Ｋｎｏｗｌｅｓ（１９
７２年）：「生物のレセプター部位標識の為の発光標
識」Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ ５巻１５５−１６０ペ
ージ；Ｋ．Ｐｅｔｅｒｓ ａｎｄ Ｆ．Ｍ．Ｒｉｃｈａ
ｒｄｓ（１９７７年）「化学的クロスリンキング：膜構
造の研究に於ける試薬と問題」Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．４６巻 ５２３−５５１ページ；Ｗ．Ｓ．Ｊ
ａｃｏｂｙａｎｄ Ｍ．Ｗｉｌｃｈｅｋ（ｅｄｓ．）
「親和性標識」Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．４６
巻；Ｍ．Ｄａｓ ａｎｄ Ｃ．Ｆ．Ｆｏｘ（１９７９
年）「生物学に於ける化学的クロスリンキング」Ａｎ
ｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．８巻 １
６５−１９３ページ；Ｍ．Ｒ．Ｂｏｓｓｈａｒｄ（１９
７９年）「タンパク質−核酸及びタンパク質−タンパク
質複合体に於ける接触面の示差化学修飾によるマッピン
グ」Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ａｎａｌ．２５
巻 ２７３−３０１ページ；Ｂａｙｅｒ ａｎｄ Ｗｉ
ｌｃｈｅｋ（１９７８年）「分子生物学に於ける道具と
してのアビジン−ビオチン複合体」Ｔｒｅｎｄｓ ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．３巻 Ｎ２５７−２５９ページ；
Ｂａｙｅｒら（１９７９年）：Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ．６２巻 ３１９−３２６ページ）。更に、分子生物
学の適用も可能であった。この方法によって、抗生物質
結合タンパク質及び酵素標識の両者の遺伝情報に基づ
く、新しいタンパク質（融合タンパク質）が創られた。

【０００６】好ましい酵素標識はホースラディッシュ
パーオキシダーゼであり、その安定性については周知で
あるが、他の酵素も用いることができる。例えばパーオ
キシダーゼ、アルカリホスファターゼ、或いはβ−ガラ
クトシダーゼ（酵素を結合した免疫測定法，ＥＬＩＳＡ
に用いられるすべての酵素）が一般的である（Ｊ．Ｗ．
Ｇｏｄｉｎｇ（１９８３年）：モノクローナル抗体：原
理と実験（ＩＳＢＮ０１２−２８７０２０−４）。酵素
を検出する方法は、用いられる特定の酵素に依存する。
典型的には、例えば色の変化を起こす反応の触媒として
酵素が作用するとき、或いは酵素が反応を阻害するとき
に、酵素の標識が検出される。一般的に、酵素の存在が
色の変化によって検出されるとき、適当な基質が加えら
れ、その基質に酵素が作用する。その後、色の変化の程
度が存在する酵素の量と比較される。ホースラディッシ
ュ パーオキシダーゼに対する適当な基質は、例えばテ
トラメチルベンジジン、ｏ−フェニレンジアミン或いは
アジノジエチルベンズチアゾリンの様な、酸素の生成に
よって容易に酸化される発色基質である。目的の抗生物
質の固定化は、例えば固体マトリックス（例えばプレー
ト、チューブ、ディプスティック或いはビーズ（鉄、ラ
テックス等））への共有結合或いは非共有結合の吸着
（Ｐ．Ｔｉｊｓｅｎ、酵素免疫測定法の実験と理論，Ｅ
ｌｓｅｖｉｅｒ、１９８５年）によって、それ自体周知
の方法で行われても良い。ラクタム環を有する抗生物質
は、随意にスペーサーを介して共有結合により担体に結
合することができる。抗生物質に損傷を与えなければ、
化学結合を作ることのできるすべての方法を適当に用い
ることができる。

【０００７】例えばペプチド化学で周知の方法である多
くのカップリング法が適用可能であり、多くの二官能性
化合物がスペーサーとして適切なことが明らかである。
例えばＨ．Ｒ．Ｙｏｃｕｍら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．（１９８０年）２５５巻 ３９７７−３９８６ペー
ジ）によって報告されている方法は適切な方法であり、
その報告では、一般的な形、Ｘ（ＣＨ₂)_n −ＣＯＯＨ
のスペーサーが用いられている。かなり有効で信頼性の
ある分子間結合は、Ｊ．Ｃａｒｌｓｓｏｎら（１９７８
年）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１７３巻 ７２３−７３７ペ
ージによって報告されており、異二官能分子試薬Ｎ−サ
クシニミジル−３−（２−ピリジルチオ）−プロピオン
酸（ＳＰＤＰ）が用いられる。ガラス或いはプラスチッ
クの様な素材はマトリックス素材として利用可能であ
る。マトリックスのＮＨ2 基は、固定化する為に利用可
能である。プラスチック類（例えばポリスチレン）の様
な素材とタンパク質（例えばＢＳＡ）との間の共有結合
によるカップリングも、目的の抗生物質を固定化する為
に利用可能であり、例えばＲ．Ｈ．Ｂｕｒｄｏｎ ａｎ
ｄ Ｐ．Ｈ．ｖａｎ Ｋｎｉｐｐｅｎｂｅｒｇ、生化学
及び分子生物学に於ける研究法，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１
９８５年を参照のこと。

【０００８】好ましい態様に従って、抗生物質は、試験
管の様な内部表面に、好ましくはＢＳＡの様な結合性化
合物を介して固定化される。また本発明は検出を遂行す
る為のキットも提供し、そのキットは、少なくとも１種
類の酵素標識をした抗生物質結合タンパク質と、少なく
とも１種類の固定化抗生物質を含む。個々の出願或いは
特許或いは他の報告が参照によって引用されるよう、特
別にそして個別に指示されたかのように、すべての特許
出願、特許及び本出願に記載の他の報告を、同じ範囲の
参照によって、本出願に引用している。以下の実施例に
於いて本発明を具体的に説明する為に、好ましい態様を
述べる。しかしながら本発明は特定の態様に制限され
ず、手法に習熟した当分野の熟練者が本発明の目的の為
に、同様に利用可能な他の試験を用いても良いことを理
解すべきである。これらの改変は本発明の範囲内に含め
る。

【０００９】

【実施例１】 抗生物質残渣試験 本実施例では、ミルク中５ｐｐｂという低濃度のベンジ
ルペニシリン残渣を検出する方法を記載する。抗生物質結合タンパク質の抽出 本実施例に於ける抗生物質感受性微生物バチルス ステ
アロサーモフィルスの生育菌体（連続培養法＃１０８
Ｐｏｒｔｏｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｌｔｄ．ＵＫ）をリ
ゾチーム、ＤＮＡｓｅ及びトライトンＸ−１００と一緒
に０．１Ｍリン酸ｐＨ７．０中４℃で終夜溶解した。該
溶解液を約１６００ｘｇ（４℃）で３０分間遠心分離し
た。遠心分離後、上清を抗生物質親和性ゲルマトリック
スと混合した。例えば７−アミノセファロスポラン酸
（７ＡＣＡ）を調製する為に以下の方法を用いた。０．
３４ｇの７ＡＣＡを２５ｍｌの０．１Ｍ リン酸ｐＨ
７．０（ｐＨは７に調整する）と混合した。この溶液
に、１００ｍｌのビーズアフィゲル１０（登録商標、Ｂ
ｉｏＲａｄ）（１ｌの０．１Ｍ リン酸ｐＨ７．０で洗
浄した）を加えた。これを２０℃で２時間穏やかに混合
した。７ＡＣＡ−アフィゲル１０をろ過し、真空吸引し
た。その後７ＡＣＡ−アフィゲルを０．１Ｍ リン酸ｐ
Ｈ７．０で再度洗浄して準備を整えた。

【００１０】７ＡＣＡ−アフィゲル及び溶解した菌体の
上清を、２０℃で３時間穏やかに振盪しながら混合し
た。ゲルを０．１Ｍ リン酸＋１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ
７．０で６回洗浄した。１回の洗浄には５００ｍｌ用い
た。２０ｍｌの溶出緩衝液（０．０５Ｍ リン酸＋０．
５Ｍ ＮａＣｌ＋０．１％トリトンＸ−１００＋０．８
Ｍ ヒドロキシルアミン、ｐＨ７．０）を湿ったゲルの
塊に加え、２０℃で２０分間穏やかに振盪しながら混合
した。その後混合物を４℃に於いておよそ３００ｘｇで
６分間遠心分離した。上清を３２ｍｍチューブ（排除限
界１２−１４ＫＤ）で透析した。１回目の透析は０．０
５Ｍ リン酸＋０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０に対し
て４℃で終夜行い、２回目から５回目までの透析は、
０．１Ｍ 炭酸 ｐＨ９．４に対して行い、透析中４−
６時間毎に緩衝液を交換した。該溶解液を４℃で、およ
そ１０００ｘｇで２０分間遠心分離し、アミコン濃縮器
（限外ろ過）（モデル＃８２００ ＷＲ Ｇｒａｃｅ
ａｎｄ Ｃｏ．）で、製造者の標準操作法（ＳＯＰ）に
従って濃縮した。精製された抗生物質結合タンパク質が
準備された。抗生物質結合タンパク質（ａｂｐ）と酵素標識との結合 本実施例では、ホースラディッシュパーオキシダーゼ
（ＨＲＰＯ）を用いる。１ｍｇ ＨＲＰＯ（標識に適す
る）を１ｍｌ蒸留水（ｄ．ｉ−水）に溶かした溶液と、
０．２ｍｌの０．１Ｍ 過ヨウ素酸ナトリウムを２０℃
で２０分間混合し、０．００１Ｍ 酢酸ナトリウム ｐ
Ｈ４．４に対して４℃で終夜透析した。この透析物に２
５μｌの０．１Ｍ 炭酸を加えることによってｐＨを
９．０−９．６に調整した。その後直ちに１ｍｇのａｂ
ｐを透析物に添加した（ピアス プロテインアッセ
イ）。混合物を室温で２時間、穏やかに振盪した。その
後１５０μｌの４ｍｇ水素化ほう素ナトリウム／ｍｌ蒸
留水を混合物に添加し、これを４℃で２時間インキュベ
ートした。

【００１１】溶液をＰＢＳ（０．０１Ｍ リン酸＋０．
９％（ｍ／ｖ）ＮａＣｌ ｐＨ７．０）に対して透析
し、その間４時間毎に４回緩衝液を交換した。透析完了
後、透析物を１０％山羊の血清（不活化したもの）＋
０．０３％ ４−アミノアンチピリンで希釈した。これ
を抗生物質結合タンパク質−酵素（ＨＲＰＯ）複合体と
命名する。試験構成では、有色基質の発色を速める最高
の希釈倍率を用いる。チオメザールと一緒に希釈物を保
存することにより、４℃で少なくとも６ヶ月間保存可能
な、かなり安定な試験−キット試薬が得られる。β−ラクタムの蛋白質への結合 本実施例では、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）に結合させ
る為に、セファロスポリン（７ アミノ−セファロスポ
ラン酸（７ＡＣＡ））の基本構造を利用する。β−ラク
タムに対する最高の親和性と特異性を得る為に７ＡＣＡ
とＢＳＡの間にスペーサーを用いる。４０ｍｇの７ＡＣ
Ａを４ｍｌの５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）溶液
に加えた。溶解後、ｐＨを１Ｎ ＮａＯＨでｐＨ７．０
に調整した。その後２０ｍｇＢＳＡと４０ｍｇのビス
（スルホサクシンイミジル）スベレート（スペーサー）
及び更に２ｍｌの５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ溶液を加えた。
混合物を２０℃で４５分間穏やかに振盪した。

【００１２】溶液を混合した後、ＰＢＳに対して４８時
間透析を行い（チューブの排除限界１２−１４ＫＤ）、
その間緩衝液を３回交換した。この透析物は、希釈後チ
ューブのコーティングに利用される。

【００１３】β−ラクタム−スペーサー−タンパク質
複合体の固相へのコーティング この複合体を固相にコーティングすることによって、結
合したａｂｐ−複合体と結合していないａｂｐ−複合体
とを有効に分離することができる。本実施例では以下の
方法を用いた。０．１２５ｍｌの透析物（７ＡＣＡ−ス
ペーサー−ＢＳＡ 複合体）を５００ｍｌの炭酸 ｐＨ
９．６に加えた。この溶液０．５ｍｌをポリスチレンス
ターチューブ（ＮＵＮＣ ＭＡＸＩＳＯＲＢ、登録商
標）に入れた。チューブを覆い、４℃で終夜インキュベ
ートした。インキュベートした後、β−ラクタム スペ
ーサー タンパク質複合体の希釈液をチューブから除去
し、２ｍｌの０．０５Ｍリン酸＋０．５％ＢＳＡ＋２％
ショ糖＋０．１Ｍ グリシン ｐＨ７．２を各チューブ
に加えた。２０℃で１時間保持した後、チューブを空に
し、２２−２７℃、湿度３０％以下で４８時間乾燥させ
た。乾燥したチューブは４℃で少なくとも１年間安定で
ある。

【００１４】洗浄液 有効な分離法は、以下に記載の溶液で固相（チューブ）
を洗浄することである。固相にコーティングされている
抗生物質に結合している複合体を、´試料´−抗生物質
に結合している複合体から分離する為の洗浄液は、以下
の様に調製される；

【００１５】 リン酸一ナトリウム １１．７ ｇ／ｌ リン酸二ナトリウム ２１．６ ｇ／ｌ 塩化ベンズアルコニウム ３．５７ ｇ／ｌ グリセロール ５００ ｍｌ／ｌ ツイーン２０ １２．５ ｍｌ／ｌ ｐＨ ６．５

【００１６】この溶液を、最終試験キットの安定性（一
年）及び輸送に有利な様に５０倍の濃度で作った。試験
には蒸留水（或いは水道水）で５０倍に希釈して用い
る。また他の低濃度の塩及び界面活性剤を含む溶液も利
用可能である。

【００１７】基質 ＨＲＰＯの基質には、酸素の生成によって容易に酸化さ
れる発色性基質を用いることができる。本実施例に於い
ては、ＴＳＩ社から購入した安定性と作用性の良い商品
ＴＭ−ブルー（登録商標、米国特許第５，０１３，６４
６号）を用いる。発色は、波長６５０ｎｍ或いは酸性化
した後の４５０ｎｍに於ける光学密度によって測定可能
である。

【００１８】停止液 １．５％ＮａＦ（或いは強酸）のような停止液を利用す
るとかなり安定性もあり、発色の差を時間単位で測定す
る場合には、更に良い定量が得られる。

【００１９】試験の実施（連続測定） ０．２ｍｌのミルク試料及び０．２ｍｌの希釈したａｂ
ｐ−酵素複合体を、空の反応アンプルに入れた。６４℃
で２分間インキュベートした後、チューブの内容物を、
コーティングしたチューブに移した。６４℃で２分間、
２回目のインキュベーションを行った後、コーティング
したチューブの内容物を流しに捨て、その後５０倍に希
釈した洗浄液をチューブに満たし、内容物を流しに捨
て、吸着紙にチューブを軽く叩きつけて残渣を除去する
ことを繰り返しながら、洗浄を３回行った。洗浄後、
０．５ｍｌのＴＭ−ブルー有色基質をチューブに添加し
た。これを室温で４分間インキュベートし、０．５ｍｌ
の停止液（１．５％ＮａＦ）を加えてインキュベートを
停止した。６５０ｎｍに於ける発色を、試料と並行して
試験した抗生物質の標準と比較した。凍結乾燥して保存
された抗生物質の標準を、便宜上試験キットの中に含め
る（少なくとも１年間安定である）。本法では、５ｐｐ
ｂのベンジルペニシリンの様な微量の抗生物質残渣を有
するミルク試料を総計８分のインキュベート時間で容易
に検出できる。試験結果を表１に示す。

【００２０】

【表１】 表１ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 試料 試料中に存在するPen.G リーダー単位* （％で表す） ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ １ ０ １００ ２ １．２５ ９６ ３ ２ ６９ ４ ３ ６５ ５ ４ ５１ ６ ５ ４７ ７ １０ ３２ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ＊リーダー単位：波長６５０ｎｍで測定 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 本実施例に従うこの試験は、他のβ−ラクタム類にも感
度を有しており、例として表２を参照のこと。

【００２１】

【表２】 表２ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ β−ラクタム抗生物質 感度 ｐｐｂ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ アモキシシリン ５ アンピシリン １０ セファピリン ５ セフチオファ ５ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ １回目と２回目のインキュベートする段階を組み合わせ
ることによって、競合測定を行うことができる。この試
験構成は、第２段階のインキュベートする時間を省略す
ることによって幾分速くなるだろう。しかしながら連続
測定としての感度は低くなる。

【００２２】

【実施例２】 抗生物質残渣試験 本実施例に於いては、ミルク中の３０ｐｐｂという低濃
度のゲンタマイシン残渣を検出する方法を述べる。ゲン
タマイシン測定法は、一般的にβ−ラクタム測定と同じ
基本に基づいて展開される。従って、本実施例に於いて
は、実施例１のβ−ラクタム測定と同じ大要を、相違点
を述べながら提供する。

【００２３】抗生物質結合タンパク質の入手 商品、抗ゲンタマイシン−兎抗体をＢｉｏｄｅｓｉｇｎ
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｋｅｎｎｅｂｕｎｋｐ
ｏｒｔ、Ｍａｉｎ、ＵＳＡより購入した。牛血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）担体の抗体を除去する為に、抗−ゲンタ
マイシン−兎抗血清を吸収した。１０ｍｇ／ｍｌのスル
ホサクシニックミジルスベレート−ＢＳＡ及び２ｍｇの
未反応ＢＳＡを含む溶液を１０対１の比で未精製の抗血
清と混合した。この様にして検出できるすべてのＢＳＡ
との反応性を除去した。

【００２４】抗生物質結合タンパク質と酵素標識との結合 吸収した抗−ゲンタマイシン抗血清と、スタフィロコッ
カス オーレウス由来のホースラディッシュ パーオキ
シダーゼを標識したプロテインＡと反応させて、抗生物
質結合タンパク質複合体を形成させた。１％ＢＳＡを含
むリン酸緩衝生理食塩水で希釈された２つの成分をチェ
ッカー盤滴定で測定し、抗体のプロテインＡに対する至
適比を決定した。

【００２５】ゲンタマイシンのタンパク質への結合 本実施例では、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）への結合に
ゲンタマイシンを用いた。最高の親和性及び特異性を得
る為に、ゲンタマイシンとＢＳＡとの間にスペーサーを
用いた。そのスペーサーは、実施例１で用いたものと同
様である。

【００２６】ゲンタマイシン−スペーサー−タンパク質
複合体の固相へのコーティング β−ラクタム試験で述べたように、ゲンタマイシン−ス
ペーサー−タンパク質複合体を固相にコーティングし
た。

【００２７】洗浄液、基質、停止液 ゲンタマイシン試験に於ける洗浄液、基質及び停止液は
β−ラクタム試験に於いて用いたものと同様である。

【００２８】試験の実施（連続測定） 実施例１で述べたβ−ラクタムの試験法と同様の試験法
をゲンタマイシン試験に用いることができる。しかしな
がら本試験ではインキュベーションをすべて２０℃で行
った。本試験では、３０ｐｐｂという微量の抗生物質残
渣を有するミルク試料（表３を参照すると、２．５ｐｐ
ｂの低値まで可能である）を総計８分間のインキュベー
ションで容易に検出できる。試験の結果を表３に示す。

【００２９】

【表３】 表３ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 試料 試料中に存在するゲンタ リーダー単位* マイシン ｐｐｂ （％で表す） ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ １ ０ １００ ２ ２．５ ５５ ３ ５ ３９ ４ １０ ３１ ５ ２０ ２３ ６ ３０ ２０ ７ ３６ １８ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ＊リーダー単位：６５０ｎｍの波長で測定 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━

【００３０】

【実施例３】 Ｎ−ペンタデカキス［Ｎ−（４−カ
ルボニル−３−メチルセフ−３−エム−７−イル）アミ
ノカルボニルエチルジエチルジチオエチルカルボニル］
牛血清の調製（１）段階Ａ ： ７β−（２−ピリジルジチオプロピオンアミ
ド）−３−メチル−３−セフェム−４−カルボン酸
（２）の調製

【００３１】

【化１】

【００３２】７β−アミノ−３−メチル−３−セフェム
−４−カルボン酸（３４．２８ｍｇ；０．１６ｍｍｏ
ｌ）を水（７ｍｌ）に懸濁し、撹拌して０．１Ｍ リン
酸緩衝液、ｐＨ８．０を用いてｐＨを７．１に調整し
た。その後温度を約３℃に保持しながら、Ｎ−サクシン
イミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸
（１００ｍｇ；０．３２ｍｍｏｌ）の無水エタノール
（１０ｍｌ）溶液を滴加した。反応混合物を更に３℃で
約７２時間撹拌し、水（２０ｍｌ）で希釈して、上方へ
移動する成分を除去する為にエーテルで抽出した。その
後水相を０．１Ｎ 塩酸でｐＨを２．５に調整した後、
酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル抽出物を集めて水で
洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、溶媒を減圧
下で除去して生成物（２）を恒量まで真空で乾燥させ
た。収量＝２８．４ｍｇ ＩＲスペクトル（ＫＢｒ）：３２９４、１７７８、１７
１２、１６８６ｃｍ^{-1 1}Ｈ ＮＭＲ（３６０ＭＨｚ；Ｃ
ＤＣｌ₃ ；ｐｐｍで表すδ−値；ＴＭＳ）：２．０６
（３Ｈ、ＣＨ ₃ ）；２．６８、２．９９［２ｘｍ、２ｘ
２Ｈ、（ＣＨ ₂ ） ₂ ］；３．２４、３．５３（ＡＢｑ、
Ｊ＝１８．７Ｈｚ、Ｃ ² Ｈ ₂ ）；５．０２（ｄ，１Ｈ，
Ｊ＝４．５Ｈｚ、Ｃ ⁶ Ｈ）；５．７０（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ
＝４．５Ｈｚ及びＪ＝７．９Ｈｚ、Ｃ ⁷ Ｈ）；７．２
１、７．７７、７．８７、８．４８（ｍ、１Ｈ；ｍ、１
Ｈ；ｄ、１Ｈ；ｄｄ、１Ｈ；ｐｙｒ；８．２０（ｄ、１
Ｈ、Ｊ＝７．９Ｈｚ ＮＨ）

【００３３】段階Ｂ： Ｎ−サクシニミド−３−（２−
ピリジルチオ）プロピオン酸による、２−ピリジルジス
ルフィド基の牛血清アルブミンへの導入及び特異的な還
元によるその後のチオール化

【００３４】

【化２】

【００３５】Ｊ．Ｃａｒｌｓｓｏｎ、Ｈ．Ｄｒｅｖｉｎ
ａｎｄ Ｒ．Ａｘｅｎ［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（１９
７８年）１７３巻、７２３ページ］の記載に従って、こ
れを遂行した。 Ｎ−サクシンイミジル３（２−ピリジルジチオ）−プロ
ピオン酸（１００ｍｇ；３２０μｍｏｌ）の無水エタノ
ール（４ｍｌ）溶液を、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）
（３）（２６５ｍｇ；４．０μｍｏｌ）の０．１Ｍ リ
ン酸ナトリウム緩衝液／０．１Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ７．
５３（４ｍｌ）溶液に、室温（２４℃）で撹拌しながら
滴加した。約２４℃で３５分間撹拌した後、反応混合物
をセファデックスＧ−２５（３８ｇ）（溶出液：０．１
Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液／０．１Ｍ ＮａＣｌ ｐ
Ｈ７．５３）を用いたゲルろ過により分離した。タンパ
ク質−２−ピリジルジスルフィド誘導体（４）を含む画
分を集めた。重量＝２５．６６３５ｇであった。ジチオ
スレイトールで還元後の、０．０９８２８ｇ（４）（上
記の画分から得られる）のＵＶ−スペクトル（λmax
３４３ｎｍ）の測定値は、ｍｏｌ−牛血清アルブミン当
たり２４ｍｏｌの２−ピリジルジスルフィド構造が取り
入れられたことを示した。

【００３６】その後、［４μｍｏｌの牛血清アルブミン
−２−ピリジルジスルフィド誘導体（４）を含む］画分
を集めて凍結乾燥し、再度、水（１０ｍｌ）に溶解し、
その後セファデックスＧ−２５によるゲルろ過を行い、
濃縮されたタンパク質−結合２ピリジルジスルフィド誘
導体（４）の緩衝液のｐＨを、０．１Ｍ クエン酸−ク
エン酸ナトリウム緩衝液／０．１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ
５．８１を用いて５．８１に変えた。牛血清アルブミン
−２−ピリジルジスルフィド誘導体（４）を含む画分を
集め、室温（２３℃）にてジチオスレイトール（６１．
７ｍｇ；４００μｍｏｌ）で処理し、更に同温で１．５
時間撹拌した。その後タンパク質−結合チオール基誘導
体（５）をセファデックス−２５を用いたゲルろ過によ
って分離し、０．１Ｍ クエン酸−クエン酸ナトリウム
緩衝液／０．１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ５．８１で溶出し
た。これらの画分を合わせて凍結乾燥した。牛血清アル
ブミン−結合チオール基誘導体（５）（４μｍｏｌ）を
含む凍結乾燥品の緩衝液のｐＨを、０．１Ｍ リン酸緩
衝液／０．１Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ７．５３（５ｍｌ）に
溶かすことによって７．５３に変え、その後溶出液とし
て同じ緩衝液を用いてセファデックス２５によるゲルろ
過を行った。牛血清アルブミン誘導体（５）を含む画分
を集めた。重量＝２２．８３９８ｇであった。

【００３７】段階Ｃ： Ｎ−ペンタデカキス［Ｎ−（４
−カルボキシル−３−メチルセフ−３−エム−７−イ
ル）アミノカルボニル−エチルジチオエチルカルボニ
ル］牛血清（１）を生成させる為の、７β−（２−ピリ
ジルジチオプロピオンアミド）−３−メチル−３−セフ
ェム−４−カルボン酸（２）（３４．２８ｍｇ）の、牛
血清アルブミン−結合チオ−ル基誘導体（５）との反応

【００３８】

【化３】

【００３９】段階Ａで得られた７β−（２−ピリジルジ
チオプロピオンアミド）−３−メチル−３−セフェム−
４−カルボン酸（２）（３４．２８ｍｇ）を０．１Ｍ
リン酸ナトリウム緩衝液／０．１Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ
７．５３に溶かした溶液を、段階Ｂで得られた牛血清ア
ルブミン−結合チオール基誘導体（５）（９．１４３３
ｇ；１．６μｍｏｌ）の溶液に２０℃で撹拌しながら添
加した。反応混合物を２０℃で更に２時間撹拌した後、
０℃で２日間放置した。反応混合物のＵＶ−スペクトル
の測定値（λmax ３４３ｎｍに於ける）は、１ｍｏｌの
牛血清アルブミン当たり１５ｍｏｌのＮ−（４−カルボ
キシル−３−メチルセフ−３−エム−７−イル）アミノ
カルボニルエチルジチオエチルカルボニル単位（ｎ＝
０）が取り入れられたことを示した。その後反応混合物
を、セファデックスＧ−２５を用いたゲルろ過（溶出
液：０．１Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液／０．１Ｍ Ｎ
ａＣｌｐＨ７．５３）によって精製した。λmax ２６５
ｎｍを有する画分を集めて凍結乾燥させた。溶出液とし
て水を用いてセファデックスＧ−２５によるゲルろ過を
行うことにより、該凍結乾燥品を脱塩した。Ｎ−ペンタ
デカキス［Ｎ−（４−カルボキシ−３−メチルセフ−３
−エム−７−イル）アミノカルボニルエチルジチオエチ
ルカルボニル］牛血清（１）を含む画分を合わせて凍結
乾燥させた。収量＝９３．６ｍｇ。５．６０及び４．９
８ｐｐｍにおいてβ−ラクタムプロトンをそれぞれ示
し、１．９２ｐｐｍにおいてＣＨ3 シグナルを示す１Ｈ
ＮＭＲスペクトル（６００ＭＨｚ；Ｄ2 Ｏ；δ−値）に
よって生成物（１）が同定された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ロジャー ピアジオ アメリカ合衆国 メイン州 04106 サウ ス ポートランド ダーリング アベニュ ー 95 (72)発明者 ヤフディス ハンデル カピュール オランダ 2624 カーベー デルフト ロ ーランド ホルストラーン 799 (72)発明者 ニコラース コルネリス マリア エマニ ュエル バレンドス オランダ 2635 ハーセー デン ホール ン プリンセス ベアトリックスストラー ト ５ (72)発明者 ヘンリー ヘラルド ユリウス ヒルス オランダ 2717 デーデー ズーテルメー ル オブレヒトローデ 26 (72)発明者 ヤン ヴェルウェイユ オランダ 2313 エーエス レイデン ペ ー イェー ブロクストラート 13

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】（ａ）液体媒体の流体試料、少なくとも１
   種類の標識をした抗生物質結合タンパク質、及び少なく
   とも１種類の固定化抗生物質を一緒に入れ、 （ｂ）標識した抗生物質結合タンパク質を固定化抗生物
   質に結合させ、 （ｃ）固定化抗生物質に結合していない標識した抗生物
   質結合タンパク質を除去し、 （ｄ）固定化抗生物質に結合している標識した抗生物質
   結合タンパク質の量を決定する、ことを含む、液体媒体
   中の少なくとも１種類の抗生物質を検出する方法。
2. 【請求項２】 液体媒体がミルク、尿、血液である請
   求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 段階（ａ）が、標識した抗生物質結合
   タンパク質を液体試料と接触させ、試料中の抗生物質を
   酵素標識した抗生物質結合タンパク質に結合させ、その
   後固定化抗生物質を加えることを含む請求項１または２
   に記載の方法。
4. 【請求項４】 固定化抗生物質が液体試料中に存在す
   る抗生物質と同一である請求項１〜３の何れか１つに記
   載の方法。
5. 【請求項５】 固定化抗生物質が液体試料中に存在す
   る抗生物質と異なる請求項１、２または３の何れか１つ
   に記載の方法。
6. 【請求項６】 固定化抗生物質がβ−ラクタム、テト
   ラサイクリン、サルファ化合物及びゲンタマイシンのう
   ちの少なくとも１つである請求項１〜５の何れか１つに
   記載の方法。
7. 【請求項７】 固定化抗生物質が、試験管、ディプス
   ティック、プレート或いはビーズに固定化される請求項
   １〜６の何れか１つに記載の方法。
8. 【請求項８】 固定化抗生物質がβ−ラクタム−スペ
   ーサー−タンパク質複合体である請求項１〜７の何れか
   １つに記載の方法。
9. 【請求項９】 固定化抗生物質が牛血清アルブミン
   （ＢＳＡ）により固相に結合している請求項１〜８の何
   れか１つに記載の方法。
10. 【請求項１０】 抗生物質結合タンパク質が抗生物質感
    受性微生物、好ましくはバチルス スアテロサーモフィ
    ルス株から得られる請求項１〜９の何れか１つに記載の
    方法。
11. 【請求項１１】 標識が酵素、好ましくはパーオキシダ
    ーゼ、更に好ましくはホースラディッシュ パーオキシ
    ダーゼである請求項１〜１０の何れか１つに記載の方
    法。
12. 【請求項１２】 段階（ｄ）が、酵素標識した抗生物質
    結合タンパク質の酵素に反応を触媒させる或いは阻害さ
    せることを含む請求項１１に記載の方法。
13. 【請求項１３】 標識が蛍光化合物である請求項１〜１
    ０の何れか１つに記載の方法。
14. 【請求項１４】 抗生物質結合タンパク質がアフィニテ
    ィークロマトグラフィーによって得られる請求項１〜１
    ３の何れか１つに記載の方法。
15. 【請求項１５】 少なくとも１種類の標識をした抗生物
    質結合タンパク質及び少なくとも１種類の固定化抗生物
    質を含む前記請求項の何れか１つに於いて請求項１〜１
    ４のいずれかに記載の方法を遂行するためのキット。
16. 【請求項１６】 結合性化合物によって容器の内部表面
    に固定化された抗生物質。
17. 【請求項１７】 結合性化合物がＢＳＡである請求項１
    ６に記載の抗生物質。
18. 【請求項１８】 請求項１〜１４の何れか１つの方法或
    いは請求項１５のキットで使用するための、抗生物質を
    内部にコーティングしている容器。
19. 【請求項１９】 抗生物質が請求項１６または１７に記
    載のものである請求項１８に記載の容器。
20. 【請求項２０】 ７ＡＣＡ−スペーサー−ＢＳＡ及びＮ
    −ペンタデカキス［Ｎ−（４−カルボニル−３−メチル
    セフ−３−エム−７−イル）アミノ−カルボニルエチル
    ジチオエチルカルボニル］ＢＳＡからなる群から選ばれ
    る抗生物質−ＢＳＡ複合体。
21. 【請求項２１】 液体媒体中の抗生物質の検出法に於け
    る抗生物質−ＢＳＡ複合体の利用。