JP5078100B2 - 循環癌細胞におけるステロイド受容体の検出および処置 - Google Patents
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Description
内分泌療法またはホルモン療法は、乳癌および前立腺癌患者の処置において最も重要な手法の1つである。処置は、これらの癌患者の腫瘍におけるステロイド受容体の存在に大きく依存している。乳癌の女性を処置する意思決定プロセスにおいては、25年以上にわたってステロイド受容体の状態が使用されてきた。内分泌療法またはホルモン療法は、エストロゲン受容体(ER)およびプロゲステロン受容体(PR)陽性腫瘍を有する患者の処置での使用に成功している(非特許文献1)。さらに、内分泌療法への反応に対する、腫瘍中のアンドロゲン受容体レベルの重要な役割も明らかにされている(非特許文献2)。内分泌療法は、高い割合で腫瘍反応を生じる(30%と推定され、特定の患者では80%までが報告されている;非特許文献3)。乳癌の内分泌療法は、高い効果と最小限の毒性および高い生活の質とを兼ね備えた利点を有する(非特許文献1)。
・ER陰性患者の11%(原発での結果に基づく)が、その後転移においてER陽性結果を示した(非特許文献13)。
・全被験患者の11%(これは原発腫瘍のアッセイに基づくER陰性患者の33%となる)が、その後転移においてER陽性結果を示した(非特許文献14)。
・ER陰性患者(原発での結果に基づく)140例の33%が、その後転移においてER陽性結果を示した(非特許文献15)。
Bernard−Martyら,2004,The Oncologist 9:617−32 Buchanan Gら,2005,Cancer Res 65:8487−8496 Gradishar,2004,The Oncologist 9:378−84 Esslimani−Sahlaら,2004,Clin Cancer Res 10:5769−5776 Hanstein Sら,2004,Eur J Endocrin 150:243−255 Matthews&Gustafsson JA,2003,Mol.Interv.3:181−92 Bardouら,2003,J Clin Oncol 10:1973−79 Hoppら,2004;Clin Cancer Res 10:7590−00 Scherら,2004,Endocrine−Related Cancer 11:459−76 Suzukiら,2003,Endocrine−Related Cancers 19:209−216 Mannら,2005,J Clin Oncol 22:5148−54 McCann,2004 J Natl Cancer Inst 93:579−80 Glass EL,2003ら,San Antonio Breast Cancer Symposium,Abstract #257 Franco N,2004,Proc ASCO,Abstract 539 Spataroら,1992.Annals of Oncology 3:733−740,1992 Delage Vら,1996 Clin Chem 42:1955−1960 Krambovitisら,1995 Clin Chem 41:48−53 Cotran,Kumar and Robbins,1989 Robbins Pathologic Basis of Disease,4th Edition,WB Saunders Co,Philadelphia,page 251,2nd column,1st paragraph,2nd sentence Kelemenら,2002,J Biol Chem 277:8741−48
本発明は、血液試料中の循環癌細胞からステロイド受容体の発現を検出する方法であって、前記血液試料から前記癌細胞を単離した後、前記単離した癌細胞から抽出物(例えば、溶解産物)を作製し、その後前記抽出物に対してステロイド受容体を検出することができるイムノアッセイを行う工程を含み、陽性のイムノアッセイ結果が、癌細胞におけるステロイド受容体の存在を示す、方法を提供する。本発明によれば、癌細胞は乳癌細胞であり、ステロイド受容体は、エストロゲン受容体−α、エストロゲン受容体−β、プロゲステロン受容体、およびアンドロゲン受容体からなる群から選択されるか、あるいは癌細胞は前立腺癌細胞であり、ステロイド受容体はアンドロゲン受容体である。イムノアッセイは、癌を有さないヒト由来の血液試料1ミリリットル中に添加される900個のMCF−7癌細胞からステロイド受容体を検出することができる。
本発明の好ましい実施形態によれば、例えば以下の方法などが提供される:
(項目1)
血液試料中の循環癌細胞からステロイド受容体の発現を検出する方法であって、該血液試料から該癌細胞を単離した後、該単離した癌細胞から抽出物を作製し、その後、該抽出物に対して、該ステロイド受容体を検出することができるイムノアッセイを行う工程を含み、陽性のイムノアッセイ結果が、該癌細胞における該ステロイド受容体の存在を示し、
該癌細胞が乳癌細胞であり、該ステロイド受容体が、エストロゲン受容体−α、エストロゲン受容体−β、プロゲステロン受容体、およびアンドロゲン受容体からなる群から選択されるか、あるいは該癌細胞が前立腺癌細胞であり、該ステロイド受容体がアンドロゲン受容体であり、
該イムノアッセイが、癌を有さないヒト由来の血液試料1ミリリットル中に添加される900個のMCF−7癌細胞から該ステロイド受容体を検出することができることによってか、あるいは4pgの該ステロイド受容体を検出することができることにより定義される感度を有する、
方法。
(項目2)
前記イムノアッセイが、癌を有さないヒト由来の血液試料1ミリリットル中に添加される500個のMCF−7癌細胞から前記ステロイド受容体を検出することができる、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記イムノアッセイが、乳癌を有さないヒト由来の血液試料1ミリリットル中に添加される100個のMCF−7癌細胞から前記ステロイド受容体を検出することができる、項目2に記載の方法。
(項目4)
前記イムノアッセイが、乳癌を有さないヒト由来の血液試料1ミリリットル中に添加される30個のMCF−7癌細胞から前記ステロイド受容体を検出することができる、項目3に記載の方法。
(項目5)
前記イムノアッセイが、電気化学発光を検出に使用する、項目1に記載の方法。
(項目6)
前記イムノアッセイが、化学発光、蛍光化学発光、蛍光偏光、および時間分解蛍光から選択される技法を検出に使用する、項目1に記載の方法。
(項目7)
前記イムノアッセイが、前記ステロイド受容体に対するポリクローナル抗体を使用する、項目1に記載の方法。
(項目8)
前記イムノアッセイが、前記ステロイド受容体のN末端領域に対する第1のポリクローナル抗体と、前記ステロイド受容体のC末端領域に対する第2のポリクローナル抗体とを使用する、項目1に記載の方法。
(項目9)
前記イムノアッセイが、前記ステロイド受容体に対するモノクローナル抗体を使用する、項目1に記載の方法。
(項目10)
前記癌細胞が、該癌細胞に選択的に結合できる免疫磁気ビーズと前記血液を接触させることによって単離される、項目1に記載の方法。
(項目11)
前記ステロイド受容体がエストロゲン受容体−αである、項目1に記載の方法。
(項目12)
前記ステロイド受容体がプロゲステロン受容体である、項目1に記載の方法。
(項目13)
内分泌療法剤による処置から利益が得られる可能性がある癌患者を同定する方法であって、項目1〜12に記載のいずれか1項に記載の方法を含み、前記癌細胞含有血液試料が該患者から採取される、方法。
(項目14)
前記患者由来の腫瘍組織が、前記ステロイド受容体の発現に対して陰性であることが免疫組織化学的に予め測定されている、項目13に記載の方法。
(項目15)
内分泌療法剤による処置から利益が得られる可能性がある癌患者を処置する方法であって、項目13に記載の方法に基づき同定された該患者に抗癌剤を投与し、それによって該患者を処置する工程を含む、方法。
(項目16)
前記内分泌療法剤が、タモキシフェン、アロマターゼ阻害剤、およびフルベストラントからなる群から選択される、項目15に記載の方法。
(項目17)
前記アロマターゼ阻害剤が、アナストロゾール、レトロゾール、エキセメスタン、およびファドロゾールからなる群から選択される、項目16に記載の方法。
AR:アンドロゲン受容体
ER:エストロゲン受容体
PR:プロゲステロン受容体
IHC:免疫組織化学
ECL:電気化学発光
本発明は、血液試料中の循環乳癌または循環前立腺癌におけるステロイド受容体タンパク質(エストロゲン受容体−α、エストロゲン受容体−β、プロゲステロン受容体、および/またはアンドロゲン受容体)のレベルを定量化するのに十分な感度の方法を提供し、エストロゲン受容体および/またはプロゲステロン受容体などのステロイド受容体を対象とするホルモン療法剤または別の薬剤を使用した療法から利益が得られる可能性がある癌患者を同定する方法を提供する。したがって、本発明は、血液試料を試験して、ホルモン療法から利益が得られると思われるさらなる患者を同定するのに便利で、感度がきわめて高く、高速の手段を提供することによって、乳癌または前立腺癌の処置の分野を進歩させる。循環乳癌細胞におけるエストロゲン受容体−α、エストロゲン受容体−β、アンドロゲン受容体、および/またはプロゲステロン受容体タンパク質を検出するための、あるいは循環前立腺癌細胞におけるアンドロゲン受容体タンパク質を検出するための、例えば電気化学発光(ECL)検出を使用した、高速かつきわめて感度が高い免疫学的アッセイは、ホルモン療法から利益が得られると思われるさらなる患者を同定するのに好ましい手段である。
1.赤血球の除去
2.正常な白血球をさらに枯渇させるための任意の陰性選択。好ましい実施形態はこの手順を含む。
3.循環癌細胞の陽性選択
4.エストロゲン受容体および/またはプロゲステロン受容体を含む核タンパク質の抽出
5.循環癌細胞からのエストロゲン受容体および/またはプロゲステロン受容体の検出および定量化
1.赤血球の除去
赤血球の除去には、密度に基づく分離(例えば、Becton Dickinson BD Vacutainer CPTチューブ内に直接血液を採取した後、遠心分離を行う)、PURESCRIPT RBC溶解緩衝液(Gentra、米国ミネソタ州ミネアポリス)、FACS溶解溶液(BDIS)、IMMUNOLYSE(Coulter)、OPTILYSE B(Immunotech)、およびACK溶解緩衝液(Biosource、米国メリーランド州ロックビル)などの市販の溶解緩衝液を含むがこれらに限定されない、種々の方法を使用することができる。
2.正常な白血球をさらに枯渇させるための陰性選択
本発明の好ましい実施形態は、腫瘍細胞の単離に陰性選択手順を使用する。陰性選択は、白血球、特にリンパ球および単球のさらなる枯渇を可能にする。この手順は、白血球抗原(特に白血球共通抗原であるCD45)と赤血球抗原(グリコフォリンAなど)との両に対して二重特異性を有する抗体の使用を含む。このような二重特異性抗体の市販のカクテルは、Stemcell Technologiesから入手することができる(Rosettesepカタログ番号15127および15167)。このカクテルは、グリコフォリンA、およびヒト造血細胞上の各種細胞表面抗原(CD2、CD16、CD19、CD36、CD38、CD45、CD66b)に対する二重特異性抗体を含む。これらの二重特異性抗体の1つ以上が、血液採取前に、BD Vacutainer CPTチューブに添加される。好ましい実施形態においては、1つ以上の白血球に関連するCD分子に対する二重特異性抗体のカクテルが使用される。血液がCPT Vacutainerチューブ内に導入されると、二重特異性抗体は、それぞれ白血球と多くの赤血球とからなる免疫ロゼットを形成する。これらの免疫ロゼットは、赤血球の密度とほぼ同じ密度を有しており、遠心分離時に赤血球ペレット中に存在し、それによって細胞ペレットやゲルバリアの上にある腫瘍細胞画分から白血球をさらに除去する。血漿中に腫瘍細胞を有する画分は、さらなる処理のために採取される。
3.循環癌細胞の陽性選択
循環癌細胞を単離する好ましい方法では、免疫磁気ビーズが使用される。循環癌細胞を単離する他の方法には、濾過が含まれる(Vona Gら,2000,Am J Pathol.2000 156:57−63)。好ましい実施形態において、免疫磁気ビーズは、上皮細胞接着分子(EpCAM)、サイトケラチン−19などのサイトケラチン、特にサイトケラチンやその他の表面マーカーに対する抗体のカクテルなど、癌細胞の表面に選択的に認められる抗原に対する抗体を有する。免疫磁気ビーズは種々のサイズ(50ミクロン〜200nm未満)となる場合があり、EpCAMに対する抗体を有するDYNALビーズ(1.5ミクロン超〜約50ミクロン、市販)を含む。本発明の一実施形態において、EASYSEP(登録商標)ヒトEpCAM陽性選択カクテルおよびEASYSEP(登録商標)磁性ナノ粒子(Stemcell Technologies)は、前の手順で得た血漿中の腫瘍細胞を有する画分に添加する。次いで磁石を使用して腫瘍細胞を残りの物質から分離し、これらの腫瘍細胞を水溶液で洗浄する。
4.ステロイド受容体を含む核タンパク質の抽出
次の手順において、濃縮または精製した腫瘍細胞は、核タンパク質の抽出ができる状態となっている。以下のような各種の市販のキットを使用することができる。
・Sigma CelLytic(登録商標)NuClEAR(登録商標)Extraction Kit(製品コード:NXTRACT;Sigma、米国ミズーリ州セントルイス 63103)
・Pierce NE−PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents Kit(製品番号78833;Pierce Biotechnology,Inc.、米国イリノイ州ロックフォード 61105)
・核抽出キット(カタログ番号AY2002、Panomics,Inc.、米国カリフォルニア州レッドウッドシティー 94063)
好ましい抽出方法では、RlPA緩衝液(Pierce Biotechnology、カタログ番号89900)を0.4M〜0.45M 塩化カリウム(KCl)とともに使用する。
5.循環癌細胞からのステロイド受容体の検出および定量化
次いで、アッセイ中の受容体に結合する抗体を使用した高感度のサンドイッチイムノアッセイを使用することにより、エストロゲン受容体−α、プロゲステロン受容体、またはアンドロゲン受容体の検出を行うことができる。イムノアッセイには種々の抗体、好ましくは少なくとも1つのポリクローナル抗体、最も好ましくは2つのポリクローナル抗体が使用できる。本発明の一実施形態において、イムノアッセイは、ステロイド受容体のN末端領域に対する第1のポリクローナル抗体と、ステロイド受容体のC末端領域に対する第2のポリクローナル抗体を使用する。
1.ER−αに対する2組のポリクローナル抗体(最も好ましい実施形態)
2.ER−αに対するポリクローナル抗体とモノクローナル抗体
3.ER−αに対する2つのモノクローナル抗体
ER−αを検出するためには、ER−αに対する種々のモノクローナルおよびポリクローナル抗体が有用であり、これにはER−αに対する以下の抗体が含まれるが、これらに限定されない。
・ER−αに対するポリクローナル抗体(例えば、ウサギ抗ER−αポリクローナル抗体(BETHYL Laboratories、米国テキサス州モントゴメリー、カタログ番号A300−495A、A300−496A、A300−497A、およびA300−498A;AnaSpec、米国カリフォルニア州サンホセ 95131、カタログ番号29595;Abcam,Inc.、米国マサチューセッツ州ケンブリッジ 02139、Abcamカタログ番号ab3575、ab5700−l、ab30656、ab28798、ab28799、ab31312、ab31314−5、31478;LabVision、Labvision、カリフォルニア州フレモント 94539、米国カリフォルニア州フレモント 94539、LabVisionカタログ番号RB−9061)
・ER−αに対するモノクローナル抗体(LabVisionカタログ番号:MS−750、MS−354、MS−391、MS−1071、RM−9101、RT−1639、RT−1640、RT−1641、RT−1642;Abcamカタログ番号:ab31478、abll04、ab858、ab484、ab2746、ab9269、ab8857、ab7820−8、ab19348−9、ab15284)
本発明のイムノアッセイは、これまでに開発されたステロイド受容体に対するいずれのイムノアッセイよりも高速であり、有意に高い感度を有する。本発明のイムノアッセイは、癌を有さないヒト志願者の血液1mL当たりに添加された900個のMCF−7乳癌細胞、好ましくは血液1mL当たり500個のMCF−7細胞、より好ましくは血液1mL当たり100個のMCF−7細胞、最も好ましくは血液1mL当たり30個のMCF−7細胞からステロイド受容体発現を検出することができる。
a)Liu Yら,2003(J Food Protection 66:512−7)に記載のような化学発光
b)Yu Hら,2000(Biosens Bioelectron 14:829−40)に記載のような蛍光化学発光(FCL)
c)蛍光偏光イムノアッセイ(Howanitz JH,1988 Arch Pathol Lab Med 112:775−9を参照)
d)時間分解蛍光イムノアッセイ(Butcher Hら,2003,J Immunol Methods 272:247−56;Soukkaら,2001,Clin Chem 47:1269−78;Howanitz JH,1988 Arch Pathol Lab Med 112:775−9)
好ましい実施形態においては、アッセイで使用される乳癌細胞の相対量が推定される。これにより細胞1個当たりの総ER−αタンパク質の比率が得られ、細胞1個当たりのER−αタンパク質のレベルが高い、中程度の、および低い乳癌細胞の対照標準物質と比較することができる。これは、高レベルの発現を有する少数の乳癌細胞から得られるものによく似たシグナルを生じうる、低レベルのER−αタンパク質の発現を有する多くの循環乳癌細胞が存在する偽陽性の状況を排除することから、好ましい実施形態である。本実施形態においては、フローサイトメトリー分析、溶解細胞からの総DNAあるいはヒストンなどのDNA関連抗原の定量化(二倍体細胞当たりDNA6pgが存在)、ベータアクチンのようなハウスキーピング遺伝子産物の定量化、および濁度または吸光測定を含めた、種々の手法を使用して相対細胞数を推定することができる。
・ERベータに対するウサギポリクローナル抗体(例えば、カタログ番号Erb15−A、Alpha Diagnostics International,Inc.、米国テキサス州サンアントニオ;カタログ番号ab5786、Novus Biologicals、米国コロラド州リトルトン)
・ERベータに対するマウスモノクローナル抗体(例えば、カタログ番号ab16813、Novus Biologicals)
PRのアッセイは、PRに対して特異的な抗体を使用する点を除けば、ER−αと同じ方法を使用して行うことができる。PRに対する有用な抗体の例には、以下が含まれるが、これらに限定されない。
・PRに対するウサギポリクローナル抗体(例えば、Abcamカタログ番号abl5509、ab15510、Abcam,Inc.、米国マサチューセッツ州ケンブリッジ 02139)
・PRに対するマウスモノクローナル抗体(例えば、Abcamカタログ番号ab9895、ab9896、ab2764、Abcam,Inc.)
・PRに対するウサギモノクローナル抗体(例えば、Abcamカタログ番号ab27616)
アンドロゲン受容体(AR)のアッセイは、ARに対して特異的な抗体を使用する点を除けば、ER−αと同じ方法を使用して行うことができる。PRに対する有用な抗体の例には、以下が含まれるが、これらに限定されない。
・ARに対するヤギポリクローナル抗体(例えば、Abcamカタログ番号ab19066、Abcam,Inc.、米国マサチューセッツ州ケンブリッジ 02139)
・ARに対するウサギポリクローナル抗体(例えば、Abcamカタログ番号ab3509)
本発明における乳癌の処置のためのホルモン療法剤(内分泌療法剤とも呼ばれる)には、以下を含む米国食品医薬品局の承認を受けたものが含まれるが、これらに限定されない(Buzdar,2003,The Oncologist 8:335−41)。
・タモキシフェン(Gradishar,2004,The Oncologist 9:378−84も参照)
・アロマターゼ阻害剤(アナストロゾール、レトロゾール、エキセメスタン;Campos 2004(The Oncologist 9:126−36)も参照)
・エストロゲンおよびプロゲステロン受容体を下方調節し、既知のアゴニスト活性を有さないエストロゲン受容体拮抗薬である、フルベストラント(Brossら,2002,The Oncologist 7:477−80も参照)
アロマターゼ阻害剤のファドロゾールは、すでに日本で承認されている。
乳癌患者が来院したら、凝固を予防するために血液試料をチューブに採取する。Sigma CelLytic(登録商標)NuClEAR(登録商標)Extraction Kitなどの市販のキットを使用して、癌細胞を単離し、核タンパク質を抽出する。ER−αに対するルテニウム標識ウサギポリクローナル抗体と、ビオチン化ポリクローナル抗体(ER−αに対する抗体も)とを添加した後、ストレプトアビジンが付着した磁気ビーズの懸濁液を添加し、次いでトリプロピルアミンを含有する溶液を添加する。電流を印加し、市販品(BioVeris Corporation)などのECL検出装置を使用して電気化学発光(ECL)を検出する。シグナルは、循環腫瘍細胞中に存在するER−α受容体の量に比例する。
実施例1に記載のような、高レベルのER−αを循環悪性細胞に有する患者をホルモン療法で処置する。
方法は実施例1と同様であるが、抗体はプロゲステロン受容体(PR)に対する抗体である。
実施例1、2または3に記載のような、高レベルのER−αまたはPRを循環悪性細胞に有する患者をホルモン療法で処置する。
本実施例では、電気化学発光によるサンドイッチイムノアッセイを使用して、乳癌細胞からER−αを検出する感度を検査する。
・アッセイ緩衝液:0.5%Tween−20および0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)含有PBS(リン酸緩衝生理食塩水)
まず、ビオチン化と非ビオチン化の両形態で、ウサギ抗ER−αポリクローナル抗体(好ましくは、このポリクローナル抗体は、完全長ER−αタンパク質に対する抗体である)を得る。非ビオチン化ポリクローナル抗体は、以下の通りにルテニウム標識(「TAG標識」)する。
・1.5μg/μLルテニウム標識(BV−TAG−NHS Ester、カタログ番号110034;BioVeris Corporation、米国メリーランド州ゲイサーズバーグ)をDMSO中で調製する。
・500μLの抗体の場合は18.8μLのBV−TAG−NHSを添加し、200μLのポリクローナル抗体の場合は3.8μLのBV−TAG−NHSを添加する。いずれの場合も、溶液を1時間インキュベートし、20μLの2M グリシンを添加することにより反応を停止する。
・各反応混合物中の非結合BV−TAG−NHS Esterは、事前にPBS(0.08%アジ化ナトリウムを含有)(溶出にも使用する)で平衡化したPD−10ゲル濾過カラムを使用して除去する。各標識抗体について、各画分中のタンパク質濃度をタンパク質アッセイにより測定し、タンパク質含有量の多い画分を次の実施例で使用する。
・各ウェルに順次、MCF−7細胞からの抽出物を添加し(1ウェル当たりの抽出物の量は、30〜100個のMCF−7細胞から抽出されたものと異なる。抽出物を含まない対照ウェルも使用する)、次に50μL/ウェルのTAG−Abとビオチン−Abとの混合物(例えば、それぞれ0.5〜2μg/mLの濃度;PBSアッセイ緩衝液で希釈)を96ウェルU底ポリプロピレンプレートのウェルに添加し、絶えず振盪させながら室温にてインキュベートする(例えば、2時間)。
・ストレプトアビジン磁気ビーズ(例えば、Dynabeads M−280 Streptavidin、カタログ番号110028、BioVeris Corporation、米国メリーランド州ゲイサーズバーグ)l0μgを含む25μLを各ウェルに添加し、絶えず振盪させながらインキュベートする(例えば、30分間)。
・各ウェルにPBSアッセイ緩衝液を添加して、1ウェル当たり250μLの最終量とする。すべての条件を少なくとも2つのウェルで試験する。次に、M8 M−Series(登録商標)Analyzer(カタログ番号310800、BioVeris Corporation、米国メリーランド州ゲイサーズバーグ)を使用して、96ウェルプレートの電気化学発光を分析する。
本実施例では、組換えヒトエストロゲン受容体(ER)アルファを検出する感度を電気化学発光によるサンドイッチイムノアッセイを使用して検査した。
・アッセイ緩衝液:0.5%Tween−20および0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)含有PBS(リン酸緩衝生理食塩水、pH7.2)
まず、以下の2組の抗ER−αウサギポリクローナル抗体をAbcam Inc(ケンブリッジ、MA)から入手した。
・C末端を対象とするAb−5700
・ヒトエストロゲン受容体−αのアミノ酸セリン167の非リン酸化部位を対象とするAb−31315
Lorence&Lu(国際特許公開第WO 2006/041959 A2号)の方法に基づき、両ポリクローナル抗体の一部をルテニウム標識(「TAG標識」)し、Ab−31315の一部をビオチン標識した。ルテニウム標識ポリクローナル抗体Ab5700およびルテニウム標識ポリクローナル抗体Ab31315は、以後それぞれ「TAG−5700」および「TAG−31315」と呼ぶ。ビオチン化ポリクローナル抗体Ab31315は、本実施例において以後「ビオチン−31315」と呼ぶ。
・1ウェル当たり25μLの使用時に、1600、160、16、4、および1pg/ウェルとなるように、標準物質をアッセイ緩衝液で希釈した。96ウェルU底ポリプロピレンプレートの各ウェル(1ウェル当たり標準物質25μLを有する)に、以下のいずれかの混合物50μL/ウェルを添加した。
・AG−5700とビオチン−31315(例えば、添加前は50μL中1.0μg/mLの濃度)
・得られた溶液を絶えず振盪させながら室温にてインキュベートした(2時間)。
・l0μgのストレプトアビジン磁気ビーズ(例えば、DYNABEADS M−280 Streptavidin、カタログ番号110028、BioVeris Corporation、米国メリーランド州ゲイサーズバーグ)を含む25μLを各ウェルに添加し、絶えず振盪させながらインキュベートした(30分間)。
・PBSアッセイ緩衝液を各ウェルに添加し、1ウェル当たり250μLの最終量を作製した。すべての条件を2つのウェルで試験した。次に、M−Series(登録商標) 384 Analyzer(BioVeris Corporation、米国メリーランド州ゲイサーズバーグ)を使用して、96ウェルプレートの電気化学発光を分析した。
これらの一連の実験では、最初に、実施例6と同じ抗体を使用して、組換えER−αを検出する感度の測定を繰り返し行った。しかし、これらの抗体を4℃で保管したところ、感度の低下が生じ、1ウェル当たり1,250pgの場合のECLシグナルは、ベースラインを下回り、1ウェル当たり12,500pgのECLシグナルは、ベースラインを160 ECL単位上回った。こうした感度の低下により、さらなる抗体を試験した。ER−αに対するニワトリポリクローナルIgY抗体を、GenWay Biotech,Inc.(米国カリフォルニア州サンディエゴ;カタログ番号15−288−21182)から入手した。Lorence&Lu(国際特許公開第WO 2006/041959 A2号)の方法に基づき、このポリクローナル抗体の一部をルテニウム標識し(「TAG−IgY」)、一部をビオチン標識した(「ビオチン−IgY」)。
・RIPA抽出緩衝液(Pierce Biotechnology、カタログ番号89900)
・RIPA緩衝液と0.4Mの塩化カリウム(KCl)
・RIPA緩衝液と95℃にて2分間の加熱
・RIPA緩衝液とスピンカラム(QIAGEN)による剪断
・Marligenの核抽出キット(カタログ番号11906−100)
MCF−7細胞を試験したところ、KClを含むRIPA緩衝液がこれらの手法すべての中で最も優れていることが判明した(表2)。
MCF−7細胞抽出物を使用したこのアッセイと並行して、別の標準曲線を作成し、感度の低下が認められた(表3と表1を比較)。このことから、次の実施例では、抗体の安定性を改善するために、IgYのさらなる保管条件を検査した。さらに、さらなる抗体も検査した。
本実施例では、電気化学発光によるサンドイッチイムノアッセイを使用して、以下を検査した。
・組換えER−αを検出する感度
・MCF−7乳癌細胞からER−αを検出する感度
・MCF−7(ER−α高発現の陽性対照細胞)とK562白血病細胞(陰性対照細胞)からER−αを検出する特異性
ニワトリ抗ER−αIgYポリクローナル抗体を、GenWayから新たに入手した(カタログ番号15−288−21182)。Lorence&Lu(国際特許公開第2006/041959 A2)の方法に基づき、この抗体原料の一部を再びビオチン化し、一部を再びルテニウムで標識した。ルテニウム標識ニワトリポリクローナル抗体およびビオチン化ニワトリポリクローナル抗体は、本実施例において以後「TAG−IgY2」および「ビオチン−IgY2」と呼ぶ。標識化後、これらの濃度はそれぞれ201μg/mLおよび124μg/mLとなった。また、標識化後、「TAG−IgY2」および「ビオチン−IgY2」の一部はそれぞれ、BSAを添加せずに4℃で保管し、「TAG−IgY2」および「ビオチン−IgY2」の一部はそれぞれ、1%のBSAを添加して4℃で保管した。
・カタログ番号A300−495A:アミノ酸残基1〜50のタンパク質領域に位置するER−αのエピトープに対し、したがってN末端を対象とする、ポリクローナル抗体。この抗体は、Lorence&Lu(国際特許公開第WO 2006/041959 A2号)の方法に基づき、ルテニウムで標識した。これは、本実施例において以後「TAG−495A」と呼ぶ。標識化後、これは483μg/mLの濃度を有し、BSAを添加せずに4℃で保管した。
・カタログ番号A300−496A:アミノ酸残基100〜150のタンパク質領域に位置するER−αのエピトープに対し、したがってN末端付近の領域を対象とする、ポリクローナル抗体。この抗体は、Lorence&Lu(国際特許公開第2006/041959 A2号)の方法に基づき、ビオチンで標識した。これは、本実施例において以後「ビオチン−496A」と呼ぶ。標識化後、これは486μg/mLの濃度を有し、BSAを添加せずに4℃で保管した。
・カタログ番号A300−497A:アミノ酸残基525〜575のタンパク質領域に位置するER−αのエピトープに対し、したがって抗体A300−495AおよびA300−496AよりもC末端に近い領域を対象とするポリクローナル抗体。この抗体は、Lorence&Lu(国際特許公開WO 2006/041959 A2号)の方法に基づき、ルテニウムで標識した。これは、本実施例において以後「TAG−497A」と呼ぶ。標識化後、これは622μg/mLの濃度を有し、BSAを添加せずに4℃で保チューブした。
・カタログ番号A300−498A:アミノ酸残基550とC末端との間のタンパク質領域に位置するER−αのエピトープに対するポリクローナル抗体。この抗体は、Lorence&Lu(国際特許公開第2006/041959 A2号)の方法に基づき、ビオチンで標識した。これは、本実施例において以後「ビオチン−498A」と呼ぶ。標識化後、これは335μg/mLを有し、BSAを添加せずに4℃で保管した。
・標準物質をアッセイ緩衝液中で再度希釈し、1ウェル当たり25μLを使用した場合、1600、160、16および4pg/ウェルを産生した。96ウェルU底ポリプロピレンプレートの各ウェル(1ウェル当たり標準物質25μLを有する)に、50μL/ウェルのTAG抗体とビオチン化抗体との混合物(添加前は50μL中1.0μg/mLの濃度)を添加し、得られた溶液を絶えず振盪させながら室温にてインキュベートした(2時間)。このアッセイでは以下の4組の抗体条件を試験した。
・条件2:標識化後、各標識抗体に1%BSAを添加して4℃で保存した「TAG−IgY2」および「ビオチン−IgY2」
・条件3:「TAG−495A」および「ビオチン−498A」(この抗体対は、タンパク質の2種類の領域に由来するエピトープに対する抗体であることから選択した)
・条件4:「TAG−497A」および「ビオチン−496A」(この抗体の対は、タンパク質の2種類の領域に由来するエピトープに対する抗体であるため選択した)
・10μgのストレプトアビジン磁気ビーズ(例えば、Dynabeads M−280 Streptavidin、カタログ番号110028、BioVeris Corporation、米国メリーランド州ゲイサーズバーグ)を含む25μLを各ウェルに添加し、絶えず振盪させながらインキュベートした(30分間)。
・各ウェルにPBSアッセイ緩衝液を添加して、1ウェル当たり250μLの最終量を作製した。すべての条件を2つのウェルで試験した。次に、M−Series(登録商標)384 Analyzer(BioVeris Corporation、米国メリーランド州ゲイサーズバーグ)を使用して、96ウェルプレートの電気化学発光を分析した。
(実施例9)
本実施例では、電気化学発光によるサンドイッチイムノアッセイを使用して、以下を検査した。
・MCF−7乳癌細胞からER−αを検出する感度
・MCF−7(ER−α高発現の陽性対照細胞)とK562白血病細胞(ER−αの陰性対照細胞)からER−αを検出する特異性
方法は、条件3(ビオチン−498AとTAG−495A)を使用する実施例8と同じであったが、細胞抽出物を得るための以下の追加の手順を行った。
・MCF−7乳癌細胞およびK562白血病細胞(ATCC、米国バージニア州マナッサス)を、ATCCの推奨条件通りに増殖させ、PBSで2回洗浄し、血球計を使用してアリコートを計数した。各細胞株(抽出緩衝液1mL当たり細胞500万個)からのER−αの抽出は、0.45Mの塩化カリウム(KCl)と5mMのエチレンジアミン四酢酸(EDTA)とを添加して修正したRIPA緩衝液(Pierceカタログ番号89900)を使用して行った。抽出緩衝液の添加後、細胞物質を氷浴中ロッカー上で80分間振盪させた。18,000rpmでの20分間の遠心分離後、上清を得て、試験用の「抽出物」を産生した。
・各ウェルに順次、MCF−7またはK562細胞からの抽出物を添加し(1ウェル当たりの抽出物の量は、100〜10,000細胞から抽出されたものと異なった。抽出物を含まない対照ウェルも使用した)、次に50μL/ウェルのビオチン−498AとTAG−495Aの混合物(1ウェル当たりに添加される50μL中それぞれ1μg/mLの濃度;PBSアッセイ緩衝液で希釈)を96ウェルU底ポリプロピレンプレートのウェルに添加し、絶えず振盪させながら室温にて2時間インキュベートした。
・10μgのストレプトアビジン磁気ビーズ(例えば、Dynabeads M−280 Streptavidin、カタログ番号110028、BioVeris Corporation、米国メリーランド州ゲイサーズバーグ)を含む25μLを各ウェルに添加し、絶えず振盪させながら30分間インキュベートした。
・各ウェルにPBSアッセイ緩衝液を添加して、1ウェル当たり250μLの最終量を作製した。すべての条件を少なくとも2つのウェルで試験した。次に、M−Series(登録商標)384 Analyzer(BioVeris,Corporation、米国メリーランド州ゲイサーズバーグ)を使用して、96ウェルプレートの電気化学発光を分析した。
Claims (9)
- 血液試料中の循環癌細胞からステロイド受容体の発現を検出する方法であって、該血液試料から該癌細胞を単離した後、該単離した癌細胞から抽出物を作製し、その後、該抽出物に対して、該ステロイド受容体を検出することができるイムノアッセイを行う工程を含み、陽性のイムノアッセイ結果が、該癌細胞における該ステロイド受容体の存在を示し、
該癌細胞が乳癌細胞であり、該ステロイド受容体が、エストロゲン受容体−α、エストロゲン受容体−β、プロゲステロン受容体、およびアンドロゲン受容体からなる群から選択されるか、あるいは該癌細胞が前立腺癌細胞であり、該ステロイド受容体がアンドロゲン受容体であり、
該イムノアッセイが、該ステロイド受容体のN末端領域に対する第1のポリクローナル抗体と、該ステロイド受容体のC末端領域に対する第2のポリクローナル抗体とを使用し、該第1のポリクローナル抗体および該第2のポリクローナル抗体の一方がビオチンに結合し、該第1のポリクローナル抗体および該第2のポリクローナル抗体の他方がルテニウム検出分子に結合し、そして、該イムノアッセイは、検出のために電気化学発光をさらに使用し、癌を有さないヒト由来の血液試料1ミリリットル中に添加される900個のMCF−7癌細胞から該ステロイド受容体を検出することができることによってか、あるいは4pgの該ステロイド受容体を検出することができることにより定義される感度を有する、
方法。 - 前記イムノアッセイが、癌を有さないヒト由来の血液試料1ミリリットル中に添加される500個のMCF−7癌細胞から前記ステロイド受容体を検出することができる、請求項1に記載の方法。
- 前記イムノアッセイが、乳癌を有さないヒト由来の血液試料1ミリリットル中に添加される100個のMCF−7癌細胞から前記ステロイド受容体を検出することができる、請求項2に記載の方法。
- 前記イムノアッセイが、乳癌を有さないヒト由来の血液試料1ミリリットル中に添加される30個のMCF−7癌細胞から前記ステロイド受容体を検出することができる、請求項3に記載の方法。
- 前記癌細胞が、該癌細胞に選択的に結合できる免疫磁気ビーズと前記血液を接触させることによって単離される、請求項1に記載の方法。
- 前記ステロイド受容体がエストロゲン受容体−αである、請求項1に記載の方法。
- 前記ステロイド受容体がプロゲステロン受容体である、請求項1に記載の方法。
- 内分泌療法剤による処置から利益が得られる可能性がある癌患者の同定を補助するための方法であって、請求項1〜7に記載のいずれか1項に記載の方法を含み、前記癌細胞含有血液試料が該患者から採取されている、方法。
- 前記患者由来の腫瘍組織が、前記ステロイド受容体の発現に対して陰性であることが免疫組織化学的に予め測定されている、請求項8に記載の方法。
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