JPH05223816A - 末梢血液中のリンパ球亜型分類のための方法と試薬組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】 直接標識吸収染色を含む、免疫表現分類に有
用な新規の方法と試薬組成物とを提供する。 【構成】 ウシ−腸管アルカリ性ホスファターゼを、直
接免疫酵素標識のため、マウス単クローン抗体（抗−Ｃ
Ｄ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９）に抱合させ
る。赤血球はアルカリ性ホスファターゼ抱合単クローン
抗体と一緒の第一培養期間での硫酸アンモニウムにより
溶血のために前準備され、つづいてデキストロース存在
下で白血球を早期に固定する。ｐＨ９．５±０．１で、
グリシン亜鉛を含有するジエタノールアミン緩衝剤中の
５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート
とニトロブルー−テトラゾリウム塩との組合せを、アル
カリ性ホスファターゼ抱合単クローン抗体で標識された
細胞表面上に、安定で、不溶性で強い紫色の沈澱物を生
じさせるために、緩衝剤／基質として用いる。顆粒球と
リンパ球との分離は前方光散乱／吸収光学によって検出
する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の分野】本発明は免疫表現型分類の方法と試薬組
成物、一層特別には前方光散乱／吸収流通血球計（ｆｌ
ｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）に用いるのに適合した、直
接標識吸収−染色法とそのための試薬とに関する。

【０００２】

【先行技術の説明】リンパ球細胞の流通血球計分析は免
疫学的並に生物学的研究の多くの分野において重要な影
響をもっている。免疫システムの、細胞により表現され
る種々な分別抗原（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ
ａｎｔｉｇｅｎ）と特異的に結合する色色な単クローン
抗体が使用できる。多くのその様な抗体はリンパ球部分
集合の計数のための信頼できる試薬を提供する。主要な
適用は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を持つ患者
からの末梢血液中のＨｅｌｐｅｒＴ細胞の数の監視およ
び血液−リンパ悪性腫瘍の系統の特徴づけならびに移植
医学にある。

【０００３】極めて普通には、末梢血液リンパ細胞の部
分集合は、免疫色素−抱合単クローン抗体を用いて（直
接免疫蛍光法）あるいは抱合されていない単クローン抗
体に対して向けられている蛍光色素−抱合抗体を用いて
（間接免疫蛍光法）細胞を標識することにより識別され
る。細胞懸濁液中、標識された細胞は蛍光により識別さ
れ、顕微鏡的にあるいは光散乱／蛍光流通血液計を用い
て計数される。例えば米国特許第４，２８４，４１２号
を見よ。典型的には、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅの
勾配で分離された単クローン細胞あるいは溶血された全
血試料からの白血球が分析に用いられる。

【０００４】マウスの単クローン抗体と、アルカリ性ホ
スファターゼ（ＡＰ）と単クローン抗−ＡＰ（ＡＰＡＡ
Ｐ）との抗マウスＩｇＧ−免疫複合体とを用いる免疫酵
素標識は組織切片と細胞標本との優れた免疫細胞化学的
標識を与えることが見出されている。骨髄並にリンパ球
白血病からの白血病細胞は骨髄またはリンパ球抗原と反
応する単クローン抗体を利用して、血液および骨髄に関
するＡＰＡＡＰ技術により免疫表現型分類された。Ｐｈ
ｉｌａｄｅｌｐｈｉａ染色体−陽性芽細胞白血病の単ク
ローン抗体研究もまたＡＰＡＡＰ技術を用い、血液およ
び骨髄標本について行われた。しかし、これらのＡＰＡ
ＡＰ法は非常に長時間かかり、退屈であり、自動化され
た方法に用いるには容易には適合できない。アルカリ性
ホスファターゼの特異単クローン抗体への直接的な抱合
は、流通血球計による特定の目標細胞の直接免疫表現型
分類をして、もしＡＰＡＡＰ技術の感度に匹敵できる感
度が得られるならばその手順を非常に短くさせるであろ
う。

【０００５】アルカリ性ホスファターゼは多数の種並に
組織中で見出されるアイソザイムの広く分布されている
族である。ウシ（Ｃａｌｆ）腸管のアルカリ性ホスファ
ターゼ抱合体は、多くの内因性組織アルカリ性ホスファ
ターゼが腸内形成を阻害しないレバミゾールにより特異
的に阻害され得ない故に、特異的抗原を局在化するため
の標識にはよい選択である。着色された生成物を生ずる
種々な基質がアルカリ性ホスファターゼ活性の測定に用
いられている。ｐ−ニトロフェニルホスフェートは可溶
性着色生成物生成のためにしばしば用いられ、ナフトー
ルＡＳ−ＢＩホスフェート、ナフトールＡＳ−ＭＳホス
フェートは不溶性着色生成物生成のために、アルカリ性
ホスファターゼ基質中では、非常にしばしばジアゾニウ
ム塩と１緒に用いられる。我々は本発明中で用いるため
の前記の基質を検討したがどれも、はっきりした分離の
ために、標識に細胞から充分に大きい吸収信号を生じな
かった。５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホス
フェート（ＢＣＩＰ）とニトロブルー−テトラゾリウム
塩（ＮＢＴ）との組合せが以前ＭｃＧａｄｅｙにより発
見され、ＡＰＡＡＰ技術を用いるアルカリ性ホスファタ
ーゼの組織化学的定位に対しての感度を増大させた。

【０００６】先行技術における前記の欠点の見地から、
末梢血液リンパ球亜型分類のために開発され、常用の臨
床血液学装置例えばＴｅｃｈｎｉｃｏｎＨ・１^TM血液分
析機（Ｔｅｃｈｎｉｃｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃ
ｏｒｐ．，Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）で
実施できる、迅速で、直接的な免疫アルカリ性ホスファ
ターゼ法並に付随した試薬とが必要であることが容易に
明らかになった。

【０００７】

【本発明の目的】直接標識吸収染色を含む、免疫表現分
類に有用な新規の方法と試薬組成物とを提供することが
本発明の目的である。

【０００８】本発明の他の目的は迅速な直接末梢血液リ
ンパ球亜型分類に用いることができる前記の方法および
試薬組成物を提供することにある。

【０００９】本発明の更に他の目的は前方光散乱／吸収
流通血球計に用いることができる前記の方法および試薬
組成物を提供することにある。

【００１０】本発明の更に他の目的は高められた温度で
実施でき、それで、現存の技術に比較して分析に要する
時間を減少することができる前記の方法および試薬組成
物を提供することにある。

【００１１】本発明の尚その上の目的は、未染色リンパ
球を前方光散乱／血球計技術により未染色顆粒球と容易
に区別することができる試薬組成物を提供することにあ
る。

【００１２】本発明の尚他の目的は安定な亜鉛含有アル
カリ性溶液を提供することにある。

【００１３】本発明の尚他の目的は標識され、そして染
色された白血球細胞の安定した懸濁液を提供することで
ある。

【００１４】本発明の他の目的並に特徴は一部分は明ら
かであり、一部分は以下で指摘されるであろう。

【００１５】

【発明の要約】本発明はアルカリ性ホスファターゼ抱合
単クローン抗体標識細胞を用い、前方光散乱／吸収流通
血球計技術を採用する、末梢血液中のリンパ球亜型分類
すための、迅速、簡単、正確で鋭敏な方法およびそのた
めの試薬組成物を提供する。

【００１６】本発明の好ましい態様に従うと、ウシ−腸
管アルカリ性ホスファターゼを指向性の（ｄｉｒｅｃｔ
ｅｄ）免疫酵素標識のためマウス単クローン抗体（抗−
ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９）と抱合さ
せる。赤血球をアルカリ性ホスファターゼ抱合単クロー
ン抗体との第１培養期間中、硫酸アンモニウムにより溶
血の前準備をし、つづいてデキストロース存在の下で、
白血球の早期固定をする。グリシン亜鉛を含有している
ジエタノールアミン緩衝剤中の５−ブロモ−４−クロロ
−３−インドリルホスフェートとニトロブルー−テトラ
ゾリウム塩との組合せを、単クローン抗体−アルカリ性
ホスファターゼ抱合体で標識された細胞表面に、安定、
不溶性で強い紫色の沈澱物を生成し、前方光散乱／吸収
光学により検出して顆粒球とリンパ球との明瞭な分離を
もたらすために緩衝剤／基質として選択する。

【００１７】本発明の他の態様に従えば、顆粒球中の内
因性のアルカリ性ホスファターゼはレバミゾール（ｌｅ
ｖａｓｉｍｏｌｅ）で阻害される。白血球の早期の緩和
な固定は高められた温度例えば３８±１℃での細胞培養
を可能にし、それがこの手順を通じて細胞を破壊するこ
となく、反応の各段階を促進する。この方法は、ＡＰ抱
合抗−ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ１９
単クローン抗体を用いて示される如く、迅速さと感度と
正確さとにおいて、蛍光流通血球計で用いられる直接免
疫蛍光全血法と張合っている。

【００１８】

【好ましい態様の説明】本発明の重要な特徴は、前方光
散乱／吸収流通血球計における直接標識−吸収染色技術
によって免疫表現型分類を行うため、アルカリ性ホスフ
ァターゼ抱合単クローン抗体を使用することにある。

【００１９】提案している方法によるリンパ球部分集合
の正確な計数のためには、リンパ球群の、他の細胞群か
らの明瞭な分離が得られることが重要である。前方角光
散乱軸に沿っての、未染色リンパ球の未染色顆粒球から
の明瞭な分離は非常に困難な仕事である。散乱−蛍光流
通血球計例えばＣｏｕｌｔｅｒのＥｐｉｃｓシステムま
たはＢ−ＤのＦａｃｓシステムは２軸、前方角と直角、
光散乱を用いての２つの細胞群を分離する。Ｔｅｃｈｎ
ｉｃｏｎＨ・１^TMあるいはＴｅｃｈｎｉｃｏｎＨ・２^TM
装置は、リンパ球分類に用いられるペルオキシダーゼ光
学において、唯１つの光散乱チャンネルを持つのみであ
る。

【００２０】我々は緩衝剤１基質に対し約０．０７〜約
０．２５ｍＭの濃度の亜鉛例えば塩化亜鉛、硫酸亜鉛ま
たは酢酸亜鉛の少量が、多分亜鉛が顆粒細胞蛋白質の損
失を防止するため、顆粒細胞により起される前方角光散
乱信号のパルスの波高を増大することを発見した。

【００２１】我々はまた固定剤中約７〜約１５ｖ／ｖ％
濃度のデキストロースと染料／基質／緩衝剤中（亜鉛の
ほかに）約０．５〜約２．０ｍＭ濃度のＮＢＴとが顆粒
細胞の未染色リンパ球からの分離を可能にさせることも
発見した。

【００２２】全血試料中の赤血球の、出来る限り短時間
での完全な溶血が、末梢血液リンパ細胞亜型分類のため
の迅速法開発には重要である。不完全に溶血された赤血
球の幻影は望ましくない発生雑音の源である。我々は更
に、アルカリ性ホスファターゼ抱合単クローン抗体の希
釈剤に少量の硫酸アンモニウムを添加し、全血をその混
合物と短時間培養することが引き続く固定段階を通って
あとの迅速溶血のために、赤血球を前準備するも発見し
た。従って、本発明の他の態様に従うと、約１〜約５ｖ
／ｖ％、好ましくは２．５ｖ／ｖ％濃度で硫酸アンモニ
ウムを、アルカリ性ホスファターゼ抱合単クローン抗体
を含有する溶液に、（この溶液２０μｌを標識のため全
血１００μｌに加える）温度約３５〜約４０℃、好まし
くは３８±１℃での最初５分間の培養中添加し、２つの
目的：（ｉ）目標細胞への抗体の結合と（ｉｉ）赤血球
の前準備を達成させる。

【００２３】方法の開発においては正確で再現性のある
データを得ることが非常に重要な要因である。アルカリ
性ホスファターゼによる基質の交替は連続的である故
に、アルカリ性ホスファターゼ活性細胞（標識されたリ
ンパ球および結局、レバミゾール存在の下での顆粒細
胞）により発生される吸収信号の位置を決定するのは非
常に困難である。調製された細胞懸濁液の染色は時間と
共に増大しつづける。その細胞懸濁液の酸性化によるア
ルカリ性ホスファターゼの停止は多くの問題例えば顆粒
細胞散乱信号の低下をもたらす。細胞懸濁液へのホルム
アルデヒドのみの添加、ｐＨ９．５±０．１、は凡ての
細胞群の前方角散乱信号を高い方に変化させ、それによ
って、定められた培養時間（約３時間）後の試料の分析
は最早不可能になる。ウシ−腸管アルカリ性ホスファタ
ーゼの既知の阻害剤例えばＥＤＴＡは吸収信号の高さを
安定化しない。

【００２４】本発明の他の態様に従うと、濃度約２〜約
６ｖ／ｖ％のホルムアルデヒドと殆んど自然のｐＨ６．
０〜７．０のリン酸塩緩衝剤との組合せが、引延ばされ
た時間例えば１週間の間の、調製された細胞懸濁液の染
色の増大を、試料のサイトグラムの本来の姿を損うこと
なく停止させるのに用いられる。このことは調製１週間
以内の都合のよい時のいつでも、調製した細胞懸濁液の
分析が許されることになり、それは正確で再現性のある
結果をもたらす。

【００２５】

【実施例】次の実施例は我々の発明の方法と試薬組成物
とを説明する。標準的な、市場で入手できる試薬級材料
を、可能な場合はいつでも用いた。次の試薬と手順とは
単に説明の目的で与えたものであること、他の成分と割
合と手順とこの発明の開示に従って採用できるものであ
ることは理解されるであろう。

【００２６】

【材料と方法】ウシ−腸管アルカリ性ホスファターゼ
（ＡＰ）（Ｂｉｏｚｙｍｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃ
Ａ）を、均質−並に不均質−二官能橋かけ剤、２−イン
ムノチオレン（ｉｍｍｕｎｏｔｈｉｏｌａｎｅ）（２−
ＩＴ）とＮ−（４−カルボキシ−シクロヘキシル−メチ
ル）マレイミドのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステ
ル（ＳＭＣＣ）と（共にＰｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒ
ｄ，ＩＬから）を用い、マウス単クローン抗体、抗−Ｃ
Ｄ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ１９（凡てＴ
ｅｃｈｎｉｃｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｃｏｒ
ｐ．，Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，Ｎ．Ｙ．）に抱合する。抗
−単核細胞−ＡＰ抱合体も、Ｈ・１サイトグラム中の単
核細胞の個体群の位置を検討するため、抗−Ｍ７７．７
単クローン抗体（Ｋｉｍ Ｙ．Ｒ．，Ａｂｒａｈａｍ
Ｎ．Ｇ．，Ｌｕｔｔｏｎ Ｊ．Ｄ．，“Ｍｅｃｈａｎｉ
ｓｍｓ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ
Ｕ９３７Ｌｅｕｋｅｍｉｃ Ｃｅｌｌｓ Ｉｎｄｕｃ
ｅｄ ｂｙ ＧＭ−ＣＳＦ ａｎｄ１．２５（ＯＨ₂−
Ｖｉｔａｍｉｎ Ｄ₃）”、Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｒｅ
ｓ．，１９９１、１５：４０９−４１８）を用いて調製
する。その抱合方法はＹｏｓｈｉｔａｋｅ等１９８２；
Ｌａｍｂｅｒｔ等、１９８３（Ｌａｍｂｅｒｔ Ｊ．
Ｍ．，Ｊｕｅ Ｒ．，Ｔｒａｕｔ Ｒ．Ｒ．，“Ｄｉｓ
ｕｌｆｉｄｅ Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ ｏｆ Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌｉ Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ
Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｗｉｔｈ２−ｉｍｉｎｏｔｈｉｏ
ｌａｎｅ（ｍｅｔｈｙｌ４−ｍｅｒｃａｐｔｏｂｕｔｙ
ｒｉｍｉｄａｔｅ）：Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｔｈａｔ ｔ
ｈｅ Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐ
ａｉｒｓ ａｒｅ Ｆｏｒｍｅｄ ｉｎ ｔｈｅ Ｉｎ
ｔａｃｔ Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｓｕｂｕｎｉｔ”、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９７８、１７：５４０６−
５４１６；およびＹｏｓｈｉｔａｋｅ Ｓ．，Ｉｍａｋ
ａｗａ Ｍ．，ＩｓｈｉｋａｗａＥ．，等“Ｍｉｌｄ
ａｎｄ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ
ｏｆ Ｒａｂｂｉｔ Ｅａｂ′ａｎｄ Ｈｏｒｓｅｒａ
ｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｍ
ａｌｅｉｍｉｄｅ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ ａｎｄＩｔｓ
Ｕｓｅ ｆｏｒ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａ
ｙ”、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８２、９２：１４１
３−１４２４）の方法から改変した。

【００２７】単クローン抗体とＡＰ分子とは個別に活性
化される。第１に、単クローン抗体は２−ＩＴと反応さ
せて、その単クローン抗体分子に−ＳＨ基をもつ間隙
“アーム”を導入する。ＡＰはＳＭＣＣと反応してＡＰ
分子にマレイミド基を導入する。その結合反応は塩化ナ
トリウム１００ｍｍｏｌ／Ｌとテトラ−ＥＤＴＡナトリ
ウム１ｍｍｏｌ／Ｌを含有するトリエタノールアミン緩
衝剤（ｐＨ７．３）１００ｍｍｏｌ／Ｌ中でその２つの
活性化された蛋白質を混合して行い、抗体−ＡＰ抱合体
を生成させる。マレイミドは、この２つの蛋白質分子間
に安定な結合、“柔軟なのびたアーム”を生成する−Ｓ
Ｈ基と特異的に反応する。抗体−ＡＰ抱合体はＳｅｐｈ
ａｃｒｙｌ−３００カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉ
ｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を通じ、塩化ナトリウム１０
０ｍｍｏｌ／Ｌと酢酸マグネシウム２ｍｍｏｌ／Ｌと硫
酸亜鉛１ｍｍｏｌ／ＬとＥＤＴＡジナトリウム１ｍｍｏ
ｌ／Ｌとを含有するトリス緩衝剤（ｐＨ７．３）５０ｍ
ｍｏｌ／Ｌで溶離することにより遊離の単クローン抗体
とＡＰとから単離される。単離されたその抱合体はプロ
テアーゼのない牛血清アルブミン２ｇ／Ｌと硫酸アンモ
ニウム１８９ｍｍｏｌ／Ｌとアジ化ナトリウム１ｇ／Ｌ
とを含有するトリス緩衝剤で希釈し最終ＩｇＧ濃度（そ
れぞれＣＤ３には１０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＣＤ４には１５ｍ
ｇ／Ｌ、ＣＤ２とＣＤ８とＣＤ１９とには２５ｍｇ／
Ｌ）とする。

【００２８】次の試薬を用いてリンパ球分類用試料を調
製する。 ａ） トリス緩衝剤５０ｍＭとプロテアーゼを含有しな
いＢＳＡ２ｇ／Ｌと硫酸アンモニウム２５ｇ／Ｌとアジ
化ナトリウム１ｇ／Ｌとを含有する溶液中のアルカリ性
ホスファターゼ抱合単クローン抗体（抗−ＣＤ２、ＣＤ
３、ＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ１９） ｂ） デキストロース５５５ｍｍｏｌ／ＬとＨＣＨＯ
１．６７ｍｍｏｌ／Ｌとをリン酸塩緩衝剤７５ｍｍｏｌ
／Ｌ（ｐＨ７．０）中に含有している固定剤 ｃ） ＮＨ₄Ｃｌ １５５ｍｍｏｌ／ＬとＫＨＣＯ₃１０
ｍｍｏｌ／ＬとＮａ₄ＥＤＴＡ１．２ｍｍｏｌ／Ｌとホ
ルムアルデヒド２５ｍｍｏｌ／Ｌとを含有する溶血試薬 ｄ） ジエタノールアミン緩衝剤８０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐ
Ｈ９．５±０．１）中、ＮＢＴ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌ
ｏｕｉｓ，ＭＯ）１ｍｍｏｌ／ＬとＢＣＩＰ（ＪＢＬ，
Ｓａｎ Ｌｕｉｓ Ｏｂｉｓｐｏ，ＣＡ）１．２ｍｍｏ
ｌ／Ｌと塩化ナトリウム１００ｍｍｏｌ／Ｌと酢酸マグ
ネシウム１ｍｍｏｌ／Ｌとグリシン亜鉛０．１０ｍｍｏ
ｌ／Ｌとを含有する緩衝剤／基質溶液 ｅ） ｈｅｐｅｓ緩衝剤１０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ７．
４）中、プロテアーゼを含有しない牛血清アルブミン
（Ｍｉｌｅｓ，Ｋａｎｋａｋｅｅ，ＩＬ）２ｇ／Ｌとレ
バミゾール（Ｌ［−］−２，３，５，６−テトラ−ヒド
ロ−６−フェニル−イミダゾール［２．１−ｂ］チアゾ
ール）３ｍＭ／Ｌと、Ｋａｔｈｏｎ ＣＧ０．０３％
（ｐＨ７．４）とを含有する細胞洗浄溶液（ＷＳ） ｆ） リン酸塩緩衝剤７５ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ６．５）
中プロプレングリコール６００ｇ／Ｌとホルムアルデヒ
ド５３３ｍｍｏｌ／Ｌとを含有するプロプレングリコー
ル（ＰＧ）溶液

【００２９】恐らく正常であろう供給者３１人からのＥ
ＤＴＡ−抗凝固化全血標本は次のように処理した。ＥＤ
ＴＡ−抗凝固化全血標本１００μｌを単クローン抗体溶
液２０μｌと混合し、加熱ブロック中、好ましくは３８
±１℃で５分間培養する。（凡ての培養は加熱ブロック
中にて行う。）それから固定剤２００μｌを加え、混合
し、更に５分間培養する。その後、溶血試薬２ｍｌを添
加し、混合し、更に５分間培養して赤血球を破壊する。
それから残っている白血球を、毎回、Ｓｅｒｏｆｕｇｅ
^TM中１分間遠心分離し、上澄液を傾斜して取り去り、ボ
タン状の細胞を移して再懸濁することによりＣＷＳで２
回洗浄する。それから緩衝／基質溶液０．５ｍｌを加
え、混合し、５分間培養して標識した細胞を染色する。
最後に、ＰＧ溶液０．５ｍｌを添加し、混合する（その
細胞懸濁液の屈折率をＨ・１ペルオキシダーゼチャンネ
ル流通細胞被包流体のそれに合せるため）．ＰＧ溶液中
（ｐＨ６．５）のホルムアルデヒドとリン酸塩とを用
い、最終細胞懸濁液中のＡＰ活性をとめる。

【００３０】その調製された試料を、Ｔｅｃｈｎｉｃｏ
ｎＨ・１^TM血液分析機（Ｔｅｃｈｎｉｃｏｎ Ｉｎｓｔ
ｒｕｍｅｎｔｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｔａｒｒｙ
ｔｏｗｎ，Ｎ．Ｙ．）で、直接血球計口を用いて分析す
る。Ｈ・１ペルオキシダーゼチャンネルには前方光散乱
／吸収光学装置が備えられている。そのＨ・１装置ソフ
トウエアシステムにはソフトウエアプログラムが組込ま
れていて、自動的に、各試料の百分率標識リンパ細胞数
を表示し、検討（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）し、計算し、印
字する（ＴｅｃｈｎｉｃｏｎＨ・１^TM Ｓｙｓｔｅｍ
Ｏｐｅｒａｔｏｒ′ｓ Ｇｕｉｄｅ，Ｔａｒｒｙｔｏｗ
ｎ，Ｎ．Ｙ．Ｔｅｃｈｎｉｃｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎ
ｔｓ Ｃｏｒｐ．，１９９０）。その試験を行うのにそ
の装置のハードウエアの改変の必要はない。この計算に
おいては顆粒球と単核細胞とは無視される。Ｅｐｉｃｓ
^TM ＰＲＯＦＩＬＥ（Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｈｉａｌｅａ
ｈ，ＦＬ）が蛍光法用の参照装置として用いられた（Ｔ
ｒａｉｎｉｎｇ Ｇｕｉｄｅｆｏｒ ｔｈｅ Ｅｐｉｃ
ｓ^TM ＰＲＯＦＩＬＥ、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｄｕｃａｔ
ｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｍｉａｍｉ Ｌａｋｅｓ，
ＦＬ，Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｒ
ｐ．，１９８７）。Ｅｐｉｃｓ^TM ＰＲＯＦＩＬＥ分析
のために用いた参照単クローン抗体はＦＩＴＣ−抱合Ｏ
ＫＴ３（ＣＤ３）、ＯＫＴ４（ＣＤ４）、ＯＫＴ８（Ｃ
Ｄ８）、ＯＫＴ１１（ＣＤ２）（凡てＯｒｔｈｏ，Ｒａ
ｒｉｔａｎ，ＮＪより）およびＬｅｕ１２（ＣＤ１９）
（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｍｏｕｎｔａｉ
ｎ Ｖｉｅｗ ＣＡ）である。これらの試料は各製造業
者のプロトコールに従って調製した。Ｈ・１^TM並にＥｐ
ｉｃｓ^TM ＰＲＯＦＩＬＥ法共、各調製物から２つの読
みを取り、繰返しの読みの平均を、結果を表わすのに用
いた。

【００３１】

【結果】本発明の免疫アルカリ性ホスファターゼ法を用
いて測定し、ＴｅｃｈｎｉｃｏｎＨ・１^TMで分析された
リンパ球部分集合は図１のサイトグラム中に説明されて
いる。縦座標は前方光散乱信号の高さを、横座標は吸収
信号の高さを表わす。境界枠１、２、３および４中の細
胞はそれぞれ、標識されていないリンパ球、標識されて
いない顆粒球（好中球、好酸球および単核細胞）、標識
されているリンパ球並に根源雑音（小板および赤血球幻
影）を表わす。標識されていない対照細胞並にアルカリ
性ホスファターゼ抱合抗−ＣＤ２（ＰａｎＴ細胞、Ｅ−
ｒｏｓｅｔｔｅ陽性）、ＣＤ３（ＰａｎＴ細胞、ｍｉｔ
ｏｇｅｎｉｃ）、ＣＤ４（ＨｅｌｐｅｒＴ細胞）、ＣＤ
８（ＳｕｐｐｒｅｓｓｏｒＴ細胞）およびＣＤ１９（Ｂ
細胞）で標識されている細胞についての結果。

【００３２】標識されていない対照細胞並に、ＦＩＴＣ
抱合抗−ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ１
９で標識されている細胞の対応する試料についての、Ｅ
ｐｉｃｓ ＰＲＯＦＩＬＥ^TM線形緑色蛍光パルス波高分
布が図２に示されていて、各基質のリンパ球間の細胞表
面抗原の密度分布における同様な変動性を示している。
リンパ球群は前方角光散乱−直角光散乱のサイトグラム
にゲート（ｇａｔｅ）され、そして前方角散乱−緑色蛍
光チャンネル中で再分析される。

【００３３】細胞のアルカリ性ホスファターゼ染色懸濁
液の光顕微鏡検査は、標識されているリンパ球が暗紫色
に染色されていることを見つけた。標識されていないリ
ンパ球は染色されない。顆粒球中の内因性アルカリ性ホ
スファターゼはレバミゾールの添加により選択的に阻害
され、それ故に染色されない。赤血球幻影は見えない。
小板は染色されない。レバミゾールによりあるいはよら
ずに処理された染色されていない細胞懸濁液、レバミゾ
ールで処理された抗−単核細胞−ＡＰ標識細胞懸濁液お
よびレバミゾールで処理された抗−ＣＤ４−ＡＰ標識細
胞懸濁液のＨ・１サイトグラムを図３に示す。レバミゾ
ールによらず処理された、細胞懸濁液中の顆粒球はその
内因性のアルカリ性ホスファターゼ活性により染色され
る。図３ａに見ることができるように、染色された顆粒
球個体群は標識されたリンパ球境界線をこえて、陽性リ
ンパ球（ＬＰＯＳ）枠中に入って右に移動する。しか
し、同じ試料をレバミゾールで処理すると、顆粒球は最
早染色せず、その結果顆粒球からの吸収信号は大きい染
色されていない細胞（ＬＵＣ）境界枠中にとどまる（図
３ｂ）。

【００３４】この方法のＨ・１サイトグラム中の単核細
胞個体群の位置を調べるため、同じ試料を抗−単核細胞
−ＡＰ抱合体で標識し、レバミゾール存在の下で処理し
た。図３ｃで説明されるように、標識され、染色されて
いる単核細胞の吸収信号は吸収境界線を横切り、ＬＵＣ
枠からＬＰＯＳ枠に行き、この方法における標識され
ず、染色されていない単核細胞信号は常態では顆粒球
（好中球と好酸球）と１緒に、ＬＵＣ枠中にあることを
示している。多くの単核細胞はその細胞表面上での低水
準のＣＤ４分子を表現することが知られているから、同
一試料を抗−ＣＤ４−ＡＰ抱合体で標識し、染色し、Ｈ
・１サイトグラム中の顆粒球分布における変化を注意深
く調べた（図３ｄ）。顆粒球のやや膨れ出た集団（多分
染色されたＣＤ４⁺単核細胞）を見ることができる。し
かし、その膨らみはＬＰＯＳ枠には入らず、それ故ＣＤ
４⁺リンパ球数を損うことはない。

【００４０】凡てのリンパ球部分集合（ＣＤ２、ＣＤ
３、ＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ１９）についての免疫蛍
光法による結果（Ｅｐｉｃｓ ＰＲＯＦＩＬＥデータ）
対本方法による結果の線形回帰プロットを図４に示す。
表１（下に示す）中に示す相関データは各リンパ球部分
集合についての２つの方法間の良好な一致を示してい
る。データはＣＤ２⁺ＰａｎＴ細胞を除き、凡ての部分
集合について勾配あるいは切片の偏倚が取るに足らない
ことを示している。

【００４１】

【表１】 表 １ Ｅｐｉｃｓ ＰＲＯＦＩＬＥ(ｘ)による結果とＨ・１(ｙ)による結果との間の相関 パラメーター ％標識 ％標識 （ＣＤ＃） ｘ平均 ｙ平均 ｒ^a 勾 配 ｙ−切片 Ｓｙｘ^b Pan Ｔ（CD2） 80.1 79.2 0.95 0.88 8.65 1.59 Pan Ｔ (CD3) 72.2 71.8 0.98 0.95 3.21 1.61 Helper Ｔ(CD4) 46.0 47.4 0.95 0.96 3.23 3.02 Suppressor Ｔ （CD8） 29.2 30.4 0.97 1.02 2.98 2.98 Pan Ｔ (CD19) 9.4 11.4 0.94 0.99 2.10 1.27 ａ 相関係数 ｂ 推定値の標準誤差 検定された供与試料数＝各３１

【００４２】表２（以下に示す）中に示された本方法の
不正確さを、相関研究に用いた同じ３１試料のそれぞれ
の２重の読みから計算する。９５％信頼区間は凡ての部
分集合について２単位より小さい変化量を示している。

【００４３】

【表２】 表 ２ Ｈ・１リンパ細胞分類法の不正確さ パラメーター 試験した試料の範囲 （ＣＤ＃） 平均(％) ＳＤ(％) 95％ ＣＩ(％) （％） Pan Ｔ (CD2) 79.2 0.56 1.20 71.1−88.0 Pan Ｔ (CD3) 71.8 0.92 1.20 58.3−84.1 Helper Ｔ(CD4) 47.4 1.01 1.30 18.0−62.9 Suppressor Ｔ （CD8） 30.4 1.26 1.60 14.9−73.1 Pan Ｔ (CD19) 11.4 0.63 0.82 4.3−18.8

【００４４】直接ＡＰ標識によるこの全血免疫表現型分
類法の開発の間、我々は前方光散乱／吸収流通血球計を
用いて、顆粒球を標識されていないリンパ球と、顆粒球
を標識されているリンパ球と、そして標識されているリ
ンパ球を標識されていないリンパ球と明瞭に、再現性よ
く分離する多くの問題を、サイトグラムを得るのに経験
した。これらの問題にはより多くの理由があった。顆粒
球はその内因性アルカリ性ホスファターゼの故に染色さ
れず、単クローン抗体−ＡＰ抱合体は不安定であったか
あるいは単クローン抗体結合個所近くに立体障害を生成
したかもしれなかった。染色されていない顆粒球からの
前方角光散乱信号は、大きい染色されていないリンパ球
のそれに余りにも接近していた。

【００４５】前記の凡ての問題は試薬組成物と検定条件
との組合せを選択し、最適化することにより解決した。
抱合体の大きいアルカリ性ホスファターゼ分子による、
単クローン抗体−結合場所近くの考えられる立体障害
は、橋かけ剤としてＳＭＣＣと２−ＩＴとを用い、抗体
分子とアルカリ性ホスファターゼ分子との間に、安定な
“長いアーム”をこしらえることにより解決した。その
調製された単クローン抗体−ＡＰ抱合体は冷凍条件下で
一年以上の安定性を示した（材料の項の単クローン抗体
−希釈剤組成物を見よ）

【００４６】前記の濃度での、固定剤中のデキストロー
スと緩衝剤中のＮＢＴ、ＢＣＩＰ、グリシン亜鉛とＰＧ
溶液中のホルムアルデヒドとの組合せは顆粒球からの充
分に大きい散乱信号の生成を助け、前方角光散乱軸に沿
って標識されていないリンパ球から顆粒球を明瞭に分離
する。この試薬の組合せは手順を通じての顆粒球蛋白質
の損失を防止し、顆粒球の屈折率を増大し、こうして、
その細胞からの前方角光散乱信号のパルス波高を増大す
る。

【００４７】我々は、緩衝剤／基質へ、約０．０７〜
０．２５ｍＭの濃度の少量の亜鉛例えば、これに限定さ
れないが、塩化亜鉛、硫酸亜鉛および酢酸亜鉛の添加
が、顆粒球により生ずる前方角光散乱信号のパルス波高
を、恐らく亜鉛が顆粒球蛋白質の損失を防止する故に増
大させることを発見した。

【００４８】亜鉛はアルカリ性ｐＨで水酸化亜鉛の不溶
性沈澱物を形成する。亜鉛をこのＤＥＡ緩衝剤、ｐＨ
９．５±０．１中に溶解させておくために、我々は適当
な亜鉛キレート化剤を探し求めた。多くの普通の金属キ
レート化剤例えばＥＤＴＡまたはヒドロキシ−ＥＤＴＡ
はＡＰ活性を阻害し、顆粒球に亜鉛の影響を及ぼし、顆
粒球の染色されていないリンパ球からの分離を損う。グ
リシンまたはクエン酸塩の添加は、顆粒球により生ずる
前方散乱信号を低下することなく、長時間緩衝剤の亜鉛
の沈澱を防止する。その上、グリシン亜鉛またはクエン
酸亜鉛はＡＰの触媒活性に対する亜鉛自身の阻害効果を
最小にする（文献の知見に反し、緩衝剤中の亜鉛は０．
１ｍＭまたはそれ以上でＡＰ活性を阻害する）。顆粒球
からの散乱信号波高（ＬＵＣ平均Ｙ）と、標識され、染
色されたリンパ球からの吸収信号の波高（ＬＰＯＳ平均
Ｘ）とが図６で説明されていて、Ｈ・１散乱並に吸収信
号の平均チャンネル数として表わされている。亜鉛濃度
（硫酸亜鉛使用）が緩衝剤／基質中で増大するに従っ
て、ＬＵＣ平均Ｙは直線的に増加し、ＬＰＯＳ平均Ｘは
低下する。

【００４９】ＣＷＳ中のレバミゾールは、顆粒球の、標
識されたリンパ球からの明確な分離を維持して、顆粒球
中の内因性ＡＰ活性を阻害する（図３を見よ）。単クロ
ーン抗体−ＡＰ希釈剤中の硫酸アンモニウムは固定剤の
存在の下でも、後での迅速で完全な赤血球の溶血のため
に前準備する。白血球の早期の緩和な固定は細胞表面抗
原分子のキャッピング（ｃａｐｐｉｎｇ）を防止し、ま
た反応の各段階を、試料のサイトグラムの質を低下させ
ることなく促進する、３８±１℃での培養を可能にす
る。

【００５０】代りに、レバミゾールを緩衝剤／基質に添
加してもよいが、それをすると、緩衝剤のアルカリ性ｐ
Ｈでレバミゾールがずっと溶液から沈澱し、それによっ
て緩衝溶液の安定性に対し負に影響する。

【００５１】固定剤中のデキストロース濃度の影響は抗
−ＣＤ４−ＡＰ標識細胞のサイトグラムを説明している
図５から理解されるであろう。固定剤中のデキストロー
ス濃度は、ホルムアルデヒド濃度を４％の一定に保ち乍
ら標識されたもののように変えた。デキストロース濃度
０％では、標識されたリンパ細胞枠中にある単核細胞を
除き、殆んど凡ての顆粒球の信号は標識されていないリ
ンパ球枠にある。単核細胞はＣＤ４分子を表わし、それ
故この調製において抗−ＣＤ４−ＡＰ単クローン抗体で
標識された。デキストロース濃度の増大と共に凡ての顆
粒球の散乱信号は増大し、それによって顆粒球はリンパ
球から分離される。

【００５２】ＰＧ溶液中（ｐＨ６．５）のホルムアルデ
ヒドとリン酸塩とはサイトグラムを変えることなく、細
胞懸濁液中でのそれ以上のＡＰ反応を阻害する。このこ
とは正確で、再現性のある結果を与え乍ら、調製一週間
以内の都合よい時に、調製された細胞懸濁液を分析する
のを可能にしている。

【００５３】新に調製された細胞懸濁液を用いて本発明
を実行した場合に得られる結果と、２４時間前の細胞懸
濁液から得られた結果との比較を図８に示してあり、そ
れは細胞懸濁液の終始に亙る安定性を説明している。

【００５４】細胞懸濁液の安定性は図９に更に説明され
ている。図９ａは抗−ＣＤ４−ＡＰ標識細胞の新に調製
された細胞懸濁液について得られたサイトグラムであ
る。この試料の標識されたＣＤ４+リンパ細胞は５５．
１％である。図９ｂは読みを２４時間後にとったほか
は、同じ細胞調製物について得られたサイトグラムであ
る。その細胞懸濁液は冷凍の下、安定化剤（６０％ＰＧ
中ＣＨＣＨＯおよびリン酸塩）なしで２４時間貯蔵され
ていた。ＣＤ４+細胞の百分率は、染色された顆粒球の
侵入する吸収信号により５５．１％から８７．９％に増
加したことを言及しておく。

【００５５】緩衝剤／基質溶液中のＮＢＴおよびＢＣＩ
Ｐの正の効果は図７に関連して最もよく理解できる。図
７ａにおいて、対照の緩衝剤／基質は前記の方法中で述
べたごとくＤＥＡ緩衝剤中にＮＢＴおよびＢＣＩＰ両者
を持っている。図７ｂは、緩衝剤／基質処方からＢＣＩ
Ｐを省いた場合得られるサイトグラムを説明する。図７
ｃにおいては、ＮＢＴが緩衝剤／基質処方から省かれ
た。図７ｄはＮＢＴおよびＢＣＩＰ両方がその処方物か
ら省かれた。これらの図から判るように、ＮＢＴは顆粒
球のリンパ球からの分離に重要な役割を演じている。固
定剤中のデキストロースだけではこの役は行えない。亜
鉛１．０ｍＭが材料の項で述べた緩衝剤／基質中にある
ことを述べておく。その緩衝剤中の亜鉛なしでは、ＮＢ
Ｔが存在してもＬＵＣ平均Ｙは非常に低いであろう。

【００５６】図３ｃ中で判るように、この調製物中で単
核細胞−信号は顆粒球と一致し、それ故標識されたリン
パ球数を妨害しない。各部分集合についての陽性リンパ
球絶体係数は、所望ならば、試料中の標識された細胞百
分率と、同じ装置（Ｈ・１^TMまたはＨ・２^TM）のＣＢＣ
／ＤＩＦＦ方式で行った、対応試料のリンパ球絶体数
（手動または変更ソフトウエアによる自動で）とを掛け
て得ることができる。

【００５７】ここに示した５つのほかに他のリンパ部分
集合が、開示した方法を用いて分析されるべきであるこ
とを注目すべきである。また、同じ技術を用いて他の血
液および骨髄細胞の部分集合の検出も可能である。

【００５８】前記の方法は高められた温度、即ち約３５
℃と約４０℃との間で行われた。それは一層低い温度で
行うことも理解できるが、その手順のうちの種々な段階
を完結するのに必要な時間を、反応を完結させるために
適当に延長しなければならないかもしれない。

【００５９】ＨＩＶウイルス感染の危険が、手順の間全
血試料をホルムアルデヒドに曝すために、実質的に取り
除かれることも理解されるであろう。

【００６０】ここに示した方法は蛍光流通血球計で用い
られる、全血免疫蛍光直接法と、速さと感度と正確さと
で競合する。

【００６１】先の説明から明らかな、本発明の幾つかの
有利さには、自動化された流通血球計に用いるのに適合
した、散乱／吸収技術を利用したリンパ細胞亜型分類の
ための改良された手順とそれ用の試薬組成物とが包含さ
れる。

【００６２】前記から、本発明の種々な目的は達成さ
れ、他の有利な結果が得られることが判るであろう。

【００６３】本発明の種々な特徴並に有利さは前記の説
明から明らかであると思われる。しかし、特別には列挙
しなかった種々な他の特徴並に有利さが、技術に熟達し
た人々には、説明した好ましい態様の多くの変形並に変
更態様と同様に疑いもなく生ずるであろうが、その凡て
は以下の請求範囲により定義される本発明の精神と範囲
とから逸脱することなく達成されてもよい。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明に従い測定された、リンパ球部分集合を
示す一連のサイトグラムである。

【図２】標識されていない対照細胞と、ＦＩＴＣ−抱合
抗−ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８及びＣＤ１９で標
識された細胞とのＥｐｉｃｓ ＰＲＯＦＩＬＥ^TM線型緑
色蛍光パルス波高分布である。

【図３】正常の全血試料のサイトグラムを表わす。ａは
レバミゾールなしで処理された標識されていない試料を
表わし、ｂはレバミゾールで処理された標識されていな
い試料を、ｃはレバミゾールで処理された、アルカリ性
ホスファターゼ抱合抗−単核細胞で標識された試料を、
ｄはレバミゾールで処理された、アルカリ性ホスファタ
ーゼ抱合抗−ＣＤ４で標識されている試料を表わす。

【図４】先行技術の免疫蛍光法により測定されたリンパ
球部分集合と本発明により測定されたリンパ細胞部分集
合との相関プロットである。

【図５】本発明のもう１つの態様を示す抗−ＣＤ４−Ａ
Ｐ標識された細胞のサイトグラムである。

【図６】顆粒球／標識され、染色されているリンパ球の
散乱／吸収信号に対する亜鉛濃度の影響を説明する。

【図７】本発明のもう１つの態様を示す、標識されてい
ないリンパ球と顆粒球とのサイトグラムである。

【図８】本発明を実行して、新に調製された細胞から得
られた結果と、２４時間後に得られた結果との相関であ
る。

【図９】本発明を実行して、新に調製された細胞からと
２４時間後とから得られた抗−ＣＤ４−ＡＰ標識された
細胞のサイトグラムである。

フロントページの続き (72)発明者 チェン・クオ、イエ アメリカ合衆国ニューヨーク州10570、プ レズァントヴィル、レイク・ショー・ドラ イヴ 38番

Claims (30)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ａ） 全血アリコートを準備し、 ｂ） 前記アリコートを、 ｉ） 選んだ亜綱の細胞表面の独特な抗原決定基と選択
   的に反応性で、その亜綱の細胞を標識するためアルカリ
   性ホスファターゼと抱合されている抗体と ｉｉ） 溶血のために赤血球を前準備するための硫酸ア
   ンモニウムと、 を包含する試薬組成物と培養し ｃ） デキストロースとホルムアルデヒドとを包含する
   固定試薬を添加して白血球を固定し、 ｄ） 塩化アンモニウムを包含する溶血試薬を添加して
   赤血球を溶血し、 ｅ） その固定した白血球を、内因性のアルカリ性ホス
   ファターゼの活性を阻害するために阻害剤を包含する細
   胞洗浄溶液で洗浄し、 ｆ） その固定され、抑止されている白血球を、緩衝剤
   と色原体とアルカリ性ホスファターゼのための基質とを
   包含する第２の試薬組成物中で染色し、 ｇ） 更に、ホルムアルデヒドとリン酸塩緩衝剤とプロ
   ピレングリコールとを包含する安定化試薬を添加して、
   アルカリ性ホスファターゼの触媒活性を阻害し、 ｈ） 前記細胞により散乱ならびに吸収される光を検出
   するのに適合した電気光学的検出システムを通して、そ
   の細胞を通過させ、 ｉ） 少くとも一部分、前記細胞により散乱並に吸収さ
   れる光に基いて前記亜綱の細胞を区別する段階を包含す
   る、血中リンパ球の選んだ亜綱の細胞を固定し、計数す
   るための自動化された方法。
2. 【請求項２】 培養段階が約５分間の期間をもつ、請求
   項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 培養段階を約３５〜約４０℃の温度で行
   う、請求項１に記載の方法。
4. 【請求項４】 培養段階を３８±１℃で行う、請求項３
   に記載の方法。
5. 【請求項５】 前記試薬組成物中の硫酸アンモニウムの
   濃度が約１〜約５ｖ／ｖ％である、請求項１に記載の方
   法。
6. 【請求項６】 固定段階が約５分間の期間を持つ、請求
   項１に記載の方法。
7. 【請求項７】 固定段階を約３５〜約４０℃の温度で行
   う、請求項１に記載の方法。
8. 【請求項８】 固定段階を３８±１℃で行う、請求項７
   に記載の方法。
9. 【請求項９】 固定剤中のデキストロース濃度が約７〜
   約１５ｖ／ｖ％である、請求項１に記載の方法。
10. 【請求項１０】 固定剤中のホルムアルデヒド濃度が約
    ３〜約６ｖ／ｖ％である、請求項１に記載の方法。
11. 【請求項１１】 溶血段階が約５分間の期間を持つ、請
    求項１に記載の方法。
12. 【請求項１２】 溶血段階を約３５〜約４０℃の温度で
    行う、請求項１に記載の方法。
13. 【請求項１３】 溶血段階を３８±１℃で行う、請求項
    １２に記載の方法。
14. 【請求項１４】 阻害試薬がレバミゾールを含有する、
    請求項１に記載の方法。
15. 【請求項１５】 レバミゾールが約２〜約１０ｍＭの濃
    度で存在する、請求項１４に記載の方法。
16. 【請求項１６】 染色段階が約５分間の期間を持つ、請
    求項１に記載の方法。
17. 【請求項１７】 染色段階を約３５〜約４０℃の温度で
    行う、請求項１に記載の方法。
18. 【請求項１８】 染色段階を３８±１℃で行う、請求項
    １７に記載の方法。
19. 【請求項１９】 第２試薬組成物中の基質が５−ブロモ
    −４−クロロ−３−インドリルホスフェートのトルイジ
    ン（ｔｏｌｉｕｄｉｎｅ）塩である、請求項１に記載の
    方法。
20. 【請求項２０】 基質の濃度が約０．８〜約１．５ｍＭ
    である、請求項１９に記載の方法。
21. 【請求項２１】 第２試薬組成物中の色原体がニトロブ
    ルー−テトラゾリウム塩である、請求項１に記載の方
    法。
22. 【請求項２２】 色原体濃度が約０．５〜約２．０ｍＭ
    である、請求項２１に記載の方法。
23. 【請求項２３】 第２試薬組成物が更に亜鉛を含有す
    る、請求項１に記載の方法。
24. 【請求項２４】 亜鉛濃度が約０．０７〜約０．２５ｍ
    Ｍである、請求項２３に記載の方法。
25. 【請求項２５】 第２試薬組成物が更に亜鉛キレート剤
    を含有する、請求項１に記載の方法。
26. 【請求項２６】 亜鉛キレート剤がグリシンである、請
    求項２５に記載の方法。
27. 【請求項２７】 亜鉛キレート剤がクエン酸塩である、
    請求項２５に記載の方法。
28. 【請求項２８】 安定化試薬中のホルムアルデヒド濃度
    が約２〜約６ｖ／ｖ％である、請求項１に記載の方法。
29. 【請求項２９】 安定化試薬中のリン酸塩濃度が約２５
    〜約１００ｍＭである、請求項２８に記載の方法。
30. 【請求項３０】 安定化試薬のｐＨが約６．０〜約７．
    ０である、請求項２９に記載の方法。