MX2008013331A - Deteccion de receptores de esteroides en celulas de carcinoma circulantes y tratamiento. - Google Patents

Abstract

La expresión de un receptor de esteroides de células de carcinoma circulantes en una muestra de sangre se detecta al aislar las células de carcinoma de la muestra de sangre, hacer un extracto de las células de carcinoma aisladas y luego realizar en el extracto un inmunoensayo sensible capaz de detectar el receptor de esteroides asociado con las células de carcinoma. Un resultado positivo indica la presencia del receptor de esteroides en las células de carcinoma. Este método se puede utilizar para identificar a pacientes con cáncer quienes se beneficiarían probablemente del tratamiento con un agente terapéutico endocrino.

Description

DETECCIÓN DE RECEPTORES DE ESTEROIDES EN CÉLULAS DE CARCINOMA CIRCULANTES Y TRATAMIENTO ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La terapia endocrina u hormonal es una de las metodologías más importantes en el tratamiento de pacientes con cáncer de mama y de próstata. El tratamiento es dependiente fundamentalmente de la presencia de receptores de esteroides en los tumores de estos pacientes con cáncer. El estado de los receptores de esteroides se ha utilizado por más de 25 años en el proceso de toma de decisiones para tratar a mujeres con cáncer de mama. La terapia endocrina u hormonal se utiliza exitosamente en el tratamiento de pacientes con tumores positivos en receptores de estrógeno (ER, por sus siglas en inglés) y receptores de progesterona (PR, por sus siglas en inglés) (Bernard- arty y colaboradores, 2004, The Oncologist 9:617-32). Además, también se ha descubierto una función importante de los niveles de receptores de andrógeno en tumores para la respuesta a la terapia endocrina (Buchanan G y colaboradores, 2005 Cáncer Res 65:8487-8496). La terapia endocrina da por resultado una proporción alta de respuestas tumorales (se calcula que es 30% hasta los reportes tan altos como 80% en pacientes seleccionados, Gradishar, 2004, The Oncologist 9:378-84). La terapia endocrina de cáncer de mama tiene la ventaja de combinar la alta eficacia con una mínima toxicidad y una buena calidad de vida (Bernard-Marty y colaboradores, 2004, The Oncologist 9:617-32). Existen dos receptores de estrógeno: receptor de estrógeno alfa y receptor de estrógeno beta (Esslimani-Sahla y colaboradores, 2004, Clin Cáncer Res 10:5769-5776. Estas dos proteínas exhiben un alto grado de homología, especialmente en sus dominios de enlace de ADN (Hanstein S y colaboradores, 2004, Eur J Endocrin 150:243-255; Matthews & Gustafsson JA, 2003, Mol. Interv. 3:181-92). Es indiscutible el valor predecible del nivel de ER-alfa de tejido tumoral (Bardou y colaboradores, 2003, J Clin Oncol 10: 1973-79). Además de los receptores de estrógeno, también se ha mostrado que la presencia de receptores de progesterona en el tejido con cáncer de mama proporciona un factor predictivo independiente para beneficio de la terapia hormonal (Bardou y colaboradores, 2003, J Clin Oncol 10:1973-79). Recientemente, se ha mostrado que la expresión en tumores del receptor de estrógeno beta y del receptor de andrógeno tiene una función importante en el tratamiento de pacientes con cáncer de mama (Hopp y colaboradores, 2004; Clin Cáncer Res 10:7590-00; Buchanan y colaboradores, 2005, Cáncer Res 65:8587-96). La terapia endocrina u hormonal también desempeña una función importante en el tratamiento del cáncer de próstata. Los agentes terapéuticos endocrinos contra este cáncer fijan como objetivo el receptor de andrógeno (AR, por sus siglas en inglés) ya sea indirectamente por vía de la reducción de la cantidad de ligando circulante o por la inhibición directamente de la señalización del AR (Scher y colaboradores, 2004, Endocrine-Related Cáncer 11:459-76). Inicialmente, el AR está detectándose virtualmente en todos los canceres de próstata (Scher y colaboradores, 2004) . Sin embargo, después del tratamiento, se ha mostrado que la expresión de la proteína del AR es regulada por decremento en 30% de los casos de cáncer de próstata refractario por hormonas (Suzuki y colaboradores, 2003, Endocrine-Related Cancers 19:209-216) . Las metodologías clínicas actuales para medir receptores de esteroides utilizan la tinción inmunohistoquímica (IHC, pos sus siglas en inglés) para el receptor del material de biopsia fijado con formalina (Mann y colaboradores, 2005, J Clin Oncol 22:5148-54; Buchanan G y colaboradores, 2005, Cáncer Res 65:8487-8496). Estas metodologías son lentas y pueden proporcionar frecuentemente resultados engañosos dependiendo de cómo se procesó el tejido. Específicamente, las proporciones significativas de resultados negativos falsos para la expresión de ER se han reportado utilizando la IHC. Las proporciones negativas falsas de 20 a 30% son reportadas por D. Craig Allred, M.D. (www. breastcancerupdate . com/bcu2004/7/allred. htm) (véase también McCann, 2004 J Nati Cáncer Inst 93:579-80 para comentarios generales) . Las proporciones negativas falsas de por lo menos 24% se han reportado en el entorno de la comunidad (Mann y colaboradores, 2005, J Clin Oncol 22:5148-5154, Discussion 2o párrafo). Este es un problema clínico principal para las mujeres con cáncer de mama que no está siendo tratado adecuadamente puesto que la terapia hormonal tiene esta alta eficacia y baja toxicidad. Adicionalmente , la IHC no es práctica para pacientes quienes no tienen tejido de biopsia disponible o tienen muestras inadecuadas para la IHC. Otro problema que no es tratado por la prueba de IHC de tumores primarios es el problema de las metástasis que desarrollan un estado de receptores diferente del tumor primario, que va especialmente del estado negativo respecto a los receptores (del primario) al estado positivo respecto a los receptores (para las metástasis) . La obtención de una biopsia de la metástasis para realizar la prueba de IHC no es frecuentemente una solución práctica puesto que esto implica un paso quirúrgico. Un método preferido no implicaría ninguna cirugía adicional para el paciente. Se han reportado proporciones de conversión de once a 33% de los estados negativo a positivo respecto a los receptores: • 11% de pacientes con estado negativo respecto al ER (basado en los resultados en sus tumores primarios) tuvieron subsecuentemente resultados positivos respecto al ER para sus metástasis (Glass EL, 2003 y colaboradores, San Antonio Breast Cáncer Symposium, Extracto #257) . • 11% de todos los pacientes sometidos a prueba (esto sería 33% de los pacientes con negatividad respecto al ER en base al ensayo de sus tumores primarios) tuvieron subsecuentemente resultados positivos respecto al ER para sus metástasis (Franco N, 2004, Proc ASCO, Abstract 539) . • 33% de 140 pacientes con estado negativo respecto al ER (basado en los resultados en sus tumores primarios) tuvieron subsecuentemente resultados positivos respecto al ER para sus metástasis (Spataro y colaboradores, 1992. Annals of Oncology 3:733-740, 1992). Claramente, existe evidencia abundante de que muchas mujeres quienes someten a prueba el estrógeno o tienen un estado negativo respecto a la progesterona se beneficiarían de las terapias hormonales si estuviera disponible un ensayo conveniente ya sea debido a los resultados negativos falsos del ensayo de IHC de sus tumores primarios o debido a sus estados hormonales cambiados en sus metástasis. Por lo tanto, existe la necesidad de identificar mejor a los pacientes que expresan receptores de estrógeno (ER) y receptores de progesterona (PR) y se beneficiarían de la terapia que fija como objetivo estos receptores. Un ensayo de receptores hormonales de células tumorales circulantes en una muestra de sangre sería el más conveniente para el paciente. Desafortunadamente, los inmunoensayos utilizados previamente de receptores hormonales requieren por lo menos 0.1 gramo de tejido o aproximadamente 0.1 mi de citosol (Delage V y colaboradores, 1996 Clin Chem 42:1955-1960; Krambovitis y colaboradores, 1995 Clin Chem 41:48-53) lo cual corresponde a aproximadamente 1E+08 de células tumorales [1 gramo de tejido equivale a aproximadamente 1E+09 de células tumorales (Cotran, Kumar y Robbins, 1989; Robbins Pathologic Basis of Disease, 4a Edición, WB Saunders Co, Filadelfia, página 251, 2a columna, 1er párrafo, 2a oración) ; el volumen de citosol de 1 célula tumoral equivale a aproximadamente 1 picolitro (Kelemen y colaboradores, 2002, J Biol Chem 277:8741-48]. Los métodos de inmunoensayo reportados son notablemente muy insensibles para detectar receptores hormonales de números muy pequeños de células tumorales circulantes (órdenes de magnitud menores que 1E+08 por mi) . Por lo tanto, esta invención proporciona un medio para someter a prueba los receptores hormonales de células tumorales circulantes y por lo tanto, es un medio conveniente para tratar la necesidad médica de identificar a pacientes adicionales para la terapia hormonal .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Esta invención proporciona un método para detectar la expresión de un receptor de esteroides de células de carcinoma circulantes en una muestra de sangre que comprende aislar las células de carcinoma de la muestra de sangre, seguido por la elaboración de un extracto (por ejemplo, un lisado) de las células de carcinoma aisladas seguido por la realización en el extracto de un inmunoensayo capaz de detectar el receptor de esteroides, en el cual un resultado positivo del inmunoensayo indica la presencia del receptor de esteroides en las células de carcinoma. De acuerdo con esta invención, las células de carcinoma son células de cáncer de mama y el receptor de esteroides se selecciona del grupo que consiste del receptor de estrógeno alfa, receptor de estrógeno beta, receptor de progesterona y receptor de andrógeno; o las células de carcinoma son células de cáncer de próstata y el receptor de esteroides es el receptor de andrógeno. El inmunoensayo es capaz de detectar el receptor de esteroides de novecientas células de carcinoma MCF-7 las cuales se aumentan en un mililitro de una muestra de sangre de una persona sin carcinoma. Esta invención proporciona un método para identificar a un paciente con cáncer para beneficiarse probablemente del tratamiento con un agente terapéutico endocrino, que comprende el método de detección descrito anteriormente. Cuando se utiliza para identificar a estos pacientes, la muestra de sangre que contiene células cancerosas se retira del paciente. Esta invención proporciona un método para tratar a pacientes con cáncer identificados de esta manera, el método que comprende administrar al paciente un agente terapéutico endocrino.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. Señal de ECL para la detección por inmunoensayo del ER-alfa recombinante utilizando los anticuerpos policlonales de conejo Ab-5700 y Ab-31315 de Abcam (véase el Ejemplo 6 para detalles) . Dos condiciones se sometieron a prueba utilizando ya sea TAG-31315 y BIOTINA-31315 o TAG-5700 y BIOTINA-31315 y utilizando 1, 4, 16, 160 y 1600 pg/pocillo de la proteína de ER-alfa recombinante . Figura 2. Señal de ECL para la detección por inmunoensayo del ER-alfa en lisados de las células de cáncer de mama MCF-7 (control positivo para la expresión de ER-alfa) . Los datos se muestran utilizando lisados de 100, 500 y 900 células por pocilio. Figura 3. Una comparación de la señal de ECL para la detección por inmunoensayo del ER-alfa en lisados de las células de cáncer de mama MCF-7 (control positivo para la expresión de ER-alfa) contra las células de leucemia humanas K562 (control negativo) . Los datos del mismo experimento mostrado en la Figura 2 se utilizan para esta figura, excepto que se utilizan los siguientes datos adicionales: los datos obtenidos del material del lisado de 10,000 células MCF-7; y los datos obtenidos de las células MCF-7 (lisados de 100, 500, 900 y 10,000 células por pocilio) .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Como se utiliza en este documento, el término transicional "que comprende" es indefinido. Una reivindicación que utiliza este término puede contener elementos además de aquellos enumerados en esta reivindicación. De esta manera, por ejemplo, se pueden leer reivindicaciones sobre métodos que también incluyen otros pasos no enumerados específicamente en este documento, siempre y cuando estén presentes los elementos enumerados o su equivalente.

Las siguientes abreviaciones se utilizan en este documento : AR: receptor de andrógeno ER: receptor de estrógeno PR: receptor de progesterona IHC: inmunohistoquimica ECL: electroquimioluminiscencia Esta invención proporciona métodos suficientemente sensibles para cuantificar los niveles de proteínas receptoras de esteroides (receptor de estrógeno alfa, receptor de estrógeno beta, receptor de progesterona y/o receptor de andrógeno) en el cáncer de mama o de próstata circulante en muestras de sangre y proporciona métodos para identificar a aquellos pacientes quienes se beneficiarían probablemente de la terapia que utiliza la terapia hormonal u otro agente fijado como objetivo a los receptores de esteroides tales como los receptores de estrógeno y/o receptores de progesterona. De esta manera, esta invención avanza en los campos del tratamiento de cáncer de mama y de próstata al proporcionar un medio conveniente, sumamente sensible y rápido para someter a prueba muestras de sangre para identificar a pacientes adicionales quienes se beneficiarían de la terapia hormonal . Un ensayo inmunológico rápido y sumamente sensible para detectar proteínas del receptor de estrógeno alfa, receptor de estrógeno beta, receptor de andrógeno y/o receptor de progesterona en las células de cáncer de mama circulantes o para detectar proteínas receptoras de andrógeno en las células de cáncer de próstata circulantes, tal como utilizando la detección de electroquimioluminiscencia (ECL) , es un medio preferido para identificar a pacientes adicionales quienes se beneficiarían de la terapia hormonal. Esta invención se basa en la combinación de la alta especificidad de procedimientos utilizados para aislar células de carcinoma circulantes de la sangre con la alta sensibilidad de ciertos ensayos basados en la inmunología tal como la ECL. Las células de cáncer de mama o de próstata circulantes primero se enriquecen utilizando perlas inmunomagnéticas al aislar y purificar las células cancerosas circulantes de la sangre. En una modalidad del método de detección de esta invención, el nivel de sensibilidad del ensayo inmunológico es tal que el ensayo es capaz de detectar receptores de esteroides (es decir, receptor de estrógeno-alfa, receptor de estrógeno-beta, receptor de progesterona o receptor de andrógeno de células de carcinoma en la sangre en una concentración de entre treinta y 900 células de carcinoma por mililitro de sangre, preferiblemente entre treinta y 100 células de carcinoma por mililitro de sangre, más preferiblemente entre diez y treinta células de carcinoma por mililitro de sangre, más preferiblemente entre tres y diez células de carcinoma por mililitro de sangre y mucho más preferiblemente entre uno y tres células de carcinoma por mililitro de sangre. En una modalidad más específica, las células de carcinoma son las células de cáncer de mama MCF-7. Se sabe que las células MCF-7 expresan el receptor de estrógeno-alfa (Detre S y colaboradores, 2003, Cáncer Res 63:6516-22), el receptor de estrógeno-beta (Hopp TA y colaboradores, Clin Cáncer Res 10:7490-9), el receptor de progesterona (Detre y colaboradores, 2003) y el receptor de andrógeno (Buchanan G y colaboradores, 2005, Cáncer Res 65 : 8487-96) . Un medio preferido para aislar células de carcinoma y someter a prueba estas muestras por los receptores de hormonas es de la siguiente manera: Se toma una muestra (usualmente en el intervalo de aproximadamente 8 a 20 mi) de sangre de un paciente con cáncer, especialmente cáncer de mama. Los pasos incluyen como se detallada a continuación: 1. Remoción de glóbulos rojos. 2. Selección negativa opcional para agotar adicionalmente los leucocitos normales. Una modalidad preferida incluye este paso. 3. Selección positiva de células de carcinoma circulantes . 4. Extracción de proteínas nucleares que incluyen receptores de estrógeno y/o receptores de progesterona . 5. Detección y cuantificación de receptores de estrógeno y/o los receptores de progesterona de células de carcinoma circulantes. 1. Remoción de glóbulos rojos Está disponible una variedad de métodos para retirar glóbulos rojos que incluyen pero no están limitados a la separación basada en la densidad (tal como la recolección de sangre directamente en los tubos BD Vacutainer CPT1^ de Becton Dickinson) seguido por la centrifugación) y los amortiguadores de lisis comerciales tales como el amortiguador de lisis PURESCRIPT RBC™1 (Gentra, Minneapolis) , solución de lisis FACS" (BDIS) , IMMUNOLYSE" (Coulter) , OPTILYSE BMR (Immunotech) y amortiguador de lisis ACK™1 (Biosource, Rockville, MD) . Un método preferido utiliza los tubos BD Vacutainer CPT1 con anticoagulante (EDTA o citrato) . Estos tubos contienen un material que con la centrifugación correcta (l,100xg durante 10 minutos, rotor de aletas abatibles) permite la eliminación de los glóbulos rojos y neutrófilos. Después de la centrifugación, el fondo del tubo contiene una pelotilla de células de eritrocitos (glóbulos rojos) y neutrófilos. Arriba de la pelotilla de células está una barrera de gel y arriba de la barrera de gel están las células tumorales, los linfocitos y los monocitos como una banda en el fondo del plasma. Las células tumorales, los linfocitos y los monocitos entonces se pueden recolectar fácilmente de la parte superior sobre la barrera de gel. Se prefiere este método ya que retira no solo los glóbulos rojos sino también los neutrófilos. 2. Selección negativa para agotar adicionalmente los leucocitos normales Una modalidad preferida de esta invención utiliza el paso de selección negativa para el aislamiento de células tumorales. La selección negativa permite el agotamiento adicional de leucocitos especialmente los linfocitos y los monocitos. Este paso comprende el uso de anticuerpos que son biespecífieos tanto para los antígenos de leucocitos, especialmente CD45, el antígeno de leucocito común, y para un antígeno de glóbulos rojos tal como glicoforina A. Un cóctel comercialmente disponible de estos anticuerpos biespecíficos es disponible de Stemcell Technologies (Rosettesep # de catálogo 15127 y 15167) . Este cóctel incluye los anticuerpos biespecíficos contra la glicoforina A y contra una variedad de antígenos de la superficie celular en células hematopoyéticas humanas (CD2, CD16, CD19, CD36, CD38, CD45, CD66b) . Uno o más de estos anticuerpos biespecíficos se agregan a los tubos BD Vacutainer CPT™1 antes de la recolección de sangre. En una modalidad preferida, se utiliza el cóctel de anticuerpos biespecíficos contra más de una molécula de CD asociada con leucocitos. Cuando la sangre se introduce en el tubo CPT Vacutainer^, los anticuerpos biespecíficos forman inmunorrosetas cada una que consiste de leucocitos y muchos glóbulos rojos. Estas inmunorrosetas tienen una densidad de aproximadamente aquella de los glóbulos rojos y cuando se centrifugan se encuentran en la pelotilla de glóbulos rojos, retirando adicionalmente de esta manera los leucocitos de la fracción de células tumorales encontrada arriba de la pelotilla de células y la barrera de gel. La fracción con las células tumorales en el plasma se recolecta para el procesamiento adicional. 3. Selección positiva para células de carcinoma circulantes Un método preferido para aislar las células de carcinoma circulantes utiliza perlas inmunomagnéticas . Otros métodos de aislamiento de células de cancerosas circulantes incluyen la filtración (Vona G y colaboradores, 2000, Am J Pathol. 2000 156:57-63). En una modalidad preferida, las perlas inmunomagnéticas tienen anticuerpos contra antígenos encontrados selectivamente en la superficie de células de carcinoma tal como la molécula de adhesión de célula epitelial (EpCAM) , las citoqueratinas tal como la citoqueratina-19 y especialmente un cóctel de anticuerpos contra las citoqueratinas y otros marcadores de superficie. Las perlas inmunomagnéticas pueden ser de varios tamaños (50 micrómetros a menos de 200 nm) e incluyen las perlas DY AL^ (> 1.5 micrómetros a aproximadamente 50 micrómetros) con anticuerpos contra la EpCAM (los cuales están disponibles comercialmente) . En una modalidad de la invención, el cóctel de selección positiva de EpCAM humana EASYSEP" y las nanopartículas magnéticas EASYSEP"11 (Stemcell Technologies) se agregan a la fracción con las células tumorales en el plasma del paso previo. Entonces se utiliza un imán para separar las células tumorales del resto del material y las células tumorales se lavan con una solución acuosa. 4. Extracción de las proteínas nucleares que incluyen receptores de esteroides En el siguiente paso, las células tumorales enriquecidas o purificadas entonces están listas para la extracción de las proteínas nucleares. Se puede utilizar una variedad de equipos comercialmente disponibles tales como: • Equipo de Extracción CelLytic NuClEAR (Código del Producto: NXTRACT; Sigma, St. Louis, MO 63103) . • Equipo de Reactivos de Extracción Nuclear y Citoplásmica NE-PERMR de Pierce (Número de Producto 78833; Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL 61105). • Equipo de extracción nuclear (# de Catálogo AY2002, Panomics, Inc., Redwood City, CA 94063). Un método de extracción preferido utiliza el amortiguador de RIPA (Pierce Biotechnology, # de Catálogo 89900) junto con cloruro de potasio 0.4 M a 0.45 M (KC1) .

. Detección y cuantificación de receptores de esteroides de células de carcinoma circulantes. La detección del receptor de estrógeno-alfa, receptor de progesterona o receptores de andrógeno entonces se puede realizar por medio del uso de un inmunoensayo de emparedado sumamente sensible utilizando anticuerpos que se enlazan al receptor a ser sometido a ensayo. Se puede utilizar una variedad de anticuerpos para el inmunoensayo, utilizando por lo menos preferiblemente un anticuerpo policlonal y mucho más preferiblemente, utilizando dos anticuerpos policlonales . En una modalidad de esta invención, el inmunoensayo utiliza un primer anticuerpo policlonal contra la región N-terminal del receptor de esteroides y un segundo anticuerpo policlonal contra la región C-terminal del receptor de esteroides. La detección del receptor de esteroides se puede llevar a cabo por medio del uso de un inmunoensayo de emparedado con los dos conjuntos de anticuerpos dirigidos contra el receptor de esteroides. En una modalidad preferida que utiliza la electroquimioluminiscencia, un anticuerpo se une a la biotina y el otro se une a una molécula detectora de rutenio. En una modalidad preferida de la invención, un anticuerpo contra el receptor de esteroides se une con biotina y un segundo anticuerpo contra el receptor de esteroides se etiqueta con una molécula de detección. En el caso de la electroquimioluminiscencia (ECL) , la molécula de detección es rutenio. Existe una abundante bibliografía en el dominio público que proporciona métodos suficientemente útiles para unir el rutenio a los anticuerpos (por ejemplo, Lee y colaboradores, Am J Trop Med Hyg 2001, 65:1-9). El extracto nuclear se mezcla con los dos anticuerpos y se incuba brevemente seguido por la adición de perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina en una solución que contiene tripropilamina . Con la aplicación de un potencial eléctrico y en presencia del antígeno objetivo (ER) , la etiqueta de rutenio es excitada y se emite luz y ésta se detecta utilizando un instrumento detector de ECL (tal como el analizador ORIGEN"11 o el instrumento comercialmente disponible como M-Series 384 de BioVeris Corporation, Gaithersburg, MD) . En una modalidad preferida de la invención, el inmunoensayo utilizado de acuerdo con esta invención puede utilizar una de las siguientes combinaciones: 1. Dos conjuntos de anticuerpos policlonales contra ER-alfa (la modalidad más preferida) . 2. Un anticuerpo policlonal y un anticuerpo monoclonal contra ER-alfa. 3. Dos anticuerpos monoclonales contra ER-alfa. Para propósitos de detección del ER-alfa, una variedad de anticuerpos monoclonales y policlonales contra ER-alfa es útil e incluye pero no está limitada a los siguientes anticuerpos contra el ER-alfa: · Anticuerpo policlonal contra ER-alfa (por ejemplo, Anticuerpos policlonales anti-ER-alfa de conejo de BETHYL Laboratories (Montgomery, TX) : Números de Catálogo #A300-495A, A300-496A, A300-497A y A300-498A) ; # de Catálogo 29595, AnaSpec, San José, CA 95131; Números de catálogo de Abcam ab3575; ab5700-l; ab30656; ab28798; ab28799; ab31312; ab31314-5; 31478; Abcam, Inc., Cambridge, MA 02139; Número de Catálogo de LabVision: RB-9061, LabVision, Fremont, CA 94539; Número de Catálogo de LabVision: RB-9451, LabVision, Fremont, CA 94539) .

• Anticuerpos monoclonales contra el ER-alfa (Números de Catálogo de LabVision: MS-750; MS-354; MS-391; MS-1071; RM-9101; RT-1639; RT-1640; RT-1641; RT-1642; números de catálogo de Abcam: ab31478; abll04; ab858; ab484; ab2746; ab9269; ab8857; ab7820-8; abl9348-9; abl5284) . El inmunoensayo de esta invención es más rápido y tiene una sensibilidad significativamente mayor que cualquier inmunoensayo desarrollado previamente para los receptores de esteroides. El inmunoensayo de esta invención es capaz de detectar la expresión de receptores de esteroides de 900 células de cáncer de mama MCF-7 agregadas por mi de sangre de un voluntario humano sin cáncer, preferiblemente 500 células MCF-7 por mi de sangre, más preferiblemente 100 células MCF-7 por mi de sangre y mucho más preferiblemente 30 células MCF-7 por mi de sangre. Además de la electroquimioluminiscencia, otros inmunoensayos que pueden producir una alta sensibilidad requerida para esta aplicación incluyen, pero no están limitados a: a) Quimioluminiscencia tal como aquella descrita por Liu Y y colaboradores, 2003 (J Food Protection 66 : 512-7) . b) Quimioluminiscencia fluorogénica (FCL, por sus siglas en inglés) como aquella descrita por Yu H y colaboradores, 2000 (Biosens Bioelectron 14:829-40). c) Inmunoensayo de polarización de fluorescencia (véase Howanitz JH, 1988 Arch Pathol Lab Med 112:775-9). d) Inmunoensayo de fluorescencia con resolución temporal (Butcher H y colaboradores, 2003, J Immunol Methods 272:247-56; Soukka y colaboradores, 2001, Clin Chem 47:1269-78; Howanitz JH, 1988 Arch Pathol Lab Med 112:775-9) En una modalidad preferida, se calcula la cantidad relativa de las células de cáncer de mama utilizadas en el ensayo. Esto permite una relación de la proteína de ER-alfa total por célula a ser obtenida y se puede comparar con estándares de control de células de cáncer de mama con niveles altos, moderados y bajos de proteínas de ER-alfa por célula. Esta es una modalidad preferida puesto que elimina una situación positiva falsa en la cual existen muchas células de cáncer de mama circulantes que tienen un bajo nivel de expresión de proteínas de ER-alfa que puede proporcionar una señal que imita aquella obtenida de un número pequeño de células de cáncer de mama con una expresión de alto nivel. En esta modalidad, se puede utilizar una variedad de metodologías para calcular los números relativos de células que incluyen el análisis citométrico de flujo, la cuantificación del ADN total o antígenos relacionados con el ADN tales como histonas de células lisadas (existen 6 pg de ADN por célula diploide) , la cuantificación de un producto génico de manejo doméstico como beta-actina y las mediciones de turbiedad o absorbancia. Debido a su sensibilidad, el método de acuerdo con esta invención para identificar a pacientes con cáncer de mama quienes se beneficiarían probablemente del tratamiento con un agente hormonal se puede aplicar provechosamente a pacientes de quienes un tejido de biopsia tumoral se ha determinado previamente (por ejemplo, por medio de la inmunohistoquímica) que es negativo para la expresión de ER por medio de un ensayo de tejido para ER. Se puede realizar un ensayo para ER-beta utilizando los mismos métodos como para ER-alfa, excepto que se utilizan anticuerpos específicos hacia ER-beta. Los ejemplos de anticuerpos útiles contra ER-beta incluyen pero no están limitados a: • Anticuerpo policlonal de conejo contra ER-beta (por ejemplo, Número de Catálogo Erbl5-A, Alpha Diagnostics International, Inc., San Antonio, TX; Número de Catálogo ab5786, Novus Biologicals, Littleton, CO) . • Anticuerpo monoclonal de ratón contra ER-beta (por ejemplo, Número de Catálogo abl6813, Novus Biologicals). Se puede realizar un ensayo para PR utilizando los mismos métodos que para ER-alfa, excepto que se utilizan anticuerpos específicos hacia PR. Los ejemplos de anticuerpos útiles contra PR incluyen, pero no están limitados a: • Anticuerpo policlonal de conejo contra PR (por ejemplo, Números de Catálogo de Abcam abl5509; abl5510; Abcam, Inc., Cambridge, MA 02139). • Anticuerpos monoclonales de ratón contra PR (por ejemplo, Números de Catálogo de Abcam ab9895; ab9896; ab2764; Abcam, Inc.). • Anticuerpo monoclonal de conejo contra PR (por ejemplo, Número de Catálogo de Abcam ab27616) . Se puede realizar un ensayo para el receptor de andrógeno (AR) utilizando los mismos métodos que para ER, excepto que se utilizan anticuerpos específicos hacia AR. Los ejemplos de anticuerpos útiles contra PR incluyen, pero no están limitados a: • Anticuerpo policlonal de cabra contra AR (por ejemplo, Número de Catálogo de Abcam abl9066; Abcam, Inc., Cambridge, MA 02139) . • Anticuerpo policlonal de conejo contra AR (por ejemplo, Número de Catálogo de Abcam ab3509) . Los agentes terapéuticos hormonales (también llamados agentes terapéuticos endocrinos) para el tratamiento del cáncer de mama en esta invención incluyen, pero no están limitados a, aquellos aprobados por the US Food and Drug Administration incluyen (Buzdar, 2003, The Oncologist 8:335-41): • Tamoxifen (véase también Gradishar, 2004, The Oncologist 9:378-84) . • Inhibidores de Aromatasa (anastrozol, letrozol, exemestano; véase también Campos 2004 (The Oncologist 9:126-36) . • Fulvestrant, el antagonista de receptores de estrógeno que regula por decremento los receptores de estrógeno y de progesterona y no tiene actividad agonista conocida (véase también Bross y colaboradores, 2002, The Oncologist 7:477-80). El inhibidor de aromatasa, fadrozol, ha sido aprobado en Japón. La invención será mejor entendida por referencia a los siguientes ejemplos, los cuales ilustran pero no limitan la invención descrita en este documento.

EJEMPLOS EJEMPLO 1. Un paciente con cáncer de mama entra en el consultorio y se recolecta una muestra de sangre en un tubo para impedir la coagulación. Las células cancerosas se aislan y las proteínas nucleares se extraen utilizando un equipo comercialmente disponible tal como el Equipo de Extracción CelLytic NuClEAR1 de Sigma. Un anticuerpo policlonal de conejo etiquetado con rutenio contra ER-alfa y un anticuerpo policlonal biotinilado (también contra el ER-alfa) se agregan y es seguido por la adición de una suspensión de perlas magnéticas con estrepavidina unida y luego una solución que contiene tripropilamina . Se aplica una corriente eléctrica y se detecta la electroquimioluminiscencia (ECL) utilizando un dispositivo de detección de ECL tal como uno comercialmente disponible (BioVeris Corporation) . La señal es proporcional a la cantidad del receptor de ER-alfa encontrado en las células tumorales circulantes. EJEMPLO 2. Un paciente con un nivel elevado de ER-alfa en las células malignas circulantes indicadas en el Ejemplo 1 entonces se trata con una terapia hormonal. EJEMPLO 3. Los métodos son como en el ejemplo 1, excepto que los anticuerpos son contra el receptor de progesterona (PR) . EJEMPLO 4. Un paciente con un nivel elevado de ER-alfa o PR en las células malignas circulantes indicadas en los Ejemplos 1, 2 o 3 entonces se trata con la terapia hormonal . EJEMPLO 5. En este ejemplo, se examina la sensibilidad para detectar el ER-alfa de células de cáncer de mama utilizando un inmunoensayo de emparedado que utiliza la electroquimioluminiscencia. Se prepara un amortiguador de ensayo de PBS: • Amortiguador de Ensayo: Tween-20 al 0.5% y albúmina de suero bovino al 0.5% (BSA) en PBS (solución salina amortiguada con fosfato) . El anticuerpo policlonal anti-ER-alfa de conejo (preferiblemente este anticuerpo policlonal es contra la proteína de ER-alfa de longitud completa) se obtiene primero en formas tanto biotiniladas como no biotiniladas . El anticuerpo policlonal no biotinilado se etiqueta con rutenio ("etiquetado con TAG" ) de la siguiente manera: · 1.5 µg/ l de etiqueta de rutenio (Ester de BV-TAG-NHS, # de Catálogo 110034; BioVeris Corporation, Gaithersburg, MD, EUA) se prepara en DMSO. • Para 500 µ? de anticuerpo, se agregan 18.8 µ? de BV-TAG- NHS y para 200 µ? de anticuerpo policlonal, se agregan 3.8 µ? de BV-TAG-NHS. En cada caso, la solución se incuba durante una hora y la reacción se detiene por la adición de 20 µ? de glicina 2M. • El Ester de BV-TAG-NHS desacoplado en cada mezcla de reacción se retira utilizando una columna de filtración de gel PD-10, pre-equilibrada con PBS (que incluye azida de sodio al 0.08%), la cual también se utiliza para la elusión. Para cada anticuerpo etiquetado, la concentración de proteínas en cada fracción se determina por medio del ensayo de proteínas y la fracción con alto contenido de proteínas se utiliza en los ejemplos subsecuentes . El anticuerpo policlonal etiquetado con rutenio y el anticuerpo policlonal biotinilado son referidos en lo sucesivo en este ejemplo como "TAG-pAb" y "Biotina-pAb" . Las células de cáncer de mama MCF-7 (de ATCC, Manassas, VA) se desarrollan en placas de cultivo de tejido de 6 pocilios conforme a las condiciones recomendadas por ATCC, se lavan dos veces con PBS y una alícuota se cuenta utilizando un hemacitómetro . La extracción de las proteínas nucleares de células MCF-7 se realiza utilizando el Equipo de Extracción CelLytic NuClEAR^ de Sigma conforme a la recomendación del fabricante. Un ensayo de electroquimioluminiscencia se realiza de la siguiente manera: • Secuencialmente, a cada pocilio, se agregan extractos de las células MCF-7 (la cantidad de extracto por pocilio es diferente de aquella extraída de 30 a 100 células MCF-7; también se utilizan pocilios de control sin extracto) y entonces 50 µ?/pocillo de una mezcla de TAG- Ab y Biotina-Ab (por ejemplo, en una concentración entre 0.5 a 2 µg/ml cada una; diluida en el amortiguador de ensayo de PBS) se agregan a los pocilios de una placa de polipropileno de fondo en forma de U de 96 pocilios y se incuban a temperatura ambiente con agitación constante (por ejemplo durante 2 horas) . • 10 µg de perlas magnéticas de estreptavidina (por ejemplo, Estreptavidina Dynabeads M-280MR, # de Catálogo 110028, BioVeris, Corporation, Gaithersburg, MD) en 25 µ? se agregan a cada pocilio y se incuban con agitación constante (por ejemplo, durante 30 minutos) . • El amortiguador de ensayo de PBS se agrega a cada pocilio para hacer un volumen final de 250 µ? por pocilio. Todas las condiciones se someten a prueba en pocilios por lo menos duplicados. La placa de 96 pocilios entonces se analiza por la electroquimioluminiscencia utilizando el Analizador M8 M-Series" (Número de Catálogo 310800, BioVeris, Corporation, Gaithersburg, MD) . Utilizando este inmunoensayo, el ER-alfa es detectable y arriba de la línea de referencia de los extractos de por lo menos 100 células MCF-7 por pocilio. EJEMPLO 6. En este ejemplo, se examinó la sensibilidad para detectar el receptor de estrógeno-alfa (ER) humano recombinante utilizando un inmunoensayo de emparedado que utiliza la electroquimioluminiscencia. Se preparó un amortiguador de ensayo de PBS: • Amortiguador de Ensayo: Tween-20 al 0.5% y albúmina de suero bovino al 0.5% (BSA) en PBS (solución salina amortiguada con fosfato, pH 7.2) Dos conjuntos del anticuerpo policlonal de conejo anti-ER- alfa se obtuvieron primero de Abcam Inc (Cambridge, A) : • Ab-5700 el cual se dirige a la terminación C; y • Ab-31315 el cual se dirige al sitio no fosforilado del aminoácido Serina 167 del receptor de estrógeno humano- alfa. Una porción de ambos anticuerpos policlonales se etiquetó con rutenio ("etiquetado con TAG" ) y una porción de Ab-31315 se etiquetó con biotina de acuerdo con los métodos de Lorence & Lu (documento WO 2006/041959 A2) . El anticuerpo policlonal etiquetado con rutenio Ab5700 y el anticuerpo policlonal etiquetado con rutenio Ab31315 son referidos en lo sucesivo como "TAG-5700" y "TAG-31315", respectivamente. El anticuerpo policlonal biotinilado Ab31315 es referido en lo sucesivo en este ejemplo como "BIOTINA-31315" . La proteína del receptor de estrógeno-alfa recombinante se obtuvo de Invitrogen (Carslbad, CA; Número de catálogo #P2187, 2600 pmol/ml) . Un ensayo de electroquimioluminiscencia se realizó de la siguiente manera: • Los estándares se diluyeron en un Amortiguador de Ensayo para producir 1600, 160, 16, 4 y 1 pg/pocillo cuando 25 µL se utilizaron por pocilio. A cada pocilio de una placa de polipropileno de fondo en forma de U de 96 pocilios (con 25 µL de estándar por pocilio) se agregaron 50 µ?/pocillo de una mezcla de cualquiera de: o TAG-31315 y BIOTINA-31315 (por ejemplo, en una concentración de 1.0 g/ml en los 50 µ? antes de la adición) ; o o TAG-5700 y BIOTINA-31315 (por ejemplo, en una concentración de 1.0 µg/ml en los 50 µ? antes de la adición) • La solución resultante se incubó a temperatura ambiente con agitación constante (durante 2 horas) . · 10 µg de perlas magnéticas de estreptavidina (por ejemplo, Estreptavidina DYNABEADS M-280MR, # de catalogo 110028, BioVeris Corporation, Gaithersburg, MD) en 25 µ? se agregaron a cada pocilio y se incubaron con agitación constante (durante 30 minutos) . · El Amortiguador de Ensayo de PBS se agregó a cada pocilio para hacer un volumen final de 250 µ? por pocilio. Todas las condiciones se sometieron a prueba en pocilios por duplicado. La placa de 96 pocilios entonces se analizó por la electroquimioluminiscencia utilizando el Analizador M-Series 384^ (BioVeris Corporation, Gaithersburg, MD) . Utilizando este inmunoensayo, 1600 pg por pocilio de estándar de ER fue detectable con una señal arriba del fondo (Figura 1) . EJEMPLO 7. En estos conjuntos de experimentos, se realizó inicialmente una determinación de repetición de la sensibilidad para detectar el ER-alfa recombinante utilizando los mismos anticuerpos que en el Ejemplo 6. Sin embargo, el almacenamiento de estos anticuerpos a 4°C condujo a una pérdida en la sensibilidad con la señal de ECL para 1250 pg por pocilio que está abajo de la línea de referencia y la señal de ECL de 12500 pg por pocilio que está 160 unidades de ECL arriba de la línea de referencia. Con esta pérdida en la sensibilidad, entonces se sometieron a prueba los anticuerpos adicionales. El anticuerpo IgY policlonal de pollo contra el ER-alfa se obtuvo de GenWay Biotech, Inc. (San Diego, CA; # de catálogo 15-288-21182) . Una porción de este anticuerpo policlonal se etiquetó con rutenio ("TAG-IgY") y una porción se etiquetó con biotina ( "BIOTINA-IgY" ) de acuerdo con los métodos de Lorence & Lu (documento WO 2006/041959 A2) . Un inmunoensayo de ECL que utiliza los estándares de ER-alfa se realizó con estos anticuerpos de acuerdo con los métodos del Ejemplo 6. Utilizando estos anticuerpos de IgY, la cantidad más baja sometida a prueba (12.5 pg por pocilio de ER-alfa) fue detectable y proporcionó una señal de ECL arriba de la línea de referencia (Tabla 1) .

Tabla 1. Detección por electroquimioluminiscencia (ECL) de ER-alfa recombinante por medio del inmunoensayo que utiliza el anticuerpo policlonal de pollo etiquetado con rutenio (TAG-IgY) y el anticuerpo policlonal de pollo biotinilado (Biotina-IgY) .

* Señal de ECL promedio arriba de la señal promedio de los pocilios de control sin antígeno. Utilizando estos anticuerpos IgY, se analizaron los extractos celulares de las células de carcinoma de mama humanas MCF-7 (células de control positivo para la expresión de ER-alfa) . Las células MCF-7 (de ATCC, Manassas, VA) se desarrollaron en un cultivo de tejido conforme a las condiciones recomendadas por ATCC, se lavaron dos veces con PBS y una alícuota se contó utilizando un hemacitómetro . La lisis de las células SK-BR-3 y la obtención del sobrenadante se realizó utilizando el Amortiguador de Lisis de Pierce [M-PER; # de catálogo 78501; Pierce Biotechnology, Rockford, IL] con el inhibidor de proteasa de Pierce [# de catálogo 78410; Pierce Biotechnology] . La cantidad de sobrenadante del lisado por pocilio fue diferente de aquella extraída de 8 a 125,000 células MCF-7 y se analizó por el ER utilizando el inmunoensayo con los anticuerpos IgY. Puesto que poca, si existe algo, señal de ECL se observó utilizando esta extracción con M-PER, esto se atribuyó a la pobre eficiencia de extracción. Después se utilizó una variedad de métodos de extracción. Se sometió a prueba el uso de: o Amortiguador de extracción de RIPA (Pierce Biotechnology, # de Catálogo 89900) . o Amortiguador de RIPA más cloruro de potasio 0.4 M (KC1) . o Amortiguador de RIPA más calentamiento a 95 °C durante 2 minutos . o Amortiguador de RIPA más cizalladura con una columna giratoria (QIAGEN) . o Equipo de extracción nuclear de Marligen (# de catálogo 11906-100) . Se descubrió que el amortiguador de RIPA con KC1 es el mejor de todas estas metodologías cuando se someten a prueba las células MCF-7 (Tabla 2) .

Tabla 2. Detección por electroquimioluminiscencia (ECL) de ER-alfa por medio del inmunoensayo de ECL que utiliza el anticuerpo policlonal de pollo etiquetado con rutenio (TAG-IgY) y el anticuerpo policlonal de pollo biotinilado (Biotina-IgY) y utilizando la extracción con RIPA-KCL de células MCF-7.

• Señal de ECL promedio arriba de la señal promedio de los pocilios de control sin antígeno.

Al mismo tiempo que este ensayo que utiliza los extractos de células MCF-7, se realizó otra curva estándar y se observó una disminución en la sensibilidad (comparar la Tabla 3 con la Tabla 1) . Por esta razón, en el siguiente ejemplo, las condiciones de almacenamiento adicionales para IgY se examinaron a fin de mejorar la estabilidad del anticuerpo. Además, los anticuerpos adicionales también se examinaron .

Tabla 3 . Repetición de la detección por electroquimioluminiscencia (ECL) de ER-alfa recombinante por medio de un inmunoensayo que utiliza el anticuerpo policlonal de pollo etiquetado con rutenio (TAG-IgY) y el anticuerpo policlonal de pollo biotinilado (Biotina-IgY) .

* Señal de ECL promedio arriba de la señal promedio de los pocilios de control sin antígeno. ** Estos valores bajos de ECL fueron mucho más consistentes con un problema temporal con el instrumento de detección de ECL durante el análisis de estos pocilios.

EJEMPLO 8 En este ejemplo, un inmunoensayo de emparedado que utiliza la electroquimioluminiscencia se utilizó para examinar : • la sensibilidad para detectar ER-alfa recombinante • la sensibilidad para detectar el ER-alfa de las células de cáncer de mama MCF-7 • la especificidad para detectar el ER-alfa de MCF-7 (células de control positivo para la expresión alta de ER-alfa) contra las células de leucemia K562 (células de control negativo) Un nuevo embarque de anticuerpo policlonal IgY anti-ER-alfa de pollo se obtuvo de GenWay, Número de Catálogo #15-288-21182. Una porción de esta reserva de anticuerpos se biotiniló nuevamente y una porción se etiquetó nuevamente con rutenio de acuerdo con los métodos de Lorence & Lu (documento O 2006/041959 A2) . El anticuerpo policlonal de pollo etiquetado con rutenio y el anticuerpo policlonal de pollo biotinilado son referidos en lo sucesivo en este ejemplo como "TAG-IgY2" y "BIOTINA-IgY2" . Después del etiquetado, éstos tuvieron concentraciones de 201 µg/mL y 124 µg/mL, respectivamente. Después del etiquetado, una porción de "TAG-IgY2" y "BIOTINA-IgY2" se almacenó cada una 4°C sin la adición de BSA y la porción de "TAG- IgY2" y "BI0TINA-IgY2" se almacenó cada una a 4°C con la adición de BSA al 1%. Cuatro diferentes anticuerpos policlonales anti-ER-alfa de conejo se obtuvieron de BETHYL Laboratories (Montgomery, TX) : • Número de Catálogo #A300-495A: Anticuerpo policlonal contra el epítopo de ER-alfa el cual representa una región de la proteína entre los residuos de aminoácido 1 y 50 y por lo tanto, se dirige a la terminación N. Este anticuerpo se etiquetó con rutenio de acuerdo con los métodos de Lorence & Lu (documento WO 2006/041959 A2). Es referido en lo sucesivo en este ejemplo como "TAG-495A" . Después del etiquetado, tuvo una concentración de 483 y entonces se almacenó a 4°C sin la adición de BSA. Número de Catálogo #A300-496A: Anticuerpo policlonal contra el epítopo de ER-alfa el cual representa una región de la proteina entre los residuos de aminoácidos 100 y 150 y por lo tanto se dirige a una región cerca de la terminación N. Este anticuerpo se etiquetó con biotina de acuerdo con los métodos de Lorence & Lu (documento WO 2006/041959 A2) . Es referido en lo sucesivo en este ejemplo como "BIOTINA-496A" . Después del etiquetado, tuvo una concentración de 486 µg/mL y entonces se almacenó a 4°C sin la adición de BSA. Número de Catálogo #A300-497A: Anticuerpo policlonal contra el epítopo de ER-alfa el cual representa una región de la proteína entre los residuos de aminoácidos 525 y 575 y por lo tanto se dirige a una región más cercana a la terminación C que los anticuerpos A300-495A y A300-496A. Este anticuerpo se etiquetó con rutenio de acuerdo con los métodos de Lorence & Lu (documento WO 2006/041959 A2). Es referido en lo sucesivo en este ejemplo como "TAG-497A" . Después del etiquetado, tuvo una concentración de 622 µg/mL y entonces se almacenó a 4°C sin la adición de BSA. • Número de Catálogo #A300-498A: Anticuerpo policlonal contra el epitopo de ER-alfa el cual representa una región de la proteína entre los residuos de aminoácidos 550 y la terminación C. Este anticuerpo se etiquetó con biotina de acuerdo con los métodos de Lorence & Lu (documento WO 2006/041959 A2) . Es referido en lo sucesivo en este ejemplo como "BIOTINA-498A" . Después del etiquetado, tuvo una concentración de 335 g/mL y entonces se almacenó a 4°C sin la adición de BSA. El ER-alfa humano recombinante (de Invitrogen) fue el mismo que aquel utilizado en el ejemplo 6. Un ensayo de electroquimioluminiscencia se realizó de la siguiente manera: • Los estándares se diluyeron nuevamente en el Amortiguador de Ensayo para producir 1600, 160, 16 y 4 pg/pocillo cuando se utilizaron 25 µ?? por pocilio. A cada pocilio de una placa de polipropileno de fondo en forma de U de 96 pocilios (con 25 µ?_ de estándar por pocilio) se agregaron 50 µ?/pocillo de una mezcla de un anticuerpo con TAG y un anticuerpo biotinilado (en una concentración de 1.0 µg/ml en los 50 µ? antes de la adición) y la solución resultante se incubó a temperatura ambiente con agitación constante (durante 2 horas) . En este ensayo, se sometieron a prueba cuatro conjuntos de condiciones de anticuerpos: o CONDICIÓN #1: el "TAG-IgY2" y "BIOTINA- IgY2" se almacenaron a 4°C sin la adición de BSA después del etiquetado, o CONDICIÓN #2: "TAG-IgY2" y "BIOTINA-IgY2" se almacenaron a 4°C con la adición de BSA al 1% a cada anticuerpo etiquetado después de que ocurrió el etiquetado, o CONDICIÓN #3: "TAG-495A" y "BIOTINA-498A" (se seleccionó este par de anticuerpos ya que estos fueron anticuerpos contra epítopos de dos regiones diferentes de la proteína) . O CONDICIÓN #4: "TAG-497A" y "BIOTINA-496A" (Se seleccionó este par de anticuerpos ya que estos fueron anticuerpos contra epítopos de dos regiones diferentes de la proteína) . 10 µg de perlas magnéticas de estreptavidina (por ejemplo, Estreptavidina Dynabeads -280MR, # de Catálogo 110028, BioVeris Corporation, Gaithersburg, MD) en 25 µ? se agregaron a cada pocilio y se incubaron con agitación constante (durante 30 minutos) . El Amortiguador de Ensayo de PBS se agregó a cada pocilio para hacer un volumen final de 250 µ? por pocilio. Todas las condiciones se sometieron a prueba en pocilios por lo menos duplicados. La placa de 96 pocilios entonces se analizó por la electroquimioluminiscencia utilizando el Analizador M- Series 384^ (BioVeris Corporation, Gaithersburg, MD) . Utilizando las CONDICIONES #2, #3 y #4 , tan solo 4 pg por pocilio del estándar de ER-alfa tuvo una señal de ECL promedio arriba del fondo (Tabla 4) . Utilizando la CONDICIÓN #1, tan solo 16 pg por pocilio del estándar de ER-alfa fue detectable con una señal arriba del fondo (Tabla 4) . La CONDICIÓN #2 en la cual los anticuerpos IgY etiquetados (los cuales estuvieron en concentraciones más bajas que cualquiera de los 4 anticuerpos de conejo) se almacenaron en BSA al 1% y proporcionaron resultados ventajosos en comparación con la CONDICIÓN #1 en la cual el IgY etiquetado no se almacenó con la adición de BSA. Las CONDICIONES #3 y #4 que utilizan los anticuerpos policlonales de conejo proporcionaron resultados ventajosos en comparación con las CONDICIONES #1 y #2 que utilizan el anticuerpo policlonal de pollo. Adicionalmente, la CONDICIÓN #3 que utiliza BIOTINA-498A y TAG-495A proporcionó resultados ventajosos en comparación con la CONDICIÓN #4 que utiliza BIOTINA-496A y TAG-497A.

Tabla 4. Detección por electroquimioluminiscencia (ECL) de ER-alfa recombinante por medio del inmunoensayo que utiliza cuatro condiciones de anticuerpos diferentes (véase el texto de este Ejemplo) *Negativa: Señal de ECL promedio abajo del nivel del fondo EJEMPLO 9 En este ejemplo, un inmunoensayo de emparedado que utiliza la electroquimioluminiscencia se utilizó para examinar : • la sensibilidad para detectar el ER-alfa de las células de cáncer de mama MCF-7 · la especificidad para detectar el ER-alfa de MCF-7 (células de control positivo para la expresión alta del ER-alfa) contra células de leucemia K562 (control negativo para ER-alfa) Los procedimientos fueron como en el EJEMPLO 8 utilizando la CONDICIÓN #3 (BIOTINA-498A y TAG-495A) con los siguientes pasos adicionales que consisten en obtener los extractos celulares: • las células de cáncer de mama MCF-7 y las células de leucemia K562 (de ATCC, Manassas, VA) se desarrollaron conforme a las condiciones recomendadas por ATCC, se lavaron dos veces con PBS y una alícuota se contó utilizando un hemacitómetro . La extracción del ER-alfa de cada línea de células (5 millones de células por mL de amortiguador de extracción) se realizó utilizando un amortiguador de RIPA modificado (# de Catálogo de Pierce 89900) con la adición de cloruro de potasio 0.45 M (KC1) y ácido etilendiaminotetraacético 5 mM (EDTA) . Después de la adición del amortiguador de extracción, el material celular se alojó en un balancín en un baño de hielo durante 80 minutos. El sobrenadante se obtuvo después de la centrifugación a 18000 rpm durante 20 minutos para producir el "extracto" para la prueba. Un ensayo de electroquimioluminiscencia se realiza de la siguiente manera: · Secuencialmente, a cada pocilio, los extractos de las células MCF-7 o K562 se agregaron (la cantidad de extracto por pocilio fue diferente de aquella extraída de 100 a 10,000 células; los pocilios de control sin extracto también se utilizaron) y entonces 50 µ?/pocillo de una mezcla de BIOTINA-498A y TAG-495A (en una concentración entre 1 µg/ml cada uno en los 50 µ? agregados por pocilio) diluida en el amortiguador de ensayo de PBS) se agregaron a los pocilios de una placa de polipropileno de fondo en forma de U de 96 pocilios y se incubaron a temperatura ambiente con agitación constante durante 2 horas . • 10 µg de perlas magnéticas de estreptavidina (por ejemplo, Estreptavidina Dynabeads -280M , # de Catálogo 110028, BioVeris Corporation, Gaithersburg, MD) en 25 µ? se agregaron a cada pocilio y se incubaron con agitación constante durante 30 minutos. • El amortiguador de ensayo de PBS se agregó a cada pocilio para hacer un volumen final de 250 µ? por pocilio. Todas las condiciones se sometieron a prueba en pocilios por lo menos cuadruplicado. La placa de 96 pocilios entonces se analizó por la electroquimioluminiscencia utilizando el Analizador M- Series 384^ (BioVeris, Corporation, Gaithersburg, MD) . Utilizando este inmunoensayo, el ER-alfa fue detectable de los números pequeños de las células MCF-7 por pocilio y las señales de ECL de los extractos de K562 fueron más bajas que de las células MCF-7 (Tabla 5 y Figuras 2 y 3) , indicando la alta sensibilidad y la alta especificidad del inmunoensayo.

Tabla 5. Comparación de la señal de ECL para la detección por inmunoensayo de ER-alfa en las células MCF-7 (control positivo para los niveles altos de ER-alfa) contra las células K562 (control negativo) . Los pocilios sin células se condujeron 8 veces; todas las otras muestras se condujeron por cuadruplicado. Células /pocilio Señal de ECL Promedio (arriba del fondo)± Error Estándar del Promedio MCF-7 K562 0 0 + 2 0±2 100 8±2 6±6 500 34 ±5 6±4 900 54 ±4 14±5 10,000 432 ± 10 11 ±5

Claims (17)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para detectar la expresión de un receptor de esteroides de células de carcinoma circulantes en una muestra de sangre, caracterizado porque comprende aislar las células de carcinoma de la muestra de sangre seguido por hacer un extracto de las células de carcinoma aisladas seguido por realizar en el extracto un inmunoensayo capaz de detectar el receptor de esteroides, en el cual un resultado positivo del inmunoensayo indica la presencia del receptor de esteroides en las células de carcinoma; en donde las células de carcinoma son células de cáncer de mama y el receptor de esteroides se selecciona del grupo que consiste del receptor de estrógeno-alfa, receptor de estrógeno-beta, receptor de progesterona y receptor de andrógeno o las células de carcinoma son células de cáncer de próstata y el receptor de esteroides es el receptor de andrógeno; en donde el inmunoensayo tiene una sensibilidad definida por ser capaz de detectar el receptor de esteroides de novecientas células de carcinoma MCF-7 las cuales se aumentan en un mililitro de una muestra de sangre de una persona sin carcinoma o por ser capaz de detectar 4 pg del receptor de esteroides.
2. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el inmunoensayo es capaz de detectar el receptor de esteroides de quinientas células de carcinoma MCF-7 las cuales se aumentan en un mililitro de una muestra de sangre de una persona sin carcinoma .
3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el inmunoensayo es capaz de detectar el receptor de esteroides de cien células de carcinoma MCF-7 las cuales se aumentan en un mililitro de una muestra de sangre de una persona sin carcinoma de mama .
4. 4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el inmunoensayo es capaz de detectar el receptor de esteroides de treinta células de carcinoma MCF-7 aumentadas en un mililitro de una muestra de sangre de una persona sin el carcinoma de mama.
5. 5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el inmunoensayo utiliza la electroquimioluminiscencia para la detección.
6. 6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el inmunoensayo utiliza una técnica seleccionada de quimioluminiscencia, quimioluminiscencia fluorogénica, polarización de fluorescencia y fluorescencia con resolución temporal para la detección.
7. 7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el inmunoensayo utiliza un anticuerpo policlonal contra el receptor de esteroides .
8. 8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el inmunoensayo utiliza un primer anticuerpo policlonal contra la región N-terminal del receptor de esteroides y un segundo anticuerpo policlonal contra la región C-terminal del receptor de esteroides .
9. 9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el inmunoensayo utiliza un anticuerpo monoclonal contra el receptor de esteroides .
10. 10. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las células de carcinoma se aislan al poner en contacto la sangre con perlas inmunomagnéticas capaces de enlazarse selectivamente a las células de carcinoma.
11. 11. Un método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el receptor de esteroides es el receptor de estrógeno-alfa .
12. 12. Un método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el receptor de esteroides es el receptor de progesterona.
13. 13. Un método para identificar a un paciente con cáncer para beneficiarse probablemente del tratamiento con un agente terapéutico endocrino, caracterizado porque comprende el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde la muestra de sangre que contiene células de carcinoma es extraída del paciente.
14. 14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el tejido tumoral del paciente se ha determinado previamente de manera inmunohistoquímica que es negativo por la expresión del receptor de esteroides.
15. 15. Un método para tratar a un paciente con cáncer para beneficiarse probablemente del tratamiento con un agente terapéutico endocrino, caracterizado porque comprende administrar el agente anticancerígeno al paciente identificado de acuerdo con el método de la reivindicación 13, tratando en consecuencia al paciente.
16. 16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el agente terapéutico endocrino se selecciona del grupo que consiste de tamoxifen, un inhibidor de aromatasa y fulvestrant.
17. 17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el inhibidor de aromatasa se selecciona del grupo que consiste de anastrozol, letrozol, exemestano y fadrozol .