MX2008013333A - Deteccion de celulas endoteliales circulantes. - Google Patents

Abstract

Las células endoteliales se detectan en una muestra de sangre el enriquecer las células endoteliales de la muestra de sangre seguido por realizar en las células endoteliales enriquecidas un inmunoensayo capaz de detectar antígenos expresados por las células endoteliales. El inmunoensayo es capaz de detectar un antígeno expresado de 300 células endoteliales por mililitro de sangre. El método se puede utilizar para someter a ensayo células endoteliales circulantes maduras o células progenitoras endoteliales circulantes.

Description

DETECCIÓN DE CÉLULAS ENDOTELIALES CIRCULANTES ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Existen dos poblaciones distintas de células endoteliales circulantes: células progenitoras, endoteliales, circulantes que se derivan de la médula ósea (CEPs, por sus siglas en inglés) y células endoteliales circulantes maduras (mCECs, por sus siglas en inglés) (Beaudry y colaboradores, 2005, Clin Cáncer Res 11:3514; Para antecedentes adicionales véase Rosenzweig, 2005; New Engl J Med 353:1055-1057; Khan SS, 2004; Cytometry Part B, Clinical Cytometry 64B: 1-8). La medición de las células endoteliales circulantes puede actuar como marcadores sustitutos para la actividad biológica de agentes antiangiogénicos y se utiliza para seleccionar a pacientes quienes se beneficiarán de esta terapia para el cáncer (Beaudry y colaboradores, 2005, Clin Cáncer Res.). Por ejemplo, los pacientes con CEPs que expresan altos niveles de VEGFR son excelentes candidatos para el tratamiento con inhibidores de VEGFR tal como bevacizumab (Avastin) . También, la medición de las mCECs es útil en el cáncer puesto que un nivel incrementado indica la progresión de la enfermedad (Mancuso P y colaboradores, 2001, Blood 97:3658-61; Beerepoot L V y colaboradores, 2004, Ann Oncol 15:139-45) . Pero "La prueba clínica de estos agentes [antiangiogénicos] es obstaculizada actualmente por la falta de marcadores sustitutos para medir su efecto biológico y predecir que pacientes se benefician más probablemente" ("The clinical testing of these [antiangiogenic] agents is currently hampered, by the lack of surrogate markers for measuring their biological effect and predicting which patients are most likely to benefit"). (Davis DW y colaboradores, 2003, Br J Cáncer 89:8-14). Por lo tanto, existe la necesidad de una prueba para predecir que pacientes con cáncer se beneficiarán probablemente de la terapia antiangiogénica. Las células endoteliales circulantes son un factor de pronóstico importante en el campo cardiovascular de la medicina. Los niveles bajos de las CEPs indican un alto riesgo de eventos cardiovasculares (Hill JM y colaboradores, 2003, New Engl J Med 348:593-600; erner N, y colaboradores, 2005, New Engl J Med 353:999-1007; Schmidt-Lucke C y colaboradores, Circulation 2005, 111:2981-87). Existe la necesidad de una prueba para predecir mejor que pacientes están en riesgo de eventos cardiovasculares. En un paciente que se sospecha que tiene un infarto de miocardio (MI, por sus siglas en inglés) , los altos niveles de CEPs sugieren la ocurrencia reciente de un MI. Existe la necesidad de una prueba mejor para predecir que pacientes han tenido un infarto de miocardio si se sospecha que hayan tenido uno.

Las metodologías utilizadas en la bibliografía publicada para cuantificar las CEPs y mCECs utilizan frecuentemente la citometría de flujo (Werner N y colaboradores, 2005, N Engl J Med 353:999-1007) la cual se describe como una "tarea difícil" (Khan SS y colaboradores, 2004) . Esta es una metodología difícil y lenta no se puede adaptar fácilmente a la automatización. Un problema adicional con la citometría de flujo y otros es la alta tinción de fondo en la citometría de flujo. La tinción no específica de 0.1 a 0.5% de células analizadas se observa comúnmente con la citometría de flujo y ésta es muy alta y ocultará la detección y numeración de la población deseada de células endoteliales circulantes la cual puede ser tan baja como 0.0001% (Khan SS y colaboradores (2004; Cytometry Part B, Clinical Cytometry 64B:l-8)). La capacidad de almacenamiento de datos excesivos es otro problema con los análisis de eventos raros por la citometría de flujo (Khan y colaboradores, 2004) . Otro método utilizado en la bibliografía para medir las CEPs es por medio del conteo de colonias (Hill JM y colaboradores, 2003, New Engl J Med 348:593-600) . Este método es más lento que la citometría de flujo que toma más de una semana para realizarlo (Hill y colaboradores, 2003) . Por lo tanto, el método de esta invención es un avance significativo en el campo en cuanto a que permite una rápida valoración de las células endoteliales circulantes y evita las dificultantes (problemas de fondo, capacidad de almacenamiento de datos excesivos) inherentes en un análisis de eventos raros por la citometría de flujo. Las CEPs y mCECs representan una fracción muy pequeña de células mononucleares en la sangre con un cálculo de entre 0.01% y 0.0001% (Khan SS y colaboradores, 2004) . La enumeración de estas células en la sangre periférica es médicamente importante debido a que proporciona un entendimiento en las actividades angiogénicas y neovasculogénicas del cuerpo. Se ha mostrado que la angiogénesis es crítica para el crecimiento de tumores y las terapias anti-angiogénicas novedosas (tal como el agente aprobado bevacizumab) se utilizan para disminuir la velocidad de o prevenir el crecimiento de tumores. La angiogénesis y neovascularización también son perjudiciales en muchas otras enfermedades además del cáncer, que incluyen la anemia falciforme, vasculitis e hipertensión pulmonar (Khan SS y colaboradores, 2004) . En contraste, en la enfermedad coronaria, es deseable la neovascularización o revascularización a fin de mejorar el flujo sanguíneo al tejido cardíaco.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Esta invención proporciona un método para someter a ensayo células endoteliales en una muestra de sangre que comprende enriquecer las células endoteliales de la muestra de sangre seguido por realizar en las células endoteliales enriquecidas un inmunoensayo capaz de detectar el antígeno expresado por trescientas células endoteliales por mililitro de muestra de sangre. Alternativamente, el ensayo es capaz de detectar el antígeno de ciento sesenta picogramos de proteína antigénica. Esta invención proporciona un método para someter a ensayo un antígeno de células endoteliales en las células endoteliales en una muestra de sangre que comprende enriquecer las células endoteliales de la muestra de sangre seguido por realizar en las células endoteliales enriquecidas un inmunoensayo capaz de detectar el antígeno expresado por las células endoteliales; en donde el inmunoensayo tiene una sensibilidad definida por ser capaz de detectar el antígeno de trescientas células endoteliales por mililitro de sangre o por ser capaz de detectar el antígeno de ciento sesenta picogramos de proteína antigénica; y en donde el inmunoensayo genera una señal que es proporcional a la cantidad (es decir números) del antígeno en las células endoteliales. Esta invención proporciona inmunoensayos suficientemente sensibles para cuantificar los niveles de las células endoteliales circulantes (mCECs y/o CEPs) en las muestras de sangre. Estos inmunoensayos proporcionan métodos para identificar a pacientes en riesgo incrementado de varias enfermedades (por ejemplo cáncer, anemia falciforme, vasculitis, diabetes, hipertensión pulmonar y enfermedad cardiovascular) .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. Sensibilidad para Detectar el VEGFR2. Se muestra una comparación de la señal de ECL para la detección por inmunoensayo de VEGFR2 en lisados de células HUVEC (células endoteliales que son un control positivo para la expresión de VEGFR2) contra K562 (control negativo para la expresión de VEGFR2) . Se muestran los datos utilizando lisados de 300, 625 y 2500 células por pocilio. Figura 2. Sensibilidad y Especificidad para Detectar el VEGFR2 de Células Endoteliales contra Células No Endoteliales. Se muestra una comparación adicional de la señal de ECL para la detección por inmunoensayo de VEGFR2 en lisados de células HUVEC (células endoteliales que son un control positivo para la expresión de VEGFR2) contra K562 (control negativo para la expresión de VEGFR2) . Los datos del mismo experimento mostrado en la Figura 1 se utilizan para esta figura, excepto que los datos obtenidos del material del lisado de 10,000 células por pocilio también se incluyeron en esta gráfica a fin de mostrar una escala incrementada del eje X. Figura 3. Especificidad para Detectar el VEGFR2 de Células Endoteliales contra Células No Endoteliales . Se muestra una comparación de la señal de ECL para la detección por inmunoensayo de VEGFR2 en lisados de células HUVEC (células endoteliales que son un control positivo para la expresión de VEGFR2) contra PMBCs . Se muestran los datos que utilizan lisados de hasta 2500 células por pocilio. En comparación con las Figuras 1 y 2, esta Figura 3 presenta datos adicionales de las PBMCs . Para propósitos de comparación, también se presentan los mismos datos de las células HUVEC de las Figuras 1 y 2. Figura 4. Efecto del enriquecimiento. Comparación de la señal de ECL para la detección por inmunoensayo de VEGFR2 en lisados de ya sea los cultivos ex vivo de sangre de cordón umbilical humano no enriquecidos o de los mismos cultivos enriquecidos por el antígeno CD34 utilizando perlas inmunomagnéticas con un anticuerpo anti-CD34. En esta figura, se extrajeron células utilizando el Reactivo de Extracción M-PER de Pierce como se indica en el Ejemplo 9. Utilizando la citometría de flujo, se calculó que había 960 células positivas respecto a VEGFR2 por 5000 células enriquecidas con CD34. Figura 5. Efecto del enriquecimiento. Comparación de la señal de ECL para la detección por inmunoensayo de VEGFR2 en lisados de ya sea los cultivos ex vivo de sangre de cordón umbilical humano no enriquecidos o de los mismos cultivos enriquecidos por el antígeno CD34 utilizando perlas inmunomagnéticas con un anticuerpo anti-CD34. En esta figura, se utilizaron las mismas células utilizadas para obtener los lisados en la Figura 4, excepto que las células se extrajeron utilizando el Amortiguador de Extracción RIPA indicado en el Ejemplo 9. Figura 6. Efecto del enriquecimiento. Comparación de la señal de ECL para la detección por inmunoensayo de VEGFR2 en lisados de ya sea los cultivos ex vivo de sangre de cordón umbilical humano no enriquecidos o de los mismos cultivos enriquecidos por el antígeno CD34 utilizando perlas inmunomagnéticas con un anticuerpo anti-CD34. En esta figura, se utilizó un conjunto diferente de células del cultivo ex vivo de sangre de cordón umbilical. Como en la Figura 4, las células se sometieron a la lisis utilizando el Reactivo de Extracción M-Per de Pierce. Utilizando la citometría de flujo, se calculó que había 700 células positivas respecto a VEGFR2 por 5000 células enriquecidas por CD34.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Como se utiliza en este documento, el término transicional "que comprende" es indefinido. Una reivindicación que utiliza este término puede contener elementos además de aquellos enumerados en esta reivindicación. De esta manera, por ejemplo, se pueden leer reivindicaciones sobre métodos que también incluyen otros pasos no enumerados específicamente en este documento, siempre y cuando estén presentes los elementos enumerados o su equivalente . Como se utiliza en este documento, "enriquecer" una determinada clase de células de una muestra significa purificar o purificar parcialmente estas células de otras clases de células en la muestra. Abreviaciones : mCEC: célula endotelial circulante madura CEP: célula progenitora endotelial circulante ECL: electroquimioluminiscencia HUVEC: célula endotelial del cordón umbilical humano MI : infarto de miocardio PBMCs : células mononucleares de sangre periférica VEGF: factor de crecimiento endotelial vascular VEGFR2 : receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular Las CEPs se pueden distinguir debido a la presencia de los siguientes marcadores (Khan y colaboradores, 2004; Rosenzweig, 2005, New Engl J Med 353: 1055-7) : • CD133 (no está presente en las mCECs) • VEGFR-2 (molécula 1 de adhesión de células vasculares; también llamada KDR) • CD34 · Deficiencia de CD45 y deficiencia de CD3 Las mCECs se pueden distinguir debido a la presencia de los siguientes marcadores: • CD146 (no está presente en las CEPs) • Factor de Von Willebrand (vWF) · CD31 (también llamada PECAM-I: molécula 1 de adhesión de células endoteliales de plaquetas) Deficiencia de CD45 y deficiencia de CD3 (esto es importante puesto que las células T activadas pueden expresar la CD146; Khan y colaboradores, 2004). Esta invención proporciona inmunoensayos suficientemente sensibles para cuantificar los niveles de células endoteliales circulantes (mCECs y/o CEPs) en muestras de sangre. Estos inmunoensayos proporcionan métodos para identificar a pacientes en riesgo incrementado de varias enfermedades (por ejemplo, cáncer, anemia falciforme, vasculitis, diabetes, hipertensión pulmonar y enfermedad cardiovascular) . Los medios convenientes, sumamente sensibles y rápidos para someter a prueba muestras de sangre para identificar a estos pacientes proporcionados por esta invención son sumamente deseables de tal manera que se pueden llevar a cabo mediciones preventivas. El uso de la detección por electroquimioluminiscencia (ECL) es un medio preferido para conseguir esto. Esta invención se basa en la combinación de la alta especificidad de procedimientos utilizados para aislar células endoteliales circulantes de la sangre con la alta sensibilidad de ciertos ensayos basados en la inmunología tal como la ECL. Las células endoteliales circulantes primero son enriquecidas utilizando perlas inmunomagnéticas . En una modalidad del método de detección de esta invención, el ensayo inmunológico es tal que el ensayo es capaz de detectar un antígeno de trescientas, más preferiblemente ciento cincuenta, más preferiblemente cien, más preferiblemente treinta y mucho más preferiblemente diez células endoteliales por mililitro de sangre. La siguiente es una modalidad preferida de un procedimiento para enriquecer las células endoteliales: Una muestra de sangre (usualmente en el intervalo de aproximadamente 8 a 20 mi) se toma de un paciente: 1. Remoción de glóbulos rojos. 2. Selección negativa opcional para agotar adicionalmente los leucocitos normales. Una modalidad preferida incluye este paso. 3. Selección positiva para las células endoteliales circulantes (mCECs o CEPs) . 4. Detección y cuantificación de las mCECs o CEPs utilizando un inmunoensayo para uno o más antígenos de las mCECs o CEPs circulantes. 1. Remoción de glóbulos rojos Está disponible una variedad de métodos para retirar glóbulos rojos que incluyen pero no están limitados a la separación basada en la densidad (tal como la recolección de sangre directamente en los tubos BD Vacutainer CPT"* de Becton Dickinson) seguido por la centrifugación) y los amortiguadores de lisis comerciales tales como el amortiguador de lisis PURESCRIPT RBC^ (Gentra, Minneapolis) , solución de lisis FACS"* (BDIS) , IMMUNOLYSEMR (Coulter) , OPTILYSE BMR (Immunotech) y amortiguador de lisis ACK1411 (Biosource, Rockville, MD) . método preferido utiliza los tubos Vacutainer CPT con anticoagulante (EDTA o citrato) . Estos tubos contienen un material que con la centrifugación correcta (1,100 x g durante 10 minutos, rotor de aletas abatibles) permite la eliminación de los glóbulos rojos y neutrófilos. Después de la centrifugación, el fondo del tubo contiene una pelotilla de células de eritrocitos (glóbulos rojos) y neutrófilos. Arriba de la pelotilla de células está una barrera de gel y arriba de la barrera de gel están las células tumorales, los linfocitos y los monocitos como una banda en el fondo del plasma. Las células tumorales, los linfocitos y los monocitos entonces se pueden recolectar fácilmente de la parte superior sobre de la barrera de gel. Se prefiere este método ya que retira no solamente los glóbulos rojos sino también los neutrófilos . 2. Selección negativa para agotar adicionalmente los leucocitos normales Una modalidad preferida de esta invención utiliza un paso de selección negativa para el aislamiento de células endoteliales . La selección negativa es la remoción selectiva de células indeseables. La selección negativa permite el agotamiento adicional de leucocitos especialmente los linfocitos y los monocitos. Una metodología es utilizar perlas magnéticas con anticuerpos unidos contra uno o más antígenos de leucocitos tales como CD45 y/o CD3. En una modalidad preferida, se utiliza más de un anticuerpo contra los leucocitos. La adición de estas perlas magnéticas a la muestra de sangre y la remoción de las perlas con un imán agota adicionalmente la muestra de leucocitos y enriquece las células endoteliales. Otra metodología para la selección negativa comprende el uso de anticuerpos que son biespecíficos tanto para los antígenos de leucocitos, especialmente CD45, el antígeno de leucocitos común como para un antígeno de glóbulos rojos tal como glicoforina A. Uno o más de estos anticuerpos biespecíficos se agregan a los tubos BD Vacutainer CPTMR antes de la recolección de sangre. En una modalidad preferida, se utiliza el cóctel de anticuerpos biespecíficos contra más de una molécula de CD asociada con leucocitos. Cuando la sangre es introducida en el tubo Vacutainer CPTMR, los anticuerpos biespecíficos forman inmunorrosetas cada una que consiste de leucocitos y muchos glóbulos rojos. Estas inmunorrosetas tienen una densidad de aproximadamente aquella de los glóbulos rojos y cuando se centrifugan se encuentran en la pelotilla de glóbulos rojos, retirando adicionalmente de esta manera los leucocitos de la fracción de células tumorales encontrada arriba de la pelotilla de células y la barrera de gel . La fracción con las células tumorales en el plasma se recolecta para el procesamiento adicional. 3. Selección positiva para células endoteliales circulantes (mCECs o CEPs) El método preferido para aislar las células endoteliales circulantes utiliza perlas inmunomagnéticas . Otros métodos de aislamiento de células circulantes incluyen la filtración (Vona G y colaboradores, 2000, Am J Pathol. 2000 156:57-63). En una modalidad preferida, las perlas inmunomagnéticas tienen anticuerpos contra antígenos encontrados selectivamente en la superficie de células endoteliales . Los ejemplos incluyen pero no están limitados a: a) en el caso de CEPs : CD133, VEGFR-2 y CD34; b) en el caso de mCECs : CD146, vWF y CD31. Se utilizan las perlas inmunomagnéticas con anticuerpos contra uno de estos antígenos. Las perlas inmunomagnéticas pueden ser de varios tamaños (50 micrómetros a menos de 200 nm) e incluyen las perlas DYNAL1* (>1.5 micrómetros a aproximadamente 50 micrómetros) . En una modalidad de la invención, el cóctel de selección positiva EasySepMR y las nanopartículas magnéticas EasySepMR (Stemcell Technologies) con uno de los anticuerpos mencionados anteriormente se agregan a la fracción con las células endoteliales del paso previo. Entonces se utiliza un imán para enriquecer o aislar las células endoteliales del resto del material y las células endoteliales se lavan con una solución acuosa. 4. Detección y cuantificación de mCECs o CEPs utilizando un inmunoensayo para uno o más antígenos de mCECs o CEPs circulantes En una modalidad preferida, las mCECs o CEPs aisladas y enriquecidas se someten a la lisis antes del ensayo y las perlas magnéticas previamente utilizadas se retiran magnéticamente. Para la lisis, se pueden utilizar reactivos de lisis de células comercialmente disponibles que incluyen, pero no están limitados a: Amortiguador de Lisis de Pierce [Reactivo de Extracción M-PER^ (Número del producto 78501 de Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL) ] y Amortiguador de lisis de Sigma [Sigma CelLytic-M^ (Número del producto de Sigma C 2978, Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, O 63103)]. Después de la lisis, los restos de células se retiran por medio de la centrifugación dejando el sobrenadante del lisado con los antígenos de mCEC o CEP a ser medidos . La detección de los antígenos específicos de mCEC o CEP entonces se puede realizar por medio del uso de un inmunoensayo de emparedado sumamente sensible utilizando anticuerpos los cuales se enlazan al antígeno que es sometido a ensayo. Se puede utilizar una variedad de anticuerpos para el inmunoensayo, que incluye preferiblemente por lo menos un anticuerpo policlonal y mucho más preferiblemente, que utiliza dos anticuerpos policlonales . En una modalidad preferida de la invención, un anticuerpo se une con biotina y el segundo anticuerpo contra ER se etiqueta con una molécula detectora. En una modalidad más preferida que utiliza la electroquimioluminiscencia (ECL) , la molécula detectora es rutenio. Existe abundante bibliografía en el dominio público que proporciona métodos ampliamente útiles para unir el rutenio a los anticuerpos (por ejemplo, Lee y colaboradores, Am J Trop Med Hyg 2001, 65:1-9). El sobrenadante lisado entonces se mezcla con los dos anticuerpos y se incuban brevemente seguido por la adición de las perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina en una solución que contiene tripropilamina . Con la aplicación de un potencial eléctrico y en presencia del antígeno objetivo (ER) , la etiqueta de rutenio se excita y se emite luz y ésta se detecta utilizando un instrumento detector de ECL (tal como el analizador ORIGEN" o un instrumento comercialmente disponible como M-Series 384MR de BIOVERIS Corporation, Gaithersburg, MD) . La señal de ECL es proporcional al número de mCECs o CEPs en la muestra de sangre original. En una modalidad preferida de la invención, el inmunoensayo utilizado de acuerdo con esta invención puede utilizar una de las siguientes combinaciones: 1. Dos conjuntos de anticuerpos policlonales contra el antígeno endotelial (la modalidad mucho más preferida) . 2. Un anticuerpo policlonal y un anticuerpo monoclonal contra el antígeno endotelial. 3. Dos anticuerpos monoclonales contra el antígeno endotelial.

En una modalidad preferida de la invención, el objetivo de antígeno utilizado para el enriquecimiento o aislamiento de las células endoteliales es diferente del objetivo de antígeno para el inmunoensayo de emparedado. Estos dos objetivos de antígenos forman un par de antígenos; los ejemplos de estos pares de antígenos incluyen: Tipo de Célula Número del par de Objetivo de antígeno para el Objetivo de antígeno para el Endotelial para Antígenos enriquecimiento o aislamiento inmunoensayo de el Ensayo utilizando perlas magnéticas emparedado con anticuerpos contra este antígeno MCECs 1 (preferido para vWF CD146 las mCECs) 2 CD146 vWF 3 CD31 CD146 4 CD31 vWF CEPs 1 (preferido para CD133 VEGFR-2 las CEPs) 2 VEGFR-2 CD133 3 CD34 CD133 4 CD34 VEGFR-2 5 VLA-4 (heterodímero de LFA-1 (heterodímero de CD49d/CD29) CD11a/CD18) 6 LFA-1 (heterodímero de VLA-4 (heterodímero de CD11a/CD18) CD49d/CD29) 7 CD11a CD146, VEGFR-2, CD133 8 CD11 b CD146, VEGFR-2, CD133 9 CD11c CD146, VEGFR-2, CD133 10 CD18 CD146, VEGFR-2, CD133 11 LFA-1 (heterodímero de CD146, VEGFR-2, CD133 CD11a/CD18) 12 VLA-4 (heterodímero de CD146, VEGFR-2, CD133 CD49d/CD29) 13 CD146, VEGFR-2, CD133 CD11a 14 CD146, VEGFR-2, CD133 CD11 b 15 CD146, VEGFR-2, CD133 CD11c 16 CD146, VEGFR-2, CD133 CD18 17 CD146, VEGFR-2, CD133 LFA-1 (heterodímero de CD11a/CD18) 18 CD146, VEGFR-2, CD133 VLA-4 (heterodímero de CD49d/CD29) 19 CD31 (PECAM) CD146, VEGFR-2, CD133 20 CD141 CD146, VEGFR-2, CD133 21 CD105 (Endoglina) CD146, VEGFR-2, CD133 22 CD144 (VE Caderina) CD146, VEGFR-2, CD133 23 tie2 (Receptor 1 de CD146, VEGFR-2, CD133 angiopoyetina ) 24 lectina de Ulex europaeus CD146, VEGFR-2, CD133 25 E-select¡na CD146, VEGFR-2, CD133 Por ejemplo, una modalidad preferida para detectar mCECs es utilizar perlas con anticuerpos contra vWF para el enriquecimiento o aislamiento seguido por un par de anticuerpos contra CD146 para la detección por medio del inmunoensayo de emparedado. Una modalidad preferida para detectar CEPs es utilizar perlas con anticuerpos contra CD133 para el enriquecimiento o aislamiento seguido por un par de anticuerpos contra VEGFR-2 para la detección por medio del inmunoensayo de emparedado. Otra modalidad preferida para detectar CEPs es utilizar perlas con anticuerpos contra CD34 para el enriquecimiento o aislamiento seguido por un par de anticuerpos contra VEGFR-2 para la detección por medio del inmunoensayo de emparedado . El inmunoensayo de esta invención es más rápido y tiene una sensibilidad significativamente mayor que cualquier inmunoensayo previamente desarrollado para un antígeno de células endoteliales . El inmunoensayo de esta invención es capaz de detectar un antígeno de 300 mCECs o CEPs circulantes por mililitro de sangre, más preferiblemente de 150 mCECs o CEPs circulantes por mililitro de sangre, más preferiblemente de 100 mCECs o CEPs circulantes por mililitro de sangre, más preferiblemente de 30 mCECs o CEPs circulantes por mililitro de sangre y mucho más preferiblemente de 10 mCECs o CEPs por mililitro de sangre. En una modalidad de esta invención, el ensayo es capaz de detectar el antígeno de 4 picogramos de proteína antigénica, más preferiblemente el ensayo es capaz de detectar el antígeno de 1 picogramo de proteína antigénica. En otra modalidad preferida, el inmunoensayo de esta invención consiste de un método para someter a ensayo células endoteliales en una muestra de sangre que comprende enriquecer las células endoteliales de la muestra de sangre seguido por realizar en las células endoteliales enriquecidas un inmunoensayo capaz de detectar el VEGFR2 expresado por las células endoteliales y en donde el inmunoensayo es capaz de detectar el VEGFR2 de 300 células endoteliales del cordón umbilical humano (HUVECs) , más preferiblemente de 150 HUVECs, más preferiblemente de 100 HUVECs, más preferiblemente de 30 HUVECs y mucho más preferiblemente de 10 HUVECs. En otra modalidad preferida, el inmunoensayo de esta invención consiste de un método para someter a ensayo células endoteliales en una muestra de sangre que comprende enriquecer las células endoteliales de la muestra de sangre seguido por realizar en las células endoteliales enriquecidas un inmunoensayo capaz de detectar el VEGFR2 expresado por las células endoteliales y en donde el inmunoensayo es capaz de detectar 4 pg de VEGFR2, más preferiblemente 1 pg de VEGFR2, más preferiblemente de 0.3 pg de VEGFR2 y mucho más preferiblemente de 0.1 pg de VEGFR2. En otra modalidad preferida, el inmunoensayo de esta invención consiste de un método para someter a ensayo un antígeno de células endoteliales en células endoteliales en una muestra de sangre que comprende enriquecer las células endoteliales de la muestra de sangre seguido por realizar en las células endoteliales enriquecidas un inmunoensayo capaz de detectar el antigeno expresado por las células endoteliales, en donde el inmunoensayo es capaz de detectar el antígeno de trescientas células endoteliales por mililitro de sangre, más preferiblemente de ciento cincuenta células endoteliales por mililitro de sangre, más preferiblemente de cien células endoteliales por mililitro de sangre, más preferiblemente de treinta células endoteliales por mililitro de sangre y mucho más preferiblemente de diez células endoteliales por mililitro de sangre . Además de la electroquimioluminiscencia, otros inmunoensayos que pueden producir una alta sensibilidad requerida para esta aplicación incluyen, pero no están limitados a: a) Quimioluminiscencia tal como aquella descrita por Liu Y y colaboradores, 2003 (J Food Protection 66 : 512-7) . b) Quimioluminiscencia fluorogénica (FCL, por sus siglas en inglés) descrita por Yu H y colaboradores, 2000 (Biosens Bioelectron 14:829- 40) . c) Inmunoensayo de polarización de fluorescencia (véase Howanitz JH, 1988 Arch Pathol Lab Med 112 : 775-9) . d) Inmunoensayo de fluorescencia con resolución temporal (Butcher H y colaboradores, 2003, J Immunol Methods 272:247-56; Soukka y colaboradores, 2001, Clin Chem 47:1269-78; Howanitz JH, 1988 Arch Pathol Lab Med 112:775-9) . Debido a su sensibilidad, el método de acuerdo con esta invención para identificar a pacientes en riesgo de una enfermedad incrementada (que incluye, pero no está limitada a: cáncer, anemia falciforme, vasculitis, hipertensión pulmonar, diabetes y enfermedad cardiovascular) y quienes es probable que se beneficien de mediciones profilácticas para prevenir esa enfermedad o el empeoramiento de la enfermedad. La invención será mejor entendida por referencia a los siguientes ejemplos, los cuales ilustran pero no limitan la invención descrita en este documento.

EJEMPLOS EJEMPLO 1. Un paciente entra en el consultorio y se recolecta una muestra de sangre en un tubo para impedir la coagulación. Las mCECs se aislan y entonces se someten a la lisis utilizando un amortiguador de lisis. Un anticuerpo etiquetado con rutenio contra un antigeno contra las mCECs y un anticuerpo biotinilado (también contra el antígeno de mCECs) se agrega junto con una solución de tripropilamina y perlas magnéticas con avidina unida. Se aplica una corriente eléctrica y la electroquimioluminiscencia (ECL) se detecta utilizando un dispositivo de detección de ECL tal como uno comercialmente disponible (BioVeris Corporation o Roche Diagnostics) . La señal es proporcional a la cantidad de mCECs por mililitro encontradas en la circulación. EJEMPLO 2. Los métodos como en el Ejemplo 1, en los cuales las mCECs se aislan o se enriquecen utilizando perlas magnéticas recubiertas con anticuerpos contra vWF. Estas células se someten a la lisis utilizando el Amortiguador de Lisis de Sigma [Sigma CelLytic-MMR (Número del Producto de Sigma C 2978, Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO 63103)] . La lisis de células se realiza conforme a la recomendación del fabricante con la adición de 5 minutos de remolineo vigoroso antes de la remoción de los restos de células. Los restos de células se retiran del lisado de células por medio de la centrifugación a 14,000 rpm durante 30 minutos en una Centrífuga EppendorfMR (Modelo 5415C) . Se utiliza un imán para agotar adicionalmente las partículas magnéticas. Los anticuerpos etiquetados con rutenio contra CD-146 y los anticuerpos biotinilados contra CD-146 se agregan al lisado y luego a las perlas de estrepavidina magnéticas y una solución que contiene tripropilamina. Se aplica una corriente eléctrica y se detecta la electroquimioluminiscencia (ECL) utilizando un dispositivo de detección de ECL tal como uno comercialmente disponible (BioVeris Corporation) . La señal es proporcional a la cantidad de mCECs y el número de mCECs se puede calcular al comparar esta señal con la señal de una muestra de control positivo. EJEMPLO 3. Los métodos como en el ejemplo 2, excepto que el número de CEPs se determina y las perlas magnéticas utilizadas para el aislamiento o enriquecimiento de CEPs se recubren con anticuerpos contra CD133 y no contra vWF y el inmunoensayo de ECL de emparedado utiliza anticuerpos contra VEGFR-2 y no contra CD-146. EJEMPLO 4. Se prepara un amortiguador de ensayo: Tween-20 al 0.5% y albúmina de suero bovino al 0.5% (BSA) en PBS (solución salina amortiguada con fosfato) . El anticuerpo contra la CD146 se obtiene primero en formas tanto biotiniladas como no biotiniladas . La biotinilación de los anticuerpos es bien conocida en el campo y se puede realizar en solución o en fase sólida (Strachan E y colaboradores, 2004, J Mol Recognit 17:268-76). El etiquetado con rutenio ("etiqueta de TAG" ) se realiza como sigue: • 1.5 µg/µl de etiqueta de rutenio (Ester de BV-TAG-NHS, # de Catálogo 110034; BioVeris Corporation, Gaithersburg, MD, EUA) se prepara en DMSO. • Para 500 µ? de anticuerpo, se agregan 18.8 µ? de BV-TAG- NHS y para 200 µ? de anticuerpo policlonal, se agregan 3.8 µ? de BV-TAG-NHS. En cada caso, la solución se incuba durante una hora y la reacción se detiene por la adición de 20 µ? de glicina 2M. • El éster de BV-TAG-NHS no acoplado en cada mezcla de reacción se retira utilizando una columna de filtración de gel PD-10, equilibrada previamente con PBS (que incluye azida de sodio al 0.08%), la cual también se utiliza para la elusión. Para cada anticuerpo etiquetado, la concentración de proteínas en cada fracción se determina por medio del ensayo de proteínas y las fracciones con alto contenido de proteína se utilizan en los ejemplos subsecuentes. El anticuerpo etiquetado con rutenio contra CD146 y el anticuerpo biotinilado contra CD146 son referidos en lo sucesivo en este ejemplo como "TAG-pAb" y "Biotina-pAb" .

Las células endoteliales [células endoteliales del cordón umbilical humano (HUVEC, número de catálogo CC-2517) de Cambrex Corporation, East Rutheford, NJ 07073] se desarrollan en placas de cultivo de tejido de 6 pocilios conforme a las condiciones recomendadas del fabricante, se lavan dos veces con PBS y una alícuota se cuenta utilizando un hemacitómetro . Estas células se someten a la lisis utilizando el Amortiguador de Lisis de Sigma [Sigma CelLytic-M"11 (Número de producto de Sigma C2978, Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, O 63103)] . La lisis de células se realiza conforme a la recomendación del fabricante con la adición de 5 minutos de remolineo vigoroso antes de la remoción de los restos de células. Los restos de células se retiran del lisado de células por medio de la centrifugación a 14,000 rpm durante 30 minutos en una Centrífuga Eppendorf" (Modelo 5 15C) . Un ensayo de electroquimioluminiscencia se realiza de la siguiente manera: • Secuencialmente, a cada pocilio, se agregan los sobrenadantes del lisado de células (la cantidad del lisado por pocilio es diferente de aquella extraída de 30 a 100 células endoteliales; los pocilios de control sin el extracto también se utilizan) y entonces 50 µ?/pocillo de una mezcla de TAG-Ab y Biotina-Ab (por ejemplo, en una concentración entre 0.5 a 2 µg/ml de cada uno; diluida en el amortiguador de ensayo de PBS) se agregan a los pocilios de una placa de polipropileno de fondo en forma de U de 96 pocilios y se incuban a temperatura ambiente con agitación constante (por ejemplo, durante 2 horas) . • 10 g de perlas magnéticas de estreptavidina (por ejemplo, Estreptavidina Dynabeads M-280MR, # de Catálogo 110028, BioVeris, Corporation, Gaithersburg, MD) en 25 µ? se agregan a cada pocilio y se incuban con agitación constante (por ejemplo durante 30 minutos) . • El amortiguador de ensayo de PBS se agrega a cada pocilio para hacer un volumen final de 250 µ? por pocilio. Todas las condiciones se someten a prueba en pocilios por lo menos duplicados. La placa de 96 pocilios entonces se analiza por la electroquimioluminiscencia utilizando el Analizador M8 M-Series" (Número de Catálogo 310800, BioVeris, Corporation, Gaithersburg, MD) . Utilizando este inmunoensayo, la señal de ECL es proporcional al número de células HUVEC y la CD146 es detectable y está arriba de la línea de referencia de por lo menos 100 células HUVEC por pocilio. EJEMPLO 5. En este ejemplo, se examinó la sensibilidad para detectar el VEGFR2 recombinante utilizando un inmunoensayo de emparedado que utiliza la electroquimioluminiscencia . Se preparó un amortiguador de ensayo de PBS: • Amortiguador de Ensayo: Tween-20 al 0.5% y albúmina de suero bovino al 0.5% (BSA) en PBS (solución salina amortiguada con fosfato, pH 7.2) Se preparó un diluyente estándar: • Diluyente Estándar: albúmina de suero bovino al 1% (BSA) en PBS (solución salina amortiguada con fosfato, pH 7.2) El anticuerpo policlonal anti-VEGFR2 se obtuvo primero en formas tanto biotiniladas (BAF357 de R&D Systems) como no biotiniladas (AF357 de R&D systems) . El anticuerpo policlonal no biotinilado se etiqueta con rutenio ("etiquetado con TAG" ) de acuerdo con los métodos de Lorence & Lu (documento PCT WO 2006/041959 A2) . El anticuerpo policlonal etiquetado con rutenio y el anticuerpo policlonal biotinilado son referidos en lo sucesivo en este ejemplo como "TAG-pAb" y "Biotina-pAb" . La proteína VEGFR2 recombinante se obtuvo en la forma de la proteína VEGFR2 -Fe (una proteína quimérica que consiste del dominio extracelular fusionado a la región Fe de la IgG humana por vía de un grupo conector; R&D systems, • de Catálogo 357-KD) . Un ensayo de electroquimioluminiscencia se realizó de la siguiente manera: · Los estándares se diluyeron en 1 mi de PBS (pH 7.2 con BSA al 0.1% y azida de sodio al 0.05%) para formar una solución madre de 50 µ9/t??_. Los estándares se diluyeron en el Diluyente Estándar para producir 1600, 160, 16 y 4 pg/pocillo cuando se utilizaron 25 µL por pocilio. A cada pocilio de una placa de polipropileno de fondo en forma de U de 96 pocilios (con 25 µ?? de estándar por pocilio) se agregaron 50 µ?/pocillo de una mezcla de TAG-Ab y Biotina-Ab (por ejemplo, en una concentración de 1.0 µg/ml en los 50 µ? antes de la adición) y la solución resultante se incubó a temperatura ambiente con agitación constante (durante 2 horas) . 10 µg de perlas magnéticas de estreptavidina (por ejemplo, Estreptavidina Dynabeads M-280MR, # de Catálogo 110028, BioVeris Corporation, Gaithersburg, MD) en 25 µ? se agregaron a cada pocilio y se incubaron con agitación constante (durante 30 minutos) . Amortiguador de Ensayo de PBS se agregó a cada pocilio para hacer un volumen final de 250 µ? por pocilio. Todas las condiciones se sometieron a prueba en pocilios por lo menos duplicados. La placa de 96 pocilios entonces se analizó por la electroquimioluminiscencia utilizando el Analizador M-Series 384^ (BioVeris Corporation, Gaithersburg, MD) . Utilizando este inmunoensayo, tan solo 4 pg por pocilio de estándar de VEGFR2 fueron detectables con una señal arriba del fondo (Tabla 1) .

Tabla 1. Detección por electroquimioluminiscencia (ECL) del VEGFR2 recombinante por medio del inmunoensayo que utiliza el anticuerpo policlonal etiquetado con rutenio (TAG-pAb) y el anticuerpo policlonal biotinilado (Biotina-pAb) .

* Señal de ECL promedio arriba de la señal promedio de los pocilios de control sin antígeno.

EJEMPLO 6. En este ejemplo, la especificidad para un inmunoensayo de ECL contra el VEGFR2 para el detectar VEGFR2 de células endoteliales contra células no endoteliales se determinó junto con una determinación de repetición de la sensibilidad para detectar el EGFR recombinante. Los métodos fueron como aquel utilizado en el ejemplo 5 con (1) la prueba de cantidades más bajas del estándar de VEGFR2; y (2) el análisis adicional de extractos celulares de las células HUVEC (células de control positivo para la expresión del VEGFR2) y las células de leucemia humana K562 (control negativo para VEGFR2) . Las HUVECs [Número de catálogo CC-2517) de Cambrex Corporation, East Rutheford, NJ 07073] se desarrollaron en un cultivo de tejido conforme a las condiciones recomendadas por el fabricante (y no incluyó el VEGF) , se lavaron dos veces con PBS y una alícuota se contó utilizando un hemacitómetro . Las células K562 (de ATCC, Manassas, VA) se desarrollaron en placas de cultivo de tejido conforme a las condiciones recomendadas por ATCC, se lavaron dos veces con PBS y una alícuota se contó utilizando un hemacitómetro. La lisis de las células HUVEC y K562 y la obtención del sobrenadante se realizaron utilizando el Amortiguador de RIPA de Pierce [# de Catálogo 89900, Pierce Biotechnology, Rockford, IL] con el inhibidor de proteasa de Pierce [# de Catálogo 78410; Pierce Biotechnology] conforme a las condiciones recomendadas por el fabricante. La cantidad de sobrenadante del lisado por pocilio era diferente de aquella extraída de 300, 625, 2500 y 10,000 células y se analizó por el VEGFR2 utilizando el inmunoensayo descrito en el Ejemplo 5. Utilizando el estándar de VEGFR2 , tan solo 1 pg por pocilio de estándar de EGFR fue detectable con una señal arriba del fondo (Tabla 2) .

Tabla 2. Detección por electroquimioluminiscencia (ECL) del VEGFR2 recombinante por medio del inmunoensayo que utiliza el anticuerpo policlonal etiquetado con rutenio (TAG-pAb) y el anticuerpo policlonal biotilinado (Biotina-pAb) .

* Señal de ECL promedio arriba de la señal promedio de los pocilios de control sin antígeno.

Utilizando los lisados de células, los resultados de este experimento se presentan en las Figuras 1 y 2. La Figura 1 muestra gráficamente el extremo inferior del conjunto de datos para observar mejor la capacidad de este ensayo para detectar el VEGFR2 de bajos números de células.

La Figura 1 solo incluye datos para el intervalo de células de hasta 2500 células por pocilio. La Figura 2 muestra gráficamente el conjunto de datos completo (hasta 10,000 células por pocilio) . El VEGFR2 fue detectable y estaba arriba de la línea de referencia de los lisados de células HUVEC en este experimento incluyendo aquellos pocilios que utilizaban la cantidad más baja del lisado de HUVEC en este experimento (lisado de 300 células agregadas por pocilio; Figura 1) . Además, el lisado de las células HUVEC (control positivo de células endoteliales para la expresión de VEGFR2) proporcionó una señal mucho más alta en el inmunoensayo para VEGFR2 que el lisado de las células K562 (control negativo para la expresión de VEGFR2) arriba del intervalo completo sometido a prueba de 300 a 10,000 células por pocilio y todos los lisados de las células K562 fueron negativos indicando la alta sensibilidad y especificidad de los resultados para la detección de VEGFR2 (Figuras 1 & 2) . EJEMPLO 7. En este ejemplo se examinó adicionalmente la sensibilidad para un inmunoensayo de ECL contra VEGFR2 para detectar el VEGFR2 de células endoteliales HUVEC. Los métodos fueron como aquel utilizado en el ejemplo 6 con la prueba de cantidades más bajas de los extractos de células HUVEC (células de control positivo para la expresión de VEGFR2) . Utilizando los lisados de las células endoteliales HUVEC, los lisados de tan solo 150 HUVECs por pocilio fueron detectables con una señal arriba del fondo (Tabla 3) .

Tabla 3. Detección por electroquimioluminiscencia (ECL) del VEGFR2 de lisados de HUVEC por medio del inmunoensayo que utiliza el anticuerpo policlonal etiquetado con rutenio (TAG-pAb) y el anticuerpo policlonal biotinilado (Biotina-pAb) .

* Señal de ECL promedio arriba de la señal promedio de los pocilios de control sin antígeno.

EJEMPLO 8. En este ejemplo, las señales de ECL de un inmunoensayo contra el VEGFR2 se determinaron para los números pequeños de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMCs) . Se utilizaron los métodos para someter a prueba lisados de células como en el Ejemplo 6 excepto que se utilizaron los lisados de PBMCs humanas. Las PBMCs humanas se obtuvieron de Cellular Technology Ltd. ; Cleveland, Ohio; # de producto CTL-UP1) . Los lisados de 156, 313, 625, 1250 y 1500 PMBCs se sometieron a prueba en el inmunoensayo de ECL por el VEGFR2 como se describe en el Ejemplo 7. La Figura 3 muestra los resultados y para propósitos de comparación- los datos del Ejemplo 6 utilizando HUVECs se incluyen en esta gráfica. Para el intervalo completo de PBMCs sometidas a prueba, la señal fue baja o a niveles del fondo. Estos resultados fueron consistentes con el hecho de que no se esperaría que las células endoteliales se encontrarían en la cantidad máxima de PBMCs sometidas a prueba (2500) . Como se indica en la sección de Antecedentes, las CEPs y mCECs representan una fracción muy pequeña de células mononucleares en la sangre con un cálculo de entre 0.01% y 0.0001% (Khan SS y colaboradores, 2004) . Los resultados de este experimento demuestran que si existen números pequeños de PBMCs contaminantes en una población enriquecida de células endoteliales, estas PBMCs contaminantes no originarían una señal que impediría la determinación de los antígenos de células endoteliales de esa población de células endoteliales enriquecidas. EJEMPLO 9. En este ejemplo, se determinó la efectividad del enriquecimiento. En este ejemplo, la capacidad para detectar el VEGFR2 de células después del enriquecimiento de una muestra de células hematopoyéticas por las células CD34+ se sometió a prueba dos veces utilizando perlas inmunomagnéticas . Como se observara previamente, las EPCs expresan tanto la CD34+ como el VEGFR2. Por lo tanto, se esperaría el enriquecimiento por CD34+ reforzara las células con la expresión de VEGFR2. Un Equipo de Aislamiento Directo de Células Progenitoras CD34 (ahora llamado Equipo de MicroPerlas CD34) se obtuvo de Miltenyi Biotec Inc. (Auburn, CA) y se utilizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Este equipo contiene MicroPerlas las cuales se conjugan al anticuerpo anti-CD34 humana de ratón monoclonal, QBEND/10. Como células de partida para el aislamiento de CD34, los cultivos de sangre de cordón umbilical humano (de Cambrex (East Rutherford, NJ, # de Catálogo 2C-101A) se utilizaron y se desarrollaron en el medio Libre de Suero StemSpan" (Stem Cell Technologies; www.stemcell.com) con los siguientes factores de crecimiento, todos de PeproTech (Rocky Hill, NJ) : factor de crecimiento endotelial vascular humano (VEGF; 50 ng/ml; número de catálogo 100-20) , trombopoyetina humana (20 ng/ml; número de catálogo 300-18) ; interleucina-6 humana (20 ng/ml; número de catálogo 200-06) , ligando de tirosina cinasa 3 relacionado con Fms humano (Flt-3; 100 ng/ml; número de catálogo 300-19) y factor de célula madre humano (SCF; 100 ng/ml número de catálogo 300-07) . No se determinó el efecto sobre el nivel de expresión de VEGFR2 por célula del cultivo de células en presencia del ligando (VEGF) para este receptor. Los Usados (realizados como en el Ejemplo 6 utilizando RIPA o con la adición del uso del Reactivo de Extracción de Proteínas de Mamífero M-PER de Pierce, número de catálogo de Pierce 78501) de hasta 250,000 células de dos cultivos de esta sangre de cordón umbilical humano se analizaron por la expresión de VEGFR2 utilizando el inmunoensayo de ECL descrito en el Ejemplo 5. Los resultados de este experimento se muestran en las Figuras 4-6. Las Figuras 4-6 indican que el enriquecimiento utilizando perlas inmunomagnéticas contra el antígeno de CD34 fue notablemente exitoso en el enriquecimiento para que las células expresen el marcador de células endoteliales VEGFR2. Esto fue cierto sin tener en cuenta el método para hacer los lisados de células, aunque se obtuvieron señales más altas utilizando el amortiguador de RIPA (comparar la Figura 4 con el amortiguador de lisis M-PER contra la Figura 5 que utiliza RIPA) al utilizar el mismo conjunto exacto de células para la extracción.

Claims (16)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para someter a ensayo células endoteliales en una muestra de sangre, caracterizado porque comprende enriquecer las células endoteliales de la muestra de sangre seguido por realizar en las células endoteliales enriquecidas un inmunoensayo capaz de detectar un antígeno expresado por las células endoteliales; en donde el inmunoensayo tiene una sensibilidad definida por ser capaz de detectar el antígeno de trescientas células endoteliales por mililitro de sangre o por ser capaz de detectar el antígeno de ciento sesenta picogramos de proteína antigénica; y en donde el inmunoensayo genera una señal que es proporcional al número de células endoteliales presentes en la muestra de sangre .
2. 2. Un método para someter a ensayo un antígeno de células endoteliales en células endoteliales en una muestra de sangre, caracterizado porque comprende enriquecer las células endoteliales de la muestra de sangre seguido por realizar en las células endoteliales enriquecidas un inmunoensayo capaz de detectar el antígeno expresado por las células endoteliales; en donde el inmunoensayo tiene una sensibilidad definida por ser capaz de detectar el antígeno de trescientas células endoteliales por mililitro de sangre o por ser capaz de detectar el antígeno de ciento sesenta picogramos de proteína antigénica; y en donde el inmunoensayo genera una señal que es proporcional a la cantidad del antígeno en las células endoteliales .
3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el inmunoensayo es capaz de detectar el antígeno de ciento cincuenta células endoteliales por mililitro de sangre.
4. 4. El método de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el inmunoensayo es capaz de detectar el antígeno de treinta células endoteliales por mililitro de sangre.
5. 5. El método de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el inmunoensayo es capaz de detectar el antígeno de cuatro picogramos de proteína antigénica.
6. 6. El método de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el inmunoensayo es capaz de detectar el antígeno de un picogramo de proteína antigénica.
7. 7. El método de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque las células endoteliales se seleccionan del grupo que consiste de células endoteliales circulantes maduras y células progenitoras endoteliales circulantes.
8. 8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque las células endoteliales son células endoteliales circulantes maduras y el antígeno se selecciona del grupo que consiste de CD146 y vWF.
9. 9. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque las células endoteliales son células progenitoras endoteliales circulantes y el antígeno se selecciona del grupo que consiste de VEGFR-2 y CD133.
10. 10. El método de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el inmunoensayo utiliza la electroquimioluminiscencia para la detección.
11. 11. El método de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el inmunoensayo utiliza una técnica seleccionada de quimioluminiscencia, quimioluminiscencia fluorogénica, polarización de fluorescencia y fluorescencia con resolución temporal para la detección.
12. 12. El método de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el inmunoensayo se realiza en las células endoteliales intactas y utiliza un anticuerpo que se enlaza selectivamente al dominio extracelular del antígeno.
13. 13. El método de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque comprende además someter a lisis las células endoteliales enriquecidas antes del inmunoensayo y en donde el inmunoensayo se realiza en el lisado de células.
14. 14. El método de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el inmunoensayo utiliza un anticuerpo policlonal contra el antígeno.
15. 15. El método de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el inmunoensayo utiliza un anticuerpo monoclonal contra el antígeno.
16. 16. El método de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque las células endoteliales se enriquecen al poner en contacto la sangre con perlas inmunomagnéticas capaces de enlazarse selectivamente a las células endoteliales.