CN103842813A - 用于对样品中的稀少目标细胞进行细胞计数检测的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于对一个样品中的稀少目标细胞进行检测的细胞计数方法。在某些方面，这些方法和组合物可以协助对在一个生物样品诸如血液中的稀少目标细胞例如循环肿瘤细胞（CTC）进行检测。这些方法的方面包括使该样品与特异性地结合至该稀少目标细胞的一种标志物的第一和第二结合成员接触，并且针对包括结合的第一和第二结合成员的细胞的存在对该样品进行细胞计数测定以检测在该样品中的该稀少目标细胞。还提供了用于实践这些主题方法的系统、组合物、以及试剂盒。

Description

用于对样品中的稀少目标细胞进行细胞计数检测的方法和组合物
相关申请的交叉引用
根据35U.S.C.§119(e)，本申请案要求2011年9月6日提交的美国临时专利申请序列号61/531,575的提交日期的优先权；将该申请案的披露通过引用结合于此。
简介
流式细胞术是研究中被很好接受的工具，它允许用户对样品流体中的组分进行快速分析和分类。流式细胞计数器使用一种载液（例如，鞘液（sheath fluid））以使样品组分（基本上一次一个组分）通过一个照射区。通过光源（例如激光）对每个样品组分进行照射，并且对由每个样品组分散射的光进行检测并分析。这些样品组分可以在它们退出照射区时基于它们的光学和其他特征来分离。
循环肿瘤细胞（CTC）是从肿瘤流出进入受试者血流中的细胞。一旦在血液中，这些细胞可以循环通过受试者的身体，在体内它们可以入侵其他组织并且生长出新的肿瘤。因此CTC牵涉到转移，转移是患有癌症的受试者中死亡的主要致因。对CTC进行计数的努力已经通过以下事实受到妨碍：CTC极其难以检测，它们是异常稀少的，并且难以将其与健康细胞区分开来。用于检测CTC的现存方法在敏感性和/或特异性方面具有限制，导致许多健康细胞被错误表征为癌性的，并且许多癌细胞在分析中漏掉。
概述
本披露提供了用于对一个样品中的稀少目标细胞进行检测的细胞计数方法。在某些方面，这些方法可以协助对生物样品（血液）中的稀少目标细胞（例如，循环肿瘤细胞（CTC））进行检测。这些方法的方面包括使该样品与特异性地结合至该稀少目标细胞的一种标志物的第一和第二结合成员接触，并且针对包括结合的第一和第二结合成员的细胞的存在对该样品进行细胞计数测定以检测在该样品中的该稀少目标细胞。还提供了用于实践这些主题方法的系统、组合物、以及试剂盒。
感兴趣的稀少目标细胞包括但不限于原核细胞（例如，细菌细胞或古细菌细胞）以及真核细胞（例如，哺乳动物细胞，例如神经细胞、肌细胞、上皮细胞（例如，循环肿瘤细胞）、干细胞（例如，造血干细胞）、脂肪细胞等等）。稀少目标细胞可以从一个范围的样品来检测，这些样品包括获得自体外来源（例如，来自培养生长的实验室细胞的细胞悬浮液）或来自体内来源（例如，哺乳动物受试者、人类受试者、等）的样品。
各种结合成员可以用于实践这些主题方法。结合成员可以特异性地结合至稀少目标细胞的一种标志物。感兴趣的标志物可以包括但不限于CD1a、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD10、CD11b、CD13、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD22、CD23、CD25、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、CD45、CD56、CD57、CD59、CD61、CD64、CD71、CD74、CD79a、CD90、CD103、CD117、CD133、CD138、CD271、CD303、CD304、bcl-2、C-kit、TdT、FMC7、SCA-1、血型糖蛋白A、细胞角蛋白、EpCAM、EphB4、EGFR、CEA、HER2以及MUC-1。在某些方面，标志物可以位于稀少目标细胞的表面上、和/或稀少目标细胞内部。可以对有核细胞进行透化以允许第一和第二结合成员结合至细胞内标志物。在主题方法的某些方面，样品中的非稀少细胞没有进行染色（例如，对于CD45没有被染色）。
在某些方面中，结合成员可以被标记。结合成员的标记可以是直接的或间接的，如在此更完整地描述的。感兴趣的标记包括但不限于吲哚碳菁（C3）、吲哚二碳菁（C5）、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、德克萨斯红（Texas Red）、太平洋蓝（Pacific Blue）、俄勒冈绿（Oregon Green）488、亚历克萨荧光染料（Alexa fluor）-355、亚历克萨荧光染料（Alexa fluor）488、亚历克萨荧光染料（Alexa fluor）532、亚历克萨荧光染料（Alexa fluor）546、亚历克萨荧光染料（Alexa fluor）-555、亚历克萨荧光染料（Alexa fluor）568、亚历克萨荧光染料（Alexa fluor）594、亚历克萨荧光染料（Alexa fluor）647、亚历克萨荧光染料（Alexa fluor）660、亚历克萨荧光染料（Alexa fluor）680、亚历克萨荧光染料（Alexa fluor）700、JOE、丽丝胺（Lissamine）、罗丹明绿（Rhodamine Green）、BODIPY、异硫氰酸荧光素（FITC）、羧基荧光素（FAM）、藻红蛋白、罗丹明、二氯罗丹明（dRhodamine）、羧基四甲基罗丹明（TAMRA）、羧基-X-罗丹明（ROX）、LIZ、VIC、NED、PET、SYBR、PicoGreen、RiboGreen、等等。
感兴趣的结合成员包括抗体、及其抗原结合片段。在一些实施例中，在第一结合成员和第二结合成员是抗体或其抗原结合片段时，它们结合至标志物的相同的表位。
本披露还提供了试剂盒。试剂盒可以包括第一和第二结合成员，这些第一和第二结合成员特异性地结合至稀少目标细胞的标志物；说明书，用于指导使用这些第一和第二结合成员来针对包括结合的第一和第二结合成员的细胞的存在对生物样品进行流式细胞计数测定以检测样品中的稀少目标细胞。进一步提供了组合物和系统，如在此更完整地描述的。
附图简要说明
当结合附图阅读时，本发明可以从以下详细说明书得到最好的理解。以下图包括在附图中：
图1是根据本披露的方法的图解概述。在这个具体实例中，将稀少目标细胞（标记为“肿瘤细胞”）用细胞角蛋白（CK）-红和CK-绿两者来标记，而非稀少细胞（此处，为白细胞，或WBC）没有进行标记。这些细胞在流式细胞计数器中向下流动，如由指示流动的箭头所指示的。施用激发光（“Ex-光”）以产生CK-红和/或CK-绿的荧光。在每个标记是荧光染料的情况下，将两种颜色荧光灯的组合用作流式细胞计数测定中的阈值。所得到的CK-红荧光（y-轴）对CK-绿荧光（x-轴）的密度图显示了由仪器检测出的肿瘤细胞数目。
图2，图A-B描绘了异硫氰酸荧光素（FITC，图A）标记以及亚历克萨荧光染料647（图B）标记的发射光谱。对于各自的激光激发光线是由箭头指示。
图3是本披露的测定程序的流程图。根据生产商的说明书将7.5mL样品在BD Vacutainer CPT管中进行旋转，以分离WBC部分。随后将WBC部分进行固定、透化、染色、并且经由FACS（例如，通过BD BiosciencesFACSCantoTM流式细胞计数器）进行分析。
图4，图A-D是密度图，显示了在WBC存在下对来自血液的不同浓度的HT-29肿瘤细胞的富集和分析。图A：使包含10,000HT-29细胞/mL的0.5mL血液样品经历红细胞溶解、固定、和离心。将WBC部分去除并且透化。添加入CK-FITC和CK-Alexa647，持续60m。使用BD BiosciencesFACSCantoTM流式细胞计数器对样品进行分析。图B：HT-29细胞是以1,000HT-29细胞/mL的起始浓度存在。图C：HT-29细胞是以100HT-29细胞/mL的起始浓度存在。图D：HT-29细胞是以0HT-29细胞/mL的起始浓度存在。
图5，图A-C是密度图，显示了在WBC存在下对来自血液的HT-29肿瘤细胞的富集和分析。将血液样品用1x BD FACS细胞溶解溶液进行溶解，以将样品中的红细胞溶解。将这些样品用1x BD FACS透化溶液2进行透化，进行洗涤，然后以0.55mL Rx体积用CK Ab-FITC和CK Ab-A647轭合物进行细胞内染色，并且在不用进一步洗涤的情况下，根据生产商说明书，在BD Biosciences FACSCantoTM流式细胞计数器上在介质流速（36μL/min）下，对0.36mL的这种混合物进行计数。图A：阳性计数，使用7.5mL血液和10,000HT-29细胞/mL的浓度。图中显示了1分钟计数。图B：阴性计数，使用7.5mL血液和0HT-29细胞/mL的浓度。图中显示了10分钟计数。图C：仅有缓冲液，15分钟计数。累积地，图A-C显示了在34,363,636WBC的背景上观察到一个HT-29肿瘤细胞，并且对于“仅缓冲液”而言在15分钟运行过程中没有假阳性点记录。
图6，图A-C显示了本披露的方法的辨别效率。将包含WBC和HT-29肿瘤细胞的样品如在此描述地进行制备，并且用CK-APC和CK-FITC进行标记。图A和B：典型的一种颜色密度图，显示SSC对APC（图A）和FITC（图B）。HT-29肿瘤细胞由图中的颜色较深的点表示，并且可以易于从非特异事件中检测到。图C：测量样品中的APC和FITC两者导致窄对角地下行的点图，并且肿瘤细胞易于鉴定。
图7，图A-C显示了图6的样品中的阴性样品。没有HT-29肿瘤细胞存在于这些样品中。图A和图B：一种颜色的密度图，显示SSC对APC（图A）和FITC（图B）揭示了许多假阳性。图C：没有观察到假阳性事件。
图8，图A-C显示样品中的HT-29肿瘤细胞的图像，使用不同起始浓度。将包含WBC和HT-29的样品用CK-FITC和CK-PE进行染色。HT-29细胞是以5,000细胞/mL（图A）、500细胞/mL（图B）、或0.0细胞/mL（图C）的浓度存在。在PE通道中甚至在0.0细胞/mL（图C）的HT-29细胞浓度下，观察到事件。
图9，图A-B显示了在WBC存在下来自血液的HT-29肿瘤细胞的测定方案和图像。图A：用于使细胞成像的测定程序。如在图5中上述的来制备样品，并且使用蔡司（ZEISS）显微镜使用汞弧灯来成像。图B：从左至右：分别是包含CK-FITC的细胞（FITC通道）、包含CK-Alexa647的细胞（APC通道）的图像，以及图像叠加。所有的图表示100倍图像。
图10显示了对样品制备技术进行比较的图。标有“细胞溶解”的图涉及使用细胞溶解和离心来处理血液中的HT-29肿瘤细胞。标有“CPT”的图涉及使用BD Vacutainer CPT管的处理。
详细说明
本披露提供了用于对一个样品中的稀少目标细胞进行检测的细胞计数方法。这些方法的方面包括使该样品与特异性地结合至该稀少目标细胞的一种标志物的第一和第二结合成员接触，并且针对包括结合的第一和第二结合成员的细胞的存在对该样品进行细胞计数测定以检测在该样品中的该稀少目标细胞。还提供了用于实践这些主题方法的系统、组合物、以及试剂盒。
在更详细地描述本发明之前，应理解的是本发明不限于所描述的具体实施例，因为这些可以改变。还应理解的是，在此使用的术语仅是出于描述具体实施例的目的，并且不旨在限制，因为本发明的范围将仅有所附权利要求书限制。
在一个范围的值被提供时，应理解的是，每个介于中间的值，到下限的第十个单位，除非上下文清楚地指出，该范围的上限和下限之间以及在该陈述范围内的其他陈述的或介于中间的值被涵盖在本发明之内。这些更小范围的上限和下限可以独立地被包括在更小的范围内，并且还被涵盖在本发明之内，服从所陈述范围内的任何确切排除的限制。在所陈述范围包括一个或两个这些限制时，排除那些被包括的限制的任一者或两者的范围也被包括在本发明之内。
除非另外限定，在此使用的所有的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。虽然任何类似于或等同于在此描述的那些的方法和材料也可以用于本发明的实践或测试中，现在仍描述了代表性的说明性方法和材料。
在本说明书中引用的所有公开物和专利通过引用结合于此，就好像每个单独的公开物或专利被确切地并单独地指示为通过引用结合，并且通过引用结合于此从而结合引用的公开物披露和描述这些方法和/或材料。任何公开物的引用是针对在提交日期之前它的披露，并且不应当解释为承认本发明无权借助于先前发明提前于此公开物。另外，提供的公开日期可以不同于需要独立证实的实际公开日期。
应指出的是，如在此使用的，并且在所附权利要求书中，单数形式“一个”、“一种”、和“该”包括复数指示物，除非上下文另外清楚地指明。另外指出的是，权利要求书可以被撰写为排除任何可选择的要素。这样，本声明旨在充当对于结合了所要求要素的引用而使用此类排除性术语如“唯一地”、“仅”、等的先行基础，或充当对于使用“阴性”限制的先行基础。
如本领域的技术人员在阅读本披露时将清楚的是，每一个在此描述和说明的单独的实施例具有分离的组分和特征，它们可以易于与任何其他若干实施例的特征分离或组合，而不偏离本发明的范围或精神。可以按照引用的事件的顺序或按照逻辑上可能的任何其他顺序进行任何引用的方法。
方法
如上所述，本披露提供了用于对样品中的稀少目标细胞进行检测的细胞计数方法。在此使用术语“细胞计数方法”来描述流式细胞计数方法和/或成像细胞计数方法。因此，“细胞计数测定”可以是指流式细胞计数测定和/或成像细胞计数测定，并且“细胞计数器”可以是指流式细胞计数器和/或成像细胞计数器。
本发明的实施例的方面包括使该样品与至少第一和第二结合成员接触，这些第一和第二结合成员特异性地结合至稀少目标细胞的标志物。通过经由细胞计数查询样品以检测包含结合的第一和第二结合成员的细胞的存在，可以在样品中检测到稀少目标细胞。
在一些实施例中，本发明的检测样品中的稀少目标细胞的方法是定性的，其中稀少目标细胞的检测是定性的，例如作出关于目标细胞存在或不存在于样品中的确定。在一些实施例中，本发明检测样品中的稀少目标细胞的方法是定量的，其中稀少目标细胞的检测是定量的。这些方法可以包括对样品中的稀少目标细胞的数目的定量量度进行确定。在一些实施例中，对样品中的稀少目标细胞的数目进行定量包括确定存在的稀少目标细胞的数目是否是在预先确定的阈值之上或之下。
现在将在下文中更详细地描述这些方法的不同步骤和方面。
稀少目标细胞
如上所述，本披露提供了用于对样品中的稀少目标细胞进行检测的细胞计数方法。如在此使用的，术语“稀少目标细胞”用于指代存在于样品中的任何细胞类型，其中该类型细胞的数目小于样品中细胞总数目的50.0%，例如小于40%、小于30%、小于20%、小于10%、小于1%、小于0.1%、小于0.01%、或小于0.001%。在某些方面，在细胞样品中非稀少细胞在数目上以104或更多（105或更多，包括106或更多、107或更多、108或更多、或109或更多）的系数超过稀少目标细胞。感兴趣的稀少目标细胞类型包括但不限于原核细胞（例如，细菌细胞或古细菌细胞）以及真核细胞（例如，哺乳动物细胞，例如神经细胞、肌细胞、上皮细胞（例如，循环肿瘤细胞）、干细胞（例如，造血干细胞）、稀少淋巴细胞（例如，调节性T细胞）、脂肪细胞等）。
术语“非稀少细胞”可以用于指代样品中不是稀少目标细胞的那些细胞。非稀少细胞可以是任何类型，包括但不限于，原核细胞（例如细菌细胞或古细菌细胞）以及真核细胞（例如，哺乳动物细胞，例如神经细胞、白细胞、肌细胞、上皮细胞、脂肪细胞等）。在这些主题方法的某些方面中，在细胞计数分析之前，非稀少细胞没有进行特异性的标记和/或染色。例如，在某些方面中，非稀少细胞不是CD45染色的。在某些方面中，非稀少细胞可以比稀少细胞大幅更少地被标记（例如，由于非特异性结合）。在某些此类方面，通过细胞计数分析，可以将稀少细胞与大幅更少地标记的非稀少细胞区分开。
样品
如在此使用的术语“样品”和“细胞样品”意指包含以任何希望浓度的在悬浮液中的一种或多种单独细胞的任何样品。例如，细胞样品可以包含1011或更少、1010或更少、109或更少、108或更少、107或更少、106或更少、105或更少、104或更少、103或更少、500或更少、100或更少、10或更少、或一个细胞/毫升。该样品可以包含已知数目的细胞或未知数目的细胞。合适的细胞包括真核细胞（例如，哺乳动物）和/或原核细胞（例如，细菌细胞或古细菌细胞）。
在实践本发明的方法中，该样品可以获得自体外来源（例如，来自培养生长的实验室细胞的细胞悬浮液）或获得自体内来源（例如，哺乳动物受试者、人类受试者、等）。在一些实施例中，细胞样品是获得自体外来源。体外来源包括但不限于，原核（例如，细菌、古细菌）细胞培养物、包含原核和/或真核（例如，哺乳类、protest、真菌，等）细胞的环境样品、真核细胞培养物（例如，建立的细胞系的培养物，已知的或购买的细胞系的培养物，固定化细胞系的培养物，原代细胞培养物，实验室酵母菌培养物，等）、组织培养物、等等。
在一些实施例中，该样品是获得自体内来源，并且可以包括获得自组织（例如，来自组织活检的细胞悬浮液，来自组织样品的细胞悬浮液，等）和/或体液（例如，全血，分级的血液，血浆，血清，唾液，淋巴液，间质液，等）的样品。在一些情况下，在评估之前，对衍生自受试者的细胞、流体、或组织进行培养、储存或操作。体内来源包括活的多细胞生物，并且可以产生非诊断性或诊断性细胞样品。
在某些实施例中，样品的来源是“哺乳动物”或“哺乳类”，其中这些术语被广泛地用于描述在哺乳纲之内的生物，包括食肉目（例如，狗和猫）、啮齿目（例如，小鼠、豚鼠、和大鼠）、以及灵长类（例如，人类，黑猩猩，以及猴子）。在一些情况下，受试者是人类。这些方法可以应用于获得自两种性别的以及在任何发育阶段（即新生儿、婴儿、幼年、青春期、成年）的人类受试者的样品，其中在某些实施例中，人类受试者是幼年、青春期、成年人。尽管本发明可以应用于来自人类受试者的样品，但应理解的是，这些方法还可以对来自其他动物受试者（即，在“非人类受试者”中）的样品来进行，这些其他动物受试者例如但不限于鸟、小鼠、大鼠、狗、猫、牲畜以及马。
用于当前方法中的样品可以是通过任何方便的方法获得的。在某些方面，该样品是通过静脉穿刺获得的血液。血液可以从受试者获得，并且可以在细胞计数分析之前进行操作。对于细胞计数分析而言，获得并操作样品的方法在本领域中是熟知的。例如，在某些方面，可以使用如在图3中呈现的测定来操作样品。在此实例中，血液样品是遵照标准静脉穿刺方案通过静脉穿刺从一个受试者中获得的。将细胞样品收集在BD
Figure BDA0000472711780000091
CPT管中，并且根据生产商说明书进行操作。将该管在大约室温（大约18℃至大约25℃）下在大约1500至大约1800的相对离心力下离心20分钟或更长。在离心之后，将单核细胞层和血小板层进行收集和再悬浮。可以使用任何方便的方案，例如通过使用可商购的试剂如BD FACS透化溶液2，将这个部分进行固定和/或透化。
结合成员
如上所述，本发明的方面可以包括使该样品与至少第一和第二结合成员接触，这些第一和第二结合成员特异性地结合至稀少目标细胞的标志物。如在此使用的术语“结合成员”是指特异性地结合至稀少目标细胞的标志物的任何试剂（例如，蛋白质、小分子，等等）。术语“特异结合”、“特异性地结合”等等是指相对于溶液或反应混合物中的其他分子或部分而言优先结合至一种分子。在一些实施例中，结合成员与它特异性结合至的稀少目标细胞的标志物之间（当它们特异性地结合彼此在结合复合物中时）的亲和力被表征为以下Kd（解离常数）：10-6M或更小，例如10-7M或更小，包括10-8M或更小，例如10-9M或更小、10-10M或更小、10-11M或更小、10-12M或更小、10-13M或更小、10-14M或更小，包括10-15M或更小。“亲和力”是指结合的强度，增加的结合亲和力与更低的Kd相关。
在本发明的某些方面，可以将一个样品与多于两种的特异性结合至稀少目标细胞的标志物上的结合成员进行接触，例如，3种或更多种、4种或更多种、5种或更多种、6种或更多种、7种或更多种、8种或更多种、9种或更多种，包括大约10至15种，或大约15或更多种。
结合成员可以特异性地结合至稀少目标细胞的一种标志物。如在此使用的，术语“标志物”被广泛地使用，并且通常是指存在于稀少目标细胞的表面上或之内的任何分子，正常而言，该标志物当其在稀少目标细胞上时不是以与在健康的非稀少细胞上的浓度相同的浓度存在的。在某些方面，结合成员可以特异性地结合至稀少目标细胞的不同标志物（例如，不同类型的标志物，例如EpCam和细胞角蛋白）。在某些方面，标志物可存在于稀少目标细胞的表面上。在其他方面，标志物被包含于稀少目标细胞中。在此类方面，可能需要对样品的细胞进行透化，以便使得第一和第二结合成员能够特异性地结合至细胞内标志物。使样品的细胞透化的方法在本领域中是熟知的，并且包括例如，商业试剂和方案，例如BD FACS透化溶液2的使用。任何使细胞透化的方便手段可以用于实践这些方法中。
感兴趣的标志物可以包括但不限于CD1a、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD10、CD11b、CD13、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD22、CD23、CD25、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、CD45、CD56、CD57、CD59、CD61、CD64、CD71、CD74、CD79a、CD90、CD103、CD117、CD133、CD138、CD271、CD303、CD304、bcl-2、C-kit、TdT、FMC7、SCA-1、血型糖蛋白A、细胞角蛋白、EpCAM、EphB4、EGFR、CEA、HER2以及MUC-1。
在一些实施例中，结合成员包括标记或经标记的结合成员。如在此使用的，术语“标记”和“可检测的标记”是指能够检测的分子，包括但不限于放射性同位素、荧光剂、化学发光剂、发色团、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、发色团、染料、金属离子、金属溶胶、配体（例如，生物素、抗生物素蛋白、链霉亲和素或半抗原）、嵌入染料等等。术语“荧光剂”是指能够展现可检测范围内的荧光的一种物质或其部分。
感兴趣的标记包括直接和间接可检测的标记两者。合适的用于在此处描述的方法中使用的标记包括通过光谱的、光化学的、生物化学的、免疫化学的、电子的、光学的、化学的或其他手段间接或直接可检测的任何分子。感兴趣的标记包括但不限于：荧光素及其衍生物；罗丹明及其衍生物；菁蓝及其衍生物；香豆素及其衍生物；瀑布蓝（Cascade Blue）及其衍生物；荧光黄（Lucifer Yellow）及其衍生物；BODIPY及其衍生物；等等。感兴趣的标记还包括：荧光团，例如吲哚碳菁（C3）、吲哚二碳菁（C5）、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、德克萨斯红（Texas Red）、太平洋蓝（PacificBlue）、俄勒冈绿（Oregon Green）488、亚历克萨荧光染料（Alexa fluor）-355、亚历克萨荧光染料（Alexa fluor）488、亚历克萨荧光染料（Alexa fluor）532、亚历克萨荧光染料（Alexa fluor）546、亚历克萨荧光染料（Alexa fluor）-555、亚历克萨荧光染料（Alexa fluor）568、亚历克萨荧光染料（Alexa fluor）594、亚历克萨荧光染料（Alexa fluor）647、亚历克萨荧光染料（Alexa fluor）660、亚历克萨荧光染料（Alexa fluor）680、亚历克萨荧光染料（Alexa fluor）700、JOE、丽丝胺（Lissamine）、罗丹明绿（Rhodamine Green）、BODIPY、异硫氰酸荧光素（FITC）、羧基荧光素（FAM）、藻红蛋白、罗丹明、二氯罗丹明（dRhodamine）、羧基四甲基罗丹明（TAMRA）、羧基-X-罗丹明（ROX）、LIZ、VIC、NED、PET、SYBR、PicoGreen、RiboGreen、等等。
可以使用光检测器（例如在流式细胞计数器中）检测发射光来对荧光标记进行检测。典型地，酶标记是通过以下方式来检测：为酶提供底物，并且对通过酶对底物的作用产生的反应产物进行检测；比色标记可以通过简单地使带色标记可视化来检测；并且抗原标记可以通过提供一种特异性地结合至该抗原标记的抗体（或其结合片段）来检测。特异性地结合至抗原标记的抗体可以是直接或间接可检测的。例如，该抗体可以轭合至一种提供信号（例如，荧光）的标记部分（例如，荧光团）；该抗体可以轭合至酶（例如，过氧化物酶、碱性磷酸酶、等），该酶在供有适当底物（例如，荧光-酪胺，FastRed等）时产生可检测产物（例如，荧光产物）；等等。
这些方法的结合成员可以用不同的标记进行标记。在某些方面，标记被选择为使得这些标记可以与彼此区分开，例如，第一标记与第二标记的发射光谱基本上是不重叠的。例如，图2的图A-B描绘了两种标记—异硫氰酸荧光素（FITC；图A）和亚历克萨荧光染料647（图B）的发射光谱，它们基本上不重叠。可以使用具有在大约488nm处的波长的光激发FITC，并且它的发射光谱可以使用过滤器（例如530/30过滤器）来检测，基本上不与亚历克萨荧光染料647的发射光谱重叠。采用具有非重叠可检测发射光谱的两种不同标记使得产生的流式细胞计数测定结果能够被绘制为密度图，该密度图中y轴上为第一标记的荧光度，而x轴上为第二标记的荧光度（参见例如图1）。
在某些方面，结合成员可以是抗体、或其抗原结合片段。如在此使用的，术语“抗体”包括任何同型抗体或免疫球蛋白，保持对抗原的特异性结合的抗体片段（包括但不限于Fab、Fv、scFv、以及Fd片段）、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体、以及融合蛋白（包括抗体的抗原结合部分和非抗体蛋白质）。抗体可以进一步轭合至其他部分，例如，特异性结合对的成员，例如，生物素（生物素-抗生物素蛋白特异性结合对的成员）等等。被该术语涵盖的还有Fab’、Fv、F(ab’)2和或其他保持对抗原的特异性结合的抗体片段、以及单克隆抗体。
可以使样品与对于稀少目标细胞的相同标志物具有特异性的至少两种结合成员进行接触。在结合成员是抗体时，稀少目标细胞的标志物可以因此包括由这些抗体结合的一种或多种抗原。“抗原”是本领域中很好理解的术语，并且包括可以特异性地由抗体分子或T细胞受体的抗原结合部位结合的任何物质。通过“表位”意指特异性B细胞和/或T细胞所响应的抗原上的一个部位。识别相同表位的抗体可以用简单的免疫测定来鉴定，这种免疫测定显示一个抗体阻断另一个抗体结合目标抗原的能力。在某些方面，抗体（例如，第一结合成员，第二结合成员，第三结合成员，等）结合相同的表位。在其他方面，抗体结合不同的表位。
各种结合成员可以用于给定的感兴趣的标志物。例如，在感兴趣的标志物是CD45时，感兴趣的结合成员包括但不限于，可商购的由克隆C0-F11、HI100、HI30、UCHL1、30-F11、2D1、L48、RA3-6B2和D058-1283产生的抗体（所有的均来自BD Biosciences公司）。然而，在一些情况下，这些方法不包括对CD45进行染色。
在标志物是细胞角蛋白时，感兴趣的结合成员包括但不限于：可商购的由克隆CAM5.2产生的抗体，主要与人类细胞角蛋白7和细胞角蛋白8（BD Biosciences公司）发生反应；由克隆KA4产生的抗体，主要与人类细胞角蛋白14、15、16和19（BD Biosciences公司）发生反应；由克隆RCK102产生的抗体，主要与人类、小鼠、大鼠、仓鼠、猪、狗、和/或兔子细胞角蛋白5和8发生反应，如在罗迪西（Lodish）等人，MCB,2000,795-847中描述的，将其披露通过引用结合于此；由克隆RCK105产生的抗体，主要与人类、小鼠、大鼠、仓鼠、猪、和/或狗细胞角蛋白7发生反应，如在罗迪西（Lodish）等人（如上）中描述的；由克隆AE1/AE3（Millipore）产生的抗体；由克隆C-11产生的抗体，如在米凯利安（Mikaelian）等人（2004）《毒理病理学》（Toxicol Pathol），32:181-191中描述的，将其披露通过引用结合于此；由克隆Lds103产生的抗体，如在索思盖特（Southgate）等人1987《实验室研究》（Lab.Invest.），56:211-223中描述的，将其披露通过引用结合于此；以及由克隆CK2产生的抗体，如在瓦克泰（Wachter）等人（1990）《肝病学杂志》（J.Hepatol.），11:232-239中描述的。
感兴趣的EpCAM结合成员包括但不限于，抗EpCAM抗体BerEP4，如在舍巴尼（Sheibani）等人《外科病理学年度杂志》（Am J Surg Pathol），1991年8月，15(8):779-784中描述的,将其披露通过引用结合于此；KS1/4，如在安托罗维奇（Antolovic），等人（2010）《BMC生物技术》（BMCBiotechnol）10:35中所描述的，将其披露通过引用结合于此；由克隆G8.8产生的抗体，主要与小鼠EpCAM（BD Biosciences公司）发生反应；以及由克隆EBA-1产生的抗体，主要与人类EpCAM发生反应（BD Biosciences公司）。
感兴趣的EGFR结合成员包括但不限于，由克隆13/EGFR产生的抗体；由克隆9H2产生的抗体；由克隆EGFR.1产生的抗体；由克隆12A3产生的抗体；以及由克隆17/eps15产生的抗体（BD Biosciences公司）。
感兴趣的CEA结合成员包括但不限于，由克隆COL-1产生的抗体；由克隆B1.1/CD66产生的抗体；以及由克隆B6.2/CD66产生的抗体（BDBioscience公司）。
感兴趣的HER2结合成员包括但不限于，由克隆Neu24.7产生的抗体；由克隆42/c-erbB-2产生的抗体；由克隆3B5产生的抗体（BD Biosciences公司）；以及由克隆9G6产生的抗体，如在汉考克（Hancock）等人1991《癌症研究》（Cancer Res.）51:4575-4589中描述的，将其披露通过引用结合于此。
感兴趣的MUC-1结合成员包括但不限于由克隆HMPV产生的抗体（BD Biosciences公司）。
细胞计数分析
本披露的方法可以涉及对样品进行流式细胞计数测定。流式细胞计数测定程序在本领域中是熟知的。参见，例如，奥默罗德（Ormerod）（编著），《流式细胞术：实践方法》（Flow Cytometry:A Practical Approach），牛津大学出版社（Oxford Univ.Press）(1997)；乔罗谢夫斯基（Jaroszeski）等人（编著），《流式细胞术方案》（Flow Cytometry Protocols），分子生物学中的方法（Methods in Molecular Biology）91期，胡马纳出版社（HumanaPress）(1997)；《实践流式细胞术》（Practical Flow Cytometry），第三版，Wiley-Liss(1995)；弗戈（Virgo）等人(2012)《临床生物化学年鉴》（AnnClin Biochem.）1月；49(pt1):17-28；林登（Linden），等人，《凝血止血研讨会》（Semin Throm Hemost.）2004年10月;30(5):502-11；Alison，等人《病理学杂志》（J Pathol），2010年12月；222(4):335-344；以及赫尔比希（Herbig）等人（2007）《治疗性药物载体系统锐评》（Crit Rev TherDrug Carrier Syst.）24(3):203-255；将它们的披露通过引用结合于此。在某些方面中，对样品进行流式细胞计数测定涉及使用能够同时激发并检测多荧光团的流式细胞计数器，例如BD Biosciences FACSCantoTM流式细胞计数器，基本上根据生产商说明书使用。本披露的方法可以涉及成像细胞计数，例如描述于霍尔登（Holden）等人（2005）《自然方法》（Nature Methods）2:773和沃莱特（Valet）等人2004《细胞计数》（Cytometry）59:167-171中的，将它们的披露通过引用结合于此。
在这些方法的某些方面中，细胞计数测定包括前向光散射（FSC）和/或侧向光散射（SSC）。在其他方面中，细胞计数测定包括对第一结合成员的标记和第二结合的标记两者进行检测（图4，图A-D和图5，图A-C），其中取代散射光，标记的组合（例如两种颜色荧光灯的组合，其中每个标记是荧光染料）用作测定中的阈值。在此类方面中，对样品中的稀少目标细胞的鉴定可以需要第一标记和第二标记两者的检测。在某些方面中，对样品中的稀少目标细胞的鉴定可以需要多于两种标记的检测（例如，第三结合成员，第四结合成员，等）。
在某些方面中，可以在细胞计数分析之前将非稀少细胞从样品中进行分离。可以采用将非稀少细胞从样品中去除的任何方便手段。感兴趣的分离方法包括但不限于：磁力分离技术，例如描述于以下文献中的那些：美国专利号5,945,281、6,858,440；6,645,777；6,630,355；以及6,254,830；美国专利申请号PCT/US2012/032423；以及霍普纳（Hoeppener）,等人（2012）《癌症研究当前结果》（Recent Results Cancer Res.）195:43-58；将它们的披露通过引用结合于此。感兴趣的分离方法进一步包括包含声集中器或分离器的那些，例如，在美国专利号6,929,750中描述的那些，特此将其披露通过引用结合。
细胞计数分析可以包括分类。可以通过任何方便的分析技术对样品中被鉴定为稀少目标细胞的细胞进行分类并随后进行分析。感兴趣的随后的分析技术包括但不限于，测序；通过CellSearch进行的测定，如在《食品与药品管理》（Food and Drug Administration）（2004）最终条例Fed Regist69:26036-26038中描述的；通过CTC芯片进行的测定，如在纳格瑞思（Nagrath），等人（2007）《自然》（Nature）450:1235-1239中描述的；通过MagSweeper进行的测定，如在塔拉萨兹（Talasaz），等人（2009），《美国国家科学院院刊》（Proc Natl Acad Sci U S A）106:3970-3975中描述的；以及通过纳米结构底物进行的测定，如在王（Wang）S，等人（2011）Angew Chem Int Ed Engl50:3084-3088中描述的；将它们的披露通过引用结合于此。在希望时，分类方案可以包括区分可变的和死亡的稀少细胞，其中对于鉴定此类细胞来说任何方便的染色方案可以结合进这些方法中。
系统
还提供了用于实践这些主题方法的细胞计数系统。这些细胞计数系统可以包括细胞计数样品流体子系统，如下文所述。另外，这些细胞计数系统包括流体地连接至细胞计数样品流体子系统的细胞计数器。本披露的系统可以包括若干另外的部件，例如，数据输出装置（如监测器、打印机、和/或扬声器），数据输入装置（如界面接口、鼠标、键盘等），流体处理部件、电源、等。
在某些方面中，一种细胞计数系统包括细胞计数样品流体子系统，该子系统被配置为使一个包含一种稀少目标细胞的样品与第一和第二结合成员接触，这些第一和第二结合成员特异性地结合至该稀少目标细胞的一种标志物。该子系统可以进一步被配置为使得样品的非稀少细胞不会特异性地被标记和/或染色（例如，对于CD45没有进行染色）。系统可以包括一种细胞计数器，该细胞计数器流体地连接至该细胞计数样品流体子系统。
在其他方面，系统可以包括细胞计数样品流体子系统，该子系统被配置为使一个包含一种稀少目标细胞的样品与第一和第二结合成员接触，这些第一和第二结合成员特异性地结合至该稀少目标细胞的一种标志物；以及细胞计数器，该细胞计数器流体地连接至该流式细胞计数样品流体子系统，该细胞计数器被配置为针对包括结合的第一和第二结合成员的细胞的存在对样品进行测定以检测样品中的稀少目标细胞。在某些方面中，细胞计数器被配置为使用第一标记和第二标记的荧光组合作为检测阈值，该第一标记附接至第一结合成员，该第二标记附接至第二结合成员。
试剂盒
还提供了用于实践以上所述方法的一个或多个实施例的试剂盒。这些主题试剂盒可以包括不同的组件和试剂。在一些情况下，这些试剂盒包括：至少在这些方法（例如，如上所述的）中发现用途的试剂；以及具有储存于其中的计算机程序的计算机可读取介质，其中该计算机程序在加载在计算机中时运行计算机以执行如在此所述的细胞计数测定；以及具有地址的物理基质，从该地址可获得计算机程序。
除了以上组件之外，这些主题试剂盒可以进一步包括用于实践这些方法的说明书。这些说明书可以按多种形式存在于这些主题试剂盒中，这些形式中的一种或多种可以存在于试剂盒中。这些说明书可以存在的一种形式是：作为在合适介质或基质上打印的信息（例如，上面打印信息的一张或多张纸），在试剂盒的包装中打印的信息，在包装插入物中打印的信息，等等。又另外的手段可以是在其上已经记录有信息的计算机可读取介质，例如CD、DVD、蓝光光碟（Blu-Ray）、闪存盘、等等。可以存在的又另外的手段是可以在远离的地方经由因特网用来获取信息的网址。任何方便的手段可以存在于这些试剂盒中。
实用性
这些主题方法、组合物、系统以及试剂盒发现在希望检测样品中的稀少目标细胞时的各种不同应用中发现用途。
本披露的非限制性示例性实施例提供如下：
1.一种用于对一个样品中的一种稀少目标细胞进行检测的方法，该方法包括：
使该样品与第一和第二结合成员接触，这些第一和第二结合成员特异性地结合至该稀少目标细胞的一种标志物，并且
针对包括结合的第一和第二结合成员的细胞的存在对该样品进行细胞计数测定以检测该样品中的该稀少目标细胞。
2.根据1的方法，其中对样品的细胞计数测定包括对样品的流式细胞计数测定。
3.根据1或2的方法，其中对样品的细胞计数测定包括对样品的成像细胞计数测定。
4.根据1-3中任一项所述的方法，进一步包括使该样品与特异性地结合至该稀少目标细胞的一种标志物的三结合成员接触，并且针对包括结合的第一、第二和第三结合成员的细胞的存在对该样品进行细胞计数测定以检测在该样品中的该稀少目标细胞。
5.根据1-4中任一项所述的方法，其中至少这些第一和第二结合成员是抗体、或其抗原结合片段。
6.根据5所述的方法，其中这些抗体或其抗原结合片段结合至该标志物上的重叠表位。
7.根据6所述的方法，其中这些抗体或其抗原结合片段结合至该标志物的相同的表位。
8.根据1-7中任一项所述的方法，其中这些结合成员被标记。
9.根据8所述的方法，其中这些结合成员被直接进行了标记。
10.根据8-9中任一项所述的方法，其中该第一或第二结合成员被选自以下项的标记进行了标记：吲哚碳菁（C3）、吲哚二碳菁（C5）、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、德克萨斯红（Texas Red）、太平洋蓝（Pacific Blue）、俄勒冈绿（Oregon Green）488、亚历克萨荧光染料（Alexa fluor）-355、亚历克萨荧光染料（Alexa fluor）488、亚历克萨荧光染料（Alexa fluor）532、亚历克萨荧光染料（Alexa fluor）546、亚历克萨荧光染料（Alexa fluor）-555、亚历克萨荧光染料（Alexa fluor）568、亚历克萨荧光染料（Alexa fluor）594、亚历克萨荧光染料（Alexa fluor）647、亚历克萨荧光染料（Alexa fluor）660、亚历克萨荧光染料（Alexa fluor）680、亚历克萨荧光染料（Alexa fluor）700、JOE、丽丝胺（Lissamine）、罗丹明绿（Rhodamine Green）、BODIPY、异硫氰酸荧光素（FITC）、羧基荧光素（FAM）、藻红蛋白、罗丹明、二氯罗丹明（dRhodamine）、羧基四甲基罗丹明（TAMRA）、羧基-X-罗丹明（ROX）、LIZ、VIC、NED、PET、SYBR、PicoGreen、以及RiboGreen。
11.根据8-10中任一项所述的方法，其中该第一结合成员的标记和该第二结合成员的标记是不同的标记。
12.根据1-11中任一项所述的方法，其中该样品中的非稀少细胞没有被特异性地染色。
13.根据1-12中任一项所述的方法，其中该样品中的非稀少细胞没有被针对CD45而进行染色。
14.根据1-13中任一项所述的方法，其中该标志物是一种细胞内标志物。
15.根据14所述的方法，包括用一种透化试剂将该样品中的有核细胞进行透化。
16.根据1-15中任一项所述的方法，其中该标志物是选自CD1a、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD10、CD11b、CD13、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD22、CD23、CD25、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、CD45、CD56、CD57、CD59、CD61、CD64、CD71、CD74、CD79a、CD90、CD103、CD117、CD133、CD138、CD271、CD303、CD304、bcl-2、C-kit、TdT、FMC7、SCA-1、血型糖蛋白A、细胞角蛋白、EpCAM、EphB4、EGFR、CEA、HER2以及MUC-1。
17.根据1-16中任一项所述的方法，其中该样品是血液。
18.根据1-17中任一项所述的方法，其中该样品是全血。
19.根据1-18中任一项所述的方法，其中该样品是获得自哺乳类受试者。
20.根据1-19中任一项所述的方法，其中该样品是获得自人类受试者。
21.根据1-20中任一项所述的方法，其中该稀少目标细胞是一种上皮细胞。
22.根据21所述的方法，其中该上皮细胞是一种循环肿瘤细胞。
23.根据22所述的方法，其中该标志物是一种选自CK4、CK7、CK8、CK10、CK13、CK14、CK18、CK19、以及CK20的细胞角蛋白。
24.根据22所述的方法，其中这些第一和第二结合成员是抗体，并且作为由克隆CAM5.2、KA4、RCK102、RCK105、C-11、Lds103、或CK2产生的抗体结合基本上相同的表位。
25.根据1-24中任一项所述的方法，其中对该样品进行细胞计数测定包括分类。
26.根据25所述的方法，其中将该稀少目标细胞进行收集。
27.根据26所述的方法，其中随后将该稀少目标细胞进行测定。
28.一种细胞样品，包括：
一种稀少目标细胞，该稀少目标细胞包括一种标志物；以及
第一和第二结合成员，这些第一和第二结合成员特异性地结合至该稀少目标细胞的该标志物。
29.根据28所述的细胞样品，进一步包括一种第三结合成员，该第三结合成员特异性地结合至该稀少目标细胞的该标志物。
30.根据28或29所述的细胞样品，其中这些结合成员是抗体、或其抗原结合片段。
31.根据30所述的细胞样品，其中这些抗体或其抗原结合片段结合至该标志物上的重叠表位。
32.根据31所述的细胞样品，其中这些抗体或其抗原结合片段结合至该标志物的相同的表位。
33.根据28-32中任一项所述的细胞样品，其中这些结合成员被标记。
34.根据33所述的细胞样品，其中这些结合成员被直接进行了标记。
35.根据33-34中任一项所述的细胞样品，其中该第一或第二结合成员被选自以下项的标记进行了标记：吲哚碳菁（C3）、吲哚二碳菁（C5）、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、德克萨斯红（Texas Red）、太平洋蓝（PacificBlue）、俄勒冈绿（Oregon Green）488、亚历克萨荧光染料（Alexa fluor）-355、亚历克萨荧光染料（Alexa fluor）488、亚历克萨荧光染料（Alexa fluor）532、亚历克萨荧光染料（Alexa fluor）546、亚历克萨荧光染料（Alexa fluor）-555、亚历克萨荧光染料（Alexa fluor）568、亚历克萨荧光染料（Alexa fluor）594、亚历克萨荧光染料（Alexa fluor）647、亚历克萨荧光染料（Alexa fluor）660、亚历克萨荧光染料（Alexa fluor）680、亚历克萨荧光染料（Alexa fluor）700、JOE、丽丝胺（Lissamine）、罗丹明绿（Rhodamine Green）、BODIPY、异硫氰酸荧光素（FITC）、羧基荧光素（FAM）、藻红蛋白、罗丹明、二氯罗丹明（dRhodamine）、羧基四甲基罗丹明（TAMRA）、羧基-X-罗丹明（ROX）、LIZ、VIC、NED、PET、SYBR、PicoGreen、以及RiboGreen。
36.根据33-35中任一项所述的细胞样品，其中该第一结合成员的标记和该第二结合成员的标记是不同的标记。
37.根据28-35中任一项所述的细胞样品，其中该样品中的非稀少细胞没有被特异性地染色。
38.根据28-37中任一项所述的细胞样品，其中该样品中的非稀少细胞没有被针对CD45而进行染色。
39.根据28-38中任一项所述的细胞样品，其中该标志物是一种细胞内标志物。
40.根据28-39中任一项所述的细胞样品，其中该标志物是选自CD1a、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD10、CD11b、CD13、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD22、CD23、CD25、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、CD45、CD56、CD57、CD59、CD61、CD64、CD71、CD74、CD79a、CD90、CD103、CD117、CD133、CD138、CD271、CD303、CD304、bcl-2、C-kit、TdT、FMC7、SCA-1、血型糖蛋白A、细胞角蛋白、EpCAM、EphB4、EGFR、CEA、HER2以及MUC-1。
41.根据28-40中任一项所述的细胞样品，其中该样品是血液。
42.根据28-41中任一项所述的细胞样品，其中该样品是全血。
43.根据28-42中任一项所述的细胞样品，其中该样品是获得自哺乳类受试者。
44.根据28-43中任一项所述的细胞样品，其中该样品是获得自人类。
45.根据28-44中任一项所述的细胞样品，其中该稀少目标细胞是一种上皮细胞。
46.根据45所述的细胞样品，其中该上皮细胞是一种循环肿瘤细胞。
47.一种细胞计数系统，包括：
一种细胞计数样品流体子系统，该子系统被配置为使一个包含一种稀少目标细胞的样品与第一和第二结合成员接触，这些第一和第二结合成员特异性地结合至该稀少目标细胞的一种标志物，其中该样品的非稀少细胞没有被标记；以及
一种细胞计数器，该细胞计数器流体地连接至该细胞计数样品流体子系统。
48.如47所述的细胞计数系统，其中该细胞计数样品流体子系统是流式细胞计数样品流体子系统，并且该细胞计数器是一种流式细胞计数器。
49.一种细胞计数系统，包括：
一种细胞计数样品流体子系统，该子系统被配置为使一个包含一种稀少目标细胞的样品与第一和第二结合成员接触，这些第一和第二结合成员特异性地结合至该稀少目标细胞的一种标志物；以及
一种细胞计数器，该细胞计数器流体地连接至该细胞计数样品流体子系统，该细胞计数器被配置为针对包括结合的第一和第二结合成员的细胞的存在对该样品进行测定以检测该样品中的该稀少目标细胞。
50.如49所述的细胞计数系统，其中该细胞计数样品流体子系统是流式细胞计数样品流体子系统，并且该细胞计数器是一种流式细胞计数器。
51.一种用于对一个样品中的一种稀少目标细胞进行鉴定的试剂盒，该试剂盒包括：
第一和第二结合成员，这些第一和第二结合成员特异性地结合至该稀少目标细胞的一种标志物；
说明书，用于指导使用这些第一和第二结合成员来针对包括结合的第一和第二结合成员的细胞的存在对该生物样品进行流式细胞计数测定以检测该样品中的该稀少目标细胞。
实例
如可以从以上提供的披露所理解的，本披露具有各种各样的应用。因此，提出以下实例以便为本领域普通技术人员提供如何制造和使用本发明的完整披露和描述，并且不旨在限制诸位发明人考虑作为他们的发明的范围，也不旨在表示以下实验是进行的所有或仅有的实验。本领域的技术人员将易于认识到多种可以改变或修饰以产生本质上相似结果的非关键参数。因此，提出以下实例以便为本领域普通技术人员提供如何制造和使用本发明的完整披露和描述，并且不旨在限制诸位发明人考虑作为他们的发明的范围，它们也不旨在表示以下实验是进行的所有或仅有的实验。已经作出努力以确保关于使用数目的准确性（例如，量，温度，等），但一些实验误差和偏差应被考虑在内。
材料与方法
以下是在下述实例中使用的总体材料与方案。
纯化的抗-细胞角蛋白抗体是获得自BD（富兰克林湖（FranklinLakes），新泽西州（New Jersey））。抗体分为两个类群，并且两个类群的轭合荧光染料的抗-细胞角蛋白抗体分别是通过将FITC或亚历克萨荧光染料（Alexa fluor）647荧光染料轭合至一个类群的抗体上来产生的。HT-29结肠腺癌细胞获得自ATCC（ATCC HTB38）。
使用1x BD FACS细胞溶解溶液将血液样品进行细胞溶解。使用1xBD FACS透化溶液2将样品进行透化。所有的流式细胞计数测定是使用BD Biosciences FACSCantoTM流式细胞计数器进行的。所有的试剂和材料是遵照以下生产商方案使用的。
实例1：检测血液样品中的肿瘤细胞
将正常供体的静脉血收集于肝素钠BD Vacutainer管中。以(i)10,000HT-29细胞/mL；(ii)1,000HT-29细胞/mL；(iii)100HT-29细胞/mL；或(iv)0HT-29细胞/mL的浓度，将HT-29肿瘤细胞添加至血液样品。对于四个样品的每一种，取7.5mL抽取物，并且在BD Vacutainer CPT管中进行旋转以分离WBC部分。CPT样品制备技术对于涉及细胞溶解和离心的方案是可比的（图10）。随后对WBC部分进行固定、透化，用CK-FITC和CK-Alexa647染色60m，并且经由FACS进行分析（图3）。
所得的密度图（图4，图A-D），APC通道（y轴）对FITC通道（x轴），显示样品中的一群细胞，其中HT-29肿瘤细胞具有(i)10,000HT-29细胞/mL（图A）；(ii)1,000HT-29细胞/mL（图B）；以及(iii)100HT-29细胞/mL（图C）的起始浓度。在每个图中观察到的细胞数目与HT-29肿瘤细胞的起始浓度成比例地降低。在起始HT-29肿瘤细胞浓度是0细胞/mL时，没有观察到细胞（图D）。
甚至在WBC的背景较高时，可以检测HT-29肿瘤细胞（图5，图A-C）。将包含浓度为10,000细胞/mL的HT-29细胞的血液样品（7.5mL）用1x FACS细胞溶解溶液进行溶解，用1x BD FACS透化溶液2进行透化，进行洗涤，然后以0.55mL Rx体积用CK Ab-FITC和CK Ab-A647轭合物染色，并且在不用进一步洗涤的情况下，在BD Biosciences FACSCantoTM流式细胞计数器上以（36μL/min）的介质流速对此混合物的0.36mL进行计数。在34,363,636个WBC的背景中观察到一个HT-29肿瘤细胞（图A-B），并且在15分钟运行期间对于“仅缓冲液”来说没有记录到假阳性点（图C）。
通过要求检测至少第一和第二结合成员，改进HT-29细胞与假阳性事件的区分。例如，当仅有一个结合成员的结合被观察到时，HT-29肿瘤细胞不能容易地从非特异性事件中检测（图6，图A-B；图7，图A-B）。要求检测第一和第二结合成员导致窄对角下行的点图，并且导致容易鉴定HT-29细胞（图6，图C），同时还清除了假阳性事件（图7，图C）。
成像进一步揭示：许多假阳性事件可以通过测量仅一个结合成员而观察到。例如，图8图A-C显示了在不同起始浓度下的HT-29肿瘤细胞的图像。将包含WBC和HT-29肿瘤细胞的样品用CK-FITC和CK-PE进行染色。HT-29细胞是以5,000细胞/mL（图A）、500细胞/mL（图B）、或0.0细胞/mL（图C）的浓度存在。在PE通道中甚至在0.0细胞/mL（图C）的HT-29细胞浓度下，观察到事件。
还使用蔡司显微镜和汞弧灯，对单独的细胞进行成像（图9，图A-B）。如上所述对样品进行制备，并且使用蔡司显微镜使用汞弧灯对单独的细胞进行成像。从FITC通道获得的图像揭示了在单独细胞中CK-FITC的存在，从APC通道获得的图像揭示了在单独细胞中CK-Alexa647的存在，并且叠加图像显示存在于细胞中的CK-FITC和CK-Alexa647两者（右图，图B）。对每个样品进行100倍图像。
虽然前述发明已经出于清楚理解的意图通过说明和实例的方式，在某些细节上得以描述，但鉴于本披露的传授，对于本领域的普通技术人员容易清楚的是可以在不偏离所附权利要求书的精神或范围的情况下对其作出某些改变和修饰。
因此，前述内容仅说明本发明的原理。将理解的是本领域的技术人员将能够设计不同的安排，这些不同的安排虽然没有在此明确地描述或显示，但实施本发明的原理并且被包括在其精神和范围之内。此外，在此引用的所有实例和有条件的语言原则上旨在帮助读者理解本发明的原理而不受此类具体引用的实例和条件的限制。并且，引用本发明的原理、方面、以及实施例的所有在此的陈述连同其具体实例旨在涵盖其结构和功能等效物两者。另外，预期此类等效物包括当前已知的等效物以及有朝一日发展的等效物，即不论结构而执行相同功能的发展的任何要素。因此，本发明的范围不是旨在限制于在此显示和描述的示例性实施例。而本发明的范围和精神是通过所附权利要求书来实施。

Claims (15)

1.一种用于对一个样品中的一种稀少目标细胞进行检测的方法，该方法包括：
使该样品与第一和第二结合成员接触，这些第一和第二结合成员特异性地结合至该稀少目标细胞的一种标志物，并且
针对包括结合的第一和第二结合成员的细胞的存在对该样品进行细胞计数测定以检测该样品中的该稀少目标细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中这些第一和第二结合成员是抗体、或其抗原结合片段。
3.根据权利要求2所述的方法，其中这些抗体或其抗原结合片段结合至该标志物的相同的表位。
4.根据权利要求1所述的方法，其中这些第一和第二结合成员被进行了标记。
5.根据权利要求4所述的方法，其中这些第一和第二结合成员被直接进行了标记。
6.根据权利要求1所述的方法，其中该样品中的非稀少细胞没有被标记。
7.根据权利要求1所述的方法，包括用一种透化试剂将该样品中的有核细胞进行透化。
8.根据权利要求1所述的方法，其中该标志物是一种细胞角蛋白。
9.根据权利要求1所述的方法，其中该标志物是选自CD1a、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD10、CD11b、CD13、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD22、CD23、CD25、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、CD45、CD56、CD57、CD61、CD64、CD71、CD74、CD79a、CD103、CD117、CD133、CD138、CD271、CD303、CD304、bcl-2、TdT、FMC7、血型糖蛋白A、细胞角蛋白、EpCAM、EphB4、EGFR、CEA、HER2以及MUC-1。
10.根据权利要求1所述的方法，其中该样品是全血。
11.根据权利要求1所述的方法，其中该样品是获得自人类。
12.一种细胞样品，包括：
一种稀少目标细胞，该稀少目标细胞包括一种标志物；以及
第一和第二结合成员，这些第一和第二结合成员特异性地结合至该稀少目标细胞的该标志物。
13.一种细胞计数系统，包括：
一种细胞计数样品流体子系统，该子系统被配置为使一个包含一种稀少目标细胞的样品与第一和第二结合成员接触，这些第一和第二结合成员特异性地结合至该稀少目标细胞的一种标志物，其中该样品的非稀少细胞没有被标记；以及
一种细胞计数器，该细胞计数器流体地连接至该细胞计数样品流体子系统。
14.一种细胞计数系统，包括：
一种细胞计数样品流体子系统，该子系统被配置为使一个包含一种稀少目标细胞的样品与第一和第二结合成员接触，这些第一和第二结合成员特异性地结合至该稀少目标细胞的一种标志物；以及
一种细胞计数器，该细胞计数器流体地连接至该细胞计数样品流体子系统，该细胞计数器被配置为针对包括结合的第一和第二结合成员的细胞的存在对该样品进行测定以检测该样品中的该稀少目标细胞。
15.一种用于对一个样品中的一种稀少目标细胞进行鉴定的试剂盒，该试剂盒包括：
第一和第二结合成员，这些第一和第二结合成员特异性地结合至该稀少目标细胞的一种标志物；
说明书，用于指导使用这些第一和第二结合成员来针对包括结合的第一和第二结合成员的细胞的存在对该生物样品进行细胞计数测定以检测该样品中的该稀少目标细胞。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108956431A (zh) * 2018-08-09 2018-12-07 苏州叠代生物科技有限公司 一种单采血小板制品中残留细胞的检测方法
CN111089967A (zh) * 2020-03-25 2020-05-01 中南大学湘雅二医院 用于红斑狼疮分型的皮肤组织免疫细胞原位检测试剂盒及其应用

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2726870B1 (en) 2011-06-29 2018-10-03 Academia Sinica The capture, purification and release of biological substance using a surface coating
US20150233932A1 (en) * 2013-02-19 2015-08-20 Ching-Ping Tseng Methods, Systems, and Compositions for Enrichment of Rare Cells
CN106662514A (zh) 2014-04-01 2017-05-10 中央研究院 用于癌症诊断及预后的方法和系统
US10112198B2 (en) 2014-08-26 2018-10-30 Academia Sinica Collector architecture layout design
US10107726B2 (en) 2016-03-16 2018-10-23 Cellmax, Ltd. Collection of suspended cells using a transferable membrane
LU500787B1 (en) 2021-10-26 2023-04-27 Univ Hamburg Eppendorf Uke Isolation and detection of cdcp1 positive circulating tumor cells
LU501430B1 (en) 2022-02-09 2023-08-09 Univ Hamburg Eppendorf Uke Enrichment, detection and characterization of circulating tumor cells with susd2 and enpp1

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20010018192A1 (en) * 1998-02-12 2001-08-30 Terstappen Leon W.M.M. Labeled cells for use as an internal functional control in rare cell detection assays
US20020009759A1 (en) * 1998-02-12 2002-01-24 Terstappen Leon W.M.M. Methods and reagents for the rapid and efficient isolation of circulating cancer cells
WO2005078450A2 (en) * 2004-02-12 2005-08-25 Pepscan Systems B.V. Method for the detection of early b cell populations in vaccine development
CN101027557A (zh) * 2004-08-27 2007-08-29 贝克曼库尔特有限公司 用于细胞信号途径的细胞计数分析的全血制备
CN101251536A (zh) * 2008-04-01 2008-08-27 中国烟草总公司郑州烟草研究院 评价卷烟烟气毒性的小鼠体内微核分析检测方法
WO2008157257A1 (en) * 2007-06-20 2008-12-24 University Of Washington A biochip for high-throughput screening of circulating tumor cells
CN101583722A (zh) * 2006-07-14 2009-11-18 阿维瓦生物科学股份有限公司 从生物学样品检测稀有细胞的方法和组合物

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5945281A (en) 1996-02-02 1999-08-31 Becton, Dickinson And Company Method and apparatus for determining an analyte from a sample fluid
US6645777B1 (en) 1999-11-05 2003-11-11 The Board Of Governors For Higher Education, State Of Rhode Island And Providence Plantation Tapered tubular optical waveguide probe for magnetic focusing immunosensors
US6254830B1 (en) 1999-11-05 2001-07-03 The Board Of Governors For Higher Education, State Of Rhode Island And Providence Plantations Magnetic focusing immunosensor for the detection of pathogens
AU2001288437C1 (en) 2000-09-09 2009-05-21 The Research Foundation Of State University Of New York Method and compositions for isolating metastatic cancer cells, and use in measuring metastatic potential of a cancer thereof
SE522801C2 (sv) 2001-03-09 2004-03-09 Erysave Ab Anordning för att separera suspenderade partiklar från en fluid med ultraljud samt metod för sådan separering
ATE441857T1 (de) * 2001-07-10 2009-09-15 Univ Leland Stanford Junior Verfahren und zusammensetzungen zum nachweis des aktivierungszustands multipler proteine in einzelzellen
US7863012B2 (en) 2004-02-17 2011-01-04 Veridex, Llc Analysis of circulating tumor cells, fragments, and debris
US20050266503A1 (en) * 2004-05-24 2005-12-01 Esoterix, Inc. Simultaneous assay of target and target-drug binding
US7842465B2 (en) 2006-01-17 2010-11-30 Palo Alto Research Center Incorporated Immunocytostaining methods for enhanced dye ratio discrimination in rare event detection
US8012480B2 (en) 2006-04-18 2011-09-06 Wellstat Biologics Corporation Detection of proteins from circulating neoplastic cells
CA2653745C (en) * 2006-06-02 2013-11-19 Pfizer Products Inc. Circulating tumor cell assay
US20080057505A1 (en) 2006-07-14 2008-03-06 Ping Lin Methods and compositions for detecting rare cells from a biological sample
ES2375453T3 (es) 2006-09-07 2012-03-01 Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf Método para la detección de células epiteliales cancerosas utilizando citoqueratinas liberadas como marcadores para dichas células.
WO2008057437A2 (en) * 2006-11-03 2008-05-15 Purdue Research Foundation Ex vivo flow cytometry method and device
US20090061456A1 (en) * 2007-08-30 2009-03-05 Allard William J Method for predicting progression free and overall survival at each follow-up time point during therapy of metastatic breast cancer patients using circulating tumor cells
US8748113B2 (en) * 2007-11-15 2014-06-10 The Johns Hopkins University Methods for detecting and monitoring circulating cancer stem cells
EP2307886A2 (en) * 2008-06-26 2011-04-13 Dana-Farber Cancer Institute Inc. Signatures and determinants associated with metastasis and methods of use thereof
US8273541B2 (en) * 2008-09-17 2012-09-25 Innate Pharma Compositions and methods for detecting TLR3

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20010018192A1 (en) * 1998-02-12 2001-08-30 Terstappen Leon W.M.M. Labeled cells for use as an internal functional control in rare cell detection assays
US20020009759A1 (en) * 1998-02-12 2002-01-24 Terstappen Leon W.M.M. Methods and reagents for the rapid and efficient isolation of circulating cancer cells
WO2005078450A2 (en) * 2004-02-12 2005-08-25 Pepscan Systems B.V. Method for the detection of early b cell populations in vaccine development
CN101027557A (zh) * 2004-08-27 2007-08-29 贝克曼库尔特有限公司 用于细胞信号途径的细胞计数分析的全血制备
CN101583722A (zh) * 2006-07-14 2009-11-18 阿维瓦生物科学股份有限公司 从生物学样品检测稀有细胞的方法和组合物
WO2008157257A1 (en) * 2007-06-20 2008-12-24 University Of Washington A biochip for high-throughput screening of circulating tumor cells
CN101251536A (zh) * 2008-04-01 2008-08-27 中国烟草总公司郑州烟草研究院 评价卷烟烟气毒性的小鼠体内微核分析检测方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AMANNA I J ET AL: "Quantitation of rare memory B cell populations by two independent and complementary approaches", 《JOURNAL OF IMMUNOLOGICAL METHODS》 *
SCIBELLI A ET AL: "Fast track selection of immunogens for novel vaccines through visualization of the early onset of the B-cell response", 《VACCINE》 *
TOWNSEND S E ET AL: "Single epitope multiple staining to detect ultrolow frequency B cells", 《JOURNAL OF IMMUNOLOGICAL METHODS》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108956431A (zh) * 2018-08-09 2018-12-07 苏州叠代生物科技有限公司 一种单采血小板制品中残留细胞的检测方法
CN108956431B (zh) * 2018-08-09 2021-04-30 苏州叠代生物科技有限公司 一种单采血小板制品中残留细胞的检测方法
CN111089967A (zh) * 2020-03-25 2020-05-01 中南大学湘雅二医院 用于红斑狼疮分型的皮肤组织免疫细胞原位检测试剂盒及其应用
CN111089967B (zh) * 2020-03-25 2020-06-26 中南大学湘雅二医院 红斑狼疮分型的皮肤组织免疫细胞原位检测试剂盒的应用

Also Published As

Publication number Publication date
US9535065B2 (en) 2017-01-03
JP2014529078A (ja) 2014-10-30
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ES2930651T3 (es) 2022-12-20
JP6133297B2 (ja) 2017-05-24
EP2753924B1 (en) 2022-10-26
WO2013036620A1 (en) 2013-03-14
EP2753924A1 (en) 2014-07-16

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