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Die Erfindung betrifft ein Verfahren
zur immunzytologischen Bestimmung apoptotischer Endothelzellen und/oder
endothelialer Vorläuferzellen
in Proben wie z.B. aus peripherem Blut, mittels z.B. Durchflußzytometrie
oder mittels eines Festphase-Immuntests, als diagnostisches Instrument
bei Patienten, bei denen eine kardiovaskuläre Erkrankung entweder manifest
ist oder die ein Risiko für
deren Entwicklung tragen, und als ein Instrument, mit dem die Prävention
und das therapeutische Management einer derartigen Erkrankung verbessert
wird.
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Die Diagnose einer kardiovaskulären Erkrankung
wird häufig
durch die symptomatische Manifestation atherosklerotischer Läsionen,
sogenannter Plaques, veranlaßt,
die durch einen akuten arteriellen Verschluß zum Ausdruck kommt. Derartige
Ereignisse, einschließlich
Myokardinfarkt und Schlaganfall, treten auf, wenn ein vorher bestehender
atherosklerotische Plaque destabilisiert und abgetragen wird oder
sogar abreißt.
Zum Zeitpunkt der Manifestation dieser Erkrankung sind zumeist frühere, stabile
Stadien einer Atherosklerose jahrelang vorausgegangen, die nicht
unbedingt zu subjektiven Beschwerden oder klinisch auffälligen Symptomen geführt haben
müssen.
Etablierte Verfahren, Patienten mit beginnenden oder progredienten
vaskulären
Abnormitäten,
die ein Risiko für
die Entwicklung instabiler Plaques tragen, zu identifizieren, schließen die
Dokumentation von Veränderungen
des Belastsungs-EKG
und Ultraschalluntersuchungen der peripheren Arterien ein. Diese
Untersuchungen allerdings weisen nur größere Plaques nach, die zu einer
signifikanten Stenose und Beeinträchtigung des Blutflusses führen, und
im allgemeinen erst unter körperlicher
Belastung zu klinischen Symptomen führen.
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Als Schlüsselereignis bei der Auslösung von
Atherosklerose wird allgemein eine Schädigung von Endothelzellen (Endothelial
Cells, EC) betrachtet (Ross R. N. Engl. J. Med. 1999; 340: 115–126). Die
Erneuerungsrate von EC ist in jenen Bereichen der Gefäße erhöht, die
für eine
spätere
Entwicklung atherosklerotischer Läsionen besonders anfällig sind
(Caplan B.A., Schwartz C.J. Atherosclerosis. 1973; 17: 401–417). Dies legt
nahe, daß vor
Entwicklung der Läsionen
zahlreich ECs absterben. Der programmierte Zelltod (Apoptose) kann
daher als eines der wichtigsten möglichen pathobiologischen Ereignisse
eingestuft werden, die dafür
verantwortlich sind. Tatsächlich
induzieren pro-atherogene Stimuli, zu denen traditionelle kardiovaskuläre Risikofaktoren
wie oxidativer Streß,
verursacht durch Rauchen oder Dysproteinämie, gehören, die Apoptose von EC in
vitro. Die Scherkräfte,
welche die laminare Strömung
des Blutes verursacht, wirken dagegen deutlich protektiv auf das Überleben
von EC, indem die pro-apoptotische Aktivierung durch atherogene
Stimuli vollständig unterdrückt wird
(Gimbrone M.A., Nagel T., Topper J.N. J. Clin. Invest. 1997; 99:
1809–1813;
Dimmeler S., Haendeler J., Rippmann V., Nehls M., Zeiher A.M. FEBS
Lett. 1996; 399: 71–74).
Darüber
hinaus sind jene Bereiche der Gefäße, die der laminaren besonders
Strömung
ausgesetzt sind, nicht nur durch eine sehr niedrige Erneuerungsrate
der EC charakterisiert (Davies P.F., Remuzzi A., Gordon E.J., Dewey
C.F. Jr., Gimbrone M.A. Jr. T Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986;
83: 2114–2117),
diese entwickeln auch eher selten atherosklerotische Läsionen (Caplan
B.A., Schwartz C.J. Atherosclerosis. 1973; 17: 401–417). Solche
Befunde stärken
das Konzept eines potentiellen Beitrags der EC-Apoptose zur Entwicklung
von Atherosklerose.
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Neben histopathologischen Untersuchungen
wurde in der Vergangenheit auch mittels immunolgischer Experimenten
versucht, Spuren einer Endothelschädigung festzustellen. Schon
früh wurde
von der signifikanten Zunahme einer Endothelämie bei Patienten mit Myokardinfarkt
und schwerer, über
mehrere Tage andauernder Angina berichtet (Hladovec J., Prerovsky
I., Stanek V., Fabian J. Klin. Wochenschr. 1978; 56: 1033–1036).
Mit der Entwicklung eines neuen Zytofluoreszenztests, bei dem an
einen monoklonalen Antikörper
(S-Endo-1) gekoppelte immunomagnetische Beads verwendet wurden,
wobei der Antikörper
gegen kultivierte Endothelzellen der menschlichen Umbilikalvene
(Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVEC) gerichtet (George
F., Poncelet P., Laurant J.C., Massot O., Arnoux D., Lequeux N.,
Ambrosi P., Chicheportiche C., Sampol J. J. Immunol. Methods. 1991;
139: 65–75),
konnten sowohl bei Patienten mit Mittelmeer-Fieber (Drancourt M.,
George F., Brouqui P., Sampol J., Raoult D. J. Infect Dis. 1992;
166: 660–663)
als auch bei Patienten mit einer Infektion durch das Cytomegalievirus
(CMV) (Grefte A., van der Giessen M., van Son W., The TH. J. Infect
Dis. 1993; 167: 270–277)
flottierende EC in der Zirkulation nachgewiesen werden. Unter Verwendung
eines adaptierten immunzytologischen Verfahrens, das auf einem Antikörper beruht,
der gegen ein im wesentlichen identisches natives Epitop (Klon P1
H12) gerichtet ist, wurde die Konzentration an zirkulierenden EC
in normalen gesunden Erwachsenen mit 2,6 ± 1,6/ml peripheres Blut bestimmt
(Solovey A., Lin Y., Browne P., Choong S., Wayner E., Hebbel R.P.
N. Engl. J. Med.; 1997: 337: 1584–1590). Messungen von Mikropartikeln,
deren Abstoßen
durch EC ein Parameter für
deren Apoptose sein könnte,
gefolgt von einer Färbung
von EC-Markern, zeigten bei Patienten mit akutem Herzsyndrom (Acute
Cardiac Syndrome) vermehrte Mikropartikel endothelialen Ursprungs
(Mallat Z., Hugel B., Ohan J., Leseche G., Freyssinet J.M., Tedgui
A. Circulation. 1999; 99: 348–353).
Auch wurde gezeigt, daß bei
Patienten, die einen Myokardinfarkt erlitten hatten, vermehrt Mikropartikel
auftraten. Obwohl der Nachweis von Mikropartikeln, die auch nach
einer pro-inflammatorischen Aktivierung des Endothels freigesetzt
werden können,
eine Diskriminierung zwischen entzündlicher Aktivierung und Apoptose
der EC nicht erlaubt, wurde eine Abhängigkeit von der Aktivität der Erkrankung
demonstriert (Mallat Z., Benamer H., Hugel B., Benessiano J., Steg
P.G., Freyssinet J.M., Tedgui A. Circulation. 2000; 101: 841–843).
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Frühere Ansätze, Patienten mit einem Risiko
zur Entwicklung instabiler atherosklerotischer Läsionen zu identifizieren, beruhten
auf biophysikalischen Funktionsbestimmungen des Gefäßendothels
durch Messungen am Unterarm oder Messungen des koronaren Blutflusses,
wobei sich gezeigt hat, daß diese
Ergebnisse mit dem späteren
Auftreten kardiovaskulärer
Ereignisse tatsächlich
korrelieren. Diese Methodik erfordert jedoch eine arterielle Katheterisierung,
was ihren Einsatz für
die Beurteilung eines zukünftigen
kardiovaskulären Risikos
bei einer asymptomatischen Population stark einschränkt. Als
nicht-invasive Alternative wurde eine Prognose durch verschiedene
biochemische Marker in Proben von peripherem Blut vorgeschlagen,
da ein Anstieg der Plasma-Konzentrationen dieser Faktoren in der
systemischen Zirkulation mit der Aktivierung und funktionellen Beeinträchtigung
des Endotheliums einhergeht. Da allerdings pro-inflammatorische
Prozesse den Hauptmechanismus darstellen, der einer endothelialen
Aktivierung und der Progression einer kardiovaskulären Störung zugrunde
liegt, weisen die Pathogenese der Atherosklerose ebenso wie die
der systemischen Herzinsuffizienz Eigenschaften auf, die sie mit
entzündlichen
Erscheinungen anderer Erkrankungen teilen. Dazu gehören insbesondere
die Zunahme pro-inflammatorischer Zytokine und anderer Plasmaproteine.
Als Folge davon fehlt allen gegenwärtig verfügbaren, im Plasma nachweisbaren
Indikatoren einer vaskulären
Aktivierung die diagnosische Spezifität und sie sind deshalb auch
nur von beschränktem
klinischem Nutzen für die
Stratifizierung eines kardiovaskulären Risikos.
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Jüngste
Strategien sind deshalb darauf gerichtet, beschädigte EC, die von atherosklerotischen Plaques
abgestoßen
werden, als aussichtsreichen Marker einer vaskulären Vulnerabilität zu messen.
Mit Hilfe magnetischer Beads zur selektiven Isolierung zirkulierender
Endothelzellen wurde in Proben von peripherem Blut von Patienten,
die unter koronaren Herzerkrankungen verschiedener Stadien litten,
gezeigt, daß eine
Zunahme der Anzahl dieser Zellen in der Zirkulation mit dem Vorhandensein
akuter koronarer Symptome im Zusammenhang stand (Dignat-George et
al.). Aus methodischen Gründen
allerdings konnten diese Autoren nur eine sehr kleine Anzahl an
Endothelzellen, die in der Zirkulation flottieren, nachweisen, und
es gelang ihnen nicht, Anzeichen eines apoptotischen Zelltods dieser
Zellen zu charakterisieren.
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In letzter Zeit hat die Entwicklung
der Multicolor-Durchflußzytometrie
die notwendigen Voraussetzungen für eine genauere Analyse von
im peripheren Blut zirkulierenden Zellen geschaffen. Durch diese
Technologie wurde die Anzahl zirkulierender EC in gesunden menschlichen
Probanden mit 9,1/μl
bestimmt. Rund 15% davon wiesen Anzeichen einer EC-Aktivierung auf,
d.h. lieferten ein positives Ergebnis bei immunzytochemischer Färbung von
CD105 und CD106 (Mancuso P., Burlini A., Pruneri G., Goldhirsch
A., Martinelli G., Bertolini F. Blood. 2001; 97: 3658–3661).
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Jüngste
Befunde liefern erste Hinweise, daß sich die Apoptose von EC
auch in vivo ereignen könnte (Rössig L.,
Dimmeler S., Zeiher A.M. Basic Res. Cardiol. 2001; 96: 11–22). In
einer Tierstudie wurde gezeigt, daß eine verstärkte Apoptose
von EC in den Aorten und Femurarterien gealterter Affen mit einer
Dysfunktion des Gefäßendothels
einherging (Asai K., Kudej R.K., Shen Y.T., Yang G.P., Takagi G.,
Kudej A.B., Geng Y.J., Sato N., Nazareno J.B., Vatner D.E., Natividad
F., Bishop S.P., Vatner S.F. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2000;
20: 1493–1499).
Eine derartige endotheliale Dysfunktion stellt ein allgemein anerkanntes
Merkmal dar, das bereits während
früher
Stadien einer Atherosklerose auf deren spätere Manifestation hinweist.
Als bisher deutlichstes Anzeichen für das Auftreten von EC-Apoptose
in vivo zeigte die histopathologische Analyse atherosklerotischer
Plaques in der menschlichen Karotis eine EC-Apoptose im downstream
gelegenen Teil der Plaques (Tricot O., Mallat Z., Heymes C., Belmin
J., Leseche G., Tedgui A. Circulation. 2000; 101: 2450–2453).
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Interessant sind auch jüngere Einblicke
in die Pathomorphologie atherosklerotischer Plaques, die mit akuten
koronaren Syndromen oder plötzlichem
koronarem Tod im Zusammenhang stehen. Sie liefern einen soliden
Beweis dafür,
daß in
erheblichem Ausmaß auch
Plaque-Erosion zusätzlich zu
einem kompletten Abreißen
der Plaques zum Auslösen
des dramatischen Ereignisses beitragen (Virmani R., Kologdie F.D.,
Burke A.P., Farb A., Schwartz S.M. Arterioscler. Thromb Vasc. Biol.
2000; 20: 1262–1275).
Eine Plaque-Erosion ist durch das Fehlen von Endothel charakterisiert,
wobei nur eine geringe Entzündung
der exponierten Intima auftritt (Farb A., Burke A.P., Tang A.L.,
Liang T.Y., Mannan P., Smialek J., Virmani R. Circulation. 1996;
93: 1354–1363).
Bedeutsam ist, daß eine
Plaque-Erosion für
ungefähr
40% der Fälle
von Thrombose-induziertem plötzlichen
Tod verantwortlich ist (Farb A., Burke A.P., Tang A.L., Liang T.Y.,
Mannan P., Smialek J., Virmani R. Circulation. 1996; 93: 1354-1363). Darüber hinaus
sind Plaque-Erosionen bei Diabetikern oder prä-menopausalen Frauen durchaus üblich, und
sie treten auch bei Personen mit erhöhtem CRP (C-reaktives Protein)-Serumspiegel vermehrt
auf (Burke A.P., Tracy R.P., Kolodgie F., Malcom G.T., Zieske A.,
Kutys R., Pestaner J., Smialek J., Virmani R. Circulation. 2002;
105: 2019–2023).
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Neuere Befunde haben gezeigt, daß die Plaque-Instabilität und damit
deren Potential, ein lebensbedrohendes kardiovaskuläres Ereignis
auszulösen,
nicht vom Ausmaß der
Plaques abhängt.
Statt dessen sind instabile Plaques, die besonders dazu neigen,
abzureißen
oder zu erodieren, durch eine Destabilisierung der Plaque-Struktur
charakterisiert. Die klinischen Bilder einer akuten Transformation
der vaskulären
Läsionen
gehen mit einer vermehrten EC-Apotose
einher, was einen Marker für
die Plaque-Instabilität
darstellt. Eine proinilammatorische Aktivierung und gesteigerte
Apoptose des Endothel ist bei dem nichtatherosklerotisch bedingten
Herzversagen ebenfalls verbreitet. Eine Quantifizierung der Apoptose
mittels der Analyse von Endothelzellen, die in die Zirkulation abgestoßen werden
(Shedding), könnte
das Ausmaß der
Erkrankung feststellen, bevor die klinische Manifestation einsetzt.
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Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden
Erfindung, ein Verfahren zu entwickeln, mit dem das Risiko, ein
kardiovaskulär
nachteiliges Ereignis, das mit unkontrollierten Veränderungen
der Endothelfunktion in Zusammenhang steht, zu erleiden, mit Hilfe
eines individuellen Risikoprofils abgeschätzt werden kann. Dies soll
durch die quantitative und kritische Bestimmung von abgestoßenen, flottierenden
und zikulierenden Endothelzellen und/oder endothelialen Vorläuferzellen
erfolgen, die einen Indikator für
das geschädigte
Endothel darstellen. Aufgrund des Risiokoprofils können dann
geeignete Gegenmaßnahmen
durch den behandelnden Arzt durchgeführt werden, um den Patienten
positiv zu beeinflussen und das nachteilige Ereignis zu verhindern oder
zumindest in seiner Schwere für
den betroffenen Patienten zu vermindern.
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Diese Aufgabe der vorliegenden Erfindung
wird durch ein Verfahren zur Identifizierung und/oder Quantifizierung
von mit kardiovaskulären
Erkrankungen in Zusammenhang stehenden endothelialen Zellen in einer Probe
gelöst.
Das erfindungsgemäße Verfahren
umfaßt
die Schritte von: (a) Gewinnung einer zu untersuchenden, endotheliale
Zellen erhaltenden Probe; (b) Inkubation der Probe mit einem oder
mehreren Molekülen,
die spezifisch an eines oder mehrere der folgende Markermoleküle der endothelialen
Zellen binden: i) Endothelzell-Marker
und/oder Apotptose-Marker; oder ii) Endothelzell-Marker und/oder
Marker endothelialer Vorläuferzellen;
(c) Identifizierung und/oder Quantifizierung der endothelialen Zellen
auf Basis der gebundenen Moleküle
unter der Verwendung immunzytologischer Methoden; und (d) Vergleich
des für
die zu untersuchende Probe erhaltenen Ergebnisses mit dem Ergebnis
einer Referenzprobe.
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Die Ergebnisse der im Rahmen der
Erfindung durchgeführten
Untersuchungen zeigen, daß Patienten mit
koronarer Arterienerkrankung (Coronary Artery Disease, CAD) signifikant
erhöhte
Konzentrationen an zirkulierenden apoptotischen EC aufweisen. Diese
erhöhten
Werte sind streng mit der Aktivität der Erkrankung assoziiert,
denn die höchsten
Konzentrationen wurden bei Patienten mit ACS beobachtet. Dementsprechend könnte die
Anzahl an zirkulierenden apoptotischen EC den Verlauf einer subklinischen
Plaque-Erosion widerspiegeln. In den Untersuchungen im Rahmen der
Erfindung wurden tatsächlich
gesteigerte Konzentrationen an apoptotischen Endothelzellen in ähnlichen
Patientengruppen beobachtet, für
die ein verstärktes
Auftreten von Plaque-Erosionen berichtet wurde.
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Bei Patienten mit Myokardinfarkt
werden endotheliale Vorläuferzellen
aus dem Knochenmark mobilisiert (Shintani S., Murohara T., Ikeda
H., Ueno T., Honma T., Katoh A., Sasaki K., Shimada T., Oike Y.,
Imaizumi T. Circulation. 2001; 103: 2776–2779). Da neuere experimentelle
Untersuchungen zeigen, daß endotheliale Vorläuferzellen
zu einer Regenerierung der entkleideten arteriellen Abschnitte beitragen
können
(Walter D.H., Rittig K., Bahlmann F., Kirchmair R., Silver M. Murayama
R., Nishimura H., Losordo D.W., Asahara T., Isner J.M. Circulation.
2002; im Druck), besteht die Möglichkeit,
daß der
Pool an zirkulierenden endothelialen Vorläuferzellen eine endogene regenerative
Kraft nach endothelialer Verletzung darstellen könnte. Tatsächlich waren die Konzentrationen
an endothelialen Vorläuferzellen
bei Patienten mit ACS im Vergleich zu Patienten mit stabiler CAD
etwa 2,3fach erhöht.
Allerdings gehen gesteigerte Konzentrationen an apoptotischen EC
mit signifikant verminderten Konzentrationen an zirkulierenden endothelialen
Vorläuferzellen
einher. Diese Ergebnisse können
derart interpretiert werden, daß eine
Gefäßverletzung
zu einem Homing der endothelialen Vorläuferzellen führen könnte, wodurch
der Gesamt-Pool an zirkulierenden EC reduziert wird. Andererseits
könnte die
in Patienten mit CAD beobachtete Reduktion zirkulierender endothelialer
Vorläuferzellen
(Vasa M., Fichtlscherer S., Aicher A., Adler K., Urbich C., Martin
H., Zeiher A.M., Dimmeler S. Circ. Res. 2001; 89: E1-7), die von
einer verstärkten
EC-Apoptose begleitet wird, die Regeneration des Endothels durch
Vorläuferzellen
begrenzen und dadurch die funktionelle Integrität des Endothel-Monolayers zusätzlich beeinträchtigen.
Weitere experimentelle Untersuchungen in Tiermodellen sind erforderlich,
um diese komplexen Prozesse zu verstehen.
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Bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren,
wobei die endothelialen Zellen aus einem Säugetier, insbesondere aus dem
Menschen, stammen. Weiter bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren,
wobei die zu analysierenden, bzw. identifizierten und/oder quantifizierten
endothelialen Zellen ausgewählt
sind aus der Gruppe bestehend aus apoptotischen Endothelzellen,
endothelialen Vorläuferzellen
und reifen Endothelzellen.
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Gemäß einem weiteren Aspekt des
erfindungsgemäßen Verfahrens
kann die zu analysierende Probe jede Probe sein, die endotheliale
Zellen enthält.
Die Probe kann vorbehandelt sein, wobei peripheren Blut z.B. ein
Gerinnungshemmer, insbesondere Heparin, zugesetzt wird, es kann
weiterhin eine Lyse der Erythrozyten zwischen Schritt (a) und (b)
durchgeführt
werden oder die Probe kann direkt verwendet werden. Bevorzugt ist ein
erfindungsgemäßes Verfahren,
bei dem die zu untersuchende Probe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend
aus peripherem Blut, Zellkultur-Suspensionen und Suspensionen, die
von einer Gefäßwand mechanisch, chemisch
und/oder enzymatisch abgelöste
Zellen enthalten. Solche enzymatische Ablösung kann z.B. durch Collagenase
erhalten werden. Besonders bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren,
wobei die zu untersuchende Probe peripheres Blut ist.
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Ein wesentlicher Aspekt des erfindungsgemäßen Verfahren
ist die Inkubation der Probe mit einem oder mehreren Molekülen, die
spezifisch an eines oder mehrere der Markermoleküle der endothelialen Zellen binden.
Diese Moleküle
können
aus einer sehr großen
Vielzahl von für
endotheliale Zellen spezifischen Molekülen ausgewählt sein. Bevorzugt ist, daß die an
einen Marker bindenden Moleküle
ausgewählt
sind aus der Gruppe bestehend aus Antikörpern oder Teilen oder Fragmenten
davon und Rezeptorliganden oder Teilen davon. Insbesondere als Rezeptorliganden
kommen eine sehr große
Zahl von Peptiden, Proteinen und kleine ren Molekülen in Frage, wie etwa Hormone
oder ähnliches.
Diese spezifisch gebundenen Moleküle werden dann als Basis für die weitere
Analyse, Identifizierung und/oder Quantifizierung der endothelialen
Zellen verwendet. Besonders bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren,
wobei die Antikörper,
Teile oder Fragmente davon polyklonale Antikörpern, monoklonale Antikörpern, Fab-Fragmente,
Single Chain-Antikörper
und Diabodies umfassen.
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Gemäß eines weiteren Aspekts des
Verfahrens der vorliegenden Erfindung können Komponenten des Verfahrens
an eine feste Phase gebunden vorliegen, somit können die an einen Marker bindenden
Moleküle in
Lösung
oder Matrix-immobilisiert vorliegen. Als Matrices können eine
Vielzahl von dem Fachmann bekannten Materialien verwendet werden,
wie zum Beispiel Harz-Matrices und/oder herkömmliche Säulenmatrices. Besonders bevorzugt
ist weiterhin ein erfindungsgemäßes Verfahren,
bei dem die an einen Marker bindenden Moleküle an eines oder mehrere Detektionsmoleküle aus der
Gruppe bestehend aus Fluoresceinthioisocyanat, Phycoerythrin, Enzymen
(zum Beispiel Meerrettich-Peroxidase) und magnetisches Bead gekoppelt
sind.
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Gemäß einem weiteren Aspekt des
erfindungsgemäßen Verfahrens
können
die an einen Marker bindenden Moleküle mit einem Antikörper, an
den eine oder mehrere Detektionsmoleküle gekoppelt sind, nachgewiesen
werden. Es handelt sich somit um einen indirekten Nachweis der Bindung
des Moleküls
an den jeweiligen endothelialen Zellmarker. Solche zweistufigen
Nachweise sind dem Fachmann zum Beispiel aus der anti-Antikörper-Nachweistechnik
bestens bekannt.
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Ein wesentlicher Aspekt des erfindungsgemäßen Verfahren
sind die Endothelzell-Marker selber, an die die oben genannten Moleküle binden.
Diese Marker können
aus allen für
endotheliale Zellen spezifischen Markern ausgewählt sein. Bevorzugt ist, daß der Endothelzell-Marker ausgewählt ist
aus der Gruppe bestehend aus CD146, von Willebrandt-Faktor (vWF)
und Vasular Endothelial Growth Factor-Rezeptor 1 (VEGF-Rezeptor-1);
der Apoptose-Marker
ausgewählt
ist aus der Gruppe bestehend aus Annexin V und PD-ECGF, und die
Marker endothelialer Vorläuferzellen
ausgewählt
sind aus der Gruppe bestehend aus CD133 und CD 34. Dies sind aber
nur Beispiele für
Marker, von denen aus der Fachmann leicht weitere bestimmen und
anwenden kann.
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Gemäß einem weiteren Aspekt des
erfindungsgemäßen Verfahrens
kann weiterhin mindestens ein weiterer nicht-endotheliale Zellen
kennzeichnender Marker nachgewiesen werden, wie z.B. CD45. Dies
dient zu einer negativen Abgrenzung der zu identifizierenden und/oder
quantifizierenden endothelialen Zellen von anderen in der Probe
enthaltenen Zellen.
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Gemäß einem weiteren Aspekt des
Verfahrens gemäß der vorliegenden
Erfindung können
zur Identifizierung und/oder Quantifizierung der endothelialen Zellen
immunzytologischen Verfahren angewandt werden. Dabei sind alle Verfahren
geeignet, die eine spezifische Bestimmung anhand der Marker/Molekül-Interaktion
erlauben. Bevorzugt sind Verfahren, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend
aus Durchflußzytometrie
und Festphase-Immuntests. Dabei können auch sogenannte „Cell-Sorter" verwendet werden.
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Die ermittelten Daten der Untersuchungen)
der endothelialen Zellen aus der Probe werden üblicherweise mit einer Referenzprobe
verglichen. Welche Probe als Refernzprobe dienen kann, wird insbesondere von
der An der untersuchten Probe und der Krankengeschichte des Individuums,
aus dem die zu untersuchende Probe stammt, abhängen. Bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren,
bei dem die Referenzprobe aus einem oder dem Mittelwert mehrerer
Säugetiere
stammt, in dem/in denen eine kardiovaskuläre Erkrankung ausgeschlossen
wurde. Dies muß aber
nicht zwangsläufig
so sein, wenn z.B. das Fortschreiten einer Erkrankung bestimmt werden
soll, kann auch eine „alte" Probe desselben
Patienten als Referenzprobe verwendet werden. Dem Fachmann ist offensichtlich,
welche Proben als Referenzprobe für das erfindungsgemäße Verfahren
geeignet sind.
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Für
eine Bewertung der ermittelten Ergebnisse des erfindungsgemäßen Verfahrens
kann so z.B. das Ergebnis für
apoptotische Endothelzellen mit dem Ergebnis für die Gesamtheit an Endothelzellen
in Beziehung gebracht werden, und/oder das Ergebnis für apoptotische
Endothelzellen mit dem Ergebnis für endotheliale Zellen in Beziehung
gebracht werden.
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Gemäß einem weiteren Aspekt des
Verfahrens gemäß der vorliegenden
Erfindung können
die zu diagnostizierenden und/oder prognostizierenden und/oder deren
Therapie zu überwachenden
kardiovaskulären Erkrankungen
ausgewählt
sein aus der Gruppe bestehend aus stabiler und instabiler Angina,
Myokardinfarkt, aktuem Herzsyndrom, koronarer Arterienerkrankung
und Herzinsuffizienz. Es soll jedoch nicht ausgeschlossen weren,
daß sich
das erfindungsge mäße Verfahren
noch für
weitere kardiologische Erkrankungszustände eignet und anwenden läßt.
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Die Erfindung stellt bevorzugt ein
durchflußzytometrisches
Verfahren zur Bestimmung abgestoßener, zirkulierender EC im
peripheren Blut zur Verfügung.
Es wird ein sensitives und hochspezifisches neues Verfahren verfügbar gemacht,
mit dem beschädigtes
Endothel, das einer Plaque-Entwicklung vorausgeht, detektiert werden
kann und der Übergang
vom stabilen zum instabilen atherosklerotischen Phänotyp quantifiziert werden
kann. Das Verfahren ermöglicht
nicht nur eine höhere
Sensitivität
im Vergleich zu früheren
Verfahren, sondern bietet auch die Möglichkeit, die Zellen im Hinblick
auf ihr Überleben
und ihren Differenzierungsgrad und ihren Ursprung innerhalb des
Gefäßsystems
weiter zu charakterisieren. Ein derartiges detailliertes Profil von
Anzahl und Eigenschaften apoptotischer, zirkulierender EC liefert
Informationen über
den Zustand des Endothels, das allen gegenwärtig verfügbaren Markern überlegen
ist. Das Verfahren der Durchflußzytometrie kann
auch an die Verwendung als Festphase-Immuntest (Solid-State Immunosorbant
Assay) adaptiert werden, wodurch eine vereinfachte, praktische Anwendung
des gleichen Prinzips verfügbar
gemacht wird.
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Ein weiterer Aspekt der vorliegenden
Erfindung betrifft einen diagnostischen Kit, wobei der Kit Mittel zur
Durchführung
des erfindungsgemäßen Verfahrens,
unter Umständen
zusammen mit weiteren Komponenten und/oder Hilfsstoffen umfaßt. Solche
Mittel sind bevorzugterweise mindestens ein Antikörper zum
Nachweis mindestens eines endothelialen Markers und Mittel zur anschließenden Identifizierung
und/oder Quantifizierung der endothelialen Zellen. Der Kit kann
außerdem
andere Komponenten und/oder Enzyme zur Durchführung der Verfahren der vorliegenden
Erfindung, z.B. Gebrauchsanweisungen zur Interpretation der Ergebnisse
des Tests im Hinblick auf das Risikoprofil des Patienten und entsprechende
Gegenmaßnahmen
und Therapievorschläge
enthalten.
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Zusammengefaßt zeigen die Ergebnisse der
der Erfindung zugrundeliegenden Studie, daß Patienten mit ACS (akuter
Myokardinfarkt und instabile Angina) eine dreifache Zunahme an zirkulierenden
apoptotischen EC aufweisen. Hypercholesterinämie, Diabetes und erhöhte CRP-Serumspiegel
korrelierten signifikant mit gesteigerten Konzentrationen an apoptotischen
EC. Die EC-Apoptose wurde durch eine vierwöchige Behandlung der Patienten
mit HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren
signifikant reduziert. Insgesamt legen diese Daten nahe, daß eine Messung
von zirkulierenden apoptotischen EC ein bisher nicht zugängliches
Verfahren für die Überwachung
der Aktivität
atherosklerotischer Erkrankungen beim Menschen verfügbar macht.
Damit ist sowohl eine Beurteilung des kardiovaskulären Risikos
als auch die primäre
Diagnose einer atherosklerotischen Gefäßerkrankung, verbunden mit
der prognostischen Stratifizierung von Patienten mit manifester
kardiovaskulärer
Erkrankung, einschließlich
koronarer, peripherer und cerebraler Arterienerkrankung und progressivem
kongestivem Herzversagen möglich.
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Ein weiterer Aspekt der vorliegenden
Erfindung betrifft somit die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens
zur Diagnose und/oder Prognose kardiovaskulärer Erkrankungen und/oder zur Überwachung
von deren Therapie. Dies geschieht durch die quantitative und kritische
Bestimmung von abgestoßenen,
flottierenden und zikulierenden Endothelzellen und/oder endothelialen
Vorläuferzellen,
die einen Indikator für
das geschädigte
Endothel darstellen. Aufgrund des daraufhin erstellbaren Risiokoprofils
können
dann geeignete Gegenmaßnahmen
durch den behandelnden Arzt durchgeführt werden, um den Patienten
positiv zu beeinflussen und das nachteilige Ereignis zu verhindern
oder zumindest in seiner Schwere für den betroffenen Patienten
zu vermindern. Eine solche Therapie kann erfindungsgemäß die Verabreichung
von Lipidsenkern, ausgewählt aus
der Gruppe bestehend aus Statinen, insbesondere Atorvastatin umfassen.
Dem Fachmann sind jedoch weitere mögliche Therapien bekannt, um
kardiovaskuläre
Erkrankungen zu therapieren, die nach herkömmlichen Schemata erfolgen
können.
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Weiterhin klären die Ergebnisse der im Rahmen
der Erfindung durchgeführten
Untersuchung erstmals die Auswirkung klassischer Risikofaktoren
für CAD
auf die EC-Apotose. Eine Schlüsselrolle
von Lipiden – insbesondere
oxidierter Lipide – als
Auslöser
für die
EC-Apoptose ist
durch verschiedene Zellkulturexperimente in vitro nahegelegt worden
(Dimmeler, S., Haendeler J, Galle J., Zeiher A.M. Circulation. 1997;
95: 1760–1763; Harada-Shiba
M., Kinoshita M., Kamido H., Shimokado K. J. Biol. Chem. 1998; 273:
9681–6987).
Auch die Ergebnisse der vorliegenden Studie zeigen, daß die LDL-Serumkonzentrationen
signifikant mit einer gesteigerten EC-Apoptose bei Patienten mit
CAD korrellieren. Wichtig ist, daß eine Behandlung mit dem Lipidsenker Atorvastatin,
einem HMG-CoA-Reduktase-Inhibitor, die EC-Apoptose innerhalb einer
vierwöchigen
Behandlungsdauer hochgradig reduziert. Weiterhin ging auch eine
Diabetes-Erkrankung mit gesteigerter EC-Apoptose einher. Dies könnte mit
Ergebnissen aus in vitro-Studien erklärt werden, die zeigen, daß hohe Glukosekonzentrationen
die EC-Apoptose induzieren (Baumgartner-Parzer S.M., Wagner L.,
Pettermann M., Grillari J., Gessl A., Waldhausl W. Diabetes. 1995;
44: 1323–1327;
Ho F.M., Liu S.H., Liau C.S., Huang P.J., Lin-Shiau S.Y. Circulation.
2000; 101: 2618–2624).
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Darüber hinaus sind Patienten mit
Diabetes durch vermehrten oxidativen Stress, einem der wirksamsten
Auslöser
von EC-Apoptose in vitro, charakterisiert (Rössig L., Dimmeler S., Zeiher
A.M. Basic. Res. Cardiol. 2001; 96: 11-22). Schließlich weisen
auch die hier vorgelegten Befunde auf einen signifikanten Zusammenhang
zwischen einer niedrig-gradigen Entzündung und EC-Apoptose hin,
insbesondere durch den Befund, daß der Serumspiegel des C-reaktiven Proteins
(CRP), eines etablierten Entzündungsmarkers,
signifikant mit EC-Apoptose
einherging, und zwar nicht nur bei Patienten mit CAD, sondern auch
bei gesunden Kontrollpersonen. Ergebnisse aus Zellkulturexperimenten
haben gezeigt, daß Entzündungsmediatoren
eine EC-Apoptose wirksam stimulieren (Robaye B., Mosselmans R.,
Fiers W., Dumont J.E., Galand P. Am. J. Pathol. 1991; 138: 447–453). Andererseits
erwiesen sich CRP-Serumkonzentrationen
als zuverlässige
Vorhersagefaktoren für
die Progression einer atherosklerotischen Erkrankung, die von klassischen
CAD-Risikofaktoren unabhängig
ist (Blake G.J., Ridker P.M. Circ. Res. 2001; 89: 763–771). Insgesamt
stärkte
der signifikante Zusammenhang zwischen apoptotischen EC und CAD-Risikofaktoren
weiter das Konzept, daß die
Anzahl von zirkulierenden apoptotischen EC tatsächlich mit der Aktivität einer
atherosklerotischen Erkrankung im Zusammenhang stehen.
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Die Erfindung soll nun im folgenden
anhand der Beispiele unter Bezugnahme auf die beigefügten Figuren
näher beschrieben
werden, ohne jedoch darauf beschränkt zu werden. In den Figuren
zeigt:
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1:
Durchflußzytometrie-Messung
zirkulierender EC.
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Zirkulierende Zellen aus peripherem
Blut wurden nach Lyse der Erythrozyten analysiert. Oben links: In
der Darstellung der Vorwärts/Seitwärts-Streuung
(Forward Scatter, FSC/Sideward Scatter, SSC) wurden Plättchen und
Debris für
die weitere Analyse ausgeblendet (Region R2). Oben rechts: anti-CD45-perCP-Färbung (Kanal
FL-3, oben, vs. Isotyp-Kontrolle,
unten) um zirkulierende Zellen, die keine Leukozyten sind, für die weitere
Analyse zu identifizieren (Region R1, blau). Links unten: CD45-Zellen
wurden zur Quantifizierung von CD146- (FITC-konjungiert, Kanal FL-1)
und vWF- (gefärbt
mit einem PE-markierten sekundären
Antikörper, Kanal
FL-2) doppelt positiven Zellen eingegrenzt (gelbe Markierung). Unten
rechts: Falsch-positive Signale nach Färbung mit Isotyp-Kontrollantikörpern wurden
von den Originaldaten subtrahiert und die resultierende EC-Zahl
wurde unter Bezug auf die Zahl der weißen Blutzellen (White Blood
Cells, WBC) normalisiert.
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2:
Anzahl zirkulierender apoptotischer EC (A) und relatives Verhältnis bezogen
auf die insgesamt zirkulierenden EC (B) bei gesunden, altersgemäßen Kontrollpersonen
(n = 41), Patienten mit stabiler Angina (SA; n = 29) und Patienten
mit ACS (UA, Unstable Angina und MI, Myokardinfarkt; n = 27).
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3:
Wirkung einer prospektiven Behandlung mit Atorvastatin (20 mg/Tag,
4 Wochen) bei n = 8 Patienten mit SA auf die Anzahl der zirkulierenden
apoptotischen EC (A) und auf den Anteil der apoptotischen EC an
insgesamt zirkulierenden EC (B).
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4:
Verhältnis
zwischen zirkulierenden apoptotischen EC und AC133+/KDR+ endothelialen Vorläuferzellen bei Patienten mit
CAD.
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Beispiele
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Material und Methoden
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1. Patienten
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Insgesamt wurden 56 Patienten untersucht.
29 Patienten litten seit drei Monaten unter stabiler Angina (SA),
definiert als angiographisch dokumentierte koronare Arterienerkrankung
und Stabilität
der Angina unter Belastung, bevor die Blutproben gewonnen wurden.
27 Patienten mit instabiler Angina (unstable angina, UA), definiert
als Angina pectoris de novo, Angina pectoris crescendo oder Angina
pectoris unter Ruhebedingungen (14 Patienten) bzw. bei denen innerhalb
der letzten 7 Tage ACS (Troponin T-positiv ohne Hebung der ST-Strecke)
oder ein akuter Myokardinfarkt (MI), verbunden mit einer ST-Hebung,
aufgetreten war (13 Patienten), wurden untersucht. Ausschlußkriterien
waren klinische oder biochemische Anzeichen einer begleitenden entzündlichen
Erkrankung, chronische Niereninsuffizienz oder eine maligne Erkrankung.
Bei allen Patienten wurde eine koronare Arterienerkrankung nachgewiesen,
wobei die auslösende
Läsion
durch Koronarangiographie identifiziert wurde. Die klinischen Charakteristika
dieser Patienten sind in Tabelle 1 unten zusammengefaßt. 41 gesunde
Personen, bei denen sich aus ihrer Anamnese oder aufgrund einer
körperlichen
Untersuchung kein Hinweis auf CAD ergeben hatte und die hinsichtlich
ihres Alters den Patienten entsprachen, dienten als Kontrollgruppe.
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Zusätzlich wurden 8 Patienten mit
stabiler Angina prospektiv mit Atorvastatin (20 mg/Tag, vier Wochen)
behandelt. Die klinischen Charakteristika dieser Patienten sind
in Tabelle 2 unten zusammengefaßt.
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Alle Patienten und Kontrollpersonen
hatten schriftlich ihr Einverständnis
erklärt.
Die Studie wurde durch die Ethikkommission der Johann Wolfgang von
Goethe-Universität,
Frankfurt/Main, genehmigt.
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Bei allen Patienten wurde zum Zeitpunkt
der Untersuchung auch Serum zur Bestimmung der Konzentrationen von
CRP und hsCRP (turbidimetrischer Test, Boehringer Mannheim bzw.
Ultrasensitive N Latex CRP Monotest, Behring) sowie der Serumlipid-Fraktionen
(Boehringer Mannheim) gesammelt.
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2. Durchflußzytometrie
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Die Erythrozytenlyse in 10 ml peripherem
venösem
Heparinblut wurde mit Hilfe einer kommerziell verfügbaren Lyse-Lösung (Becton
Dickinson, BD) durchgeführt.
Dann wurden die zirkulierenden EC unter Verwendung eines geeignet
modifizierten Protokolls nach dem Verfahren von Mancuso et al. und
Monestiroli et al. (Mancuso P., Burlini A., Pruneri G., Goldhirsch
A., Martinelli G., Bertolini F. Blood. 2001; 97: 3658–3661; Monestiroli
S., Mancuso P., Burlini A., Pruneri G., Dell'Agnola C., Gobbi A., Martinelli G.,
Bertolini F. Cancer Res. 2001; 61: 4341-4344) mittels 4-Kanal-FACS
(Fluorescence Activated Cell Sorting)-Analyse untersucht (1). Zunächst wurde in der Darstellung
der Seitwärts/Vorwärts-Streuung
ein regionales Fenster definiert, um Plättchen und Debris aus den weiteren
Analysen auszuschließen.
Unter den verbleibenden Zellen wurde die Anzahl der CD45+-Signale, identifiziert mit einem direkt
perCP-konjugierten monoklonalen Antikörper gegen menschliches CD45
(BD), quantifiziert, um jede gemessene Zellpopulation im Hinblick
auf die Gesamtzahl der Leukozyten im Verhältnis zur WBC-Zahl zu normalisieren.
Um reife EC spezifisch nachzuweisen, wurden nur CD45–-Zellen
weiter analysiert, und zwar durch Doppelfärbung mit Antikörpern gegen
die EC-spezifischen Epitope CD146 (Mel-CAM, MUC18, S-Endo-1; Shih
I.M. J. Pathol. 1999; 189: 4-11) (monoklonaler Maus-Antikörper, direkt
FITC-konjugiert; Chemicon) und gegen von Willebrandt-Faktor (vWF)
(Kaninchen, Oncogene), gefolgt durch einen PE-konjugierten anti-Kaninchen sekundären Antikörper. Alternativ
wurde menschlicher KDR mit einem anti-KDR-Antikörper der Maus (Sigma), gefolgt
durch einen PE-konjugierten anti-Maus
sekundären
Antikörper
zusätzlich
zu vWF nachgewiesen. CD45–/CD146+/vWF+ oder CD45–/KDR+/vWF+-Zellen wurden
als reife EC definiert. Diese Zellpopulationen wurden auf Annexin
V-Bindung mittels Inkubation mit primären Annexin V-APC-Konjugaten
(Bender Medical Systems) untersucht (van Engeland M., Nieland L.J.,
Ramaekers F.C., Schutte B., Reutelingsperger C.P. Cytometry. 1998;
31: 1–9).
Isotyp-identische Antikörper
dienten als Kontrollen (IgGI-PE und IgG2α-FITC, BD), und die Annexin-Bindung
wurde durch Inkubation mit Streptavidin-gekoppelten APC oder mit
Isotyp-spezifischen APC überprüft. Eine
Färbung
nach Inkubation mit Isotyp-Kontrollantikörpern wurde als falsch-positiv
beurteilt und von den Originaldaten abgezogen (1, unten rechts). Jede Analyse beinhaltet
100.000 Signale.
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Der Nachweis endothelialer Vorläuferzellen
wurde in einer Teilgruppe der Patienten durchgeführt, wie bereits früher beschrieben
(Vasa M., Fichtlscherer S., Aicher A., Adler K., Urbich C., Martin
H., Zeiher A.M., Dimmeler S. Circ. Res. 2001; 89: E1-7). 100 μl peripheres
Blut wurden mit FITC- oder perCP-konjugierten monoklonalen Antikörper gegen
menschliches CD34 (BD) inkubiert. Als ein Set an sekundären Markern,
die unreifere Vorläuferzellen
erkennen, wurden Blutproben mit monoklonalen Antikörpern gegen
menschliches CD133 (Milteny; PE-konjugiert) und gegen menschliches
KDR (Sigma), gefolgt durch einen FITC-konjugierten sekundären Antikörper, immungefärbt. Isotyp-identische
Antikörper
dienten als Kontrollen (BD). Nach der Inkubation wurden die Zellen
lysiert, mit PBS gewaschen und in 4% Paraformaldehyd fixiert, bevor
60.000 Signale analysiert wurden.
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3. Statistik
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Die Daten werden angegeben als Mittelwert ± SEM.
Kontinuierliche Variablen wurden auf Normalverteilung mit dem Kolmogorov-Smirnov-Test
getestet. Eine statistische Analyse wurde mittels T-Test für den Vergleich
zweier behandelter Gruppen (Varianzanalyse: Levene-Test) und für mehrere
Gruppen durch die einseitige ANOVA-Analyse, gefolgt durch post hoc-Analyse
mit LSD-Korrektur, durchgeführt.
Kategorische Variablen wurden mit Hilfe des Fischer's-Exakt-Test verglichen.
Eine lineare Regressionsanalyse und nicht-parametrische zweidimensionale
Korrelationen (Spearman Rank Correlation Coefficient [rs]) wurden
verwendet, um die Anzahl zirkulierender apoptotischer EC mit verschiedenen
kardiovaskulären
Risikofaktoren (Cardio Vascular Risk Factors, CVRF) zu korrelieren.
Statistische Signifikanz wurde angenommen, wenn die Null-Hypothese
bei p = 0,05 verworfen werden konnte. Alle statistischen Analysen
wurden mit Hilfe von SPSS für
Windows 9,0 (SPSS, Inc.) durchgeführt.
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Beispiel 1
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Um die Anzahl von zirkulierenden
apoptotischen EC zu bestimmen, wurden FACS-Analysen bei Patienten
mit stabiler Angina (SA, n = 29), instabiler Angina (UA, n = 14)
oder Myokardinfarkt (MI, n = 13) durchgeführt und mit 41, hinsichtlich
Alter und Geschlecht entsprechenden, gesunden Kontrollpersonen verglichen. Zirkulierende
apoptotische EC wurden definiert als Zellen, bei denen ein Nachweis
der endothelialen Markerproteine CD146 und vWF positiv war und Annexin
V-Bindung stattfand. Außerdem
wurden ausschließlich CD45–-Zellen in die Analyse
mit aufgenommen, um potentiell kontaminierende Leukozyten auszuschließen. Eine
repräsentative
Analyse wird in 1 gezeigt.
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Patienten in akuten Stadien von CAD,
definiert als ACS (instabile Angina und Myokardinfarkt, n = 27), zeigten
im Vergleich zu den gesunden Kontrollpersonen oder zu Patienten
mit stabiler CAD signifikant höhere Konzentrationen
an zirkulierenden apoptotischen EC ( 2A).
Außerdem
waren die Konzentrationen an apoptotischen EC in Patienten mit stabiler
CAD zweifach höher
als in gesunden Kontrollen (2A).
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Frühere Studien hatten bereits
gezeigt, daß die
Gesamtzahl an zirkulierenden EC bei ACS erhöht ist (Hladovec J., Prerovsky
I., Stanek V., Fabian J. Klin. Wochenschr. 1978; 56: 1033-1036; Mutin M., Canavy
I., Blann A., Bory M., Shampol J., Dignat-George F. Blood. 1999;
93: 2951–2958).
Deshalb wurde zusätzlich
das Verhältnis
an apoptotischen EC zur Gesamtzahl an zirkulierenden Zellen quantifiziert,
um auszuschließen,
daß der
Anstieg der insgesamt zirkulierenden EC die Anzahl an apoptotischen
EC fälschlicherweise
erhöht.
Allerdings war der Anteil apoptotischen EC an der EC-Gesamtzahl
auch bei Patienten mit instabiler Angina und Myokardinfarkt signifikant
erhöht
(2B).
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Der Anstieg von apoptotischen EC
in Patienten mit ACS konnte ebenfalls nachgewiesesn werden, wenn
ein anderes Set an endothelialen Markern, nämlich einem Rezeptor für Gefäßendothel-Wachstumsfaktor (Vascular
Endothelial Growth Factor, VEGF), VEGF-Rezeptor-1 (KDR), und vWF, für eine Doppelfärbung verwendet
wurde. Obwohl die Gesamtzahl an apoptotischen EC niedriger war,
wenn KDR und vWF als EC-Marker verwendet wurden, zeigten auch hier
Patienten mit instabiler Angina und Myokradinfarkt signifikant höhere Konzentrationen
an zirkulierenden apoptotischen EC im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen
(UA/MI: 0,78 ± 0,20/μl vs. Kontrolle:
0,37 ± 0,05/μl; p < 0,005). Dementsprechend
wiesen Patienten mit CAD nicht nur hochgradig gesteigerte Konzentrationen
an zirkulieren den apoptotischen EC auf, die Anzahl an zirkulierenden
apoptotischen EC korrelierte auch mit der Aktivität der Erkrankung,
was der signifikante Anstieg bei Patienten mit ACS belegt.
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Beispiel 2
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Weiterhin wurde der Einfluß von Risikofaktoren
für eine
Atherogenese, nämlich
Alter, Geschlecht, Bluthochdruck, Diabetes, Rauchen, eine hinsichtlich
CAD positive Familiengeschichte sowie Hypercholesterinämie, auf
zirkulierende apoptotische EC untersucht. Von diesen allgemein etablierten
kardiovaskulären
Risikofaktoren korrelierte eine gleichzeitige, nachgewiesene Erkrankung
an Diabetes mellitus signifikant mit einer gesteigerten Anzahl an
zirkulierenden apoptotischen EC (Tabelle 3 unten). Darüber hinaus
waren erhöhte
Konzentrationen an Serumlipid (LDL-Cholesterin) mit einer gesteigerten
EC-Apoptose assoziiert, wohingegen ein hohes HDL/LDL-Verhältnis im
umgekehrten Zusammenhang mit der Konzentration an apoptotischen
EC stand (Tabelle 3). Interessant ist, daß eine klinische Manifestation
einer koronaren Arterienerkrankung (Kontrollen vs. stabile Angina
vs. ACS) hochgradig mit einer Zunahme an zirkulierenden apoptotischen
EC einherging (Tabelle 3). Ähnliche
Ergebnisse wurden erhalten, wenn das Verhältnis von apoptotischen EC
zur EC-Gesamtzahl mit den oben beschriebenen Faktoren korreliert
wurde (nicht dargestellt). Tabelle
3:
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Neuere Studien haben Marker einer
niedrig-gradigen Entzündung
wie C-reaktives Protein (CRP) oder Serumamyloid A als wichtige prognostische
Parameter für
die Progression einer atherosklerotischen Erkrankung sowohl bei
gesunden Probanden als auch bei Patienten mit nachgewiesener CAD
etabliert (Blake G.J., Ridker P.M. Circ. Res. 2001; 89: 763–771). Deshalb
wurde der Einfluß des
CRP-Spiegels auf die Apoptose von EC untersucht. Die CRP-Konzentrationen im
Serum korrelierten signifikant mit einer gesteigerten EC-Apoptose
(Tabelle 2). Von Interesse ist auch, daß die CRP-Konzentrationen,
gemessen mit einem hochempfindlichen Test, sogar bei den gesunden
Kontrollpersonen eine hochgradig signifikante Korrelation mit dem
Auftreten apoptotischer EC zeigten (r = 0,495; p < 0,007).
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Beispiel 3
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Eine Therapie mit Statinen ist sowohl
zur primären
als auch sekundären
Prävention
einer koronaren Erkrankung etabliert, um kardiovaskuläre Ereignisse
zu reduzieren, was darauf hinweist, daß Statine die Aktivität einer
atherosklerotischen Erkrankung reduzieren (Maron D.J., Fazio S.,
Linton M.F. Circulation, 2000, 101, S. 207–213). Deshalb wurde prospektiv
untersucht, ob eine kurzzeitige Behandlung mit Atorvastatin (20 mg/Tag,
vier Wochen) die EC-Apoptose
in Patienten mit stabiler CAD reduziert. 3 zeigt, daß die Behandlung mit Atorvastatin
sowohl die Anzahl an zirkulierenden apoptotischen EC als auch deren
Anteil an der Gesamtzahl zirkulierender EC signifikant herabsetzt.
Die Statin-Therapie reduzierte auch die LDL-Cholesterin-Konzentration
signifikant (p < 0,02).
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Beispiel 4
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Untersucht wurde weiterhin, ob eine
gesteigerte Apoptose von CD45– reifen EC mit erhöhten Konzentrationen
an endothelialen Vorläuferzellen
im peripheren Blut im Zusammenhang könnte. Zirkulierende endotheliale
Vorläuferzellen
wurden auf das endotheliale Markerprotein KDR und den EC-Vorläufer-Marker
AC133 durch immunzytochemische Färbung
wie zuvor beschrieben untersucht und analysiert (Vasa M., Fichtlscherer S.,
Aicher A., Adler K., Urbich C., Martin H., Zeiher A.M., Dimmeler
S. Circ. Res. 2001; 89: E1-7). Es zeigte sich, daß erhöhte Konzentrationen
an apoptotischen Endothelzellen signifikant mit einem Anstieg an AC133+/KDR+ Zellen einherging
(4). Eine ähnliche
Korrelation wurde beobachtet, wenn die endothelialen Vorläuferzellen
als CD34+/KDR+-Zellen
definiert wurden (nicht gezeigt).
