CN112852821B - 一种cd81的适配体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域,具体的说涉及一种CD81的适配体及其应用,所述CD81的适配体,具有(a)序列1所示核苷酸序列,或者(b)序列1所示核苷酸序列经一个或多个碱基缺失或替换后的序列。本发明的CD81的适配体与CD81的结合具有极高的选择性和特异性。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及CD81的适配体及其应用。
背景技术
适配体(aptamer)是一小段经过筛选得到的单链寡核苷酸序列(DNA/RNA),能与相应的配体进行高亲和力和强特异性的结合。适配体可以与大分子如蛋白、细胞进行结合;也可以与一小段多肽、小分子药物、糖类化合物及离子进行结合。适配体可以被快速合成、鉴定及修饰,并且具有高重复性、高纯度及价格低廉等优势,使得适配体在疾病早期诊断、监测与治疗方面具有重要作用,尤其是基于外泌体的诊断。
外泌体是一类包含了小RNA,DNA和蛋白质的膜泡结构(30-150nm)。外泌体广泛存在于生物体液中,包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁等,并且绝大多数培养的细胞均可分泌外泌体。外泌体一直被视为特异性分泌的膜泡,能够参与细胞间通讯,细胞微环境调节等众多生物学功能调控,包括免疫反应、神经递质传递、肿瘤生长及转移等。越来越多的研究表明,外泌体大量存在生物体的循环系统,非常适宜于相关疾病的诊断开发。已经有公开研究表明,外泌体上的GPC1可以用作胰腺导管癌的早期诊断;而血浆外泌体上的EGFR T790M突变可以用作非小细胞肺癌的伴随诊断标志物。
CD81是四跨膜蛋白家族成员之一,其分子量为26kD。CD81在细胞内和跨细胞膜的区域具有高度保守的氨基酸序列,而在细胞外的区域则具有易变性,不同种属中胞外的氨基酸序列不同。已经有大量的研究表明CD81与众多生物功能相关,包括细胞转移、细胞黏附,细胞增殖和分化等。近期的公开报道证实CD81在外泌体上也大量存在,尤其在各种肿瘤相关的血清外泌体上丰度较高,包括乳腺癌、结直肠癌、肝癌和肺癌等。此外,相比于外泌体的其他标志物,如CD63,TSG101,Rab-5b等,CD81是一种更广谱的外泌体标志物。因此,靶向CD81的适配体非常适合于外泌体的提取、纯化及后续基于外泌体的分子诊断。
目前的外泌体分离纯化试剂盒主要基于粒径、密度梯度及特殊的外泌体表面标志物,包括密度梯度离心法、超速离心法、色谱分析法及抗体免疫结合法等方式。但是这些方法得到的外泌体在纯度、完整性及工艺成熟度都不够完善,耗时、价格高等缺点难以避免。
发明内容
本发明的目的是提供CD81的DNA适配体及其应用。
一种核酸适配体,所述核酸适配体为下述任一种单链寡核苷酸分子:
A1、核苷酸序列是序列表中序列1的单链寡核苷酸分子,
A2、将序列表中序列1所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的单链寡核苷酸分子具有50%以上的同一性且与CD81特异结合的单链寡核苷酸分子;
上述核苷酸序列中,所述90%以上的同一性可为至少91%、92%、95%、96%、98%、99%或100%的同一性。
其中,所述核酸适配体针对人的CD81蛋白,可与人的CD81蛋白特异性结合。
进一步,(A2)中所述缺失或者替换后的核苷酸序列具有如序列2所述的核苷酸序列。
进一步,(A2)中所述缺失或者替换后的核苷酸序列具有如序列3所述的核苷酸序列。
进一步,(A2)中所述缺失或者替换后的核苷酸序列具有如序列4所述的核苷酸序列。
进一步,(A2)中所述缺失或者替换后的核苷酸序列具有如序列5所述的核苷酸序列。
进一步,(A2)中所述缺失或者替换后的核苷酸序列具有如序列6所述的核苷酸序列。
上述任一种适配体在制备检测CD81的试剂或试剂盒中的应用也应在本发明的保护范围之内。
上述任一种适配体在制备提取CD81的试剂或试剂盒中的应用也应在本发明的保护范围之内。
其中,所述的CD81为人CD81蛋白。
上述任一种适配体在制备检测外泌体的试剂或试剂盒中的应用也应在本发明的保护范围之内。
上述任一种适配体在制备提取外泌体的试剂盒中的应用也应在本发明的保护范围之内。
其中,所述外泌体为人外泌体。
其中,所述人外泌体为含有人CD81的外泌体。
上述任一种适配体在制备检测和/或诊断癌症的试剂或试剂盒中的应用也应在本发明的保护范围之内。
其中,所述癌症的诊断标志物包括人CD81。
其中,所述癌症为实体癌症,如乳腺癌、结直肠癌、肝癌和/或肺癌。
上述任一种核酸适配体偶联到固相载体上得到的偶联物也应在本发明的保护范围之内。
上述任一种的核酸适配体交联到固相载体上得到的交联物也应在本发明的保护范围之内。
其中,所述的固相载体为磁珠。
本发明中筛选出6种CD81的DNA适配体,其与CD81的结合具有极高的选择性和特异性。有利于与后续CD81相关研究的推进及临床应用。
附图说明
图1为本发明的CD81重组蛋白和CD81阳性表达细胞系的SELEX技术;
图2为本发明的CD81-2的6个亚克隆序列的二级结构示意图;
图3为本发明的HepG2细胞表达CD81和HEK293T细胞表达CD81的对照图;
图4为本发明的CD81-2适配体与CD81阳性的HEK293T及HepG2的结合能力的对比图;
图5为本发明的全长CD81-2适配体对CD81过表达HEK293T细胞和阴性对照HepG2细胞的结合能力对比。
图6为CD81适配体使用浓度为200nM时,CD81-2适配体的8个亚型与CD81的结合能力对比图;其中,CD81适配体使用浓度为200nM,流式检测得到的FAM荧光强度数值以均值±标准差(Mean±SD)表示,实验次数为3次(n=3),**p<0.1,***p<0.01;
图7为本发明的CD81适配体使用浓度为600nM时,CD81-2适配体的8个亚型与CD81的结合能力对比图;其中,CD81适配体使用浓度为600nM,流式检测得到的FAM荧光强度数值以均值±标准差(Mean±SD)表示,实验次数为3次(n=3),*p<0.5,**p<0.1;
图8和图9分别为本发明的CD81-2J的几个亚型的结合力强弱示意图;其中,CD81适配体使用浓度分别为200nM和600nM,流式检测得到的FAM荧光强度数值以均值±标准差(Mean±SD)表示,实验次数为3次(n=3),**p<0.1,***p<0.01;
图10和图11分别为本发明的CD81-2F的几个亚型的结合力强弱示意图;其中,CD81适配体使用浓度分别为200nM和600nM,流式检测得到的FAM荧光强度数值以均值±标准差(Mean±SD)表示,实验次数为3次(n=3),**p<0.1;
图12为本发明的CD81-2J-1的二维结构图;
图13为本发明的CD81-2J-6的二维结构图;
图14为本发明的CD81-2F-2的二维结构图;
图15为本发明的CD81-2F-2与过表达CD81的HEK293T细胞或干扰下调CD81表达的HEK293T细胞亲和力对比图;
图16为本发明的CD81-2J-1与过表达CD81的HEK293T细胞或干扰下调CD81表达的HEK293T细胞亲和力对比图;
图17为本发明的CD81-2J-6与过表达CD81的HEK293T细胞或干扰下调CD81表达的HEK293T细胞亲和力对比图;
图18为本发明的CD81过表达的HEK293T及其他跨膜蛋白过表达的HEK293T细胞的蛋白印迹分析,使用抗组氨酸标签抗体;
图19为本发明的CD81-2J-1对CD81过表达的HEK293T细胞的特异性的亲和力以及其它跨膜蛋白的HEK293T细胞的不结合的图;
图20为本发明的CD81-2J-6对CD81过表达的HEK293T细胞的特异性的亲和力以及其它跨膜蛋白的HEK293T细胞的不结合的图;
图21为本发明的CD81-2F-2对CD81过表达的HEK293T细胞的特异性的亲和力以及其它跨膜蛋白的HEK293T细胞的不结合的图;
图22为用本发明的CD81-2F-2,CD81-2J-1和CD81-2J-6从人血清里捕获人的外泌体时CD81核酸配适体与血清孵育所需的最佳同时还是最短的时间的实验验证;
图23为用本发明的生物素标记的CD81-2J-1核酸配适体从人血清里来捕获人的外泌体时与用安捷伦科技有限公司的2.7微米的磁珠孵育所需的时间的实验验证;
图24为验证本发明的CD81-2F-2,CD81-2J-1和CD81-2J-6能够有效地从人血清里捕获人的外泌体;
图25为本发明的CD81-2F-2,CD81-2J-1和CD81-2J-6的CD81核酸配适体只识别人源的外泌体而不于牛的外泌体结合;
图26为证明与其他三个商业来源的生物素标记的CD81抗体来对比,本发明的CD81-2F-2,CD81-2J-1和CD81-2J-6的CD81核酸配适体在捕获人血清里的外泌体时,得到的外泌体含有较少的血源性的污染蛋白质;
图27为证明与其他商业来源外泌体亲和偶联捕获的产品对比,本发明的CD81-2F-2,CD81-2J-1和CD81-2J-6的CD81核酸配适体在捕获人血清里的外泌体时,得到的外泌体含有较少的血源性的污染蛋白质;
图28为证明与其他广泛应用的主流外泌体纯化方法对比,本发明的CD81核酸配适体在捕获人血清里的外泌体时,得到相对更纯的外泌体;
图29为与其他广泛应用的主流外泌体纯化方法对比,用本发明的CD81核酸配适体在捕获人血清里的外泌体具有更狭窄的大小分部;
图30是基于图29纳米粒子跟踪分析仪的测试结果图,图30A为如图示的各种方法从500微升人血清中捕获的细胞外囊泡/外泌体的颗粒总数;图30B为如图示的各种方法从500微升人血清中捕获的细胞外囊泡/外泌体的颗粒大小(纳米)的平均数;
图31显示用本发明的CD81核酸配适体在捕获人血清里的排除了非囊泡外的真正细胞外囊泡的比例可与目前的金标准制备方法(超速离心)媲美;
图32为本发明的CD81核酸配适体在人血清里捕获的细胞外囊泡里大部分是较大的外泌体;如图示的各种方法从500微升人血清中捕获的细胞外颗粒后,用纳米粒子跟踪分析仪计数;
图33为本发明的CD81核酸配适体在人血清里捕获的细胞外纳米颗粒里大部分是生物膜包裹的外泌体;
图34为本发明的CD81核酸配适体在人血清里捕获的细胞外纳米颗粒大部分是生物膜包裹的大型外泌体;
图35为本发明的CD81核酸配适体捕获的外泌体保持了原有的生物活性能够促进人源细胞在体外的细胞增殖;
图36为本发明的能够用于超灵敏的上皮细胞粘附分子阳性的外泌体的检测;
图37为本发明的CD81核酸配适体在模拟液体活检中能够在2000个不表达上皮细胞粘附分子的外泌体的背景里检测到单个上皮细胞粘附分子阳性的外泌体;
图38为本发明的CD81核酸配适体在与人源CD81重组蛋白结合的生物物理热力学测定。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
下述非限制性实施例可以使本领域的技术人员更好的理解本发明。
任何熟悉本领域的技术人员在本发明的纰漏范围内,根据本发明的技术方案及构思进行替换或改变均属于本发明的保护范畴。
实施例1.靶向CD81的适配体筛选
CD81的适配体筛选基于CD81重组蛋白和CD81阳性表达细胞系的SELEX技术(其示意图如图1所示),具体方式为:在约1014个适配体-单链DNA的文库内进行靶向CD81适配体的筛选。该文库内的DNA都含有以下核心序列(86nt,其中N为任意其它碱基):5’-TAG GGA AGAGAA GGA CAT ATG AT-40N-TTG ACT AGT ACA TGA CCA CTT GA-3’。所述文库内包含表12中所示的671个DNA序列。与CD81重组蛋白或CD81阳性表达细胞系结合的适配体被洗脱下来,并用PCR的方式进行扩增。PCR扩增的上、下游引物序列分别为:FITC-5’-TA GGG AAG AGAAGG ACA TAT GAT-3’和5’-TTT TTT TTT TTT TTT TTT TT/iSp9/T CAA GTG GTC ATG TACTAG TCA A-3’。扩增后的DNA再通过高通量测序的方式进行鉴定,其中得到6个与CD81结合最好的适配体,所述适配体分别为CD81-2、CD81-2F、CD81-2F-2、CD81-2J、CD81-2J-1和CD81-2J-6,其对应的序列如序列1-6所示;上述6个CD81适配体的结构示意图如图2所示。上述适配体均具有能与人的CD81蛋白结合的能力。
表1. 6个CD81-2的亚克隆序列
实施例2.细胞水平鉴定CD81适配体和CD81的结合能力
1、构建CD81过表达的重组动物细胞
CD81过表达的重组动物细胞(将该细胞命名为293T/CD81)的具体构建方法如下:将质粒pCMV3-C-His(北京义翘神州科技有限公司,Sino Biological Inc.的产品)的KpnI和XbaI识别位点之间的序列替换为人CD81的cDNA序列,并保持pCMV3-C-His其他部分序列不变的重组表达载体,将所述重组表达载体命名为pCMV3-CD81。将pCMV3-CD81导入HEK293T细胞,得到重组细胞,将其命名293T/CD81。所述人CD81的cDNA的核苷酸序列为序列表中7所示的核苷酸序列。
2、为了选择用于CD81适配体-细胞结合测定的合适细胞系,使用不表达CD81的HepG2细胞株和293T/CD81进行CD81抗体染色的流式细胞术测定。
在本实验中,设计了三个实验组,包括空白对照(图3中以对照表示,即不加CD81一抗和荧光二抗的处理),仅Brilliant Violet510标记的荧光二抗(流式检测荧光通道为AmCyan)以及同时加入CD81一抗和荧光二抗。其测定结果如表2和图3所示,结果证实仅有0.13%(小于1%)的HepG2细胞表达CD81;相反,98.4%的293T/CD81表达CD81。因此,HepG2是良好的阴性对照,而CD81过表达的HEK293T是适合于针对具有天然构象的人CD81的阳性选择细胞系。
表2.使用HepG2和过表达CD81的HEK293T细胞(293T/CD81)进行CD81抗体染色的流式细胞术测定的结果对照表
HepG2 | 阳性细胞% | 中位荧光强度 | 净中位荧光强度 |
对照 | 0.092 | 1046 | 0 |
二抗 | 0.032 | 1034 | -12 |
一抗+二抗 | 0.13 | 1097 | 51 |
293T/CD81 | 阳性细胞% | 中位荧光强度 | 净中位荧光强度 |
对照 | 0.04 | 780 | 0 |
二抗 | 0.05 | 765 | -15 |
一抗+二抗 | 98.40 | 3061 | 2281 |
然后,采用600nM的FAM标记的CD81-2适配体测试其与具有天然构象的CD81的结合能力。通过将FAM标记的CD81-2适配体跟293T/CD81(表达CD81)或阴性对照HepG2细胞(不表达CD81)进行充分结合,洗脱掉未结合的CD81-2后,通过流式细胞仪检测FAM荧光强度和FAM阳性的细胞数目。结果如图4所示,结果表明,CD81-2适配体与293T/CD81结合能力显著高于阴性对照HepG2(*p<0.5)。也就是说,CD81-2适配体与具有天然构象的CD81具有一定的特异结合能力。为了评估全长CD81-2适配体分别针对HepG2和293T/CD81细胞的平衡解离常数(K'd),使用不同浓度的FAM标记的CD81-2适配体(0μM,0.1μM,0.25μM,0.5μM,1μM,2μM和5μM)应用于适配体-细胞结合亲和力测定,测定结果如表3和图5所示。结果表明CD81-2适配体与HepG2细胞的结合K'd为1072.3±141.0nM,而与293T/CD81的结合K'd为520.8±4.0nM。上述结果显示,全长CD81-2适配体对293T/CD81细胞的结合能力显著高于对阴性对照HepG2细胞的结合能力,这进一步证实CD81-2适配体是CD81的结合物。
表3
此外,将CD81-2适配体改造成表4中所示的8个亚型,并通过上述手段验证这8个亚型与CD81的结合能力,各个处理组中的HepG2细胞含量相同,293T/CD81含量相同,FAM标记的适配体含量相同。
测试结果如图6和图7所示,从结果中可以明显看出CD81-2F和CD81-2J对CD81过表达HEK293T细胞的结合能力显著高于阴性对照HepG2细胞(**p<0.1,***p<0.01)。
表4.适配体CD81-2的8个亚型序列
适配体名称 | 碱基数 | 序列(5’-3’ |
CD81-2C | 28 | CCGACATCCGGTTGGTTTATGGTTTCCC |
CD81-2D | 11 | CCGACATCCGG |
CD81-2E | 17 | TTTATGGTTTCCCTAAA |
CD81-2F | 32 | CCGACATCCGGTTGGTTTATGGTTTCCCTAAA |
CD81-2H | 27 | CCGACATCCGGTTGGTTTATGGTTTCC |
CD81-2J | 28 | CATTTAGCCGACATCCGGTTGGTTTATG |
CD81-2M | 25 | TTTAGCCGACATCCGGTTGCCTAAA |
CD81-2N | 28 | TTTAGCGTTGGTTTATGGTTTCCCTAAA |
具体测试方法:收集HEK293T-CD81阳性和阴性对照HepG2细胞,分别将200nM和600nM的CD81适配体在95℃折叠和孵育5分钟,然后放置冰上5分钟,37℃放置15分钟;将折叠好的CD81适配体与细胞在冰上孵育30分钟,再用PBS洗涤3次,随后将细胞与CD81适配体的复合物用于流式细胞仪检测。
实施例3.CD81-2J和CD81-2F亚型的结合能力鉴定
针对CD81-2J和CD81-2F,我们分别再构建了8个亚克隆,序列如表5和表6所示。通过实施例2中的测试方法,比较CD81-2J和CD81-2F的亚型的结合力强弱如图8-11所示。结果证明,亚型CD81-2J-1,CD81-2J-6和CD81-2F-2对CD81过表达HEK293T细胞(293T/CD81)的结合能力显著高于阴性对照HepG2细胞(不含CD81)(**p<0.1,***p<0.01),表明以上三个亚型对具有天然构象的CD81具有更强的结合能力。所以,选取CD81-2J-1,CD81-2J-6和CD81-2F-2用于后续验证及检测实验。
表5适配体CD81-2J的8个亚型序列
表6适配体CD81-2J的8个亚型序列
实施例4.CD81-2J-1,CD81-2J-6和CD81-2F-2结合的选择性和特异性检测
将CD81过表达HEK293T细胞(293T/CD81)通过siRNA下调CD81的表达。
本实施例选用了两种下调CD81表达的siRNA,分别为siRNA-CD81-1和siRNA-CD81-2,其对应的序列分别为:siRNA-CD81-1:5’-GAACUUUCCUGUUACCUUUdTdT-3’(正义链),5’-AAAGGUAACAGGAAAGUUCdTdT-3’(反义链);siRNA-CD81-2:5’-CACCU UCUAU GUAGG CAUCU AdTdT-3’(正义链),5’-U AGAUG CCUAC AUAGA AGGUG dTdT-3’(反义链)。siRNA对照序列为:5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3’(正义链),5’-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3’(反义链)。转染方法:HEK293T细胞在6孔板中汇集到60%密度时,先用lipofectamine 2000转染pCMV3-CD81(4μg/孔)以过表达CD81蛋白质;24小时后,再转染siRNA下调细胞内CD81蛋白质的表达水平:取8μL的lipofectamine 2000加192μL的无血清DMEM,室温放置5分钟为A液;同时将5μL 20μM的siRNA(100pmol)加入195μL的无血清DMEM中,混匀成B液;将A,B液混匀,室温放置20分钟后加入到含有600μL无血清DMEM的HEK293T培养液中;6小时后,更换为含10%血清的DMEM培养液;48小时后,得到重组细胞,将转染siRNA-CD81-1的细胞命名为293T/CD81siRNA-1(CD81下调的细胞);将转染siRNA-CD81-2的细胞命名为293T/CD81siRNA-2(CD81下调的细胞)。
分别将CD81-2J-1,CD81-2J-6和CD81-2F-2与细胞(HEK293T细胞、HEK293T过表达CD81、HEK293T过表达CD81后转染siRNA-CD81-1和HEK293T过表达CD81后转染siRNA-CD81-1中的任一种细胞)进行孵育,按照实施例2中的CD81适配体-细胞亲和力实验检测适配体的亲和力。结果表明干扰下调CD81表达后,三种CD81-2适配体亚型CD81-2J-1,CD81-2J-6和CD81-2F-2的亲和力均显著降低(***p<0.01,****p<0.001)(图15-17)。以上结果表明,CD81-2J-1,CD81-2J-6和CD81-2F-2是与CD81选择性和特异性结合的适配体。图15-17中,293T/WT为野生型HEK293细胞;293T/CD81 control为HEK293过表达CD81;293T/CD81scrambled为HEK293过表达CD81用随机序列的siRNA转染;293T/CD81 siRNA-1为HEK293过表达CD81后用siRNA-CD81-1转染;293T/CD81 siRNA-2为HEK293过表达CD81后用siRNA-CD81-1转染。图中结果为均数±标准差,实验重复次数=3。***,P≤0.001。
测试结果表示CD81-2J-1,CD81-2J-6和CD81-2F-2的k’d值分别如表7-表9所示,二维结构分别如图12-14所示。
表7.CD81-2J与CD81-2J-1的k’d值对比表
表8.CD81-2J与CD81-2J-6的k’d值对比表
表9.CD81-2 F与CD81-2F-2的k’d值对比表
分别将CD81-2J-1,CD81-2J-6和CD81-2F-2与上述过表达CD81的HEK293T细胞或干扰下调CD81表达的HEK293T细胞进行孵育,再通过流式细胞仪检测适配体的亲和力。
另外,通过在HEK293T细胞中过表达其它具有组氨酸(-His)标记的跨膜蛋白来检测适配体CD81-2J-1,CD81-2J-6,CD81-2F-2与CD81结合的选择性和特异性。具体方法:分别制备HEK293T,CD81过表达的HEK293T,CD9过表达的HEK293T,CD63过表达的HEK293T,CDH13过表达的HEK293T,CD40过表达的HEK293T和Her2过表达的HEK293T细胞(制备方法参考实施例1中制备方法,其中CD9:Genebank Accession Number:NM_001769;CD63:GenebankAccession Number:NM_001257390;CDH13:Genebank Accession Number:NM_001220490;CD40:Genebank Accession Number:NM_001250;Her2:Genebank Accession Number:NM_004448.2);每500000个细胞为一组。将200nM FAM标记的CD81适配体在95℃折叠和孵育5分钟,然后放置冰上5分钟,37℃放置15分钟;将折叠好的CD81适配体与细胞在冰上孵育30分钟,再用PBS洗涤3次,随后将上述细胞与CD81适配体的复合物用于流式细胞仪检测。
经蛋白免疫印迹实验检测组氨酸标记,结果证明,CD81过表达的HEK293T及其他跨膜蛋白过表达的HEK293T细胞均已成功建立(如图18所示)。使用上述细胞进行实施例2中的CD81适配体-细胞亲和力实验。结果表明,三种CD81-2的适配体亚型CD81-2J-1,CD81-2J-6和CD81-2F-2对CD81过表达的HEK293T细胞均具有极高的亲和力(***p<0.01,****p<0.001);对过表达其它跨膜蛋白的HEK293T细胞亲和力无显著性改变(如图19-21所示)。以上结果揭示,三种CD81-2的适配体亚型与CD81的结合具有极高的选择性和特异性。
实施例5、CD81适配体捕获人血清外泌体的能力
为了评估单个CD81适配体捕获人血清外泌体的最佳时间,使用生物素(biotin,苏州吉玛基因股份有限公司,货号:F01001)标记CD81-2F-2、CD81-2J-1和CD81-2J-6,将生物素标记的CD81适配体CD81-2F-2、CD81-2J-1和CD81-2J-6与人血清分别孵育30分钟,1小时和4小时。通过链霉亲和素包被的磁珠捕获生物素-CD81适配体-外泌体复合物,然后使用抗人CD81抗体进行Western检测。如图22所示,CD81-2F-2适配体在30分钟内能捕获大量外泌体,而延长孵育时间至4小时仅略微增加捕获量。CD81-2J-1和CD81-2J-6适配体在孵育30分钟后都能有效捕获外泌体,进一步孵育1小时或4小时不会显著增加捕获外泌体的量。结果如图22所示,图22为用生物素标记的CD81-2F-2,CD81-2J-1和CD81-2J-6从人血清里捕获人的外泌体时CD81核酸配适体与血清孵育所需的最佳同时还是最短的时间的实验验证。图22A为对用不同孵育时间所捕获的外泌体的CD81蛋白印迹。图22B为根据CD81蛋白印迹分析得到的在核酸配适体与血清孵育不同时间后得到的外泌体来源的CD81蛋白半定量。图中结果为均数±标准差,实验重复次数为3次。结果表明CD81-2J-1和CD81-2J-6适配体可在30分钟内有效结合人血清中的外泌体。因此,CD81-2J-1和CD81-2J-6适配体捕获人血清外泌体的最佳时间确定为30分钟,而CD81-2F-2适配体则需要更长的孵育时间以达到最高的外泌体捕获量。
实施例6、基于CD81适配体-磁珠的系统能够孵育分离外泌体的能力
为了验证基于CD81适配体–磁珠的系统捕获人血清外泌体的最短时间,分别将实施例5中的生物素标记的CD81-2J-1适配体(图23中用CD81表示)和人血清孵育1分钟,20分钟和1小时。然后再通过链霉亲和素包被的磁珠分别捕获上述CD81适配体外泌体复合物1分钟(bead 1min)和5分钟(bead 5min)。最后,裂解由CD81适配体-磁珠捕获的外泌体,通过Western印迹对外泌体的经典标记物CD81进行检测。结果如图23所示,图23为用本发明的生物素标记的CD81-2J-1核酸配适体从人血清里来捕获人的外泌体时与用安捷伦科技有限公司的2.7微米的磁珠孵育所需的时间的实验验证。图23A为用安捷伦科技有限公司的2.7微米的磁珠孵育不同时间后所捕获的外泌体的CD81蛋白印迹。图23B为根据CD81蛋白印迹分析得到的在安捷伦科技有限公司的2.7微米的磁珠孵育不同时间后所捕获的外泌体的来源的CD81蛋白半定量结果。图中结果为均数±标准差,实验重复次数为3次。如图23A所示,与CD81适配体孵育一分钟后捕获的外泌体样品即可检测到CD81蛋白,该信号随着CD81适配体与血清孵育时间的增加而增加(图23B所示)。以上结果表明,本发明的CD81适配体可以在两分钟内捕获人血清外泌体:一分钟形成CD81适配体-外泌体复合物,另一分钟用于链霉亲和素磁珠抓取CD81适配体-外泌体复合物。2分钟即可从血清中有效分离外泌体是迄今为止报道的最快的外泌体分离方法。
实施例7、通过流式细胞术检测CD81适配体捕获人血清外泌体的能力。
使用生物素和CY5荧光标记(Q670,购自苏州吉玛基因)同时标记CD81-2F-2,CD81-2J-1和CD81-2J-6得到生物素和Q670标记的CD81适配体,将生物素Q670标记的CD81适配体与人血清一起孵育,然后使用尺寸为2.7μm的链霉亲和素包被的磁珠(来之安捷伦科技有限公司)捕获生物素-CD81适配体-外泌体结合物。在用藻红蛋白(PE)标记的CD9抗体染色后,通过流式细胞术检测固定在磁珠上的外泌体。以CY5荧光标记(Q670)和生物素共同标记的乱序DNA用作CD81 DNA适配体的阴性对照。以PE标记的小鼠IgG1作为PE标记的CD9抗体的阴性对照。结果如图24所示,图24为验证本发明的CD81-2F-2,CD81-2J-1和CD81-2J-6从人血清里捕获人的外泌体能力的结果图,图24A为本发明的核酸配适体是用Q670和生物素双标记的,在流式细胞仪里用APC通道来检测以证明核酸配适体的确与链酶亲和素包被的磁珠结合。图24B为用PE标记的CD9抗体(检测外泌体)和流式细胞仪来证明只有本发明的CD81-2F-2,CD81-2J-1和CD81-2J-6的CD81核酸配适体能捕获人血清里的外泌体,其他的阴性对照(磁珠本身,图中用磁珠表示;随机DNA片段,图中用DNA表示;或对照抗体,图中免疫球蛋白G1对照)均无作用。如图24A所示,与仅含人血清的磁珠形成鲜明对比,Q670标记的CD81-适配体组或Q670标记的乱序DNA组中99.9%链霉亲和素磁珠表面覆盖有Q670标记的CD81-适配体或乱序DNA。如图24B所示,与三个对照组相比,CD81适配体组中至少有55.4%的磁珠复合物呈PE(CD9标记)阳性。上述证据表明,在99.9%Q670标记的生物素-CD81适配体包被的磁珠复合物中,约有55.4%呈血清外泌体阳性。因此,与Western印迹结果高度一致,流式细胞术研究结果进一步证实了所有三种CD81适配体都能有效捕获人血清外泌体。
实施例8、CD81适配体的特异性验证
为了确定本发明的适配体的物种特异性,首先确定链霉亲和素包被的磁珠是否能够在生物素标记的抗牛CD81抗体与牛血清孵育后捕获牛外泌体。为此,将生物素标记的抗牛CD81抗体和牛外泌体的复合物与链霉亲和素包被的磁珠一起孵育,然后使用抗牛CD81或CD9抗体进行Western和流式细胞术检测。意料之中结果表明,本发明的磁珠系统可以通过抗牛CD81抗体的介导有效地捕获牛源外泌体。
利用这些可以与人和牛来源的CD81/CD9结合的抗体作为阳性对照,来证明基于CD81适配体-磁珠系统捕获外泌体的特异性。如图25A所示,用生物素标记的抗牛CD81抗体孵育组可以清楚地检测到牛CD81和CD9,但用生物素标记的CD81适配体孵育组没有检测到牛CD81和CD9,表明CD81适配体不与来自牛的外泌体结合。
为了进一步证实CD81适配体不与牛外泌体相互作用,进一步利用流式细胞仪分析,其灵敏度比western检测高几个数量级。如图25B所示,与仅含牛血清的磁珠组相比,三种CD81适配体CD81-2F-2,CD81-2J-1和CD81-2J-6中PE-CD9的荧光强度没有显著差异,表明我们的CD81适配体不捕获牛血清外泌体。相反,用抗牛CD81抗体处理的样品中PE-CD9的荧光强度显著向右移动(49.0%阳性磁珠),与仅含牛血清的磁珠和三种CD81适配体组相比有显著阳性。因此,CD81-2F-2,CD81-2J-1和CD81-2J-6适配体识别并特异性结合人外泌体,与牛外泌体无交叉反应。
结果如图25所示,图25证明本发明的CD81-2F-2,CD81-2J-1和CD81-2J-6的CD81核酸配适体只识别人源的外泌体而不于牛的外泌体结合。生物素标记的215nM的核酸配适体与小牛血清共孵育4小时用链酶亲和素包被的磁珠捕获。然后用抗牛的CD81的抗体来检测发明的CD81-2F-2,CD81-2J-1和CD81-2J-6是否能够捕获牛的外泌体。图25A用抗牛CD9抗体和蛋白印迹实验来显示生物素标记的抗牛的CD81抗体能够从小牛血清中通过链酶亲和素包被的磁珠捕获,但是用生物素标记的CD81-2F-2,CD81-2J-1和CD81-2J-6的CD81核酸配适体不能够捕获牛的外泌体。图25Ba用Q670和生物素双标记的CD81核酸配适体在流式细胞仪里用APC通道来检测以证明核酸配适体的确与链酶亲和素包被的磁珠结合。图25Bb显示用生物素标记的抗小牛来源的CD81抗体(检测外泌体)与链酶亲和素包被的磁珠合用可以获小牛血清里的外泌体。但是,同样生物素标记的本发明的CD81-2F-2,CD81-2J-1和CD81-2J-6的CD81核酸配适体或磁珠本身不能捕获小牛血清里的外泌体。
实施例9、CD81抗体与CD81适配体分离的外泌体中含有血清蛋白含量的比较
普通的亲和力外泌体分离试剂盒都使用各种抗体。为了评估生物素标记的CD81适配体捕获的外泌体的纯度,比较化学抗体(CD81适配体)和CD81抗体分别捕获的外泌体中血清蛋白的含量。购买三种生物素标记的抗人CD81单克隆抗体,分别为抗体-1(BioLegend,Cat#349514)(对应图26中的CD81 Ab-1),抗体-2(R&D,Cat#RDSMAB4615)(对应图26中的CD81 Ab-2)和抗体-3(MyBioSource,Cat#MBS666563)(对应图26中的CD81 Ab-3)。实验中所有CD81适配体和抗体均含有生物素标记,并使用相同的链霉亲和素包被的磁珠(Agilent,Cat#PL6827-1030)分离CD81适配体-外泌体和CD81抗体-外泌体复合物。磁珠捕获的外泌体裂解后,使用针对外泌体标记物的抗体(CD81和CD9)以及针对常见的与外泌体共同分离出的血清蛋白污染物抗体(IgG,血清白蛋白,IgM和ApoB)进行免疫印迹分析。结果如图26所示,图26显示证明与其他三个商业来源的生物素标记的CD81抗体来对比,本发明的CD81-2F-2,CD81-2J-1和CD81-2J-6的CD81核酸配适体在捕获人血清里的外泌体时,得到的外泌体含有较少的血源性的污染蛋白质。将215nM的生物素标记的抗体或核酸配适体与500微升的人血清混合后孵育30分钟后再与链酶亲和素包被的磁珠孵育20分钟然后用PBS清洗后,分别用抗体IgG、血清白蛋白(对应图26中的serum albumin)、IgM、ApoB、CD81和CD9进行蛋白印迹分析,结果如图26A所示。图26B为半定量分析,五种不同的血源蛋白的丰度皆是用各自蛋白印迹中CD81蛋白带的丰度做基准来比较的。图中结果为均数±标准差,实验重复次数为3次。如图26A和图26B-a所示,通过Western检测的CD9/CD81比例分析,本发明的CD81适配体捕获的外泌体群体与三种商业化CD81抗体略微不同。为了比较不同方式分离外泌体时血清蛋白的污染程度,采用Western中的血清蛋白信号与CD81(作为加载对照)信号的比例作为判断污染程度的指标。如图26B-b所示,CD81-2F-2-(P≤0.001),CD81-2J-1-(P≤0.01),CD81-2J-6-(P≤0.0001)适配体组)和CD81抗体-2(P≤0.01)组IgG/CD81的比例显著低于CD81抗体-1-和CD81抗体-3组。此外,与CD81抗体-2组相比,CD81-2F-2(P≤0.05)和CD81-2J-6(P≤0.05)适配体捕获的外泌体中IgG/CD81的比例显著降低(如图26B-b)。因此,使用CD81-2F-2和CD81-2J-6适配体分离得到的外泌体与用三种CD81抗体获得的外泌体相比,有着更低的血清蛋白的污染(IgG)。
由于白蛋白是最丰富的血清蛋白之一,外泌体分离液中的血清白蛋白含量是衡量外泌体分离方法的特异性和纯度的极好指标。如图26B-c所示,与CD81抗体-2和CD81抗体-3相比,三种CD81适配体及CD81抗体-1的外泌体分离液中血清白蛋白/CD81的比例显著降低。具体而言,CD81-2F-2和CD81-2J-6适配体的外泌体分离液中血清白蛋白的量分别比使用CD81抗体-2或CD81抗体-3降低12倍和3倍。
脂蛋白是外泌体分离液中的主要污染物,通过多种方法分离的外泌体组分中有多达70%的颗粒是脂蛋白,而不是真正的外泌体。在血清/血浆制备的大多数外泌体中,载脂蛋白B(ApoB)是污染性脂蛋白颗粒中的主要成分。因此,本发明分析了外泌体分离液中ApoB的含量,以评估外泌体中脂蛋白污染程度。如图26A和26B-d所示,使用适配体CD81-2F-2(P≤0.001),CD81-2J-1(P≤0.01)和CD81-2J-6(P≤0.0001)制备的外泌体分离物中ApoB的比例比三种抗CD81抗体分离的外泌体低2倍。因此,本发明的CD81适配体的一个明显优势是它们提供了非常快速的外泌体制备,并且与使用CD81抗体分离方法相比,显著减少了污染物的含量,包括血清蛋白和非外泌体颗粒。
但是,与使用CD81抗体方法分离得到的外泌体相比,CD81适配体分离的外泌体中存在更多的免疫球蛋白M(IgM)污染(图26A和26B-e)。
实验结果表明,本发明的CD81适配体在捕获人血清中CD81阳性的外泌体具有很高的特异性,并且更好的降低血清白蛋白和脂蛋白颗粒的污染。
实施例10
与商业化的基于亲和力的外泌体分离试剂盒相比,CD81适配体能够制备更高纯度的外泌体
为了进一步评估生物素-CD81适配体捕获的外泌体的纯度,本发明通过Western检测比较了基于CD81适配体-磁珠的外泌体提取与两种商业常用的基于亲和偶联磁珠的外泌体提取试剂盒的性能。所用试剂盒如下:(1)基于磷脂酰丝氨酸亲和力的MagCaptureTM外泌体分离试剂盒(Novachem,Cat#293-77601),(2)外泌体-人CD81分离试剂盒(LifeTechnologies,Cat#10616D)。
结果如图27所示,图27显示证明与其他商业来源外泌体亲和偶联捕获的产品对比,本发明的CD81-2F-2,CD81-2J-1和CD81-2J-6的CD81核酸配适体在捕获人血清里的外泌体时,得到的外泌体含有较少的血源性的污染蛋白质。本实验里使用的商业来源亲和偶联捕获的产品为MagCaptureTMExosome Isolation Kit PS(FUJIFILM Wako Chemicals,CatNo:293-77601)and Exosome-Human CD81 Isolation Reagent(ThermoFisherScientific,Cat.No.10616D)。500微升的430nM的核酸配适体与500微升的人血清混合后孵育30分钟后再与链酶亲和素包被的磁珠孵育20分钟然后用图27A左边所示的抗体对捕获的外泌体进行蛋白印迹分析。图27B的半定量分析里,五种不同的血源蛋白的丰度皆是用各自蛋白印迹中CD81蛋白带的丰度做基准来比较的。图中结果为均数±标准差,实验重复次数为3次。*,P≤0.05;**,P≤0.01;***,P≤0.001;****,P≤0.0001与5个实验组中的MagCaptureTM试剂盒相比。#,P≤0.05;##,P≤0.01;###,P≤0.001与MagCaptureTM试剂盒实验组中的免疫球蛋白G组和白蛋白组相比。与实施例9中得到的结果类似,通过不同外泌体制备方法中CD9与CD81的比例来看,本发明的CD81适配体分离的外泌体群体与两种商业化亲和分离试剂盒稍有差异(如图27A和27B-a)。与两种商业试剂盒相比,由三种CD81适配体制备的外泌体中血清蛋白(免疫球蛋白G(IgG),白蛋白,IgM和ApoB)污染均显著降低。以上结果表明,作为高纯度人血清外泌体的有效亲和分离工具,CD81适配体显然具有更高的优越性(如图27A和27B-b至27B-e所示)。
实施例11
与外泌体分离金标准方法相比,CD81适配体介导的外泌体分离含有更少的血清蛋白污染
在用于分离外泌体的许多方法中,超速离心仍然是金标准,且在外泌体领域中使用该方法发表的论文超过50%。加之超滤,色谱和基于聚合物的沉淀(例如Exoquick)等分离外泌体的物理方式,构成了目前所有外泌体分离方法的约90%。因此,将CD81适配体与现行主流制备外泌体方法的纯度进行比较势在必行。
为此,本发明分别使用超速离心,超滤,交联葡聚糖G50柱,Exoquick试剂盒(System Biosciences,Cat#EXOQ5A-1)和CD81适配体从人血清中分离外泌体。然后通过如图21和图22中所述的实验方法,检测不同方法得到的外泌体中血清蛋白的污染量。结果如图28所示,图28显示证明与其他广泛应用的主流外泌体纯化方法对比,本发明的CD81核酸配适体在捕获人血清里的外泌体时,得到相对更纯的外泌体。其中,外泌体用500微升的人血清来制作。使用的方法为超速离心,超滤,G-50葡聚糖凝胶过滤以及ExoQuick试剂盒。核酸配适体组里用磁珠本身和随机序列的DNA作为阴性对照。图28A是对各种不同方法得到的外泌体的蛋白印迹分析,所用抗体为IgG、血清白蛋白(对应图28中的serum albumin)、Haptoglobin、IgM、ApoB、CD81和CD9。图28B的半定量分析里,六种不同的血源蛋白的丰度皆是用各自蛋白印迹中CD81蛋白带的丰度做基准来比较的。图中结果为均数±标准差,实验重复次数=3。*,P≤0.05;**,P≤0.01;***,P≤0.001;****,P≤0.0001与毎个实验组中的超速离心的样本相比。#,P≤0.05与血清白蛋白组(28ABd)中的Exoquik试剂盒制备的外泌体样品相比。通过Western分析CD9与CD81的比例发现:四种常规方法以及三种CD81适配体分离的外泌体群体均有差异。
跟超滤分离方法相反,本发明的CD81适配体分离出的外泌体并未检测到触珠蛋白的存在(图28A)。此外,与超速离心和交联葡聚糖G50柱制备外泌体方法相比,CD81适配体分离的外泌体中IgG污染显著降低(图28B-c)。
就血清中最丰富的血清蛋白而言,三种CD81适配体分离的外泌体具有最少的白蛋白污染,其中,CD81-2F-2适配体最为优异。与适配体CD81-2J-1,CD81-2J-6以及其他四种常规方法相比,适配体CD81-2F-2捕获最少量的血清白蛋白(图28B-d)。
另外,与金标准超速离心法相比,三种CD81适配体分离的外泌体中IgM相对含量均显著下降(图28B-e)。
其次,与金标准超速离心法相比,三种CD81适配体分离的外泌体中ApoB相对含量亦显著下降(P<0.0001,图28B-f)。ApoB是用来检测从血的载脂蛋白(低密度载脂蛋白,极低密度载脂蛋白和乳糜微粒)来的对制备的外泌体的污染。
总之,与目前大多数研究人员采用的主流外泌体分离纯化方法相比,以基于CD81适配体-磁珠方法分离得到的外泌体具有更高的纯度,更低的蛋白污染(包括血清白蛋白和载脂蛋白等)。
实施例12
使用CD81适配体分离的外泌体具有明显接近外泌体的狭窄大小分布
人细胞释放的外泌体是膜包被囊泡的异质群体,大小为30nm至150nm。在各种类型的外泌体中,外泌体的大小在30nm至150nm之间。本发明已证明CD81适配体分离的外泌体具有更少的血清蛋白污染后,本发明进一步分析其分离的血清外泌体的产量和大小分布。纳米粒子追踪分析(NTA)是用于表征水介质中外泌体的浓度和大小的广泛使用的方法。图29显示了使用常规物理方法(超速离心,超滤,交联葡聚糖G50柱,Exoquick试剂盒),其他市售的基于亲和力的外泌体分离试剂盒,包括靶向外泌体膜表面脂质(MagCaptureTM外泌体分离试剂盒,FUJIFILM Wako Chemicals,Cat#293-77601)和靶向外泌体膜表面CD81(CD81 Exo-Flow,System Biosciences,Cat#EXOFLOW400A-1)的分离试剂盒,以及本发明的CD81适配体分离方法分别获得的外泌体尺寸分布NTA曲线。
目前流行的外泌体分离方法相比(图29A-D),基于亲和力的纯化方法分离的外泌体具有更为狭窄的尺寸分布(图29E-I)。使用商业亲和力方法分离的外泌体(图29E-F)大小范围是20nm至1000nm。然而,CD81适配体分离的外泌体显示出非常狭窄的50nm至150nm的大小范围。对于CD81-2F-2,CD81-2J-1和CD81-2J-6适配体,最丰富的外泌体群体分别以113nm,89nm和106nm为中心。
就产量而言,本发明目前的CD81适配体分离系统获得的总外泌体颗粒数(由NTA测定)低于超速离心法。具体地,CD81-2F-2适配体,CD81-2J-1适配体和CD81-2J-6适配体的总外泌体颗粒产量分别为超速离心法的67%,44%和88%(图30A)。另外,CD81适配体分离的外泌体的平均粒径为130nm-147nm略小于超速离心方法(154nm)(图30B)。
至关重要的是NTA测量所有粒子数而不代表真实的细胞外囊泡数目。实际上,文献有明确记载,用目前通用的方法从血清中分离出的“外囊泡颗粒”中约30%-70%是脂蛋白颗粒,而不是真正的外泌体。因此,本发明首先在室温下用0.5%Triton X-100处理样品15分钟来裂解不同提取方法获得的外泌体中的所有囊泡颗粒,在这一过程中非囊泡颗粒始终保持其完整性。其次,通过NTA分析0.5%Triton X-100处理前后样品中颗粒数变化,确定了CD81适配体和其他方法制备的外泌体中真实外泌体的数目和百分比。如图31A所示,使用CD81-2J-6适配体分离的总囊泡的产量仅略微低于超速离心法。而使用CD81-2F-2和CD81-2J-1适配体分离的总囊泡数分别为超速离心法的73%和48%。但是,与以上四种目前常用方法和两种基于亲和分离的试剂盒相比,CD81适配体分离的外泌体中真实外泌体的百分比是相似(CD81-2J-6适配体)或显著升高(CD81-2F-2和CD81-2J-1适配体)的(图31B)。总而言之,与金标准超速离心方法相比,CD81适配体亲和纯化方法分离的血清外泌体粒径分布更狭窄,产量在同一数量级,真实的外泌体相似。需要特别指出的是,基于CD81适配体-磁珠的系统是目前唯一的一步法快速外泌体分离方法,由其捕获的外泌体群体的大小最接近定义外泌体的大小范围。图29表示与其他广泛应用的主流外泌体纯化方法对比,用本发明的CD81核酸配适体在捕获人血清里的外泌体具有更狭窄的大小分部。人血清里的细胞外囊泡/外泌体分别使用超速离心,超滤,G-50葡聚糖凝胶过滤,ExoQuick,MagCaptureTMCD81Exo-Flow试剂盒以及本发明的3个CD81核酸配适体捕获。游离的细胞外囊泡/外泌体用纳米粒子跟踪分析仪来分析每种方法捕获的细胞外囊泡/外泌体的大小,分布和浓度。图中的垂直虚线标志着150纳米的位置。图30是基于图29纳米粒子跟踪分析仪的测试,显示如图示的各种方法从500微升人血清中捕获的细胞外囊泡/外泌体的颗粒总数(图30A)以及颗粒大小(纳米)的平均数(图30B)。图31显示用本发明的CD81核酸配适体在捕获人血清里的排除了非囊泡外的真正细胞外囊泡的比例可与与目前的金标准制备方法(超速离心)媲美。显示如图示的各种方法从500微升人血清中捕获的细胞外颗粒后,用纳米粒子跟踪分析仪的计数,得出总颗粒浓度(图31A)。然后样品用0.5%聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)处理把生物膜溶解,再用纳米粒子跟踪分析仪的计数得出非囊泡的颗粒浓度。毎个样品的总颗粒浓度减去其非囊泡的颗粒浓度,即为真正细胞外囊泡的浓度。图31B显示各种捕获/纯化方法得到的真正细胞外囊泡在总颗粒数中的比率。图30和31中结果为均数±标准差,实验重复次数为3次。*,P≤0.05;**,P≤0.01与超速离心的样本相比;#,P≤0.05;##,P≤0.01与二个市场上卖的用CD81抗体的亲和分离的试剂盒相比较。
实施例13
CD81适配体能够高度富集和分离外泌体大小范围内的外泌体群体
基于它们的生物物理特性,外泌体最近被分类为小外泌体(Exo-S,60-80nm)和大外泌体(Exo-L,90-120nm)。已经确定CD81适配体亲和纯化方法能够分离具有与外泌体的特征尺寸范围相匹配的狭窄尺寸分布的外泌体,我们继续研究CD81适配体所捕获外泌体的各个亚组中外泌体的丰度。将研究集中在四种尺寸范围,50-80nm(小外泌体,Exo-S),80-120nm(大外泌体,Exo-L),120-150nm(大外泌体,Exo-L)和>150nm(对于微泡)。如图32B所示,与使用其他物理或亲和分离方法相比,CD81适配体分离的总颗粒中大外泌体(80-120nm)的大小范围的占比最高。此外,当用0.5%Triton X-100处理分离的外泌体悬浮液以去除囊泡后,NTA分析显示:通过CD81适配体分离的外泌体在80-120nm和120-150nm的大小范围内的总颗粒中,外泌体的百分比较超速离心获得的更高或相似(图33B-C)。具体地,使用CD81-2J-1分离的80-120nm的总颗粒中有82%的外泌体(图33B),并且使用CD81-2F-2适配体分离的120-150nm总颗粒中有79%的外泌体(图33C),与超速离心相比以上两种尺寸的外泌体比例更高或相当(相应值为23%和79%)。值得注意的是,对于使用CD81适配体分离的所有真正外泌体,大约48%-57%在80-120nm(大外泌体)大小范围(图34B),23%-30%在120-150nm(大外泌体)大小范围(图34C)。因此,使用CD81适配体分离的大多数(71%-87%)真实囊泡(外泌体)是大外泌体(80-150nm)。
其中,图32显示用本发明的CD81核酸配适体在人血清里捕获的细胞外囊泡里大部分是较大的外泌体。如图示的各种方法从500微升人血清中捕获的细胞外颗粒后,用纳米粒子跟踪分析仪计数。图32A展示粒径在50-80微米之间细胞外颗粒占总颗粒的比例。图32B展示粒径在80-100微米之间细胞外颗粒占总颗粒的比率。图32C展示粒径在120-150微米之间细胞外颗粒占总颗粒的比率。图32D展示粒径在大于150微米的细胞外颗粒占总颗粒的比率。图中结果为均数±标准差,实验重复次数为3次。*,P≤0.05;**,P≤0.01;***,P≤0.001;****,P≤0.0001与超速离心的样本相比;#,P≤0.05;##,P≤0.01;###,P≤0.001与二个市场上卖的用CD81抗体的亲和分离的试剂盒相比较。图33显示用本发明的CD81核酸配适体在人血清里捕获的细胞外纳米颗粒里大部分是生物膜包裹的外泌体。显示如图示的各种方法从500微升人血清中捕获的细胞外颗粒后,用纳米粒子跟踪分析仪的计数,得出总颗粒浓度。然后样品用0.5%聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)处理把生物膜溶解,再用纳米粒子跟踪分析仪的计数得出非囊泡的颗粒浓度。图33A展示粒径为50-80微米细胞外颗粒和非囊泡的颗粒分别在总颗粒中的比率。图33B展示粒径为80-120微米细胞外颗粒和非囊泡的颗粒分别在总颗粒中的比率。图33C展示粒径为120-150微米细胞外颗粒和非囊泡的颗粒分别在总颗粒中的比率。图32D展示粒径大于150微米细胞外颗粒和非囊泡的颗粒分别在总颗粒中的比率。图中结果为均数±标准差,实验重复次数=3。P≤0.05;**,P≤0.01;***,P≤0.001与在特定的颗粒大小的组内用0.5%聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)处理过的样品比较。图34显示用本发明的CD81核酸配适体在人血清里捕获的细胞外纳米颗粒大部分是生物膜包裹的大型外泌体。显示如图示的各种方法从500微升人血清中捕获的细胞外颗粒后,用纳米粒子跟踪分析仪的计数,得出总颗粒浓度。然后样品用0.5%聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)处理把生物膜溶解,再用纳米粒子跟踪分析仪的计数得出非囊泡的颗粒浓度进而计算出真正的细胞外囊泡的得率。图34A展示各种方法得到的粒径为50-80微米细胞外囊泡(小型外泌体)在那种方法得到的总的细胞外囊泡中的比率。图34B展示各种方法得到的粒径为80-120微米细胞外囊泡(大型外泌体)在那种方法得到的总的细胞外囊泡中的比率。图34展示各种方法得到的粒径为120-150微米细胞外囊泡(大型外泌体)在那种方法得到的总的细胞外囊泡中的比率.图34D展示各种方法得到的粒径大于150微米细胞外囊泡(微囊泡体)在那种方法得到的总的细胞外囊泡中的比率。图中结果为均数±标准差,实验重复次数=3。*,P≤0.05;**,P≤0.01与本组内超速离心的样本相比。#,P≤0.05;##,P≤0.01与本组内用超滤,G-50葡聚糖凝胶过滤或与二个市场上卖的用CD81抗体的亲和分离的试剂盒提纯的样品比较。
实施例14
由CD81适配体分离的外泌体具有促进细胞增殖方面的功能
外泌体可以通过其胞内物质,如蛋白质,脂质和RNA(miRNA,lnRNA和snRNA),的介导来完成细胞间通讯功能。上述实验已证实,CD81适配体制备的外泌体具有高纯度和狭窄尺寸分布等特点,本实施例将进一步确定其所分离的外泌体是否仍具有细胞功能。
为此,本实施例采用人结肠癌HT29细胞作为外泌体的供体,在其培养基中加入0.5%去除外泌体的血清(EDS),再在37℃二氧化碳细胞孵育箱中培养48小时。然后使用基于生物素标记的CD81适配体–磁珠系统分离上述细胞培养基(CCM)中的HT29外泌体。适配体包含有内置二硫键(如图35B中的S-S),可以使用还原剂(100mM的三(2-羧乙基)膦盐酸盐/TCEP,37℃孵育5分钟)非常温和地裂解并释放CD81适配体-磁珠所捕获的外泌体。作为平行实验,本发明同时使用基于CD81抗体亲和力的商业CD81 Exo-Flow试剂盒分离并释放HT29外泌体。使用NTA分析每个样品的颗粒数和囊泡数后,将真正的囊泡而非颗粒(5×108囊泡/孔)加入事先培养在96孔板中仅在DMEM中培养的HEK293T细胞。孵育48小时后,通过MTT细胞活力测定法评估每个孔中细胞增殖情况(如图35A)。如图35C所示,CD81适配体或抗体分离的外泌体均显著促进HEK293T细胞增殖。然而,CD81适配体分离的外泌体较CD81抗体分离的外泌体促进细胞增殖的效果更为显著(P≤0.05)(如图35C)。以上限制细胞增殖的因素之一可能与释放外泌体的缓冲液有关。或者说,用于释放CD81适配体-磁珠所捕获外泌体的TCEP很可能比CD81 Exo-Flow试剂盒中提供的洗脱缓冲液更温和。因此,CD81适配体分离的外泌体较基于抗体的亲和分离方法更好的保存了其原有的细胞功能。
此外,与基于抗体的CD81 Exo-Flow相比,基于CD81适配体的外泌体分离更有效且更经济(如表10)。因此,基于CD81适配体的外泌体分离试剂盒将成为市场上其他外泌体分离试剂盒极具潜力的替代品。
图35显示用本发明的CD81核酸配适体捕获的外泌体保持了原有的生物活性能够促进人源细胞在体外的细胞增殖.图35A,整个实验的流程图。图35B,显示CD81的配适体的基底部与磁珠结合的链接中带有一个二硫键。捕获到外泌体以后,加入还原剂(三(2-羰基乙基)磷盐酸盐),二硫键被打开,外泌体就可温和地从磁珠上释放出来。图35C,体外的细胞增殖实验(用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物方法,MTT)。用本发明的CD81核酸配适体从HT29细胞培养上清液中捕获外泌体。在毎2000个HEK293T细胞培养孔中,加入5×108的HT29外泌体48小时后检测MTT。以HEK293T细胞加MTT试剂作基准度数。图中结果为均数±标准差,实验重复次数=3。P≤0.01;***,P≤0.001与基准相比.#,P≤0.05与用CD81 Exo-Flow试剂盒提取的外泌体组比。
表10.CD81 Exo-Flow试剂盒and CD81适配体对比
实施例15
CD81适配体能够在2000个上皮细胞粘附分子(EpCAM)阴性外泌体的背景中检测出一个EpCAM阳性外泌体
外泌体在癌症医学中最有前景的应用之一是其在液体活检中的应用。然而,外泌体液体活检面临的关键挑战之一是在由血细胞产生的外泌体的广泛背景中检测非常少量的癌症衍生的外泌体。例如,人血液中的总囊泡计数为7.3-9.4×1010/mL,其中93.9%囊泡来源于血小板,4.5%来自于白细胞,1.8%来自与红细胞,1%来自于内皮细胞,0.7%来源于造血干细胞(PLoS One.13(12):e0207950,2018)。现有技术中已知的,不同个体的癌症患者和健康供者的血浆外泌体浓度可以上下浮动40至50倍,并且癌症患者血浆外泌体平均浓度(0.9±1.2×109)/mL)和健康对照者(1.2±1.2×109/mL)没有显著差异。另一方面,来自肺癌供体的血浆中外泌体浓度为1.41±0.31×1010/mL,而健康供体的外泌体浓度为3.37±0.39×109/mL,即肺癌患者血液中外泌体浓度比健康对照者高3.4倍。已确定所有200种左右的人源细胞可以释放外泌体,其中大多数外泌体可能进入血液循环。因此,来自肿瘤细胞的外泌体仅占血液中总外泌体极小的比例。所以,想在患者血液样本广阔的外泌体背景中检测肿瘤细胞来源的外泌体就像“在大海捞针”。
EpCAM在许多类型的实体癌中过表达。事实上,第一个也是唯一一个FDA批准的液体活检CellSearch,就是使用针对EpCAM的单克隆抗体来检测循环肿瘤细胞(CTC)以实现转移性乳腺癌和其他实体肿瘤的诊断。
本实施例希望在液体活检的背景下建立基于CD81适配体的外泌体检测系统的检测限。为此,本实施例从高表达EpCAM(~1.2×106/细胞)的人结肠癌HT29细胞系和不表达EpCAM的人胚肾HEK293T细胞系中分别提取外泌体。对于初始测试,本发明建立了基于适配体的夹心流式分析系统,以确定在EpCAM阴性外泌体背景中EpCAM阳性外泌体的检测限。
在健康者的血液中,EpCAM阳性细胞或EpCAM阴性外泌体几乎检测不到。为了建立类似于临床的测定条件,本实施例制备了总外泌体浓度为4×1010/ml的样品,以模拟患者血液中的外泌体计数。对于检测限的测定,首先制备了范围为1:000至1:8000不同比例的EpCAM阳性与EpCAM阴性外泌体的混合液。对于该4×1010/ml的外泌体溶液,具有连续滴定的EpCAM阳性与EpCAM阴性外泌体的比例。其次,通过异硫氰酸荧光素和生物素双标记的CD81适配体捕获外泌体的混合液中的所有外泌体,并使用磁珠固定适配体-外泌体复合物。随后,分别用藻蓝蛋白标记的抗人EpCAM抗体或Q670标记的EpCAM适配体对每组中捕获的EpCAM阳性的外泌体进行染色。最后,将磁珠-CD81适配体-外泌体复合物进行流式细胞检测和分析。呈荧光阳性的磁珠百分比超过1%时被认为是阳性。结果如图36和37所示,图36显示本发明的能够用于超灵敏的上皮细胞粘附分子阳性的外泌体的检测。图36A,展示基于流式细胞仪的本检测的流程。图36B,本发明的CD81核酸配适体捕获的HT29细胞产生的外泌体与100微升8.33nM的别藻蓝蛋白标记的上皮细胞粘附分子抗体孵育。图36C,本发明的CD81核酸配适体捕获的HT29细胞产生的外泌体与同样浓度的类星球体670(Quasar 670亚磷酰胺)标记的上皮细胞粘附分子核酸配适体与HT29细胞产生的外泌体孵育。图37本发明的CD81核酸配适体在模拟液体活检中能够在2000个不表达上皮细胞粘附分子的外泌体的背景里检测到单个上皮细胞粘附分子阳性的外泌体。流式细胞仪检测异硫氰酸荧光素(FITC)的荧光以确认异硫氰酸荧光素标记的CD81核酸配适体确实是被固定在磁珠(2.7微米)上。流式细胞仪检测别藻蓝蛋白(APC)的荧光以确认别藻蓝蛋白标记的抗上皮细胞粘附分子的抗体或核酸配适体是与被本发明的CD81核酸配适体捕获的外泌体结合。实验组为磁珠本身,同型匹配抗体或随机序列的核酸配适体的阴性对照,以及源与上皮细胞粘附分子阳性的HT29细胞分泌的外泌体与源与上皮细胞粘附分子阴性的HEK293T细胞分泌的外泌体的系列有限稀释,1:8000,1:5000,1:2000和1:1000.流式细胞仪检测到在总的样品里有1%别藻蓝蛋白荧光阳性事件作为上皮细胞粘附分子阳性的检测阈.图37A展示被CD81核酸配适体捕获并固定在磁珠上的外泌体与上皮细胞粘附分子单克隆抗体孵育后在流式细胞仪上检测的异硫氰酸荧光素和别藻蓝蛋白荧光的双变点图。图37B展示被CD81核酸配适体捕获并固定在磁珠上的外泌体与上皮细胞粘附分子DNA配适体孵育后在流式细胞仪上检测的异硫氰酸荧光素和别藻蓝蛋白荧光的双变点图。
如图37A所示,来自藻蓝蛋白标记的EpCAM抗体(Q2)的阳性信号的百分比在HT29EpCAM阳性外泌体与HEK293T EpCAM阴性外泌体的比例为1:1000时达到1%。相比之下,来自Q670 EpCAM适配体(Q2)的信号在1:2000时为1%(图37B)。以上数据表明,在本实施例的系统中EpCAM抗体和EpCAM适配体的检测限分别为1:1000和1:2000。而从2000个EpCAM阴性外泌体背景中检测到1个EpCAM阳性外泌体的检测限是前所未有的,也就是说本发明进一步完善了基于CD81适配体-磁珠的液体活检系统,以实现更高的灵敏度。
实施例16
使用等温滴定法研究CD81胞外大环结构与两种不同CD81适配体(即2J-6和2F-2)之间相互作用的热力学和动力学曲线:
虽然蛋白质-适配体结合的知识对于评估适配体性能至关重要,但是探索相互作用的热力学和动力学方面的研究仍然很少。为了使用适配体作为诊断工具,我们首先研究了CD81胞外大环(LEL)与两种不同CD81适配体(即CD81-2J-6和CD81-2F-2)之间相互作用的热力学和动力学特征。其次,探索适配体-CD81蛋白相互作用的分子机制以及结合位点。
首先,在含有2.5mM MgCl2的PBS中溶解两个适配体。然后,在95℃变性5分钟,再在冰上冷却5分钟。最后,在37℃孵育15分钟进行折叠。实验中,使用NanoDropTM2000(ThermoScientificTM,United States)测量适体的浓度。
ITC实验在25℃条件下用Microcal PEAQ-ITC仪器(Malvern InstrumentsLimited,United Kingdom)进行检测。在包含PBS pH 7.4,2.5mM MgCl2,1.33%海藻糖,1.33%甘露醇,and 0.0027%吐温80的ITC缓冲液中制备适配体和CD81细胞外大环蛋白。将注射器中的适配体溶液(68μM)注入二聚体CD81包外大环蛋白溶液中(3.33μM)[7-10]。除第一次注射(0.4μL)外,每次注射的适配体溶液体积均为2μL。所有实验均在以下条件下进行:每次注射间隔为250秒,共进行19次注射,注射器搅拌速度为750rpm,参考功率为10.0μcals-1。从Micro PEAQ-ITC分析软件获得结合参数(N),结合亲和力(KD)和热力学参数(ΔH)等化学计量。然后使用以下等式[11]计算自由能(ΔG)和熵(ΔS):
ΔG=RTlnKD
ΔG=ΔH–TΔS
其中,R是通用气体常数,T是以开尔文为单位的温度。
动力学曲线获自AFFIINImeter软件(Software 4Science Developments S.L.,Spain)。
每个结合参数由三次独立测量的平均值±标准差表示。
图38本发明的CD81核酸配适体在与人源CD81重组蛋白结合的生物物理热力学测定。图38A展示人源CD81大细胞外结构域重组蛋白与CD81-2J-6核酸配适体结合的等温滴定量热法和温谱图。图38A展示人源CD81大细胞外结构域重组蛋白与CD81-2F-2核酸配适体结合的等温滴定量热法和温谱图。
结果如图38所示,图38为代表性的ITC热分析图,其中图38A为D81 LEL-2J-6相互作用的结合等温线,其中图38B为CD81 LEL-2F-2相互作用的结合等温线。其中CD81 LEL与2J-6的相互作用是放热的,但与2F-2的相互作用吸收了热量。此外,来自2F-2和CD81 LEL之间结合的热量的综合数据可以很好地拟合到1:1结合模型,但是2J-6适合具有2个逐步结合位点的顺序结合模型。这种顺序性质也在相互作用的两相等温线中清楚地显示(图38A)。其原因是,在溶液中CD81 LEL是以不可分离的同型二聚体形式存在。该研究结果与Kong等对CD81 LEL的结合位点的报道一致。
表11.两种适配体与CD81 LEL之间的结合参数
表11表示两个适配体的热力学和动力学参数,2J-6适配体与CD81蛋白的第一次结合是由艰难的熵变(焓变1of-9.30±1.02kcal/mol and–(焓变-吉布斯自由能)1of2.08±0.83kcal/mol)驱动的,并且具有较弱的结合亲和力(解离常数1=5.19±1.56μM)。然而,第一次的结合使得第二个2J-6适配体与CD81蛋白结合的更加紧密(解离常数1>>解离常数2),而且这一现象本质上是正协同的。2F-2适配体与CD81蛋白的结合也是在熵变的驱动下完成,且具有较弱的结合亲和力(解离常数=4.28±1.10μM)和较低的结合位点(N of0.13±0.04)。动力学曲线进一步证明,2F-2适配体与CD81蛋白间的相互作用具有一般的结合常数(结合速率常数=2.32×104M-1s-1),但其解离常数相对较高(解离速率常数=2.63×10-1s-1),表明2F-2适配体与CD81蛋白的相互作用可能较弱。
与流式细胞术测量相似,两种CD81适配体与CD81蛋白的亲和力约为70nM。然而,等温滴定量热法实验结果表明,两种适配体具有完全不同的热力学性质。具体而言,2F-2适配体通过1:1结合模型与可溶性CD81 LEL相互作用,且具有非常低的结合位点和弱的结合亲和力。2J-6适配体通过具有2个逐步结合位点的顺序结合模型与CD81相互作用。其中,第一次结合较弱,结合亲和力为5.19±1.56μM,但第二次结合强得多,结合亲和力增加42倍。然而,2J-6适配体与CD81蛋白的两种相互作用都是由焓驱动的,表明2J-6适配体具有极高的特异性。
表12.文库内包含的部分DNA序列列表
序列表
<110> 苏州吉玛基因股份有限公司
迪肯大学
<120> 一种CD81的适配体及其应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcatttagcc gacatccggt tggtttatgg tttccctaaa 40
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccgacatccg gttggtttat ggtttcccta aa 32
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccgacatccg gggttggttt ccca 24
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
catttagccg acatccggtt ggtttatg 28
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cgtttagccg ccatccgggc ggcttacg 28
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
catttgacca tccgggtcta tg 22
<210> 7
<211> 756
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atgggagtgg agggctgcac caagtgcatc aagtacctgc tcttcgtctt caatttcgtc 60
ttctggctgg ctggaggcgt gatcctgggt gtggccctgt ggctccgcca tgacccgcag 120
accaccaacc tcctgtatct ggagctggga gacaagcccg cgcccaacac cttctatgta 180
ggcatctaca tcctcatcgc tgtgggcgct gtcatgatgt tcgttggctt cctgggctgc 240
tacggggcca tccaggaatc ccagtgcctg ctggggacgt tcttcacctg cctggtcatc 300
ctgtttgcct gtgaggtggc cgccggcatc tggggctttg tcaacaagga ccagatcgcc 360
aaggatgtga agcagttcta tgaccaggcc ctacagcagg ccgtggtgga tgatgacgcc 420
aacaacgcca aggctgtggt gaagaccttc cacgagacgc ttgactgctg tggctccagc 480
acactgactg ctttgaccac ctcagtgctc aagaacaatt tgtgtccctc gggcagcaac 540
atcatcagca acctcttcaa ggaggactgc caccagaaga tcgatgacct cttctccggg 600
aagctgtacc tcatcggcat tgctgccatc gtggtcgctg tgatcatgat cttcgagatg 660
atcctgagca tggtgctgtg ctgtggcatc cggaacagct ccgtgtacgg gggtggaggc 720
tctcaccatc accaccatca tcaccaccat cactaa 756
<210> 8
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Met Gly Val Glu Gly Cys Thr Lys Cys Ile Lys Tyr Leu Leu Phe Val
1 5 10 15
Phe Asn Phe Val Phe Trp Leu Ala Gly Gly Val Ile Leu Gly Val Ala
20 25 30
Leu Trp Leu Arg His Asp Pro Gln Thr Thr Asn Leu Leu Tyr Leu Glu
35 40 45
Leu Gly Asp Lys Pro Ala Pro Asn Thr Phe Tyr Val Gly Ile Tyr Ile
50 55 60
Leu Ile Ala Val Gly Ala Val Met Met Phe Val Gly Phe Leu Gly Cys
65 70 75 80
Tyr Gly Ala Ile Gln Glu Ser Gln Cys Leu Leu Gly Thr Phe Phe Thr
85 90 95
Cys Leu Val Ile Leu Phe Ala Cys Glu Val Ala Ala Gly Ile Trp Gly
100 105 110
Phe Val Asn Lys Asp Gln Ile Ala Lys Asp Val Lys Gln Phe Tyr Asp
115 120 125
Gln Ala Leu Gln Gln Ala Val Val Asp Asp Asp Ala Asn Asn Ala Lys
130 135 140
Ala Val Val Lys Thr Phe His Glu Thr Leu Asp Cys Cys Gly Ser Ser
145 150 155 160
Thr Leu Thr Ala Leu Thr Thr Ser Val Leu Lys Asn Asn Leu Cys Pro
165 170 175
Ser Gly Ser Asn Ile Ile Ser Asn Leu Phe Lys Glu Asp Cys His Gln
180 185 190
Lys Ile Asp Asp Leu Phe Ser Gly Lys Leu Tyr Leu Ile Gly Ile Ala
195 200 205
Ala Ile Val Val Ala Val Ile Met Ile Phe Glu Met Ile Leu Ser Met
210 215 220
Val Leu Cys Cys Gly Ile Arg Asn Ser Ser Val Tyr Gly Gly Gly Gly
225 230 235 240
Ser His His His His His His His His His His
245 250
Claims (10)
1.一种核酸适配体,其特征在于,所述核酸适配体为与人CD81特异结合的单链寡核苷酸分子,所述核酸适配体的核苷酸序列如序列表中序列3、序列5或者序列6所示。
2.权利要求1所述的核酸适配体在制备检测人CD81的试剂或试剂盒中的应用。
3.权利要求1所述的核酸适配体在制备提取人CD81的试剂或试剂盒中的应用。
4.权利要求1所述的核酸适配体在制备检测含有人CD81的外泌体的试剂或试剂盒中的应用。
5.权利要求1所述的核酸适配体在制备提取含有人CD81的外泌体的试剂盒中的应用。
6.权利要求1所述的核酸适配体在制备检测和/或诊断癌症的试剂或试剂盒中的应用;所述癌症的诊断标志物包括人CD81。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述癌症为乳腺癌、结直肠癌、肝癌和/或肺癌。
8.权利要求1所述的核酸适配体偶联到固相载体上得到的偶联物。
9.权利要求1所述的核酸适配体交联到固相载体上得到的交联物。
10.根据权利要求8所述的偶联物或者权利要求9所述的交联物,其特征在于,所述的固相载体为磁珠。
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Title |
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外泌体内分子标志物检测及其临床应用;许文荣等;《临床检验杂志》;20170328(第03期);全文 * |
外泌体分离与鉴定方法的研究进展;龚春梅等;《生命科学》;20180326(第03期);全文 * |
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