MX2008013332A - Deteccion de proteinas de celulas neoplasicas circulantes. - Google Patents

Abstract

La proteína EGFR, ERCC1, RRN1, timidilato sintasa o beta-tubulina de células cancerosas se detecta en una muestra de sangre al enriquecer las células cancerosas de la muestra de sangre seguido por realizar en las células cancerosas enriquecidas un inmunoensayo capaz de detectar las proteínas mencionadas anteriormente. Los pacientes con cáncer que sobreexpresan el EGFR son tratados con un agente anti-EGFR, por ejemplo cetuximab, panitumumab, erlotinib y gefitinib.

Description

DETECCIÓN DE PROTEÍNAS DE CÉLULAS NEOPLÁSICAS CIRCULANTES ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Esta invención se dirige a una necesidad médica significativa y no lograda de proporcionar inmunoensayos sensibles que permitan un avance en el campo de la terapia personalizada para el cáncer. El concepto general de la medicina personalizada para el cáncer ha sido el objeto de revisiones recientes (Zoon KC, 2004, Toxicology Pathol . 32(Suppl l):l-2; acGregor JT, 2004, Toxicology Pathol. 32(Suppl 1):99-105; Carr KM y colaboradores, 2004 Hum Genomics 1:134-40). La metodología de la medicina personalizada para el cáncer es caracterizar las proteínas o genes en el tumor del paciente a fin de determinar el mejor desarrollo de la terapia. Por ejemplo, la expresión de ciertos genes o patrones de genes en cualquier nivel de proteínas o ARNm puede predecir ya sea la sensibilidad o resistencia a varias clases de agentes anticancerígenos. En base a la expresión en el tumor del paciente, un agente se puede seleccionar para la terapia o se puede rechazar para el uso en ese paciente particular. La tabla 1 lista algunas de las proteínas cuya sobreexpresión está asociada con ya sea la resistencia o la sensibilidad de ciertos agentes cancerígenos .

Tabla 1. Proteínas cuya sobreexpresion está asociada con la resistencia o la sensibilidad de ciertos agentes.

Proteína Clase de Proteína Predicción de la Resistencia o Sensibilidad de Varios Agentes EGFR Receptor de Membrana La sobreexpresion del EGFR predice la con actividad de la respuesta a agentes anti-EGFR tales como tirosina cinasa cetuximab, panitumumab ERCC1 Enzima (Miembro de la La sobreexpresion del ERCC1 predice la Ruta de Reparación resistencia a agentes de platino (por ejemplo, por Escisión de cisplatino, carboplatino, oxaliplatino) [Reed Nucleótidos) (2005; Clin Cáncer Res 11 :6100-6102); Lord y colaboradores (2002, Clin Cáncer Res 8:2286- 91 ); Metzer y colaboradores, 1998, J Clin Oncol 16:309-316; Shirota y colaboradores (2001 , J Clin Oncol 19:4298-4304)] Subunidad M1 de Enzima La sobreexpresion de la RRM1 predice la la ribonucleótido resistencia a la gemcitabina [Bergman AM y reductasa colaboradores, 2005 Clin Cáncer Res (RRM1 ) 65:9510-6] Timidilato Sintasa Enzima La sobreexpresion de la TS predice la (TS) resistencia a 5-FU; La expresión alta de la TS no predice alguna respuesta al raltitrexed [Farrugia y colaboradores (2003, Clin Cáncer Res 9:792-801)] Beta-tubulina Estructural La sobreexpresión de la beta-tubulina (clase (clase III) III) predice la resistencia a los taxanos [Mozzetti y colaboradores (2005, Clin Cáncer Res 11 :298-305)]; La sobreexpresión de la beta-tubulina (clase III) predice la resistencia a los alcaloides de vinca [Seve y colaboradores, 2005, Clin Cáncer Res 11 :5481-6] Un impedimento principal para el avance en este campo es la falta de un ensayo conveniente, rápido y objetivo para determinar la sobreexpresión de estas proteínas. Esta invención trata este problema. Una metodología para someter a ensayo la expresión de proteínas en el tejido tumoral del paciente es utilizar la función inmunohistoquímica (IHC, por sus siglas en inglés) del tejido tumoral fijado en formalina. Pero como se indicó por Mann y colaboradores (2005, J Clin Oncol 22:5148-54), esta metodología es lenta y frecuentemente puede proporcionar resultados engañosos dependiendo de cómo se procesó el tejido. Henson, D.E. (2005, J Nati Cáncer Inst 97:1976-7) en su documento titulado: "Back to the Drawing Board on Immunhistochemistry and Predictive Markers" , indica que con tantas variables (almacenamiento del espécimen, duración de la fijación, tipo de fijador y condiciones de procesamiento de tejido) y problemas asociados con cada una de ellas, es difícil controlar apropiadamente la prueba de IHC y parece imposible lograr que todos los laboratorios "acepten y apoyen [estos controles] " .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Esta invención proporciona un método para someter a ensayo una proteína de células cancerosas en una muestra de sangre que comprende enriquecer las células cancerosas de la muestra de sangre seguido por realizar en las células cancerosas enriquecidas un inmunoensayo capaz de detectar la proteína de las células cancerosas enriquecidas . El inmunoensayo es capaz de detectar la proteína de cien células cancerosas por mililitro de sangre. Alternativamente, el inmunoensayo es capaz de detectar ciento sesenta picogramos de la proteína. La proteína se selecciona del grupo que consiste del receptor del factor de crecimiento epidérmico (incluyendo el EGFR fosforilado) , la proteína de reparación por escisión del grupo de complementación cruzada 1, la subunidad MI de la ribonucleótido reductasa, la timidilato sintasa y la beta-tubulina. El inmunoensayo genera una señal que es proporcional al número de moléculas de la proteína presentes en las células cancerosas en la muestra de sangre . Esta invención proporciona un método para detectar la expresión de una proteína de las células cancerosas en una muestra de sangre que comprende aislar las células cancerosas de la muestra de sangre seguido por hacer un extracto de las células cancerosas aisladas seguido por realizar en el extracto un inmunoensayo capaz de detectar la proteína, en el cual un resultado positivo del inmunoensayo indica la presencia de la proteína en las células cancerosas; en donde la proteína es el receptor del factor de crecimiento epidérmico; y el inmunoensayo es capaz de detectar la proteína de cien células cancerosas por mililitro de sangre. Alternativamente, el inmunoensayo es capaz de detectar ciento sesenta picogramos de la proteína. Esta invención proporciona un método para tratar a un paciente con cáncer para beneficiarse probablemente del tratamiento con el agente anti-EGFR, que comprende administrar el agente anticancerígeno a un paciente identificado como que tiene la sobreexpresión del EGFR de acuerdo con un método descrito anteriormente. Los métodos de detección y de ensayo descritos son convenientes, rápidos y objetivos. Conveniencia: La metodología resumida en esta invención no depende de la necesidad de un material de biopsia. La muestra de sangre del paciente se puede analizar directamente por la expresión de las ciertas proteínas en las células tumorales circulantes. Rapidez: En comparación con la IHC, el inmunoensayo de esta invención evita la necesidad de obtener bloques de tejido, desparafinizar los bloques, cortar especímenes para portaobjetos y realizar e interpretar la tinción. En lugar de eso, se utiliza un inmunoensayo rápido. Objetivo: Utilizando el inmunoensayo de esta invención, se evita la clasificación subjetiva tal como con la IHC.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. Comparación de la señal de ECL para la detección por el inmunoensayo del EGFR en lisados de células de cáncer de mama MDA-MB-468 (control positivo para la sobreexpresión del EGFR) contra ZR-75-1 (control negativo para la sobreexpresión del EGFR) . Los datos se muestran utilizando lisados de 1, 2, y 10 células por pocilio. Figura 2. Comparación adicional de la señal de ECL para la detección por el inmunoensayo del EGFR en lisados de células de cáncer de mama MDA-MB-468 (control positivo para la sobreexpresión del EGFR) contra ZR-75-1 (control negativo para la sobreexpresión del EGFR) . Los datos del mismo experimento mostrado en la Figura 1 se utilizan para esta figura, excepto que los datos obtenidos del material del lisado de 50 y 250 células por pocilio también se incluyeron en esta gráfica a fin de mostrar una escala incrementada del eje X.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Como se utiliza en este documento, el término transicional "que comprende" es indefinido. Una reivindicación que utiliza este término puede contener elementos además de aquellos enumerados en esta reivindicación. De esta manera, por ejemplo, se pueden leer reivindicaciones sobre métodos que también incluyen otros pasos no enumerados específicamente en este documento, siempre y cuando estén presentes los elementos enumerados o su equivalente.

Abreviaciones : CTCs: células tumorales circulantes EGFR: receptor del factor de crecimiento epidérmico ERCC 1: proteína de reparación por escisión del grupo de complementación cruzada 1 ECL: electroquimioluminiscencia IHC: imunohistoquímica FosfoEGFR: EGFR fosforilado RR 1: subunidad MI de la ribonucleótido reductasa TS : timidilato sintasa Como se utiliza en este documento, el término "agentes anti-EGFR" se refiere a los agentes anticancerígenos que fijan como objetivo el EGFR, que incluyen anticuerpos y que incluyen inhibidores de moléculas pequeñas de la actividad de tirosina cinasa del EGFR (véase Ciardiello F, 2005, Future Oncol 1:221-234; y Macarulla T y colaboradores, 2006, Onkologie 29:99-105) para revisiones) . Los agentes anti-EGFR incluyen, pero no están limitados a: cetuximab, panitumumab, erlotinib y gefitinib . Como se utiliza en este documento, el término "agentes de platino" se refiere a los compuestos que contienen platino con propiedades anticancerígenas (para revisiones recientes véase Farrnell NP, 2004, Semin Oncol 31(6 Suppl 14): 1-9; Cosaert J and Quoix E, 2002, Br J Cáncer 87:825-33; Desoize B y Madoulet C, 2002, Crit Rev Oncol Hematol 42:317-25). Los agentes de platino incluyen, pero no están limitados a: cisplatino, carboplatino, oxaliplatino y nedaplatino. Como se utiliza en este documento, el término "taxanos" se refiere a paclitaxel y compuestos relacionados (véase Abal y colaboradores, 2004, Curr Cáncer Drug Targets 3:193-203; Ferlini C y colaboradores, 2003, Curr Med Chem Anticancer Agents 3:133-8; y Agrawal NR y colaboradores, 2003, Curr Oncol Rep 5:89-98). Los taxanos incluyen, pero no están limitados a: paclitaxel y docetaxel . Como se utiliza en este documento, el término "alcaloides de vinca" se refiere a vinorelbina y compuestos relacionados tales como vinblastina y vincristina (para revisiones, véase Chan, 1998, Pharmacotherapy 18:1304-7; Zhou X.-J. y Rahmani R. , 1992, Drugs, volumen 44, suplemento 4, páginas 1-16). Esta invención proporciona métodos suficientemente sensibles para cuantificar los niveles de proteínas (que consisten de EGFR, ERCC1, RRM1, TS y beta-tubulina) en células cancerosas circulantes en muestras de sangre y proporciona métodos para identificar a aquellos pacientes con cáncer quienes se beneficiarían probablemente de ciertas terapias anticancerígenas (que incluyen, pero no están limitadas a: terapias que fijan como objetivo al EGFR, agentes de platino; gemcitabina; 5-FU y raltirexed; taxanos; y alcaloides de vinca) . Un medio conveniente, sumamente sensible y rápido para someter a prueba muestras de sangre para identificar a pacientes adicionales quienes se beneficiarían de estas terapias sería un avance importante en el campo del tratamiento del cáncer. Como se indica a continuación, un ensayo inmunológico rápido y sumamente sensible para detectar estas proteínas cancerígenas en células cancerosas circulantes tal como el uso de la detección de electroquimioluminiscencia (ECL) es un medio preferido para lograr esto. Esta invención se basa en la combinación de la alta especificidad de procedimientos utilizados para aislar células cancerosas circulantes de la sangre con la alta sensibilidad de ciertos ensayos basados en la inmunología tal como la ECL. Las células cancerosas circulantes primero son enriquecidas. El término "enriquecimiento de las células cancerosas" se refiere a la implementación de cualquier paso de procesamiento que incremente la relación de células cancerosas con respecto a células no cancerosas. Un método preferido de enriquecimiento utiliza perlas inmunomagnéticas por medio del aislamiento y la purificación de células cancerosas circulantes de la sangre. Otro método preferido de enriquecimiento consiste en la recolección de una muestra de sangre entera en un tubo BD VACUTAINER CPTR de Becton Dickinson y la obtención por medio de la centrifugación (como por los procedimientos recomendados por Becton Dickinson) de una fracción mononuclear de sangre periférica que contiene las células cancerosas enriquecidas. Otro método preferido de enriquecimiento de células cancerosas consiste en la recolección de una muestra de sangre entera seguida por la lisis de los glóbulos rojos.

En una modalidad del método de detección de esta invención, el nivel de sensibilidad del ensayo inmunológico es tal que el ensayo es capaz de detectar proteínas de las células cancerosas cuando aumentan en la sangre a una concentración menor que o igual a 100 células por mililitro de sangre, más preferiblemente menor que o igual a 30 células por mililitro de sangre, más preferiblemente menor que o igual a 10 células por mililitro de sangre, más preferiblemente menor que o igual a 3 células por mililitro de sangre y mucho más preferiblemente menor que o igual a 1 célula por mililitro de sangre. En una modalidad de la invención en la cual la sensibilidad se define en términos de la cantidad de proteína que se puede detectar, el ensayo puede detectar sesenta y cuatro picogramos de la proteína, más preferiblemente dieciséis picogramos de la proteína, más preferiblemente cuatro picogramos de la proteína, aún más preferiblemente un picogramo de la proteína. Se toma una muestra (usualmente en el intervalo de aproximadamente 8 a 20 mi) de sangre de un paciente con cáncer, especialmente cáncer de mama. Los pasos incluyen como se detalla a continuación: 1. La remoción de glóbulos rojos 2. La selección negativa opcional para agotar adicionalmente los leucocitos normales. Una modalidad preferida incluye este paso. 3. La selección positiva de las células tumorales circulantes (CTCs) 4. La extracción de proteínas de las células tumorales 5. La cuantificación de proteínas de las células tumorales en las CTCs 1. Remoción de glóbulos rojos Está disponible una variedad de métodos para retirar glóbulos rojos que incluyen pero no están limitadas a la separación basada en la densidad (tal como la recolección de sangre directamente en los tubos BD VACUTAINER CPTMR de Becton Dickinson) seguido por la centrifugación) y los amortiguadores de lisis comerciales tales como amortiguador de lisis PURESCRIPT RBC" (Gentra, Minneapolis) , solución de lisis FACS" (BDIS) , IMMUNOLYSE^ (Coulter) , OPTILYSE B™1 (Immunotech) y amortiguador de lisis ACK" (Biosource, Rockville, MD) . Un método preferido utiliza los tubos BD Vacutainer CPT" con anticoagulante (EDTA o citrato) . Estos tubos contienen un material que con la centrifugación correcta (l,100xg durante 10 minutos, rotor de aletas abatibles) permite la eliminación de los glóbulos rojos y neutrófilos. Después de la centrifugación, el fondo del tubo contiene una pelotilla de células de eritrocitos (glóbulos rojos) y neutrófilos. Arriba de la pelotilla de células está una barrera de gel y arriba de la barrera de gel están las células tumorales, los linfocitos y los monocitos como una banda en el fondo del plasma. Las células tumorales, linfocitos y monocitos entonces se pueden recolectar fácilmente de la parte superior sobre la barrera de gel. Se prefiere este método ya que retira no solo los glóbulos rojos sino también los neutrófilos. 2. Selección negativa para agotar adicionalmente los leucocitos normales Una modalidad preferida de esta invención utiliza el paso de selección negativa para el aislamiento de células tumorales. La selección negativa permite el agotamiento adicional de leucocitos especialmente los linfocitos y monocitos. Este paso comprende el uso de anticuerpos que son biespecíficos tanto para los antígenos de leucocitos, especialmente CD45, el antígeno de leucocito común, y para un antígeno de glóbulos rojos tal como glicoforina A. Un cóctel comercialmente disponible de estos anticuerpos biespecíficos es disponible de STEMCELL TECHNOLOGIES (Rosettesep # de catálogo 15127 y 15167) . Este cóctel incluye los anticuerpos biespecíficos contra la glicoforina A y contra una variedad de antígenos de la superficie celular en células hematopoyéticas humanas (CD2, CD16, CD19, CD36, CD38, CD45, CD66b) . Uno o más de estos anticuerpos biespecíficos se agregan a los tubos BD Vacutainer CPT antes de la recolección de sangre. En una modalidad preferida., se utiliza el cóctel de los anticuerpos biespecíficos contra más de una molécula de CD asociada con leucocitos. Cuando la sangre se introduce en el tubo CPT Vacutainer" , los anticuerpos biespecíficos forman inmunorrosetas cada una que consiste de leucocitos y muchos glóbulos rojos. Estas inmunorrosetas tienen una densidad de aproximadamente aquella de los glóbulos rojos y cuando se centrifugan se encuentran en la pelotilla de glóbulos rojos, retirando adicionalmente de esta manera los leucocitos de la fracción de células tumorales encontrada arriba de la pelotilla de células y la barrera de gel. La fracción con las células tumorales en el plasma se recolecta para el procesamiento adicional . 3. Selección positiva para células tumorales circulantes (CTCs) Un método preferido para aislar las CTCs utiliza perlas inmunomagnéticas . Otros métodos de aislamiento de células cancerosas circulantes incluyen la filtración (Vona G y colaboradores, 2000, Am J Pathol . 2000 156:57-63). En una modalidad preferida, las perlas inmunomagnéticas tienen anticuerpos contra antígenos encontrados selectivamente en la superficie de células cancerosas tal como la molécula de adhesión celular epitelial (EpCAM) , las citoqueratinas tales como citoqueratina-19 y especialmente un cóctel de anticuerpos contra las citogueratinas y otros marcadores de superficie, el antígeno carcinoembriónico (CEA) , el antígeno tumoral de la vejiga, CA19.9, CA125, CD138 (Syndecan-1) , CD227 (MUC1) , E-Caderina, P-Caderina, EGFR, Her2/neu, AUA1, TACSTD1 y Galectina-3; y (b) en el caso de células de leucemia o linfoma: CD3, CD19, CD20, CD34, CD38, CD45, CD123, CD138, B220, HLA-DR y CXCR4 ; c) en el caso de células madre cancerosas: CD34, CD40, CD48, CD49f, CD90, CD96, CD123, CD133, CD150, CD244, CXCR4 , ABCG2 y ESA. Las perlas inmunomagnéticas pueden ser de varios tamaños (50 micrómetros a menos de 200 nm) e incluyen perlas DYNAL™1 (> 1.5 micrómetros a aproximadamente 50 micrómetros) con anticuerpos contra la EpCAM (los cuales están disponibles comercialmente) . En una modalidad de la invención, el cóctel de selección positiva de EpCAM humana EasySep"11 y las nanopartículas EasySep MagneticMR (Stemcell Technologies) se agregan a la fracción con las células tumorales en el plasma del paso previo. Entonces se utiliza un imán para separar las células tumorales del resto del material y las células tumorales se lavan con una solución acuosa. 4. Extracción de las proteínas de células tumorales En el siguiente paso, las células tumorales enriquecidas o purificadas entonces están listas para la lisis de células y la extracción de las proteínas de CTC. Se utiliza una variedad de equipos comercialmente disponibles tales como, pero no limitados a: Amortiguador de Lisis de Pierce [Reactivo de Extracción M-PER^ (Número del Producto 78501 de Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL) ] y Amortiguador de Lisis de Sigma [Sigma CelLyticMR-M (Número del Producto de Sigma C 2978, Sigma-Aldrich, Inc., St . Louis, MO 63103)]. Después de la lisis, los restos de células se retiran por medio de la centrifugación dejando el sobrenadante lisado con los antígenos a ser medidos. En una modalidad preferida, se utiliza el equipo de Sigma o Pierce. 5. Cuantificación de las proteínas de células tumorales en las CTCs . La detección y la cuantificación entonces se realizan por medio del uso de un inmunoensayo de emparedado sumamente sensible utilizando anticuerpos que se enlazan a la proteína a ser sometida a ensayo. La Tabla 1 lista las proteínas que se pueden someter a ensayo en esta invención. Se puede utilizar una variedad de anticuerpos para el inmunoensayo, utilizando preferiblemente por lo menos un anticuerpo policlonal y mucho más preferiblemente, utilizando dos anticuerpos policlonales . La detección de cada proteína se realiza al utilizar un inmunoensayo de emparedado con los dos conjuntos de anticuerpos dirigidos contra la proteína que se analiza. En una modalidad preferida utilizando la electroquimioluminiscencia, un anticuerpo se une a la biotina y el otro se une a una molécula detectora de rutenio . En una modalidad preferida de la invención, un anticuerpo contra la proteína se une con la biotina y el segundo anticuerpo contra la proteína se etiqueta con una molécula detectora. En el caso de la electroquimioluminiscencia (ECL) , la molécula detectora es rutenio. Existe una abundante bibliografía en el dominio público que proporciona métodos ampliamente útiles para unir el rutenio a los anticuerpos (por ejemplo, Lee y colaboradores, Am J Trop Med Hyg 2001, 65: 1-9). El sobrenadante del lisado de células se mezcla con los dos anticuerpos y se incuba brevemente seguido por la adición de perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina en una solución que contiene tripropilamina. Con la aplicación de un potencial eléctrico y en presencia del antígeno objetivo, la etiqueta de rutenio se excita y se emite luz y ésta es detectada utilizando un instrumento de detección de ECL (tal como el analizador ORIGEN™* o un instrumento comercialmente disponible como M-Series 384^ de BioVeris Corporation, Gaithersburg, MD o Elecsys ????"11 o Elecsys 2010" de Roche Diagnostics, Indianapolis , IN) . En una modalidad preferida de la invención, el inmunoensayo utilizado de acuerdo con esta invención puede utilizar una de las siguientes combinaciones de anticuerpos (véase la Tabla 2 para los ejemplos de anticuerpos contra proteínas específicas) : 1 . Dos conjuntos de anticuerpos policlonales contra la proteína (la modalidad mucho más preferida) . 2 . Un anticuerpo policlonal y un anticuerpo monoclonal contra la proteína. 3 . Dos anticuerpos monoclonales contra la proteína.

Tabla 2 . Ejemplos de anticuerpos Proteína Anticuerpos EGFR Anticuerpo policlonal de conejo (AF231 ; R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN); Anticuerpo monoclonal (MAB1095, R&D Systems); También anticuerpos contra el fosfoEGFR tales como los números de catálogo de R&D AF1095 anticuerpo policlonal con especificidad hacia el EGFR con fosforilación del aminoácido Y1 173; MAB1095 anticuerpo monoclonal con especificidad hacia el EGFR con fosforilación del aminoácido Y1068; y AF3394 anticuerpo policlonal con especificidad hacia el EGFR con fosforilación del aminoácido Y845. ERCC1 Anticuerpo monoclonal 8F1 (ab2356, Novus Biologicals, Littleton CO); Número de Catálogo de Anticuerpo Monoclonal ERCC1 1 -M (Alpha Diagnostics, San Antonio, TX).

RRM1 Anticuerpo policlonal (Número de Catálogo ?000?6240-?01 , Abnova Corporation, Taipei, Taiwan); Anticuerpo monoclonal (Número de Catálogo MAB3033, Chemicon International, Inc., Temecula, CA). TS Anticuerpo policlonal de conejo (Número de Catalogo ab22254, Novis Biologicals); Anticuerpo monoclonal de ratón TS106 (Número de Catálogo NB 600-550, Novus Biologicals); Anticuerpo monoclonal de ratón 3A7.A1 1 (Número de Catálogo ab990, Novus Biologicals); Anticuerpo policlonal de oveja (Número de Catálogo ab7398, Novus Biologicals) Beta-tubulina Anticuerpos policlonales y monoclonales contra la beta-tubulina Clase III: véase Seve y colaboradores, 2005, Clin Cáncer Res 1 1 :5481 -6 y véase Mozzetti y colaboradores, 2005 Clin Cáncer Res 11 :298-305 para ejemplos de anticuerpos contra la beta- tubulina Clase III.

El inmunoensayo de esta invención es capaz de detectar la expresión de proteínas de 100 o menos células cancerosas agregadas por mi de sangre de un voluntario humano sin cáncer y preferiblemente 30 o menos células por mi de sangre . Además de la electroquimioluminiscencia, otros inmunoensayos que pueden producir una alta sensibilidad requerida para esta aplicación incluyen, pero no están limitados a: a) Quimioluminiscencia tal como aquella descrita por Liu Y y colaboradores, 2003 (J Food Protection 66:512-7) . b) Quimioluminiscencia fluorogénica (FCL, por sus siglas en inglés) como aquella descrita por Yu H y colaboradores, 2000 (Biosens Bioelectron 14:829-40). c) Inmunoensayo de polarización de fluorescencia (véase Howanitz JH, 1988 Arch Pathol Lab Med 1 12:775-9). d) Inmunoensayo de fluorescencia con resolución temporal (Butcher H y colaboradores, 2003, J Immunol ethods 272:247-56; Soukka y colaboradores, 2001, Clin Chem 47:1269-78; Howanitz JH, 1988 Arch Pathol Lab Med 112 : 775-9) . En una modalidad preferida, se calcula la cantidad relativa de las células tumorales circulantes utilizadas en el ensayo. Esto permite una relación de la proteína total por célula a ser obtenida y se puede comparar con estándares de control de células cancerosas con niveles altos, moderados y bajos de proteína por célula. Esta es una modalidad preferida puesto que elimina una situación positiva falsa en la cual hay muchas CTCs que tienen un bajo nivel de expresión de proteína que puede proporcionar una señal que imita aquella obtenida de un número pequeño de CTCs con un alto nivel de expresión. En esta modalidad, se puede utilizar una variedad de metodologías para calcular los números relativos de células que incluyen el análisis citométrico de flujo, la cuantificación del ADN total o antígenos relacionados con el ADN tales como histonas de células lisadas (hay 6 pg de ADN por célula diploide) , la cuantificación de un producto génico de manejo doméstico como beta-actina y las mediciones de turbiedad o absorbancia. Debido a su sensibilidad, el método de acuerdo con esta invención es útil para identificar a pacientes con cáncer quienes se beneficiarían probablemente o no de los tratamientos anticáncer específicos. La invención será mejor entendida por referencia a los siguientes ejemplos, los cuales ilustran pero no limitan la invención descrita en este documento.

EJEMPLOS EJEMPLO 1. Un paciente con cáncer entra en el consultorio y se recolecta una muestra de sangre en un tubo para impedir la coagulación. Las células cancerosas se aislan y las proteínas se extraen utilizando un equipo comercialmente disponible tal como el Amortiguador de Lisis de Pierce y el Amortiguador de Lisis de Sigma. Un anticuerpo policlonal de conejo etiquetado con rutenio contra el EGFR y un anticuerpo policlonal biotinilado (también contra el EGFR) se agregan y es seguido por la adición de una suspensión de perlas magnéticas con avidina unida y luego una solución que contiene tripropilamina . Se aplica una corriente eléctrica y la electroquimioluminiscencia (ECL) se detecta utilizando un dispositivo de detección de ECL tal como uno comercialmente disponible (BioVeris Corporation o Roche Diagnostics) . La señal es proporcional a la cantidad del EGFR encontrado en las células tumorales circulantes. EJEMPLO 2. Los métodos son como en el ejemplo 1, excepto que los anticuerpos son contra la ERCC1. EJEMPLO 3. Los métodos son como en el ejemplo 1, excepto que los anticuerpos son contra la RRM1. EJEMPLO 4. Los métodos son como en el ejemplo 1, excepto que los anticuerpos son contra la TS. EJEMPLO 5. Los métodos son como en el ejemplo 1, excepto que los anticuerpos son contra la beta-tubulina . EJEMPLO 6. En este ejemplo, se examina la sensibilidad para detectar el EGFR de células cancerosas utilizando un inmunoensayo de emparedado que utiliza la electroquimioluminiscencia. Se prepara un amortiguador de ensayo de PBS: • Amortiguador de Ensayo Tween-20 al 0.5% y albúmina de suero bovino al 0.5% (BSA) en PBS (solución salina amortiguada con fosfato) El anticuerpo policlonal anti-EGFR se obtiene primero en formas tanto biotiniladas (BAF231 de R&D Systems) como no biotiniladas (AF231 de R&D systems) . El anticuerpo policlonal no biotinilado se etiqueta con rutenio ("etiquetado con TAG" ) como sigue: · 1.5 µg/µl de etiqueta de rutenio (Ester de BV-TAG-NHS, # de Catálogo 110034; BioVeris Corporation, Gaithersburg, MD, EUA) se prepara en DMSO. • Para 500 µ? de anticuerpo, se agregan 18.8 µ? de BV-TAG- NHS y para 200 µ? de anticuerpo policlonal, se agregan 3.8 µ? de BV-TAG-NHS. En cada caso, la solución se incuba durante una hora y la reacción se detiene por la adición de 20 µ? de glicina 2M. • El éster de BV-TAG-NHS no acoplado en cada mezcla de reacción se retira utilizando una columna de filtración de gel de PD-10, pre-equilibrada con PBS (que incluye azida de sodio al 0.08%), la cual también se utiliza para la elusión. Para cada anticuerpo etiquetado, la concentración de proteínas en cada fracción se determina por medio del ensayo de proteína y las fracciones con alto contenido de proteína se utilizan en los ejemplos subsecuentes . El anticuerpo policlonal etiquetado con rutenio y el anticuerpo policlonal biotilinado son referidos en lo sucesivo en este ejemplo como "TAG-pAb" y "Biotina-pAb" . Las células cancerosas de carcinoma A431 (de ATCC, Manassas, VA) se desarrollan en placas de cultivo de tejido de 6 pocilios conforme a las condiciones recomendadas por ATCC, se lavan dos veces con PBS y una alícuota se cuenta utilizando un hemacitómetro. Estas células se someten a la lisis utilizando el Amortiguador de Lisis de Sigma [Sigma CelLytic-M^ (Número de Producto de Sigma C 2978, Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO 63103)]. La lisis de células se realiza conforme a la recomendación del fabricante con la adición de 5 minutos de remolineo vigoroso antes de la remoción de los restos de células. Los restos de células se retiran del lisado de células por medio de la centrifugación a 14,000 rpm durante 30 minutos en una Centrífuga Eppendorf (Modelo 5415C) . Un ensayo de electroquimioluminiscencia se realiza de la siguiente manera: • Secuencialmente, a cada pocilio, se agregan los sobrenadantes del lisado de células (la cantidad del lisado por pocilio es diferente de aquella extraída de 3 a 100 células; los pocilios de control sin el extracto también se utilizan) y entonces 50 µ?/pocillo de una mezcla de TAG-Ab y Biotina-Ab (por ejemplo en una concentración entre 0.5 a 2 µg/ml cada uno; diluida en el amortiguador de ensayo de PBS) se agregan a los pocilios de una placa de polipropileno de fondo en forma de U de 96 pocilios y se incuban a temperatura ambiente con agitación constante (por ejemplo, durante 2 horas) . • 10 µg de perlas magnéticas de estreptavidina (por ejemplo, Estreptavidina DYNABEADS 14-280" , # de Catálogo 110028, BioVeris Corporation, Gaithersburg, MD) en 25 µ? se agregan a cada pocilio y se incuban con agitación constante (por ejemplo, durante 30 minutos) . • El amortiguador de ensayo de PBS se agrega a cada pocilio para hacer un volumen final de 250 µ? por pocilio. Todas las condiciones se someten a prueba en pocilios por lo menos duplicados. La placa de 96 pocilios entonces se analiza por la electroquimioluminiscencia utilizando el Analizador M8 M-Series^ (Número de Catálogo 310800, BioVeris Corporation, Gaithersburg, MD) . Utilizando este inmunoensayo, los EGFR de por lo menos diez células de carcinoma A431 son detectables con una señal arriba del fondo. EJEMPLO 7. En este ejemplo, se examinó la sensibilidad para detectar el EGFR recombinante utilizando un inmunoensayo de emparedado utilizando la electroquimioluminiscencia . Se preparó un amortiguador de ensayo de PBS: • Amortiguador de Ensayo: Tween-20 al 0.5% y albúmina de suero bovino al 0.5% (BSA) en PBS (solución salina amortiguada con fosfato, pH 7.2) Se preparó un diluyente estándar: • Diluyente Estándar: albúmina de suero bovino al 1% (BSA) en PBS (solución salina amortiguada con fosfato, pH 7.2) El anticuerpo policlonal anti-EGFR se obtuvo primero en las formas tanto biotiniladas (BAF231 de R&D Systems) como no biotiniladas (AF231 de R&D systems) . El anticuerpo policlonal no biotinilado se etiqueta con rutenio ("etiquetado con TAG" ) de acuerdo con los métodos de Lorence & Lu (documento WO 2006/041959 A2) . El anticuerpo policlonal etiquetado con rutenio y el anticuerpo policlonal biotinilado son referidos en lo sucesivo en este ejemplo como "TAG-pAb" y "Biotina-pAb" . La proteína de EGFR recombinante se obtuvo en la forma de la proteína EGFR-Fe (una proteína quimérica que consiste del dominio extracelular fusionado a la región Fe de la IgG humana por la vía de un grupo conector; R&D systems, # de catálogo 344 -ER) . Un ensayo de electroquimioluminiscencia se realizó de la siguiente manera: · Los estándares se diluyeron en 1 mi de PBS (pH 7.2 con BSA al 0.35% y azida de sodio al 0.05%) para formar una solución madre de 50 µg/mL. • Los estándares se diluyeron en el Diluyente Estándar para producir 1600, 160, 16 y 4 pg/pocillo cuando se utilizaron 25 µL por pocilio. A cada pocilio de una placa de polipropileno de fondo en forma de U de 96 pocilios (con 25 µL· de estándar por pocilio) se agregaron 50 µ?/pocillo de una mezcla de TAG-Ab y Biotina-Ab (por ejemplo, a una concentración de 1.0 µg/ml en los 50 µ? antes de la adición) y la solución resultante se incubó a temperatura ambiente con agitación constante (durante 2 horas) . • 10 µg de perlas magnéticas de estreptavidina (por ejemplo, Estreptavidina DYNABEADS M-280MR, # de Catálogo 110028, BioVeris Corporation, Gaithersburg, MD) en 25 µ? se agregaron a cada pocilio y se incubaron con agitación constante (durante 30 minutos) . • El Amortiguador de Ensayo de PBS se agregó a cada pocilio para hacer un volumen final de 250 µ? por pocilio. Todas las condiciones se sometieron a prueba en pocilios por lo menos duplicados. La placa de 96 pocilios entonces se analizó por la electroquimioluminiscencia utilizando el Analizador - Series 384" (BioVeris Corporation, Gaithersburg, MD) . Utilizando este inmunoensayo, tan sólo 4 pg por pocilio de estándar de EGFR fueron detectables con una señal arriba del fondo (Tabla 3) .

Tabla 3. Detección por electroquimioluminiscencia (ECL) del EGFR recombinante por medio del inmunoensayo que utiliza el anticuerpo policlonal etiquetado con rutenio (TAG-pAb) y el anticuerpo policlonal biotinilado (Biotina-pAb) .

* Señal de ECL promedio arriba de la señal promedio de los pocilios de control sin antígeno.

EJEMPLO 8. En este ejemplo, la especificidad para un inmunoensayo de ECL contra el EGFR para detectar la sobreexpresion contra la ausencia de sobreexpresion de EGFR de células cancerosas se determinó junto con una determinación de repetición de la sensibilidad para detectar el EGFR recombinante. Los métodos fueron como aquel utilizado en el Ejemplo 7 con el análisis adicional de los extractos celulares de las células de carcinoma de mama MDA-MB-468 (células de control positivo para la sobreexpresion del EGFR) y se analizaron las células de carcinoma de mama ZR-75-1 (control negativo para la sobreexpresion de EGFR) . Las células MDA-MB-468 y ZR-75-1 (de ATCC, Manassas, VA) se cultivaron en placas de cultivo de tejido de 6 pocilios conforme a las condiciones recomendadas por ATCC, se lavaron dos veces con PBS y una alícuota se contó utilizando un hemacitómetro . La lisis de las células SK-BR-3 y la obtención del sobrenadante se realizaron utilizando el Amortiguador de Lisis de Pierce [# de catálogo 78501; Pierce Biotechnology, Rockford, IL] con el inhibidor de proteasa de Pierce [# de catálogo 78410; Pierce Biotechnology] . La cantidad del sobrenadante del lisado por pocilio era diferente de aquella extraída de 1 a 250 células MDA-MB-468 o ZR-75-1 y se analizó por el EGFR utilizando el inmunoensayo descrito en el Ejemplo 7. Utilizando el estándar de EGFR, tan solo 4 pg por pocilio de estándar de EGFR fueron detectables nuevamente con una señal arriba del fondo (Tabla 4) . Tabla 4. Detección por electroquimioluminiscencia (ECL) del EGFR recombinante por medio de un inmunoensayo que utiliza el anticuerpo policlonal etiquetado con rutenio (TAG-pAb) y el anticuerpo policlonal biotinilado (Biotina-pAb) . EGFR Señal de ECL Promedio (arriba del fondo)* (pg/pocillo) 4 627 16 1919 160 12961 1600 113532 *Señal de ECL promedio arriba de la señal promedio de los pocilios de control sin antígeno.

Los resultados de este experimento utilizando lisados de células se presentan en las Figuras 1 y 2. La Figura 1 muestra gráficamente el extremo inferior del conjunto de datos para observar mejor la capacidad de este ensayo para detectar el EGFR de números bajos de células. La Figura 1 solo incluye datos para el intervalo de células de hasta 10 células por pocilio. La Figura 2 muestra gráficamente el conjunto de datos completo (hasta 250 células por pocilio) . El EGFR fue detectable y estaba arriba de la línea de referencia de los lisados de las células MDA-MB-468 en este experimento incluyendo aquellos pocilios que utilizaban la cantidad más baja del lisado de células MDA-MB-468 en este experimento (lisado de 1 célula agregada por pocilio; Figura 1) . Además, el lisado de las células MDA-MB-468 (control positivo para la sobreexpresión del EGFR) proporcionó una señal mucho más alta en el inmunoensayo para el EGFR que el lisado de las células ZR-75-1 (control negativo para la sobreexpresión de EGFR) arriba del intervalo completo sometido a prueba de 1 a 250 células por pocilio, indicando la alta especificidad de los resultados para la detección del EGFR (Figuras 1 y 2) .

Claims (9)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para someter a ensayo una proteína de células cancerosas en una muestra de sangre, caracterizado porque comprende enriquecer las células cancerosas de la muestra de sangre seguido por realizar en las células cancerosas enriquecidas un inmunoensayo capaz de detectar la proteína de las células cancerosas enriquecidas; en donde el inmunoensayo tiene una sensibilidad definida por ser capaz de detectar de manera cuantificable la proteína de treinta células cancerosas por mililitro de sangre o por ser capaz de detectar sesenta y cuatro picogramos de la proteína; y la proteína se selecciona del grupo que consiste del receptor de factor de crecimiento epidérmico, la proteína de reparación por escisión del grupo de complementación cruzada 1, la subunidad MI de la ribonucleótido reductasa, la timidilato sintasa y la beta-tubulina; y el inmunoensayo genera una señal que es proporcional al número de moléculas de la proteína presentes en las células cancerosas en la muestra de sangre.
2. 2. Un método para detectar la expresión de una proteína de células cancerosas en una muestra de sangre, caracterizado porque comprende aislar las células cancerosas de la muestra de sangre seguido por hacer un extracto de las células cancerosas aisladas seguido por realizar en el extracto un inmunoensayo capaz de detectar la proteína, en el cual un resultado positivo del inmunoensayo indica la presencia de la proteína en las células cancerosas; en donde la proteína es el receptor del factor de crecimiento epidérmico; y el inmunoensayo tiene una sensibilidad definida por ser capaz de detectar la proteína de treinta células cancerosas por mililitro de sangre o por ser capaz de detectar sesenta y cuatro picogramos de la proteína.
3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el inmunoensayo es capaz de detectar la proteína de diez células cancerosas por mililitro de sangre.
4. 4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el inmunoensayo es capaz de detectar la proteína de tres células cancerosas por mililitro de sangre.
5. 5. El método de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el inmunoensayo es capaz de detectar cuatro picogramos de la proteína.
6. 6. El método de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el inmunoensayo utiliza la electroquimioluminiscencia para la detección.
7. 7. El método de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el inmunoensayo utiliza una técnica seleccionada de quimioluminiscencia, quimioluminiscencia fluorogénica, polarización de fluorescencia y fluorescencia con resolución temporal para la detección.
8. 8. Un método para tratar a un paciente con cáncer para beneficiarlo probablemente del tratamiento con un agente anti-EGFR, caracterizado porque comprende administrar el agente al paciente cuya muestra de sangre sometida a prueba fue positiva en el método de conformidad con la reivindicación 1 o 2.
9. 9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el agente se selecciona del grupo que consiste de cetuximab, panitumumab, erlotinib y gefitinib.