CN110579606A

CN110579606A - 一种快速定量检测青霉素的检测卡及其应用

Info

Publication number: CN110579606A
Application number: CN201910833217.3A
Authority: CN
Inventors: 武玉香; 沈志强
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2019-09-04
Filing date: 2019-09-04
Publication date: 2019-12-17

Abstract

本发明实施例公开了一种快速定量检测青霉素的检测卡及其应用，所述检测卡包括底板、样品垫、结合垫、基膜和吸水垫，其特征在于，所述的结合垫中含有量子点标记的青霉素结合蛋白；本发明检测卡采用量子点标记青霉素结合蛋白，能够大大提高荧光检测的灵敏度；此外，本发明检测卡可以快速、灵敏、定量的检测青霉素，采用量子点定量读数仪能够快速检测出结果，大大缩短了检测时间，为现场检测提供了方便。

Description

一种快速定量检测青霉素的检测卡及其应用

技术领域

本发明实施例涉及青霉素检测技术领域，具体涉及一种快速定量检测青霉素的检测卡及其应用。

背景技术

青霉素G(penicillin G，苄青霉素)一般也叫青霉素，由青霉菌培养液中获得，具有作用强、产量高、价格低廉的特性，目前仍是治疗敏感菌的首选药物。青霉素G是一种有机酸，可与金属离子或有机碱结合成盐。低剂量的青霉素不引起毒性反应。大剂量应用，可出现神经-精神症状，如反射亢进、知觉障碍、幻觉、抽搐、昏睡等，也可导致短暂的精神失常，停药或降低剂量可恢复。对于少数有凝血障碍的患者，大剂量青霉素可扰乱凝血机制，导致出血。还会出现赫氏反应。

农业部235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》规定青霉素G在牛奶中的限量为4μg/L，肉中限量为50μg/kg，中国和欧共体(EEC)限量标准相同。

青霉素结合蛋白(PBP)是一类结合在膜上的酶，PBP也是β-内酰胺类抗生素的主要靶标，尤其对青霉素G有强烈的亲和力，应用青霉素结合蛋白快速检测牛奶中青霉素残留早已经在牛奶检验中得到了广泛应用，其基本原理是通过胶体金标记物与抗原反应形成胶体金本身的红色，可通过肉眼观察检测结果。但是对于青霉素含量低于检测限的样本，胶体金检测很难用肉眼来判断结果，灵敏度较低。

发明内容

为此，本发明实施例提供一种快速定量检测青霉素的检测卡，以解决现有技术中现有青霉素检测卡林敏度较低的问题。

为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：

根据本发明实施例的第一方面一种快速定量检测青霉素的检测卡，所述检测卡包括底板、样品垫、结合垫、基膜和吸水垫，其特征在于，所述的结合垫中含有量子点标记的青霉素结合蛋白。

进一步地，所述青霉素结合蛋白为山东绿都生物科技有限公司生产的青霉素结合蛋白。

本发明检测卡采用量子点标记青霉素结合蛋白，通过选择上述青霉素结合蛋白以及采用量子点进行标记，能够大大提高荧光检测的灵敏度；此外，本发明检测卡可以快速、灵敏、定量的检测青霉素，采用量子点定量读数仪能够快速检测出结果，大大缩短了检测时间，为现场检测提供了方便。

进一步地，所述量子点为ZnS/CdSe复合量子点。本发明通过采用ZeSe核上包裹CdSe组成复合量子点，能大大提高荧光检测的灵敏度。

进一步地，所述量子点标记的青霉素结合蛋白通过如下方法制得：

将量子点和N-羟基琥珀酰亚胺混合，在室温搅拌下进行反应，然后加入N，N′-二环己基碳二亚胺和青霉素结合蛋白，室温下反应，离心弃掉上清，将沉淀进行复溶，即得所述量子点标记好的青霉素结合蛋白。

进一步地，所述量子点和N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1∶(0.8-1.2)。

进一步地，所述量子点与N，N′-二环己基碳二亚胺的添加量的质量比为1∶(1.8-2.2)。

进一步地，所述量子点和青霉素结合蛋白的添加量的质量比为1∶(1.8-2.2)。进一步地，所述基膜上设置有检测线和控制线，所述控制线上包被有羊抗鼠二抗或抗青霉素结合蛋白的抗体；所述检测线上包被有青霉素全抗原。

进一步地，所述青霉素全抗原通过如下方法制得:

(a)将青霉素G溶解于蒸馏水中，随后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)、混匀，得到混合液；

(b)将混合物在室温条件下进行活化；

(c)将载体蛋白溶解于硼酸缓冲液，得到载体蛋白溶液；

(d)将载体蛋白溶液液滴加到活化后的混合液中进行反应，即得所述青霉素全抗原。

进一步地，所述样品垫通过如下方法制得：

将样品垫在含有5％牛血清白蛋白、0.1％吐温20、0.1％NaN3、5％丙氨酸的0.9％生理盐水溶液中进行浸泡、烘干即可。

本发明通过上述方法制得的样品垫，提升了丙氨酸含量，并提升了3倍C、T线的吸光度，进而使得生产成本降低了3倍。

根据本发明实施例的第二方面提供一种上述检测卡在检测牛奶中青霉素残留中的应用。

本发明实施例具有如下优点：

(1)本发明检测卡采用量子点标记青霉素结合蛋白，通过选择上述青霉素结合蛋白以及采用量子点进行标记，能够大大提高荧光检测的灵敏度；此外，本发明检测卡可以快速、灵敏、定量的检测青霉素，采用量子点定量读数仪能够快速检测出结果，大大缩短了检测时间，为现场检测提供了方便。

(2)本发明通过上述方法制得的样品垫，提升了丙氨酸含量，并提升了3倍C、T线的吸光度，进而使得生产成本降低了3倍。

(3)本发明通过采用ZeSe核上包裹CdSe组成复合量子点，能大大提高荧光检测的灵敏度。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。

图1为本发明实施例1中提供的青霉素全抗原紫外扫描图；

图2为本发明实施例6中提供的一种快速定量检测青霉素的检测卡的结构示意图；

图3为本发明实验例1中提供的检测卡的标准曲线图；

图中：1-样品垫；2-底板；3-结合垫；4-检测线；5-控制线；6-基膜；7-吸水垫。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例为一种青霉素全抗原的制备方法，该制备方法包括如下步骤：

称取5mg青霉素G，加入1000μL蒸馏水溶解，再加入EDC 30mg，混匀；置于25℃摇床内，180rpm摇晃1h进行羧基活化；

称取50mg牛血清白蛋白，加入2ml pH9.0的0.1M硼酸缓冲液；

将牛血清白蛋白溶液滴加到活化后的青霉素溶液中，置于25℃摇床内，180rpm摇晃2h，得到青霉素全抗原。

将上述青霉素全抗原进行紫外扫描鉴定；鉴定结果如图1所示；

由图1可知，青霉素G在300nm处有吸收峰，BSA等蛋白在280nm处有吸收峰，青霉素全抗原在280nm和300nm均有强烈的吸收峰，因此确定偶联成功。

实施例2

本实施例为一种量子点标记青霉素结合蛋白的方法，该方法包括如下步骤：

将1ml(1000μg)ZnS/CdSe复合量子点(由山东绿都生物科技有限公司生产，批号LD028-L)和1000μgN-羟基琥珀酰亚胺混合，在室温下搅拌反应20min，然后加入2000μg N，N′-二环己基碳二亚胺和2000μg青霉素结合蛋白(来源于山东绿都生物科技有限公司，货号LD-Ag089)，室温下反应1.5h，离心弃掉上清，将沉淀用含有1％牛血清蛋白、0.05％NaN₃的0.01M PBS溶解，即得到量子点标记的青霉素结合蛋白。

实施例3

本实施例为一种含有量子点标记的青霉素结合蛋白的结合垫的制备方法，该制备方法包括如下步骤：

选择聚酯纤维6613作为结合垫，将结合垫浸泡在含有0.2％Triton X-100、0.5％丙氨酸、0.05％NaN3的pH7.4 0.01M PBS缓冲液中5min，取出37℃烘干；将实施例2中制得的1mg/ml(以量子点质量计算)的量子点标记的青霉素结合蛋白用划膜仪以10μL/cm的浓度喷涂在处理好的结合上，室温自然晾干，制成含有量子点标记的青霉素结合蛋白的结合垫。

实施例4

本实施例为一种样品垫的制备方法，该制备方法包括如下步骤：

选择GRADE-2为样品垫，将样品垫在含有5％牛血清白蛋白、0.1％吐温20、0.1％NaN3、5％丙氨酸的0.9％生理盐水溶液中进行浸泡5min，取出37℃烘干即可。

实施例5

本实施例为一种基膜的制备方法，该制备方法包括如下步骤：

分别将实施例1制备得到的青霉素全抗原和抗青霉素结合蛋白的抗体(由山东绿都生物科技有限公司生产，批号LDAb038)作为检测线和控制线用划膜仪依次以0.5μL/cm的浓度喷涂在硝酸纤维素膜上，其中青霉素全抗原浓度为0.1mg/ml，抗青霉素结合蛋白的抗体浓度为0.05mg/ml，37℃包被2h后，室温自然晾干，制成基膜。

实施例6

本实施例为一种快速定量检测青霉素的检测卡，由图2可知，该检测卡包括底板2、实施例4中制备得到的样品垫1、实施例3中制备得到的结合垫3、实施例5中制备得到的基膜6和吸水垫7；上述基膜6上设置有检测线4和质控线5。

实验例1

本实验例为确定实施例6中检测卡的标准曲线

取空白新鲜牛奶，分别添加系列浓度青霉素标准物质(百灵威J&k,编号244024)，分别为0μg/kg，0.5μg/kg，1μg/k，1.5μg/kg，5μg/kg，10μg/k，20μg/kg；采用实施例6中的检测卡按照如下检测方法进行检测：

提前打开孵育器预热到37℃；

拉出孵育器槽，将检测卡平放于孵育器槽内靠里侧，用移液器吸取100微升待检样品溶液到检测卡的加样孔中，然后将槽推进孵育器内孵育；

记时8min，孵育完毕后取出检测卡，请于2分钟内读数；

读数前5分钟打开量子点免疫分析仪到主界面，将检测卡插入量子点分析仪中，点击项目与样品测试，选择样品类型，即时检测，结果将呈现于读数仪显示屏上；读取t/c比值，以青霉素标准物质系列浓度为横坐标，以t/c比值为纵坐标，选择线性最好的5个点作为横纵标绘制标准曲线，见图3；

由图3可知，青霉素线性R：R＝0.9902，拟合标准曲线为y＝-1.9497x+0.8163。

实验例2

本实验例为实施例6中检测卡的准确度和精密度的研究

农业部781号公告-11-2006牛奶中青霉素类药物残留量的测定高效液相色谱法；按照以上国标方法与本发明实施例6中的检测卡进行检测的方法分别对20份牛奶样本进行测定，平行测定3次，比较测定结果平均值，测定结果如表1所示：

表1

注：“ND”表示未检出。

由表1可知，比较测定结果平均值，验证本发明的准确性和可靠性；国标测定与本发明检测结果进行T检验，为本发明检测的平均质量分数，μ为农业部781号公告-11-2006对同一样本检测的平均质量分数，s为标准偏差，t＝0.895，t<t_0.05(1.725)，说明2种方法对样本的检测结果无显著差异；表明本发明检测方法与农业部781号公告-11-2006测定结果的符合率大于95％；因此本发明检测卡具有较高的准确度和精密度。

实验例3

将实施例6中的检测卡，分别放置于37℃和常温，分别在0天、7天、14天、21天、30天、6个月、12个月进行检测，检测结果如表2所示；

表2

由表2可知，37℃保存1天相当于常温保存15天，37℃加速破坏检测卡的稳定性，由表2测试结果可知，本发明检测卡在常温下的保质期为至少6个月，具有较好的稳定性。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种快速定量检测青霉素的检测卡，所述检测卡包括底板、样品垫、结合垫、基膜和吸水垫，其特征在于，所述的结合垫中含有量子点标记的青霉素结合蛋白。

2.根据权利要求1所述的检测卡，其特征在于，所述量子点为ZnS/CdSe复合量子点。

3.根据权利要求1或2所述的检测卡，其特征在于，所述量子点标记的青霉素结合蛋白通过如下方法制得：

4.根据权利要求3所述检测卡，其特征在于，所述量子点和N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1∶(0.8-1.2)。

5.根据权利要求3所述检测卡，其特征在于，所述量子点与N，N′-二环己基碳二亚胺的添加量的质量比为1∶(1.8-2.2)。

6.根据权利要求3所述检测卡，其特征在于，所述量子点和青霉素结合蛋白的添加量的质量比为1∶(1.8-2.2)。

7.根据权利要求1或2所述的检测卡，其特征在于，所述基膜上设置有检测线和控制线，所述控制线上包被有羊抗鼠二抗或抗青霉素结合蛋白的抗体；所述检测线上包被有青霉素全抗原。

8.根据权利要求6所述检测卡，其特征在于，所述青霉素全抗原通过如下方法制得:

(a)将青霉素G溶解于蒸馏水中，随后加入EDC、混匀，得到混合液；

(b)将混合物在室温条件下进行活化；

(c)将载体蛋白溶解于硼酸缓冲液，得到载体蛋白溶液；

9.根据权利要求1所述的检测卡，其特征在于，所述样品垫通过如下方法制得：

将样品垫在含有5％牛血清白蛋白、0.1％吐温20、0.1％NaN₃、5％丙氨酸的0.9％生理盐水溶液中进行浸泡、烘干即可。

10.权利要求1-9任一所述的检测卡在检测牛奶中青霉素残留中的应用。