KR20110052627A - 전립선암과 관련된 시그너처 및 ｐｃ결정인자 및 그의 사용 방법 - Google Patents

전립선암과 관련된 시그너처 및 ｐｃ결정인자 및 그의 사용 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 바이오마커를 사용하여 암을 검출하는 방법을 제공한다.

Description

전립선암과 관련된 시그너처 및 ＰＣ결정인자 및 그의 사용 방법{SIGNATURES AND PCDETERMINANTS ASSOCIATED WITH PROSTATE CANCER AND METHODS OF USE THEREOF}
관련 출원
본 출원은 2008년 7월 16일자로 출원된 U.S.S.N. 61/081,286(상기 문헌의 전문이 본원에서 참고로 인용된다)의 이점을 주장한다.
기술 분야
본 발명은 일반적으로 암 전이와 관련된 생물학적 시그너처 및 암 전이를 수행하는 유전적 PC결정인자의 확인, 및 암의 스크리닝, 예방, 진단, 치료, 모니터링 및 예후에 있어서 상기 생물학적 시그너처 및 PC결정인자의 사용 방법에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 일반적으로 전이성 전립선암을 앓는 유전공학처리된 마우스 모델에 관한 것이다.
전립선암(PCA: prostate cancer)은 남성들 사이에서 가장 흔한 암이며, 미국내에서 암에 기인한 사망의 주된 원인이 되고 있다. 대부분의 노년 남성은 전립선 신생물을 보유하는데, 이들 사례의 대다수는 치료학적 개입이 필요없는 국소성이고 무통성인 상태로 존재한다. 그러나, 침습성인 악성 행태 단계에 대한 "고유성을 띠는(hardwired)" 조기 단계의 PCA의 서브세트가 존재하며, 이를 치료하지 않고 방치하게 되면, 전립선 이외의 부위로 확장되고, 계속적으로 끊임없이 전이성 질환으로 진행되어 최종적으로는 사망에 이르게 된다. 현재는 무통성 질환과 침습성 질환을 정확하게 구별하지 못하고 있어서 잠재적으로는 무통성 질환을 앓는 남성들이 이환율이 높은 불필요한 치료학적 개입을 받고 있다.
결과를 예측하기 위해서 종양을 등급화하는 현행 방법은 글리슨 등급( Gleason grade), PSA, 및 종양 단계를 비롯한, 임상 병리적인 인자에 기초한다. 이러한 공식이 도움이 될 수는 있겠지만, 전반적으로 결과를 예측하지는 못하며, 중요하게는 전이성 질환 및 PCA 특이 사망 위험성에 대하여 가장 의미가 큰 임상적 종점과의 연관성에 대해서는 신뢰하기가 어렵다. 이와 같이 의학적 필요성이 충족되지 못하자, 진행 위험성을 추정할 수 있는 바이오마커를 확인하고, 표적화된 개입 요법에 대한 기회를 제공하고자 하는 목적으로 PCA 진행에 대하여 유전적으로 및 생물학적으로 기초가 되는 것을 정의하려는 노력이 가중화되었다. 인간 PCA의 유전적 연구를 통해서 PTEN 종양 억제인자 불활성화, 및 ETS 패밀리 전위 및 조절 기능 장애 뿐만 아니라, Nkx3.1, c-Myc 및 SPINK를 비롯한, 기타 다른 다수의 중요한 유전적 및/또는 후성적 변이를 포함한 다수의 시그너처 이벤트들을 확인할 수 있었다. 또한, 전반적인 분자 분석을 통해 예로서, ECAD, AIPC, Pim-1 키나제, 헵신, AMACR, 및 EZH2와 같은, 잠재적인 재발/전이 바이오마커 어레이를 확인하였다. 그러나, 인간 PCA의 이질성은 크기 때문에 임상적 환경하에서 단일의 바이오마커를 사용하는 데에는 한계가 있고, 이로써, 예후적인 다중유전자 바이오마커 패널 또는 시그너처를 정의하는 보다 포괄적인 전사 프로파일링 연구가 촉구되고 있다. 이러한 예측적 시그너처가 더욱 확고한 것처럼 보일 수도 있지만; 전사 네트워크의 유전적 잡음과 그러한 배경하의 특이적인 성질 및 암 게놈의 극도한 불안정성과, 유의적인 질환 이질성을 유발하는 무수히 많은 방관성 유전적 및 후성적 이벤트로 인해 상기 예측적 시그너처의 유용성은 여전히 불확실한 상태로 남아있다. 이러한 인자는 질환 진행의 위험성을 정확하게 추정할 수 있는 바이오마커의 확인을 방해하고자 하였다. 따라서, 특히 조기 단계에서 암의 발병과 행태를 예측하는 데 사용될 수 있는 확고한 바이오마커를 확인하기 위해서는 복합적인 인간 데이타세트와 함께 사용될 수 있는, 보다 정확한 인간 암 모델이 요구되고 있다.
발명의 개요
본 발명은 부분적으로, 상기의 신생물이 전이성 암으로 재발 및 진행될 수 있는 위험성을 증가시키는 특정 바이오마커(본원에서 "PC결정인자"로 지칭된다), 예로서, 단백질, 핵산, 다형체, 대사물, 및 기타 다른 분석물 뿐만 아니라, 특정 생리학적 병태 및 상태가 조기 암에 존재하거나 변경된다는 발견에 관한 것이다. 암은 예를 들면, 전립선암 또는 유방암이다.
따라서, 하나의 측면에서, 본 발명은 소정의 예측가능성 수준을 사용하여 피험체에서 전이성 암이 발병될 위험성을 평가하는 방법을 제공한다. 전이성 전립선암이 발병될 위험성은 피험체로부터 유래된 샘플 중 PC결정인자의 수준을 측정함으로써 측정된다. 피험체에서의 전이성 암이 발병될 위험성이 증가되었는지 여부는 샘플 중 PC결정인자의 수준이 임상적으로 유의하게 변경되었는지 여부를 측정함으로써 측정된다. 별법으로, 피험체에서의 전이성 암이 발병될 위험성이 증가되었는지 여부는 유효량의 PC결정인자의 수준을 기준값과 비교함으로써 측정된다. 몇몇 측면에서, 기준값은 지수이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 제1 기간에 피험체로부터 유래된 제1 샘플 중 PC결정인자의 수준을 측정하는 단계, 제2 기간에 피험체로부터 유래된 제2 샘플 중 PC결정인자의 수준을 측정하는 단계, 및 검출된 PC결정인자의 수준을 기준값과 비교하는 단계에 의해, 소정의 예측가능성 수준을 사용하여 피험체에서 종양의 진행 상태를 평가하는 방법을 제공한다. 몇몇 측면에서, 제1 샘플은 종양 치료를 받기 전의 피험체로부터 채취되고, 제2 샘플은 종양 치료를 받은 후의 피험체로부터 채취된 것이다.
추가의 측면에서, 본 발명은 제1 기간에 피험체로부터 유래된 제1 샘플 중 PC결정인자의 수준을 측정하는 단계, 및 임의로 제2 기간에 피험체로부터 유래된 제2 샘플 중 유효량의 PC결정인자의 수준을 검출하는 단계에 의해, 소정의 예측가능성 수준을 사용하여 전이성 암 치료법의 유효성을 모니터링하거나, 전이성 암에 대한 치료 요법을 선택하는 방법을 제공한다. 제1 기간에 검출되는 유효량의 PC결정인자의 수준을 제2 기간에 검출되는 수준과 비교하거나, 별법으로는 기준값과 비교한다. 치료법의 유효성은 피험체로부터 유래된 유효량의 PC결정인자의 수준 변화를 통해 모니터링된다.
PC결정인자로는 예를 들면, 본원에 기술된 결정인자 1-372를 포함한다. 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 10개 이상의 PC결정인자를 측정한다. 몇몇 실시태양에서, 표 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7 상에 열거되어 있는 PC결정인자로부터 선택되는 적어도 2개의 PC결정인자를 측정한다. 바람직하게는, PTEN, SMAD4, 사이클린 D1 및 SPP1을 측정한다. 임의로, 본 발명의 방법은 종양과 관련된 적어도 하나의 표준 파라미터를 측정하는 단계를 추가로 포함한다.
PC결정인자의 수준은 전기영동에 의해 또는 면역화학적으로 측정된다. 예를 들면, PC결정인자의 수준은 방사선면역분석법, 면역형광분석법 또는 효소 결합 면역흡착 분석법에 의해 검출된다. 임의로, PC결정인자는 비침습 영상 기술을 사용함으로써 검출된다.
피험체는 원발성 종양, 재발성 종양, 또는 전이성 암을 앓는다. 몇몇 측면에서, 샘플은 종양 치료를 이전에 받은 적이 있는 피험체에 대해서 채취된 것이다. 별법으로, 샘플은 종양 치료를 받기 이전의 피험체로부터 채취된 것이다. 샘플은 종양 생검, 예로서, 코어 생검, 절제 조직 생검 또는 절개 조직 생검이다. 샘플은 생물학적 체액 중 순환 종양 세포 또는 혈액이다.
또한 본 발명은 유효량의, PC결정인자 1-372로부터 선택되는 2개 이상의 마커로 이루어진 마커 수준의 패턴을 포함하는 전이성 전립선암 기준 발현 프로파일도 포함한다. 바람직하게, 본 프로파일은 표 1A, 1B, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7 중 어느 하나 상에 열거되어 있는 PC결정인자의 마커 수준의 패턴을 포함한다. 또한, 하나 이상의 전이성 종양 기준 발현 프로파일 및 임의로는 추가의 시험 결과 및 피험체 정보를 포함하는 기계로 판독가능한 매체도 포함한다. 또다른 측면에서 본 발명은 상응하는 PC결정인자를 검출하는 복수 개의 PC결정인자 검출 시약을 포함하는 키트를 제공한다. 예를 들면, 키트는 PTEN, SMAD4, 사이클린 D1 및 SPP1 검출 시약을 포함한다. 검출 시약은 예를 들면, 항체 또는 그의 단편, 올리고뉴클레오티드 또는 압타머이다.
추가의 측면에서, 본 발명은 종양의 전이 또는 진행과 관련된 생리학적 또는 생화학적 경로를 나타내는 하나 이상의 PC결정인자를 포함하는 PC결정인자 패널을 제공한다. 생리학적 또는 생화학적 경로는 예를 들면, P13K, RAC-RHO, FAK, 및 RAS 신호전달 경로를 포함한다.
추가의 또다른 측면에서, 본 발명은, 대조군에 비하여 질환에서 차별적으로 발현이 되는 하나 이상의 유전자를 확인하여 유전자 표적 목록을 작성하는 단계; 및 질환 진행의 작용성 측면과 관련이 있는, 표적 목록 상의 하나 이상의 유전자를 확인하는 단계에 의해서 질환에 대해 예후적인 바이오마커를 확인하는 방법을 제공한다. 작용성 측면이란 예를 들면, 세포 이동, 혈관형성, 원위 콜로니화, 세포외 기질 분해 또는 아노이키스이다. 임의로, 본 방법은 진화적으로 보존된 변화를 포함하는, 유전자 표적 목록 상의 하나 이상의 유전자를 확인하여 제2 유전자 표적 목록을 작성하는 단계를 포함한다. 질환은 예를 들면, 암, 예로서, 침습성 또는 전이성 암이다.
PC결정인자의 활성 또는 발현을 조절하는 화합물은, PC결정인자를 발현하는 세포를 제공하고, 후보 화합물을 포함하는 조성물과 상기 세포를 (예로서, 생체내, 생체외 또는 시험관내에서) 접촉시키고, 상기 물질이 PC결정인자의 발현 또는 활성을 변경시켰는지 여부를 측정함으로써 확인된다. 화합물의 존재하에 관찰되는 변경이, 세포를 화합물이 없는 조성물과 접촉시켰을 때에는 관찰되지 않는다면, 확인된 화합물은 PC결정인자의 활성 또는 발현을 조절한다고 볼 수 있다.
PC결정인자의 활성 또는 발현을 조절하는 화합물을 피험체에게 투여하거나, PC결정인자에 의해 조절되는 화합물의 활성 또는 발현을 조절하는 제제를 피험체에게 투여함으로써 암은 치료될 수 있다.
그의 암 세포에서 PC결정인자 1-372 중 2개 이상의 수준이 임상적으로 유의하게 변경된 피험체를 제공하고, 수술 또는 방사선 치료 이외에 보조 요법을 사용하여 피험체를 치료함으로써 암은 치료될 수 있다. PC결정인자의 수준 변경은 피험체에서 암 재발의 위험성 또는 전이성 암이 발병될 위험성이 증가되었음을 시사한다. 추가로, 피험체에서 전립선암 조직으로부터 유래된 샘플 중 PTEN, SMAD4, 사이클린 D1 및 SPP1의 발현 수준에 관한 정보를 수득하고; SPP1 억제제, CD44 억제제, 또는 그 둘 모두를 투여함으로써 전립선암은 그를 필요로 하는 피험체에서 치료된다. 피험체는 PTEN, SMAD4, 사이클린 D1 및 SPP1 수준에 기초하여 전립선암이 재발할 위험성이 있거나, 전이성 암이 발병될 위험성이 있는 것으로서 확인된 피험체다.
하나의 측면에서, 본 발명은 유효량의 PC결정인자를 측정하고, 여기서, 환자로부터 유래된 종양 샘플 중 2개 이상의 PC결정인자가 임상적으로 유의하게 변경되었다면, 이는 환자가 보조 치료법을 필요로 하는 것임을 나타내는 것인 단계에 의해서, 보조 치료법을 필요로 하는 종양 환자를 선택하는 방법을 제공한다. 예를 들면, 본원에 기술된 방법은 특정 피험체가 임상 시험에 적합한지 여부를 측정하는 데 유용하다.
추가의 측면에서, 본 발명은 환자로부터 유래된 종양 샘플 중 유효량의 PC결정인자에 관한 정보를 수득하고, 2개 이상의 PC결정인자가 임상적으로 유의적인 방식으로 변경되었는지 여부에 따라 환자에서 종양 전이를 예방하거나 감소시키는 치료 요법을 선택함으로써, 종양 환자에 대한 치료 결정을 알려주는 방법을 제공한다.
다양한 실시태양에서, 평가/모니터링은 소정의 예측가능성 수준으로 달성된다. 소정의 예측가능성 수준이란, 방법이 허용가능한 수준의 임상적 또는 진단적 정확도를 제공한다는 것을 의미한다. 임상적 및 진단적 정확도는 당업계에 공지된 방법, 예로서, 본원에 기술된 방법에 의해 결정된다.
본 발명은 추가로 게놈이, 전립선 상피 중 내인성 Pten 유전자 및 Smad4 유전자, 둘 모두를 동형접합적으로 파괴시킬 수 있는 유전적 변형을 포함하는 것인, 트랜스제닉 이중 넉아웃 마우스를 제공한다. LoxP 부위가 포매되어 있는 Pten 또는 Smad 유전자(즉, 현 균주)의 리콤비나제 매개 절제에 의해서, 또는 예를 들면, 돌연변이 넉인, 및 계내에서 또는 세포 배양물 중에서 생식계 구조물 또는 전립선 상피가 형질도입된 체세포 형질도입물에서 상기 유전자를 RNAi를 매개로 하여 소거한 후, 상기 1차 세포를 신장 상피 내로 또는 동소에 재도입시킴으로써 상기와 같은 파괴가 이루어질 수 있음을 당업자는 이해할 것이다. 생식계 전파를 방해하는 표적화된 ES 클론을 사용하여 키메라를 형성하는 것을 비롯한, 기타 다른 공학처리 전략법 또한 명백하다. 트랜스제닉 마우스는 야생형 마우스와 비교하여 전립선 종양 형성에 대하여 증가된 감수성을 나타낸다. 마우스는 또한 오직 Pten만 넉아웃된 트랜스제닉 마우스와 비교하여 전이성 전립선암 형성에 대하여 증가된 감수성을 나타낸다. 또한, 마우스로부터 유래된 세포도 포함한다. 바람직하게, 세포는 상피 세포, 예로서, 전립선 상피 세포, 유방 상피 세포, 폐 상피 세포 또는 결장 상피 세포이다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련가에 의해 통상 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본원에 기술된 방법 및 물질과 유사하거나 등가인 방법 및 물질이 본 발명을 실시하는 데 사용될 수는 있지만, 적합한 방법 및 물질은 하기에 기술되어 있다. 본원에서 언급된 모든 공개문헌, 특허 출원, 특허 기타 다른 참조 문헌은 그 전문이 명시적으로 참고로 인용된다. 상충하는 경우, 정의를 포함한 본 명세서에 따라 조정될 것이다. 또한, 본원에 기술된 물질, 방법 및 실시예는 단지 예시적인 것으로서, 제한하고자 하는 의도는 없다.
본 발명의 기타 다른 특성 및 이점은 하기의 상세한 설명 및 특허청구범위로부터 자명해질 것이며, 그에 포함될 것이다.
도 1은 전립선에서 Pten의 손실이 p-Smad2/Smad3 및 Smad4 발현 수준을 상향조절시켰다는 것을 입증한다. (A) Ptenpc -/- 마우스(3331개의 프로브 세트, 청색으로 표시)들 사이에서 차별적으로 발현된 유전자에 관한 인제뉴어티 캐노니컬 패쓰웨이 분석(Ingenuity Canonical Pathway Analysis)을 통해 동일한 크기의, 무작위로 추출된 유전자 세트 10개와 비교하였다. (B) 15주째 각 유전형으로부터 얻은 AP 조직에 관한 웨스턴 블롯 분석에서는 대조군 마우스와 비교하였을 때 Ptenpc -/- 마우스에서 pSmad2/3 수준이 증진되고, Smad4가 상향조절되고, Id1이 유도된 것으로 나타났다. (C) Smad4에 관해 15주령된 AP를 면역조직화학적으로 분석함으로써 대조군 마우스(패널 a)와 비교하여 Ptenpc -/- 마우스(패널 c)에서 Smad4가 상향조절되었음이 입증되었다. Smadpc-/- 마우스는 음성 대조군으로 사용되었다(패널 b). 스케일 바, 50 ㎛. (D,E) 인간 PCA 및 전이 사이의 Smad4 발현에 관한 온코마인(Oncomine) 분석(http://www.oncomine.org/). 문헌 [Yu et al]의 전립선 발현 데이타세트에서 차별적으로 발현된 Smad4의 열지도(D). 문헌 [Yu et al]의 전립선 발현 데이타세트 및 문헌 [Dhanasekaran et al (2001)]의 전립선 발현 데이타세트에서 인간 PCA와 전이 사이의 Smad4 발현에 관해 박스로 나타낸 플롯(E).
도 2는 Smad4 손실이 전립선 종양을 개시하지는 않지만, Pten 결핍 암종이 치사성을 띠게 한다는 것을 입증한다. (A) 9주령된 WT, Smad4 및 Pten 단일 및 이중 돌연변이체의 전립선 전엽(AP: anterior prostate)에 대한 조직병리학적 분석을 통해 WT 및 Smadpc -/- 마우스에서는 정상적인 전립선이 관찰되었지만, Ptenpc -/- 마우스에서는 PIN 병변 및 Ptenpc -/-;Smadpc -/- 마우스에서는 침습(화살표)이 관찰되었다. 스케일 바, 50 ㎛. (B) 카플란-마이어(Kaplan-Meier)의 전반적인 누적 생존분석. Ptenpc-/-;Smadpc-/- 코호트(n=26)(별표)의 경우, Ptenpc -/- 코호트(n=28)와 비교하였을 때 통계학상 유의적으로 수명이 감소한 것으로 나타났다(P<0.0001). (C) 22주령된 대표적인 WT, Smadpc -/-, Ptenpc -/-, 및 Ptenpc -/-;Smadpc -/- 전립선 전엽 또는 전립선 종양에 대해 이루어진 육안을 통한 해부학적 관찰. 스케일 바, 0.5 cm.
도 3은 Smad4의 손실로 증식이 증진되고, Pten 손실로 유도되는 세포 노화는 우회되었다는 것을 입증한다. (A) 15주령된 AP에 대한 조직병리학적 및 증식 분석을 통해 Ptenpc -/-;Smadpc -/- 이중 돌연변이체에서 몇몇 침습성 병소(화살표, 패널 e)의 증식이 증가(패널 j)하였음이 입증되었다. 15주령된 AP에 대한 Tunel 분석을 통해서는 Ptenpc -/-;Smadpc -/- 이중 돌연변이체(패널 i,j) 및 Ptenpc -/- 전립선 종양(패널 h)에서의 유의적인 차이가 나타나지 않았다. H&E, 헤마톡실린/에오신. 스케일 바, 50 ㎛. (B) Smad4의 손실은 Pten 손실로 유도되는 세포 노화를 우회시켰다. 15주령된 AP에 대한 β-Gal 염색 분석. 스케일 바, 100 ㎛. (C) (A,f-j)에서와 같이 수행된 15주령된 AP의 brdu + 표지화에 대한 정량. 3마리의 마우스로부터 얻은 대표적인 절편에서 각 유전자형에 대하여 계수하였다. (D) 15주령된 AP에서 아포프토시스에 대한 TUNEL 분석 정량. 3마리의 마우스로부터 얻은 대표적인 절편에서 각 유전자형에 대하여 계수하였다. (E) (B)에서와 같이 수행된 15주령된 AP에서 관찰되는 β-Gal 염색 정량. 3마리의 마우스로부터 얻은 대표적인 절편에서 각 유전자형에 대하여 계수하였다. C-E에서 오차 막대는 3중으로 수행된 대표적인 실험에 대한 s.d.를 나타낸다. 별표는 Ptenpc -/-;Smadpc -/- 이중 돌연변이체와 Ptenpc -/- 사이의 통계학적 유의도를 나타낸다(P<0.05).
도 4는 Smad4가 손실되면 Pten 결핍 암종의 림프절 및 폐로의 전이가 진행되어 완전하게 침투하게 된다는 것을 입증한다. (A) 전립선암의 무전이 생존 곡선 (카플란-마이어 플롯(Kaplan-Meier plot)). 허리 림프절 및/또는 폐 중의 전이 병소는 오직 16주 내지 32주령된 Ptenpc -/-;Smadpc -/- 코호트에서만 관찰되었다. 전이가 완전하게 침투한 것으로 관찰된 Ptenpc -/-;Smadpc -/- 코호트(n=25)(별표)의 경우, Ptenpc-/- 코호트(n=25)와 비교할 때 통계학적으로 유의적(P<0.0001)인 것으로 관찰되었다. (B) 대표적인 허리 림프절(점선으로 표시된 원) 및 전이 병소(검은색 화살표)를 갖는 폐에 대해 이루어진 육안을 통한 해부학적 관찰. 스케일 바, 0.5 cm. (C) H&E 염색된 절편은 림프절(검은색 화살표) 및 폐에서 전이성 전립선암 세포를 보여준다. 면역조직화학적 분석을 통해 림프절 및 폐 중의 전이성 세포는 CK8 양성 및 AR 양성(전립선 상피 마커)인 것으로 나타났다. 스케일 바, 50 ㎛. Met, 전이; LN, 림프절.
도 5는, 표 1A로부터의 284개의 PC결정인자가 인간 전립선암 침습성 및 전이를 예측한다는 것을 입증한다. 이러한 특정 실험에서, 표 1A 상에 열거되어 있는 284개의 PC결정인자는 Pten로부터의 3개의 종양 샘플과 Pten Smad4로부터의 3개의 종양 샘플에 대한 비교로부터 얻은 것이었다. 표 1A로부터의 284개의 PC결정인자를 문헌 [Glinsky et al]의 전립선암 유전자 발현 데이타세트로부터의 예후적 유용성에 대하여 평가하였다. 생화학적 재발(BCR: biochemical recurrence)은 PSA 수준(>0.2 ng/ml)에 의해서 정의되었다. 환자 샘플을 표 1A 상에 열거되어 있는 284개의 PC결정인자에 의해 정의된 2개의 주요 클러스터(고위험군 및 저위험군)로 분류화하였다.
도 6은, 세포 이동 유전자는 무통성 Pten 종양과 비교하였을 때, 전이성 Smad4/Pten 전립선 종양에서 차별적으로 발현된다는 것을 도시한다. 차별적으로 발현된 유전자의 분자적 작용에 관한 인제뉴어티 패쓰웨이 분석(IPA: Ingenuity Pathway Analysis) 분석을 통해 Pten 종양과 비교하였을 때 Smad4/Pten 전립선 종양의 경우 세포 이동 유전자의 순위는 #18 대 #1인 것으로 나타났다. (A) Pten pc -/- ; Smad4 pc-/- 이중 돌연변이체 및 Pten pc -/- 마우스 사이에서 차별적으로 발현된 유전자의 분자적 작용에 관한 IPA를 통해 상기 유전자들이 세포 이동, 세포 사멸, 세포 성장 및 증식, 세포 대 세포 신호전달 및 상호작용, 세포 발생, 세포형태, 세포 주기, 세포 신호전달, 번역 후 변형, 지질 대사, 소분자 생화학적 성질, 약물 대사, 비타민 및 무기질 대사, 세포 작용 및 유지, 분자 수송, 유전자 발현, DNA 복제 및 수복에서 중요한 작용을 하는 것으로 밝혀졌다. 세포 이동 유전자 순위는 #1이었다. (B) Pten pc -/- ; p53 pc -/- 이중 돌연변이체 및 Pten pc -/- 마우스 사이에서 차별적으로 발현된 유전자의 분자적 작용에 관한 IPA를 통해 상기 유전자들이 세포 사멸, 유전자 발현, 세포 성장 및 증식, 세포 발생, 세포 발생, 아미노산 대사, 번역 후 변형, 소분자 생화학적 성질, 세포 작용 및 유지, 세포 형태학적 성질, 세포 조립 및 조직화, 세포 주기, 세포 대 세포 신호전달 및 상호작용, 약물 대사, 지질 대사, 분자 수송, 세포 절충, 항원 제시, 세포 이동, 당질 대사, RNA 손상 및 수복, DNA 복제 및 수복, 핵산 대사, 세포 신호전달, 단백질 합성에서 중요한 작용을 하는 것으로 밝혀졌다. Pten pc -/- ; Smad4 pc -/- 종양과는 대조적으로 Pten pc -/- ; p53 pc-/- 종양에 관한 IPA 에서는 세포 이동 유전자의 순위는 #18인 것으로 나타났 다.
도 7은 유전자 프로파일링 및 프로모터 분석을 통해 Ptenpc -/-;Smadpc -/- 이중 돌연변이체 및 Ptenpc -/- 마우스 사이에서 차별적으로 발현된 66개의 추정 Smad4 표적 유전자로 구성된 서브세트가 밝혀졌음을 도시한 것이다. (A) Ptenpc -/-;Smadpc -/- 이중 돌연변이체 및 Ptenpc -/- 마우스 사이에서 차별적으로 발현된 66개의 유전자. (B) 분자적 작용에 관한 인제뉴어티 패쓰웨이 분석(IPA)을 통해 이들 66개의 유전자들이 세포 이동, 암, 세포 성장 및 증식, 및 세포 사멸에서 중요한 작용을 하는 것으로 밝혀졌다.
도 8은 17개의 Smad 표적화된 유전자 시그너처가 암 침습성 및 전이를 예측할 수 있다는 것을 도시한 것이다. (A) 17개의 Smad 표적 유전자 시그너처가 형성된 것을 나타낸 다이어그램. 컴퓨터 분석을 통해 Ptenpc -/-;Smadpc -/- 이중 돌연변이체 및 Ptenpc -/- 마우스 사이에서 차별적으로 발현된 284개의 유전자 중 66개의 추정 Smad-표적 유전자가 존재한다는 것이 밝혀졌다. 인간 전이성 PCA 데이타세트를 중복시킴으로써 그에 기반하여 17개의 유전자 시그너처가 생성되었다. (B) Ptenpc -/-;Smadpc-/- 이중 돌연변이체 및 Ptenpc -/- 마우스 사이에서 차별적으로 발현되는 17개의 유전자. (C) 이어서, 17개의 추정 Smad 표적 유전자를 전립선암 유전자 발현 데이타세트에 대한 예후적인 유용성에 관하여 평가하였다. 종양 샘플(열 방향) 및 유전자(행 방향)에 대한 계층적 클러스터링을 제공한다. 적색은 상대적으로 높은 수준의 유전자 발현을 나타내고, 녹색은 상대적으로 낮은 수준의 유전자 발현을 나타낸다. 열지도 위쪽의 수평 막대는 각 환자의 재발 상태를 나타낸다(1, 생화학적 또는 종양 재발; 0, 무재발). 환자를 17개의 유전자 시그너처에 의해 정의된 2개의 주요 클러스터로 분류화하였다. 림프절 및 기타 다른 원위 전이는 적색 화살표로 표시되어 있다. (D) 17개의 유전자 클러스터에 의해 정의된 군에 기반한 카플란-마이어 생존 분석. (E, F) C와 같이, 17개의 유전자 시그너처를 유방 선암종 데이타세트에서 평가하였다. 17개의 유전자 클러스터에 의해 정의된 군에 기반하여 생존 가능성(E) 및 무전이 생존(F)에 관한 카플란-마이어 분석을 수행하였다.
도 9는 Smad4의 손실로 인해 2세까지는 전립선 종양이 개시되지 않는다는 것을 도시한 것이다. 1세(A) 및 2세(B)된 Smad4 단일 돌연변이체의 전립선 전엽(AP)에 관한 조직병리학적 분석(헤마톡실린/에오신 염색)을 통해 Smadpc -/- 마우스의 전립선은 정상인 것으로 밝혀졌다. 스케일 바, 50 ㎛.
도 10은 Ptenpc -/-;Smadpc -/- 마우스에서의 대표적인 수신증에 관한 조직병리학적 분석을 보여준다. (A) 거대한 전립선 종양(점선으로 표시된 원)을 가진 26주령된 전립선 종양을 포함한 대표적인 Ptenpc -/-;Smadpc -/-에 대해 이루어진 육안을 통한 해부학적 관찰. 스케일 바, 2 cm. (B,C) Ptenpc -/- 마우스(B) 및 수신증(화살표)을 앓는 Ptenpc-/-;Smadpc-/- 마우스(C)로부터 유래된 대표적인 신장에 대한 조직병리학적 분석. 헤마토실린 및 에오신(H&E)으로 염색한 것. 스케일 바, 1 mm.
도 11은 Ptenpc -/-;Smadpc -/- 이중 돌연변이체 및 Ptenpc -/- 마우스 사이에서 차별적으로 발현된, 284개(표 1A 참조)의, 암의 생물학적 성질과 관련된 유전자로 구성된 서브세트에 관한 마이크로어레이 분석을 나타낸다. (A) Ptenpc -/-;Smadpc -/- 이중 돌연변이체 및 Ptenpc -/- 마우스 사이에서 차별적으로 발현된 284개의 유전자. (B) 분자적 작용에 관한 인제뉴어티 패쓰웨이 분석(IPA)을 통해 이들 284개의 유전자들이 세포 이동, 암, 세포 성장 및 증식, 및 세포 사멸에서 중요한 작용을 하는 것으로 밝혀졌다.
도 12 (A) 이어서, 66개의 추정 Smad 표적 유전자를 전립선암 유전자 발현 데이타세트에 대한 예후적인 유용성에 관하여 평가하였다. 종양 샘플(열 방향) 및 유전자(행 방향)에 대한 계층적 클러스터링을 제공한다. 적색은 상대적으로 높은 수준의 유전자 발현을 나타내고, 녹색은 상대적으로 낮은 수준의 유전자 발현을 나타낸다. 열지도 위쪽의 수평 막대는 각 환자의 재발 상태를 나타낸다(1 , 생화학적 또는 종양 재발; 0, 무재발). 환자를 66개의 유전자 시그너처에 의해 정의된 2개의 주요 클러스터로 분류화하였다. 림프절 및 기타 다른 원위 전이는 적색 화살표로 표시되어 있다. (B) 66개의 유전자 클러스터에 의해 정의된 군에 기반한 카플란-마이어 생존 분석.
도 13은 Smad4 손실은 p53 의존성 경로를 통해 1차 마우스 배아 섬유아세포(MEF: mouse embryonic fibroblast)에서 Pten 손실로 유도되는 세포 노화를 우회시킬 수 있다는 것을 보여준다. (A) WT(패널 a), Smadpc -/-(패널 b), Ptenpc -/-(패널 c), 및 Ptenpc -/-;Smadpc -/-(패널 d) MEF의 노화 염색. 이들 유전자형을 갖는 3개의 독립적인 MEF로부터 얻은 대표적인 절편. (B) β-Gal 염색 정량. 오차 막대는 3중으로 수행된 대표적인 실험에 대한 s.d.를 나타낸다. 별표는 Ptenpc -/- 와 Ptenpc -/-;Smadpc -/- 이중 돌연변이체 사이의 통계학적 유의도를 나타낸다(P<0.05). (C) 각 유전자형을 갖는 MEF에 대한 웨스턴 블롯 분석은 (유전자형 1개당 4마리보다 많은 마우스에 대하여) 2중으로 수행된 대표적인 실험에 대한 p53 발현 수준을 나타낸다. 액틴은 내부 로딩 대조군으로서 사용되었다.
도 14는 Ptenpc -/-;Smadpc -/- 이중 돌연변이체로부터의 전립선 상피 세포가 누드 마우스에서 전립선 상피 세포 마커를 포함한 동소 전이성 종양을 형성한다는 것을 나타낸다. (A) Ptenpc -/-;Smadpc -/- 이중 돌연변이체로부터의 전립선 상피 세포를 동소 주사한 결과, 전립선에 종양(점선으로 표시된 원)이 형성되었고, 폐 전이(화살표)가 형성되었다. 스케일 바, 1 cm. (B) 면역조직화학적 분석을 통해 동소 종양 및 폐 전이는 CK8 양성 및 #AR 양성(전립선 상피 마커)인 것으로 나타났다. 스케일 바, 50 ㎛.
도 15는 Ptenpc -/-;Smadpc -/- 이중 돌연변이체로부터의 전립선 상피 세포가 누드 마우스에서 동소 전이성 종양을 형성한다는 것을 나타낸다. (A) Ptenpc -/-;Smadpc -/- 이중 돌연변이체로부터의 전립선 상피 세포를 신장에 이식한 결과, 전립선에 종양(점선으로 표시된 원)이 형성되었고, 폐 전이(화살표)가 형성되었다. 스케일 바, 1 cm. (B) 면역조직화학적 분석을 통해 신장 종양 및 폐 전이는 CK8 양성 및 #AR 양성(전립선 상피 마커)인 것으로 나타났다. 스케일 바, 50 ㎛.
도 16은 Pten-Smad4 이중 널(null) 전립선 종양 세포에서 Smad4의 회복은 TGFβ1로 처리되었을 때의 세포 생존가능성을 감소시킨다는 것을 나타낸다. (A) Smad4 결핍 전립선암 세포에 Smad4를 회복시키면 TGFβ1로 처리하였을 때 세포 생존가능성은 감소한다. 모체 대조군 세포(Cont1) 및 Smad4-Tet on 세포 (Smad4)를 5%의 활성탄으로 처리된 FBS를 함유하는 배지 중 1 ㎍/mL 독시사이클린(Dox)의 존재 또는 부재하에서 0.016 ng/mL, 0.031 ng/mL, 0.063 ng/mL, 0.125 ng/mL, 0.25 ng/mL, 0.5 ng/mL TGFβ1로 처리한 후, 아데노신 트리포스페이트를 정량함으로써 세포 생존가능성을 평가하였다. 오차 막대는 3중으로 수행된 대표적인 실험에 대한 s.d.를 나타낸다. 검은색 막대, Dox 부재하의 대조군 모체 세포주; 청색 막대, Dox 존재하의 대조군 모체 세포주; 적색 막대, Dox 부재하의 Smad4 tet-on 세포주; 녹색 막대, Dox 존재하의 Smad4 tet-on 세포주. (B) Dox로 처리하였을 때의 Smad4 발현을 웨스턴 블롯 분석한 결과, Dox로 처리한 Smad4 tet-on 세포주 또는 Dox로 처리하지 않은 Smad4 tet-on 세포주에서 Smad4가 발현된 것으로 나타났다. Ran은 내부 로딩 대조군으로서 사용되었다. (C) TGFβ1로 처리하였을 때 또는 처리하지 않았을 때의 세포 형태. TGFβ1 또는 비히클로 처리한 후 4일이 경과하였을 때 세포 사진 촬영을 하였다.
도 17은 Smad4의 손실은 Pten 손실로 유도되는 자가포식을 우회시켰다는 것을 나타낸다. (A) TGFβ1로 처리하였을 때 또는 처리하지 않았을 때의 세포 형태. TGFβ1 또는 비히클로 처리한 후 3일이 경과하였을 때 세포 사진 촬영을 하였다. (B) 15주령된 Ptenpc -/-;Smadpc -/- 이중 돌연변이체 및 Ptenpc -/- 마우스로부터 유래된 전립선 종양 세포에 관한 투과 전자 현미경에 의한 관찰.
도 18은 거세를 통해 호르몬이 절제된 Pten/Smad4 이중 돌연변이체 마우스에서 호르몬 난치성 전이성 PCA가 발생되었음을 입증한다. (A) 거세된 동물의 카플란-마이어 전반적인 누적 생존분석. 거세된 Ptenpc -/-;Smadpc -/- 코호트(n=22)(별표)의 경우, 거세되지 않은 Ptenpc -/-;Smadpc -/- 코호트 (n=20)와 비교하였을 때 수명은 통계학상 유의적으로 연장되었다(P<0.0001). 화살표는 15주째 거세하였음을 나타낸다. (B) 거세가 Ptenpc -/-;Smadpc -/- 이중 돌연변이체에서의 전립선암 전이를 차단하지는 못했다. 보다 고배율의 사진(박스로 나타낸 부위)은 우측에 제시되어 있다(패널 b). 대표적인 림프절 전이에 관한 조직병리학적 분석. 스케일 바, 패널 a의 경우, 200 ㎛, 및 패널 b의 경우, 50 ㎛. (C) 조직병리학적 및 증식 분석을 한 결과, 거세된 WT 및 Ptenpc -/- 마우스와 비교하였을 때, 거세된 Ptenpc -/-;Smadpc -/- 이중 돌연변이체에서 고도로 증식(갈색 염색)된 것으로 나타났다. 스케일 바, 50 ㎛. 15주째 거세된 23주령된 마우스를 분석하였다. (D) 15주째 거세된 23주령된 마우스를 brdu + 표지화한 것에 대한 정량. 3마리의 마우스로부터 얻은 대표적인 절편에서 각 유전자형에 대하여 계수하였다. 별표는 Ptenpc -/-;Smadpc -/- 이중 돌연변이체 및 Ptenpc -/- 사이의 통계학적 유의도를 나타낸다(P<0.05).
도 19는 Pten 및 Smad4가 전립선암 개시 및 진행을 조절함에 있어 어떻게 협력하는지를 나타내는 모델을 도시한 것이다. 전립선에서 Pten을 손실하게 되면 전립선 종양이 발병하게 되지만, 추가로 진행되는 것은, Pten 손실로 인해 유도되는 증식적 차단/노화에 의해 억제되었다. Pten 및 Smad4, 둘 모두를 손실하게 되면 Pten 손실로 인해 유도되는 증식적 차단/노화는 우회되고, 가능하게는 기타 다른 세포 및 세포내 억제 기전, 예로서, PC결정인자 1-372 또는 PC결정인자 1-372의 서브세트를 통한 세포 이동을 방해하는 기전을 우회시킴으로써, 결국에는 전립선 종양 세포가 전이로 진행되게 된다.
도 20은 Pten pc -/- ; Smad4 pc -/- 이중 돌연변이체 및 Pten pc -/- 마우스 사이에서 교차종으로 3각 측량하여 차별적으로 발현된 유전자가 인간 PCA에서의 임상적 결과와 연관이 있음을 입증한다. (A) Pten pc -/- ; Smad4 pc -/- 이중 돌연변이체 및 Pten pc -/- 마우스 사이에서 차별적으로 발현된 유전자(표 1B)와 인간 전이성 PCA 데이타세트19를 중복시킨 것을 기반으로 하여 56개의 유전자 세트가 생성된 것을 나타낸 다이어그램. (B) 이어서, 56개의 유전자 세트(표 7)를 전립선암 유전자 발현 데이타세트에 대한 예후적 유용성에 대하여 평가하였다. 환자 샘플을 56개의 유전자 시그너처에 의해 정의된 2개의 주요 클러스터(저위험군 및 고위험군)로 분류화하였다. 56개의 유전자 클러스터에 의해 정의된 군에 기반한 생화학적 재발(BCR) PSA 수준(>0.2 ng/ml)에 관한 카플란-마이어 분석. "저위험군" 코호트와 비교하여 "고위험군" 코호트의 경우, BCR PSA 무재발 생존(P=0.0018)은 통계학적으로 유의적인 것으로 나타났다.
도 21은 시험관내에서 작용적으로 침습을 유도하거나 억제하는 PC결정인자를 확인하는 접근법을 도시한 것이다.
도 22는 후보 유전자를 작용에 따라 입증하기 위해 침습성 분석을 사용한 것을 보여준다. SPP1 및/또는 GFP 대조군을 과다발현하는 PC3 세포를 사용하여 3중으로 실시한 대표적인 보이든(Boyden) 챔버 침습성 분석. (A) 침습성 분석에 의해서 SPP1의 보강된 발현을 통해 인간 PCA PC3 세포의 침습성 활성을 유의적으로 증진시킬 수 있는 SPP1의 능력을 확인하였다. (B) 막대 그래프는 보강된 SPP1 및 GFP 대조군 사이의 통계학적 유의도를 나타낸다(P<0.05). (C) 세포 이동에 관여하는 것으로서 주석이 달린, 침습성 촉진 유전자 뿐만 아니라, 이동에는 관여하는 것으로서 분류되지는 않았지만, 시험관내에서 침습성 및 전이성 특성을 유도하는 것인 유전자를 분석을 통해 확인하였다는 것을 표를 통해 확인할 수 있다. 침습성이 입증된 PC결정인자 중 유의적으로 더 높은 빈도를 갖는 것(P=0.02, 피셔의 정확 검정(Fisher's Exact Test))이 세포 이동이라는 주석이 달린 유전자를 제외한 것과 비교하여 세포 이동 유전자로서 주석을 달게 되었다.
도 23은 Pten/Smad4 트랜스크립톰 데이타, 조직병리학적 데이타 및 침습성 확인 데이타에 의해 알려진 네개(4)로 구성된 PC결정인자 유전자 시그너처 PTEN-SMAD4-사이클린 D1-SPP1이 인간 PCA에서의 임상적 결과와 연관이 있음을 입증한다. (A) 이어서, 관련된 사이클린 D1(증식/노화) 및 SPP1(유동성 네트워크)과 함께 조절 기능에 장애가 있는 Pten 및 Smad4 발현은 전립선암 유전자 발현 데이타세트 상에서 인간 전립선암 진행과 상관관계에 있는 것으로 나타났다. 환자 샘플을 PTEN, SMAD4, 사이클린 D1, 및 SPP1 시그너처에 의해 정의된 K-평균(고위험군 및 저위험군)에 의해서 2개의 주요 클러스터로 분류화하였다. 고위험군 환자는 카플란-마이어 분석에 의해 생화학적 재발(BCR) PSA 수준(>0.2 ng/ml)에서 통계학적으로 유의적인 것으로 나타났다. (B) PCA 진행에서의 PTEN, SMAD4, 사이클린 D1, 및 SPP1 시그너처의 유의적인 상관관계는 c-통계를 사용하여 독립적인 내과의 건강 연구회(PHS: Physicians' Health Study) 데이타세트로 확인하였다. 치명적인 결과 예측에 있어 PTEN, SMAD4, 사이클린 D1, 및 SPP1은 글리슨 점수와 유사한 능력을 발휘하였다. PTEN, SMAD4, 사이클린 D1, 및 SPP1 유전자를 글리슨 점수에 부가하였을 때 치명적인 결과를 예측함에 있어서 PHS에서 오직 글리슨 점수만을 단독으로 하는 모델보다 유의적으로 개선된 것으로 나타났다. 또한, PTEN, SMAD4, 사이클린 D1, 및 SPP1 4개의 유전자 세트는 몰레큘라 시그너처 데이타베이스 오브 더 브로드 인스티튜트( MSigDB : Molecular Signature Databases of the Broad Institute , version 2.5)에서 큐레이팅된 244개의 양방향 시그너처 중에서 가장 강화된 순위에 등급되었으며, 이는 치명적인 결과를 예측함에 있어서 4개의 유전자 시그너처가 확고한 유의성을 띤다는 것을 시사한다.
도 24는 Pten pc -/- ; Smad4 pc -/- 이중 돌연변이체 및 Pten pc -/- 마우스 사이에서 교차종으로 3각 측량하여 차별적으로 발현된 유전자가 인간 유방암에서의 임상적 결과와 고도로 연관이 있음을 입증한다. (A) 이어서, 56개의 유전자 세트(표 7)를 유방 선암종 데이타세트에 대한 예후적 유용성에 대하여 평가하였다. 환자 샘플을 56개의 유전자 시그너처에 의해 정의된 2개의 주요 클러스터(저위험군 및 고위험군)로 분류화하였다. 56개의 유전자 클러스터에 의해 정의된 군에 기반하여 생존 가능성(p=0.00358)(A) 및 무전이 생존(p=00492)(B)에 관해 카플란-마이어 분석을 수행하였다.
도 25는 전립선 및 유방암, 둘 모두의 진행과 상관관계에 있는 PC결정인자가 인간 유방암에서의 임상적 결과와 고도로 연관이 있음을 입증한다. (A) 전립선 및 유방암, 둘 모두에서 진행과 상관관계에 있는 발현을 나타내는 20개의 PC결정인자(표 6)를 유방 선암종 데이타세트에 대한 예후적 유용성에 대하여 평가하였다. 환자 샘플을 20개의, 진행과 상관관계에 있는 유전자 시그너처에 의해 정의된 2개의 주요 클러스터로 분류화하였다. 20개의 PC결정인자에 의해 정의된 군에 기반하여 생존 가능성(p=2.93e-11)(A) 및 무전이 생존(p=4.62e-10)(B)에 관해 카플란-마이어 분석을 수행하였다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 전이성 전립선암과 관련이 있는 시그너처의 확인, 및 피험체가 전이성 전립선암을 앓게 하거나, 전이성 전립선암의 발병 위험성에 있게 하는 것인 PC결정인자의 확인에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 마우스 전립선 상피가 예로서, Pten 및 Smad4 유전자와 같은 개시 병변의 결실, 또는 돌연변이 또는 후성적 소거를 위한 기타 다른 수단을 유지하는, 침습성 및 전이성 전립선암에 대한 뮤린 마우스 모델을 제공한다. 온코진 트랜스진의 과다발현을 비롯한 기타 다른 개시 병변은 Smad4 결실과의 커플링될 수 있고, 이로써 악성으로 진행될 수 있음을 당업자는 이해할 수 있을 것이다. 이러한 마우스 모델을 사용하여 암 검출 바이오마커를 확인할 수 있다.
인간 암은 악성 과정을 유도하고 주어진 종양의 임상적 행태를 지시하는 변이를 판독할 때 방대한 도전과제를 제시하는 수많은 유전적 및 후성적 변경을 보유하고 있다. 다수의 암 유형 전체에서, 특히 전립선암에서 종양의 악성 잠재능을 반영하는 바이오마커를 정확하게 예측하여야 할 필요성은 명백한데, 현 관리 알고리즘을 통해서는 결과적으로 사망의 위험성을 안고 치료를 받고 있거나, 불필요한 병적 치료법에 노출되고 있다.
인간에서 고도로 복잡한 게놈 데이타세트를 조사하는 데 있어서 유전공학처리된 마우스 모델이 엄청나게 큰 강력한 효과를 발휘하는 "필터"로서의 역할을 하는 것으로 나타났다. 특히, 고해상 비교 온코게노믹스 분석에서는 상기와 같은 인간 암의 엄선된 유전공학처리된 마우스 모델이 암과 관련된 전사 및 염색체 DNA 변이 패턴(후자의 경우, 이를 통해서는 다수의 신규 암 유전자가 신속하고 효율적으로 확인되었다)에서 상당한 중복을 보유하고 있는 것으로 보고되었다. 또한, 혈청 프로테옴에 대한 유사한 교차종 비교가 인간에서의 췌장암에 대한 조기 검출 바이오마커가 유효한 것으로 입증되었다. 따라서, 진정한 인간 전립선암 유전자에 의해 유도되는 전이의 질환 상태를 재현할 수 있는 유효한 마우스 모델을 개발하는 것이 예후적인 조기 검출 바이오마커와, 가능한 치료학적 표적을 개발하고자 하는 본 발명자들의 노력을 매우 용이하게 할 것이라는 것은 당연한 것이다.
무통성 Pten 결핍 전립선 PIN 병변에 대한 전반적인 트랜스크립톰 분석을 통해 Smad4 의존성 체크점의 존재는 PIN 범위 밖으로 진행되는 것을 차단하면서, Pten 불활성화의 환경하에서 노화 반응을 유도한다는 추론이 이루어졌다. 마우스 전립선 상피에서 Pten 결실과 함께 수반되는 Smad4 결실을 통해서 실제로 잠재기가 짧은 전격성 전이성 전립선 모델이 발생되었고, 이는 상기 가설에 대한 명확한 증거를 제공한다. 즉, 진정한 전립선 종양 억제인자에 의해 유도된 전이성 전립선암에 대한 마우스 모델은 인간에서 원발성에서 전이성 PCA로 진행되는 동안 일관되게 Smad4가 하향조절된다는 입증 사실을 통해 뒷받침된다. 상기 모델에 대한 유효성은 추가로, 재발 또는 생존에 의해 측정된 바, 2개의 종 간에 보존되는 Smad4에 대한 17개의 예측성을 띤 직접적인 표적이 인간 전립선 및 유방 선암종을 결과에서 유의적인 차이가 나는 2개의 군으로 계층 분류할 수 있다는 입증 사실을 통해 재보강되었다. 따라서, 본 발명자들은 예후적인 조기 검출 바이오마커에 대한 조사에서 향후의 기계론적인 연구 뿐만 아니라, 비교 게놈 및 프로테오믹 분석도 수행할 수 있는, 전이성 PCA에 대한 진정한 유전공학처리된 마우스 모델을 확립하게 되었다.
Pten 작용의 손실은 전립선 발암에서 가장 유의적인 유전적 이벤트인 것으로 확립되었다. Pten가 손실되면 마우스 전립선에서 전립선 종양발생이 유발되지만; 이를 통해서는 또한, 종양 세포가 침습성 단계로 진행되는 것을 차단하는 추가 수준의 종양 억제인자로서 작용할 수 있는 세포 노화가 일어나게 된다. p53의 불활성화를 통해 Pten에 유도되는 노화를 우선시하면 전립선 종양이 무통성 병변으로부터 침습성 종양으로 진행되는 원인이 된다. 본 발명자들은 Smad4 손실 또한 Pten에 유도되는 세포 노화를 우회시킬 수 있다는 것을 발견하게 되었다. Smad4 손실에 의한 노화를 우선시하는 것은 Pten 손실에 협력적이며, 이는 종양 세포를 촉진시키는 Pten 역할에 도움을 줄 수 있다. 이는 또한 p53 손실에 의한 세포 노화의 우회는 Pten 손실에 협력적이며, 이는 전립선 종양이 적당히 별로 크지 않는 침습성이나 비전이성인 병변으로 진행되는 데 도움을 줄 수 있다는 이전 보고와도 일치한다. 따라서, 이러한 독특한 Pten/Smad4 모델 시스템은 향후에 상기와 같이 중요한 종양 생물학적 과정에 대한 분자 이벤트를 추가로 분류 구분할 수 있는 도구를 제공한다.
노화의 우회를 통해 Pten/Smad4 이중 돌연변이체 마우스 전립선 종양 세포 진행이 침습성 및 전이성 상태로 이루어지기는 하지만, Pten/p53가 불활성화된 마우스 모델에서의 노화 우회는 전이를 일으키지 않는다. 마우스 전립선에서 Pten만이 단독으로 불활성화되면 매우 노령인(1세 초과) 소규모의 Pten 마우스(8마리 중 2마리)에서 몇몇의 미미한 전이 표현형이 나타날 수 있다. 이러한 관찰 결과는 전립선 종양 세포가 전이성 상태가 되기 위해서는 Pten 손실 이외에 추가의 유전적 또는 후성적 변경이 필요하다는 것을 시사하였다. 세포 노화의 우회가 진행에 대한 전제조건이 될 수는 있지만, 확고한 전이성 상태가 되기 위해서는 예로서, 자가포식의 탈활성화와 같은 기타 다른 생물학적 과정이 필요할 수도 있다. 기타 다른 생물학적 과정의 존재를 지지하면서, 본 발명자들은, Pten/Smad 결핍 종양 세포에서 Smad4가 재건되면 노화는 원 상태로 이루어지지 못하고 세포 비전이가 이루어진다는 것을 관찰하게 되었다. 구체적으로, 본 발명자들은 시간에 의존하고 투여량에 의존하는 방식으로 Smad4 발현을 회복시킬 수 있는 유도성 Smad4 tet-on 시스템을 확립하였다. Smad4 회복이 TGFβ의 치료에 대한 반응으로 종양을 세포 사멸에 대하여 감작시킬 수 있다.
정규의 TGFβ-Smad 경로는 리간드 수용체 복합체로부터 출발하여 핵에서 끝이 난다. TGFβ 수퍼패밀리 리간드 결합시, 수용체-인산화된 R-Smad는 Smad4와 올리고머화하고, 핵으로 전위되어 DNA 상의 Smad-결합 요소에 직접 결합하게 되고, 거기서, 다양한 유전자를 유도할 수 있거나 억제시킬 수 있다. 양성 전립선 상피에서는 분화를 일으키고, 증식을 억제시키며, 아포프토시스를 유도함으로써 TGF-β는 전립선에서 항상성을 유지하는 기전을 제공한다. 따라서, TGFβ의 주된 영향력이 전립선 종양 진행을 억제시키는 데에서 중요한 역할을 한다고 예측할 수 있었다. 전립선암을 비롯한 다중 암에서 불활성 TGFβ 수용체 돌연변이의 존재와 Smad2, Smad3, 및 Smad4 단백질의 소거에서 TGFβ 신호전달의 종양 억제인자의 역할이 강조된다. TGFβ가 다수의 정상적인 세포 유형과 종양 세포의 성장을 억제시키는 것으로 나타났지만, TGFβ는 또한 증식, 이동, 및 상피에서 중간엽으로의 전이(EMT: epithelial-to-mesenchymal transition)(상기 EMT 과정을 통해 진행성 암종은 고돌 침습성인, 비분화성의 전이성 표현형이 된다)를 비롯한 상피 종양의 악성 효능을 증진시킨다고 보고되었다. 가장 최근에는, 유방 종양 미세환경에서 TGFβ가 Smad 신호전달 경로를 경유하여 TGFβ에 의한 안지오포이에틴 유사 4( ANGPTL4 )의 유도를 통해 암 세포가 폐로 전이될 수 있는 준비를 시킬 수 있다고 입증되었다. 종양 억제 및 촉진이라는 상기와 같은 역설적인 활성은 아마도, 다른 세포 배경 뿐만 아니라, 기타 다른 조직과의 상호작용에 의해 조정되는 것인, 주어진 세포에서의 기타 다른 신호전달 경로의 활성에 따라 달라진다. 이에, Pten/Smad4 모델은 Smad4 손실이 단독으로 전립선 병변의 발생을 개시시키기에는 충분하지 않지만, 적어도 Pten이 결핍된 배경하에서는 전립선 종양의 가속화와 전이로 진행되어 완전하게 침투될 수 있도록 촉진시킬 수 있다(도 3)는 것을 명확하게 보여줌으로써 전립선암에서 TGFb 경로의 역할을 명확하게 설명하였다. Pten/Smad4 모델 연구는 Smad4 손실이 Pten 손실에 의해 유도되는 노화보다 우선시될 수 있다는 것을 명확하게 입증하였다. Pten 결핍 배경하의 p53 손실에 의한 노화가 우선시 되면 무통성 전립선 종양은 전이되는 것이 아닌, 침습성 병변으로 진행된다. 따라서, 노화는 전립선 종양발생이 무통성에서 침습성 상태로 되는 동안의 조기 장벽인 것으로서 간주된다. 이는Smad4가 Pten/Smad4 이중 돌연변이체 전립선 종양 세포로 다시 회복되어도 노화는 회복되지 않기 때문이다(데이타는 나타내지 않았다). 그러나, TGFβ1로 처리하였을 때, Smad4의 회복은 세포의 생존가능성을 감소시켰다. 따라서, 노화 장벽은 종양 진행을 차단하는 발암성 신호(들)에 대한 일시적인 세포 반응일 수 있다.
추가로, 등가인 조기 단계의 Pten 및 Pten/Smad 널 전립선 종양(각 유전자형에 대해 n=5)에 대한 분자적 비교 트랜스크립토믹 분석을 통해, 적어도 66개의 유전자는 그의 프로모터에 Smad 결합 요소를 포함하는 것인, 차별적으로 발현되는 372개의 유전자가 밝혀졌다. 인간 전이성 전립선 종양의 카피수 프로파일과의 교차종 통합을 통해, 본 발명자들은 상기 Smad4 표적들 중에서, 인간 전립선암에서는 재발 위험성과, 유방암에서는 전이 위험성 및 생존과 강력한 관련성이 있는 17개의 Smad4 표적을 확인하게 되었고, 이로써, 상기와 같은 신규의 전이성 전립선 모델과 인간과의 관련성 및 유전적 PC결정인자의 발견에서 그의 용도가 비교 온코진을 통한 다수의 종양 유형 전체에서 질환 진행을 지배할 수 있다는 것을 입증하게 되었다.
따라서, 본 발명은 전이성 전립선암에 대한 동물 모델을 제공한다. 따라서, 본 발명의 동물 모델을 통해 정상 군집 및 질환에 걸린 환자 군집 둘 모두에 관련된 각종 유전자의 기전을 밝혀내는 스크리닝 도구로서의 특별한 유용성을 찾아낼 수 있다.
본 발명은 또한 전이성 종양과 관련된 PC결정인자를 검출함으로써, 전이성 종양의 증상이 없는 피험체를 비롯한, 전이성 전립선암을 앓는 피험체, 또는 전이성 전립선암을 경험하게 될 위험성이 있는 피험체를 확인하는 방법을 제공한다. 이러한 시그너처 및 PC결정인자는 또한 암에 대한 치료법 및 요법을 받은 피험체를 모니터링하는 데, 및 암을 앓는 피험체에서 유효한 요법 및 치료법을 선택하거나 변형시키는 데 유용하며, 여기서, 상기 치료법 및 요법의 선택 및 사용은 종양의 진행을 늦추거나, 또는 실질적으로 종양의 개시를 지연 또는 예방하거나, 또는 종양 전이의 발병을 감소 또는 예방한다.
정의
"정확도"란 측정량 또는 산출량(시험 보고값)과 그의 실제값(또는 진정한 값)과의 일치 정도를 지칭한다. 임상적 정확도는 진정한 결과값의 비율(진정한 양성(TP: true positive) 또는 진정한 음성(TN: true negative) 대 잘못 분류된 결과값(허위 양성(FP: false positive) 또는 허위 음성(FN: false negative))에 관한 것이고, 이는 감도, 특이성, 양성 예측도(PPV: positive predictive value) 또는 음성 예측도(NPV: negative predictive value)로서, 또는 다른 측정치들 중에서도 우도, 오즈비로서 언급될 수 있다.
본 발명과 관련하여 "PC결정인자"는 제한없이, 단백질, 핵산, 및 대사물과 함께 그들의 다형체, 돌연변이, 변이체, 변형체, 서브유닛, 단편, 단백질-리간드 복합체 및 분해 생성물, 단백질-리간드 복합체, 요소, 관련 대사물, 및 기타 다른 분석물 또는 샘플 유래의 측정물을 포함한다. PC결정인자는 또한 돌연변이화된 단백질 또는 돌연변이화된 핵산을 포함할 수 있다. PC결정인자는 또한 건강 상태의 비혈액계 인자 또는 비분석물 생리학적 마커, 예로서, 본원에서 정의된 "임상적 파라미터" 뿐만 아니라, 역시 본원에서 정의된 "통상적 실험실 위험 인자"도 포함한다. PC결정인자는 또한 수학적으로 작성된 임의의 산출 지수, 또는 일시적 경향 및 차이를 비롯한 상기 측정들 중 임의의 하나 이상의 조합도 포함된다. 이용가능한 경우, 및 본원에 달리 명시하지 않는 한, 유전자 생성물인 PC결정인자는 엔트레즈 진(Entrez Gene)으로도 알려진, 국제 인간 게놈 기관 명명 위원회(HGNC: Human Genome Organization Naming Committee)에 의해 지정되었고, 미국 국립 생명과학 정보 센터(NCBI: US National Center for Biotechnology Information) 웹사이트(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=gene)에 본 출원일자에 열거되어 있는 공식 문자 약어 또는 유전자 기호에 기초하여 확인된다.
"PC결정인자" 또는 "PC결정인자들"은 전이성 전립선암을 앓거나, 전이성 전립선암이 발병될 수 있는 성향을 보이거나, 또는 전이성 전립선암의 위험성이 있는 피험체에서 그 수준에 변화가 있는 모든 핵산 또는 폴리펩티드 중 하나 이상을 포함한다. 개별 PC결정인자는 표 1B에 요약되어 있고, 본원에서는 특히 "전이성 종양 관련 단백질," "PC결정인자 폴리펩티드," 또는 "PC결정인자 단백질"로 총괄적으로 지칭한다. 폴리펩티드를 코딩하는 상응하는 핵산은 "전이성 종양 관련 핵산," "전이성 종양 관련 유전자," "PC결정인자 핵산," 또는 "PC결정인자 유전자"로 지칭한다. 달리 명시하지 않는 한, "PC결정인자," "전이성 종양 관련 단백질," 및 "전이성 종양 관련 핵산"은 본원에 개시된 서열 중 임의의 것을 지칭한다는 것을 의미한다. PC결정인자 단백질 또는 핵산의 상응하는 대사물 또한 측정할 수 있을 뿐만 아니라, 상기 언급한 통상적 위험 마커 대사물들 중 임의의 것도 측정할 수 있다.
(예를 들어, 연령, 가족력, 및 통상의 위험성 인자로서 통상 사용되는 기타 다른 측정값과 같은) 건강 상태의 생리학적 마커는 "PC결정인자 생리학적 성질"로서 지칭된다. 상기 부류들의 PC결정인자들 중 하나 이상, 바람직하게 2개 이상의 측정값들을 수학적으로 조합함으로써 생성된 산출 지수를 "PC결정인자 지수"로 지칭한다.
"임상적 파라미터"는 피험체 건강 상태의 모든 비샘플 또는 비분석물 바이오마커, 또는 기타 다른 특징들, 예로서, 제한없이, 연령(Age), 인종(RACE), 성별(Sex), 또는 가족력(FamHX)을 포함한다.
"순환 내피 세포"("CEC: circulating endothelial cell")는 염증을 비롯한, 특정 환경하에 혈류로 들어가는 혈관의 내벽으로부터의 내피 세포이며, 암 발병기전과 관련된 신 맥관구조의 형성에 기여한다. CEC는 종양 진행 및/또는 항혈관형성 요법에 대한 반응의 마커로서 유용할 수 있다.
"순환 종양 세포"("CTC: circulating tumor cell")는 전이시에 원발성 종양으로부터 나와 순환에 들어가는 상피 기원의 종양 세포이다. 말초혈 중 순환 종양 세포의 개수가 전이성 암을 앓는 환자에서의 예후와 관련이 있다. 이러한 세포는 상피 세포를 검출하는 면역학적 방법을 사용하여 분리되고 정량화될 수 있고, 그의 PC결정인자 발현은 qRT-PCR, 면역형광법, 또는 기타 다른 접근법에 의해 정량화될 수 있다.
"FN"은 질환 상태 시험에 있어, 질환 피험체를 올바르지 않게 무질환 또는 정상으로 분류함을 의미하는 허위 음성이다.
"FP"는 질환 상태 시험에 있어, 정상적인 피험체를 올바르지 않게 질환을 앓는 것으로 분류함을 의미하는 허위 양성이다.
"식," "알고리즘," 또는 "모델"은 하나 이상의 연속 또는 분류별 입력값(본원에서 "파라미터"로 지칭)을 취하여, 때로는 "지수" 또는 "지수 값"으로 지칭되는 출력값을 계산하는 임의의 수학 방정식, 알고리즘, 분석적 또는 프로그래밍된 프로세스, 또는 통계학적 기법이다. "식"의 비제한적인 예로는 합계, 비 및 회귀 작용자, 예로서, 계수 또는 지수, 바이오마커 값 변형 및 정규화(제한없이, 임상적 파라미터, 예로서, 성별, 연령 또는 인종에 기초한 정규화 체계), 규칙 및 지침, 통계학적 분류 모델 및 기존 군집에 대해 훈련된 신경 네트워크를 포함한다. PC결정인자 및 기타 다른 PC결정인자를 조합하는 데 특별히 사용되는 것은 피험체 샘플에서 검출되는 PC결정인자의 수준과 피험체의 전이성 질환 위험성 사이의 관계를 측정하는 선형 및 비선형 방정식 및 통계학적 분류 분석이다. 패널 및 조합 구성에서, 특히 관심의 피험체가 되는 것은 무엇보다도 교차상관, 주요 성분 분석(PCA: Principal Components Analysis), 인자 회전, 로지스틱 회귀(LogReg: Logistic Regression), 선형 판별 분석(LDA: Linear Discriminant Analysis), 아이젠진 선형 판별 분석(ELDA: Eigengene Linear Discriminant Analysis), 지지 벡터 기기(SVM: Support Vector Machines), 무작위 포레스트(RF: Random Forest), 재귀 분할 트리(RPART: Recursive Partitioning Tree) 뿐만 아니라, 기타 관련 결정 트리 분류 기법, 쉬런켄 센트로이드(SC: Shrunken Centroids), 스텝AIC(StepAIC), K번째-최근접 이웃(Kth-Nearest Neighbor), 부스팅(Boosting), 결정 트리, 신경 네트워크, 베이시안 네트워크(Bayesian Networks), 지지체 벡터 머신(Support Vector Machine), 및 히든 마르코프 모델(Hidden Markov Models)과 같은 확립된 기법을 포함한 패턴 인식 특성을 이용한, 구조적 및 구문 통계학적 분류 알고리즘, 및 위험 지수 구성 방법이다. 다른 기법들이 당업자에게 주지된, 콕스(Cox), 와이불(Weibull), 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 및 그린우드(Greenwood) 모델을 비롯한, 생존 및 시간에 따른 이벤트 위해 요소 분석 수행에 사용될 수 있다. 이 기법들 중 상당수가 PC결정인자 선택 기법, 예로서, 전방 선택, 후방 선택, 또는 단계별 선택, 크기가 정해진 모든 잠재적인 패널의 완전 열거, 유전적 알고리즘과 조합되어 사용가능하거나, 자체 기법 내에 바이오마커 선택 방법들을 포함할 수도 있다. 이들은 추가의 바이오마커와 모델 사이의 트레이드오프에 따른 개선값을 정량하고, 오버핏을 최소화하기 위해 정보 기준, 예로서, 아카이케 정보 기준(AIC: Akaike's Information Criterion) 또는 베이즈 정보 기준(BIC: Bayes Information Criterion)과 결부시킬 수 있다. 생성된 예측적 모델이 다른 연구에서 검증될 수 있거나, 부트스트랩(Bootstrap), 리브-온-아웃(Leave-One-Out)(LOO) 및 10배 교차 검증(10배 CV: 10-fold cross-validation)와 같은 기법을 사용하여, 그들이 원래 훈련받았던 연구에서 교차 검증될 수 있다. 각종 단계들에서, 허위 발견율은 당업계에 공지된 기법에 따른 값 순열에 의해 추정할 수 있다. "건강 경제 효용 함수"는 건강 관리 표준에 진단 또는 치료 중재법을 도입하기 이전 및 이후, 둘 모두에 있어, 적용가능한 이상화된 환자 군집에서 일정 범위의 임상적 결과의 예상 확률들의 조합으로부터 유도되는 식이다. 이는, 건강 관리(서비스, 공급품, 장치 및 약물 등)의 실제 보건 시스템 비용으로부터 유도되고/되거나, 각 결과를 초래하는 삶의 질이 조정된 생명년수(QALY: quality adjusted life year) 당 허용가능한 예측치로서 유도될 수 있는, 상기 중재법의 정확도, 유효성 및 성능 특징의 예측치, 및 각 결과와 관련된 비용 및/또는 값 측정(유용도)을 포함한다. 모든 결과들 전반에 걸친, 결과에 대한 예측된 군집 크기와 각 결과의 예상 효용을 곱한 값의 합계는 주어진 건강 관리 표준의 건강 경제 효용값의 총합이다. (i) 중재법 적용하의 건강 관리 표준에 대해 산출된 건강 경제 효용값의 총합 대 (ii) 중재법 부적용하의 건강 관리 표준에 대한 건강 경제 효용값의 총합 간의 차이로 인해 중재법의 건강 경제 비용 또는 값을 전반적으로 측정하게 한다. 이는 그 자체가 단위 중재 당 비용에 도달하고 건강 시스템 수용의 시장 위치 지정, 가격 설정 및 상정과 같은 결정을 가이드할 수 있도록, 분석되는 전체 환자군 간에 (혹은 중재군 간에 단독으로) 분리될 수 있다. 그러한 건강 경제 효용 함수는 통상적으로 중재법의 비용 효율성을 비교하는 데 사용될 수도 있지만, 이는 또한 건강 관리 시스템이 지불하고자 하는 QALY 당 허용가능한 값 또는 새 중재법에 필요한 허용가능한 비용면에서 효율적인 임상적 성능 특징을 예측하는 것으로 전환될 수도 된다.
본 발명의 진단적(또는 예후적) 중재에 있어, (질환 분류 진단 시험에서 TP, FP, TN 또는 FN일 수 있는) 각 결과가 다른 비용을 필요로 하기 때문에 건강 경제 효용 함수는 임상적 상황 및 개별 결과 비용 및 값에 기초하여 특이성보다는 감도를 우선적으로 선호할 수 있거나, NPV보다는 PPV를 우선적으로 선호할 수 있으며, 이에 따라 더욱 직접적인 임상적 또는 분석적 성능 측정값과 상이할 수 있는 건강 경제 성능 및 값의 또다른 측정값을 제공한다. 이 상이한 측정 및 상대적인 트레이드오프는 일반적으로 오차율이 0인(예측된 피험체 결과 오분류 또는 FP 및 FN=0으로도 알려져 있다) 완전한 시험인 경우에만 수렴될 것이며, 이들 모두의 성능 측정값은 불완전한 것보다는 유리할 수 있으나, 정도에 차이는 있다.
"측정하는" 또는 "측정," 또는 별법으로 "검출하는" 또는 "검출"이라는 것은 임상 샘플 또는 피험체로부터 유래된 샘플 중에 있는 주어진 물질의 정성적 또는 정량적 농도 수준의 유도를 비롯한, 그러한 물질의 존재, 부재, 수량, 또는 양(이는 유효량일 수 있다)을 평가하는 것, 또는 피험체의 비분석물 임상적 파라미터의 값 또는 분류화를 평가하는 것을 의미한다.
"음성 예측치" 또는 "NPV(negative predictive value)"는 TN/(TN+FN) 또는 모든 음성 시험 결과들의 진정한 음성 분율에 의해 산출된다. 이는 또한 본래는 시험하고자 하는 군집의 질환 발병율 및 예비시험 확률에 의해 영향을 받는다.
시험, 예를 들어 임상적 진단 시험의 특이성, 감도, 및 양성 및 음성 예측치를 논의하는 문헌 [O' Marcaigh AS, Jacobson RM, "Estimating The Predictive Value Of A Diagnostic Test, How To Prevent Misleading Or Confusing Results," Clin Ped 1993, 32(8) 485-491]을 참조한다. 종종, 연속 진단 시험 측정을 이용한 2원 질환 상태 분류 접근법에 대한 감도 및 특이성이 문헌 [Pepe et al., "Limitations of the Odds Ratio in Gauging the Performance of a Diagnostic, Prognostic, or Screening Marker," Am J Epidemiol 2004, 159(9) 882-890]에 따른 수용자 작용 특성(ROC: Receiver Operating Characteristics) 곡선에 의해 요약되어 있고, 단지 단일 값을 사용한 전범위 시험(또는 분석) 컷트점에 대한 시험, 분석 또는 방법의 감도 및 특이성을 나타낼 수 있는 지시자인, 곡선하 면적(AUC: Area Under the Curve) 또는 c-통계에 의해 요약되어 있다. 또한, 예를 들면, 문헌 ([Shultz, "Clinical Interpretation Of Laboratory Procedures", chapter 14 in Teitz, Fundamentals of Clinical Chemistry, Burns and Ashwood (eds), 4th edition 1996, W. B. Saunders Company, pages 192-199]; 및 [Zweig et al., "ROC Curve Analysis An Example Showing The Relationships Among Serum Lipid And Apohpoprotein Concentrations In Identifying Subjects With Coronory Artery Disease," Clin. Chem., 1992, 38(8) 1425-1428]을 참조할 수 있다. 우도, 오즈비, 정보 이론, 예측치, 보정(적합도 포함), 및 재분류 측정을 이용한 하나의 대안적 접근법이 문헌 [Cook, "Use and Misuse of the Receiver Operating Characteristic Curve in Risk Prediction", Circulation 2007, 115 928-935]에 따라 요약되어 있다.
마지막으로, 시험에 의해 정의되는 피험체 코호트 내의 위해 요소 비 및 절대적 및 상대적 위험비는 임상적 정확도 및 유용도의 추가의 측정값이다. 기준 한도, 차별 한도 및 위험성 역치를 비롯한 비정상 또는 질환 값을 한정하기 위해 다중의 방법들이 빈번하게 사용된다.
"분석적 정확도"란 측정 과정 자체의 재현가능성 및 예측가능성을 지칭하고, 이는 상이한 시간, 사용자, 장비 및/또는 시약을 이용한 동일 샘플 또는 대조군의 변동 계수 및 일치(concordance) 시험 및 보정 시험과 같은 측정으로 요약될 수 있다. 새로운 바이오마커를 평가함에 있어서의 상기 및 기타 다른 고려사항이 또한 문헌 [Vasan, 2006]에 요약되어 있다.
"성능"은 무엇보다도 임상적 및 분석적 정확도, 기타 다른 분석적 및 과정 특징, 예로서, 사용 특징(예를 들어, 안정성, 사용 용이성), 건강 경제 값, 및 시험 성분의 상대적 비용을 비롯한, 진단 또는 예후 시험의 전반적 효용 및 질에 관한 용어이다. 이 인자들 중 어느 것이 우수한 성능의 공급원 및 이에 따른 시험 효용일 수 있고, 또한 관련되는 경우, 예로서, AUC, 시간 경과에 따른 결과, 반감기 등과 같은 적절한 "성능 측정 기준"에 의해 측정될 수 있다.
"양성 예측치" 또는 "PPV(positive predictive value)"는 TP/(TP+FP) 또는 모든 양성 시험 결과들의 진정한 양성 분율에 의해 산출된다. 이는 본래는 시험하고자 하는 군집의 질환 발병율 및 예비시험 확률에 의해 영향을 받는다.
본 발명과 관련된 "위험성"이란 전이성 이벤트로의 전환에서와 같이 이벤트가 특정 시간에 걸쳐 일어날 수 있는 가능성에 관한 것으로, 이는 피험체의 "절대적" 위험성 또는 "상대적" 위험성을 의미할 수 있다. 절대적 위험성은 관련 시간 코호트에 대한 측정 후 실제 관찰과 관련하여 측정될 수 있거나, 또는 관련 시간에 대해 후속된 통계학적으로 유효한 기존 코호트로부터 발달된 지수 값에 대해 측정될 수 있다. 상대적 위험성은 저위험 코호트의 절대적 위험성 또는 평균 군집 위험성에 대한 피험체의 절대 위험성의 비를 지칭하며, 이는 임상적 위험성 인자가 평가되는 방식에 따라 달라질 수 있다. 오즈비, 즉 주어진 시험 결과에 있어 음성 이벤트에 대한 양성 이벤트의 분율 또한 비전환에 대해 통상 사용된다(오즈는 식 p/(1-p)(여기서, p는 이벤트의 확률이고, (1-p)는 이벤트가 일어나지 않을 확률이다)에 따른 것이다).
본 발명과 관련하여, "위험성 평가" 또는 "위험성의 평가"는 이벤트 또는 질환 상태가 일어날 수 있는 확률, 승산 또는 가능성, 하나의 질환 상태에서 또다른 질환 상태로의 이벤트 또는 전환 발생률, 즉, 원발성 종양에서 전이성 전립선암 또는 전이성 발달 위험성이 있는 종양으로의 이벤트 또는 전환 발생률, 또는 원발성 전이성 이벤트의 위험성에서 추가 2차 전이성 이벤트로의 이벤트 또는 전환 발생률을 예측하는 것을 포함한다. 위험성 평가는 또한 사전에 측정된 군집에 대한 절대적 또는 상대적 관점에서의, 암에 대한 향후의 임상적 파라미터, 통상적 실험실 위험 인자 값, 또는 기타 다른 지수를 예측하는 것을 포함한다. 본 발명의 방법은 전이성 전립선암의 위험성을 연속적으로 또는 분류별로 측정하여, 전이성 종양의 위험성이 있는 것으로 정의된 피험체의 범주의 위험성 범위를 진단하고 정의하는 데 사용될 수 있다. 분류하는 경우에, 본 발명은 정상인 피험체 코호트와 전이성 종양에 대하여 보다 높은 위험성이 있는 기타 다른 피험체 코호트 사이를 구별하는 데 사용될 수 있다. 상기와 같이 구별하는 데 사용하기 위해서는 다른 PC결정인자 조합 및 개별화된 패널, 수학적 알고리즘, 및/또는 컷오프점이 필요할 수 있지만, 각기 의도된 용도를 위해 정확도 및 성능을 상기 언급한 바와 같이 측정할 수도 있다.
본 발명과 관련하여 "샘플"은 피험체로부터 단리된 생물학적 샘플이고, 이는 예로서, 제한하는 것은 아니지만, 조직 생검, 전혈, 혈청, 혈장, 혈액 세포, 내피 세포, 순환 종양 세포, 림프액, 복수액, 간질액(이는 "세포외 체액"으로도 알려지고, 이는 세포 간극에서 발견되는 체액, 예로서, 특히 치은열구액을 포함한다), 골수, 뇌척수액(CSF: cerebrospinal fluid), 타액, 점액, 가래, 땀, 소변, 또는 임의의 기타 다른 분비물, 배설물, 또는 기타 다른 체액을 포함한다.
"감도"는 TP/(TP+FN) 또는 질환 피험체의 진정한 양성 분율에 의해 산출된다.
"특이성"은 TN/(TN+FP) 또는 무질환 또는 정상적인 피험체의 진정한 음성 분율에 의해 산출된다.
"통계학적으로 유의한"은 변경이 ("허위 양성"일 수 있는) 단독으로 우연히 일어날 수 있는 것으로 기대될 수 있는 것보다 크다는 것을 의미한다. 통계학적 유의도는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다. 통상적으로 사용되는 유의도 측정값에는, 데이타 점이 단지 우연한 기회의 단독 결과라고 가정할 때, 적어도 주어진 데이타 점만큼 극한 결과를 수득할 수 있는 확률을 제시하는 p 값을 포함한다. 결과는 종종 0.05 이하의 p 값에서 고도로 유의적인 것으로 간주된다.
본 발명과 관련하여 "피험체"는 바람직하게는 포유동물이다. 포유동물은 인간, 비인간 영장류, 마우스, 래트, 개, 고양이, 말 또는 소일 수 있으나, 이러한 예들에 한정되지 않는다. 인간을 제외한 포유동물은 종양 전이의 동물 모델을 나타내는 피험체으로서 유리하게 사용될 수 있다. 피험체는 수컷 또는 암컷일 수 있다. 피험체는 원발성 종양 또는 전이성 종양을 앓는 것으로 사전에 진단을 받았거나 확인된 것이고, 임의로는 이미 종양에 대한 치료 중재법을 받았거나 받고 있는 중인 피험체일 수 있다. 별법으로, 피험체는 또한 전이성 전립선암을 앓는 것으로 사전에 진단을 받지 않은 피험체일 수도 있다. 예를 들어, 피험체는 전이성 전립선암에 대한 하나 이상의 위험성 인자를 나타내는 피험체일 수 있다.
"TN"은 질환 상태 시험에 있어, 올바르게 무질환 또는 정상적인 피험체인 것으로 분류함을 의미하는 진정한 음성이다.
"TP"는 질환 상태 시험에 있어, 올바르게 질환 피험체인 것으로 분류함을 의미하는 진정한 양성이다.
"통상적 실험실 위험 인자(traditional laboratory risk factor)"는 피험체 샘플로부터 단리되거나 유래된 바이오마커로서, 현재 임상적 실험실에서 평가되고 통상적 범용되는 위험성 평가 알고리즘에 사용되는 바이오마커이다. 종양 전이에 대한 통상적 실험실 위험 인자로는 예를 들면, 글리슨 점수, 침습성 깊이, 혈관 밀도, 증식 지수 등을 포함한다. 종양 전이에 대한 기타 다른 통상적 실험실 위험 인자는 당업자에게 알려져 있다.
본 발명의 방법 및 용도
본원에 개시된 방법은 전이성 전립선암이 발병될 위험성에 있는 피험체, 또는 기타 다른 암 피험체, 예로서, 전이성 전립선암 또는 기타 다른 암 유형에 걸린 것으로 이미 진단받았거나, 그렇지 않을 수 있는 경우에 있는, 유방암을 앓는 피험체, 및 원발성 종양 또는 전이성 전립선암 및 기타 다른 암 유형에 대한 치료법 및/또는 요법을 받고 있는 피험체에 사용된다. 본 발명의 방법은 또한 원발성 종양 또는 전이성 전립선암 및 기타 다른 암 유형을 앓는 피험체에 대한 치료 요법을 모니터링하거나 선택하는 데, 및 종전에 전이성 전립선암 및 기타 다른 암 유형에 대한 진단을 받은 바 없는 피험체, 예로서, 전이에 대한 위험성 인자를 보이는 피험체를 스크리닝하는 데 사용될 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 방법은 전이성 전립선암 및 기타 다른 암 유형에 대한 증상이 없는 피험체를 확인 및/또는 진단하는 데 사용된다. "증상이 없는"이라는 것은 통상적인 징후 및 증상을 나타내지 않는다는 것을 의미하는 것이다.
본 발명의 방법은 또한 오로지 통상의 위험성 인자에만 기초하여 이미 전이성 전립선암 및 기타 다른 전이성 암 유형이 발병될 위험성이 더 높은 상태에 있는 피험체를 확인 및/또는 진단하는 데에도 사용될 수 있다.
전이성 전립선암 및 기타 다른 전이성 암 유형을 앓는 피험체는, 피험체로부터 유래된 샘플 중 유효수(2개 이상일 수 있다)의 PC결정인자의 양(존재 또는 부재를 포함)을 측정한 후, 상기 양을 기준값과 비교함으로써 확인할 수 있다. 이어서, 기준값과 비교하였을 때, 바이오마커, 예로서, 단백질, 폴리펩티드, 핵산 및 폴리뉴클레오티드, 단백질, 폴리펩티드, 핵산, 및 폴리뉴클레오티드의 다형체, 돌연변이화된 단백질, 폴리펩티드, 핵산, 및 폴리뉴클레오티드의 발현의 양 및 패턴이 변경되었는지 여부, 또는 피험체 샘플 중 대사물 또는 기타 다른 분석물의 분자량이 변경되었는지 여부를 확인한다.
기준값은 제한없이, 동일한 암을 앓는 상기와 같은 피험체, 연령 범위가 동일하거나 유사한 피험체, 인종 군이 동일한 또는 유사한 피험체, 암에 대한 가족력이 있는 피험체를 포함하는 군집 연구로부터 수득되는 개수 또는 값에 대해 상대적일 수 있거나, 암 치료를 받는 피험체의 출발 샘플에 대해 상대적일 수 있다. 그러한 기준값은 암 전이의 수학적 알고리즘 및 계산된 지수로부터 수득된, 군집의 통계학적 분석 및/또는 위험성 예측 데이타로부터 유도될 수 있다. 기준 PC결정인자 지수 또한 통계학적 및 구조적 분류 알고리즘 및 기타 다른 방법을 이용함으로써 구성되고 사용될 수 있다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 기준값은 전이성 종양이 발병될 위험성이 없거나, 그러한 위험성이 낮은 하나 이상의 피험체로부터 유래된 대조군 샘플 중의 PC결정인자의 양이다. 본 발명의 또다른 실시태양에서, 기준값은 전이성 전립선암에 대한 증상이 없고/없거나, 전이성 전립선암에 대한 통상의 위험성 인자가 없는 하나 이상의 피험체로부터 유래된 대조군 샘플 중의 PC결정인자의 양이다. 추가의 실시태양에서, 그러한 피험체는 전이성 전립선암이 연속적으로 존재하지 않음(무질환 또는 무이벤트 생존)을 검증하는 시험 후에, 진단상 관련이 있는 기간("장기(longitudinal) 연구") 동안 모니터링되고/거나, 주기적으로 재시험된다. 그러한 기간은 기준값을 측정한 최초 시험일로부터 1년, 2년, 2년 내지 5년, 5년, 5년 내지 10년, 10년, 또는 10년 이상일 수 있다. 또한, 적절하게 저장된 과거의 피험체 샘플 중 PC결정인자의 소급 측정은 상기 기준값들을 구축하는 데 사용될 수 있고, 이를 통해 연구에 소요되는 시간을 단축시킬 수 있다.
기준값은 또한 암에 대한 치료법 및/또는 요법의 결과로서 전이성 위험성 인자가 개선된 것으로 보이는 피험체로부터 유래된 PC결정인자의 양을 포함할 수 있다. 기준값은 또한 공지된 침습성 또는 비침습성 기법에 의해 질환이 확인되었거나, 전이성 종양이 발병될 위험성이 크거나, 또는 전이성 전립선암을 앓고 있는 피험체로부터 유래된 PC결정인자의 양을 포함할 수 있다.
또다른 실시태양에서, 기준값은 지수 값 또는 기준선 값이다. 지수 값 또는 기준선 값은 전이성 종양을 앓지 않는 하나 이상의 피험체, 또는 전이성 증상이 없는 피험체로부터 얻은 유효량의 PC결정인자의 복합 샘플이다. 기준선 값은 또한 암에 대한 치료법 또는 요법의 결과로서 전이성 종양 위험성 인자가 개선된 것으로 보이는 피험체로부터 유래된 샘플 중 PC결정인자의 양을 포함할 수 있다. 상기 실시태양에서, 피험체로부터 유래된 샘플과 비교하기 위해, PC결정인자의 양을 유사하게 산출하여, 지수 값과 비교한다. 임의로, 전이성 종양을 앓은 것으로 확인된, 또는 전이성 전립선암의 발별 위험성이 증가된 것으로 확인된 피험체를 선택하여, 암의 진행을 늦추거나, 전이성 전립선암이 발병될 위험성을 감소시키거나 예방할 수 있도록 치료 요법을 받게 할 수 있다.
전이성 전립선암의 진행, 또는 암 치료 요법의 유효성은 시간 경과에 따라 피험체로부터 수득된 유효량(2개 이상일 수 있다)의 샘플 중 PC결정인자를 검출하고, PC결정인자의 검출량을 비교함으로써 모니터링할 수 있다. 예를 들면, 제1 샘플은 피험체가 치료를 받기 이전에 수득할 수 있고, 하나 이상의 후속 샘플은 피험체가 치료를 받은 이후에 또는 치료를 받는 동안에 채취한다. 기준값과 비교하여 PC결정인자의 양이 시간 경과에 따라 변하였다면, 암은 진행성인 것으로 간주되고(또는 별법으로, 치료가 진행을 방해하지 못한 것이고), 반면, PC결정인자의 양이 시간 경과에 따라 일정하게 유지되었다면(기준 군집과 비교하여 시간 경과에 따라 일정하게 유지되었다면, 또는 본원에서 사용되는 바, "일정"), 암은 진행성이 아닌 것이다. 본 발명과 관련하여 사용되는 바, "일정"이라는 용어는 기준값과 비교하였을 때 시간 경과에 따른 변화를 포함하는 것으로 해석된다.
예를 들면, 본 발명의 방법은 종양의 침습성을 구별하고/거나, 종양의 단계(예로서, I기, II기, III기 또는 IV기)를 평가하는 데 사용될 수 있다. 이를 통해 환자는 고위험군 또는 저위험군으로 계층 분류되어 그에 따라 치료될 수 있다.
추가로, 특정 피험체에게 투여하기에 적합한 치료제 또는 예방제는 피험체로부터 수득된 유효량(2개 이상일 수 있다)의 샘플 중 PC결정인자를 검출하고, 피험체로부터 유래된 샘플 중 PC결정인자의 양(2개 이상일 수 있다)을 결정하는 시험 화합물에 피험체로부터 유래된 샘플을 노출시킴으로써 확인할 수 있다. 따라서, 암을 앓는 피험체, 또는 전이성 종양이 발병될 위험성이 있는 피험체에서 사용하기 위한 치료법 또는 치료 요법은 피험체로부터 수득된 샘플 중 PC결정인자의 양에 기초하여, 기준값과 비교함으로써 선택할 수 있다. 어떠한 치료법 또는 치료 요법이 암의 개시를 지연시키거나, 또는 암의 진행을 늦추기 위해 피험체에서 사용함에 있어 가장 유효한지를 결정하기 위해서 2개 이상의 치료법 또는 치료 요법을 동시에 평가할 수 있다.
본 발명은 추가로 피험체로부터 유래된 샘플 중 PC결정인자의 양(2개 이상일 수 있다)을 측정하고, 기준 샘플 중의 PC결정인자의 양과 비교하고, 기준 샘플과 비교하여 피험체 샘플 중의 양이 변경되었는지 여부를 확인함으로써 전이성 전립선암과 관련된 마커 발현의 변화를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명은 추가로 종양으로부터 유래된 샘플에서 측정된 바, 유효량의 PC결정인자가 임상적으로 유의적인 방식으로 변경된 것인 종양을 앓는 환자를 확인하고, 종양 전이를 예방 또는 감소시키는 치료 요법으로 환자를 치료함으로써, 종양을 앓는 환자를 치료하는 방법을 제공한다.
추가로, 본 발명은 유효량의 PC결정인자를 측정하고, 여기서, 환자로부터 유래된 종양 샘플 중 2개 이상의 PC결정인자가 임상적으로 유의하게 변경되었다면, 이는 환자가 보조 치료법을 필요로 하는 것임을 나타내는 것인 단계에 의해서, 보조 치료법을 필요로 하는 종양 환자를 선택하는 방법을 제공한다.
환자로부터 유래된 종양 샘플 중 유효량의 PC결정인자에 대한 정보를 수득하고, 2개 이상의 PC결정인자가 임상적으로 유의적인 방식으로 변경되었는지 여부에 따라 환자에서 종양 전이를 예방 또는 감소시키는 치료 요법을 선택함으로써, 종양 환자에 대한 치료법 결정에 관한 정보를 수득한다.
기준 샘플, 예로서, 대조군 샘플이 전이성 암을 앓지 않는 피험체로부터 유래된 것이거나, 또는 기준 샘플이, 전이성 전립선암으로 빠르게 진행될 가능성이 높은 사람에 대비되는 상대적인 값을 반영할 경우, 시험 샘플 및 기준 샘플 중 PC결정인자의 양이 유사하다면, 이는 치료법이 유효하다는 것을 지시하는 것이다. 그러나, 시험 샘플 및 기준 샘플 중 PC결정인자의 양이 상이하다면, 이는 덜 바람직한 임상적 결과 또는 예후를 지시하는 것이다.
"유효성"이란, 치료법이 PC결정인자 단백질, 핵산, 다형체, 대사물, 또는 기타 다른 분석물의 양 또는 활성을 감소시켰다는 것을 의미하는 것이다. 본원에 개시된 위험성 인자를 평가하는 것은 표준 임상적 프로토콜을 사용함으로써 달성될 수 있다. 유효성은 전이성 질환을 진단, 확인 또는 치료하기 위한 임의의 공지된 방법과 함께 측정될 수 있다.
본 발명은 또한 전이성 병변과 관련된 일반적인 생리학적 경로를 나타내는 하나 이상의 PC결정인자를 포함한 PC결정인자 패널을 제공한다. 예를 들면, 하나 이상의 PC결정인자는 전이와 관련된 상이한 질환 상태 또는 후유증을 배제시키거나, 그들 간의 구별을 위해 사용될 수 있다. 단일 PC결정인자는 본 발명에 따른 상기 언급한 특징들 중 수개의 특징을 가질 수 있고, 별법으로 본 발명의 주어진 용도에 대해 적절한 경우에는 하나 이상의 기타 다른 PC결정인자에 대신하여 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 2개 이상의 PC결정인자 단백질, 핵산, 다형체, 대사물, 또는 기타 다른 분석물에 결합하는 검출 시약을 포함하는 키트를 포함한다. 본 발명은 또한 검출 시약의 어레이, 예로서, 각각 2개 이상의 PC결정인자 단백질 또는 핵산에 결합할 수 있는 항체 및/또는 올리고뉴클레오티드의 어레이를 제공한다. 하나의 실시태양에서, PC결정인자는 단백질이고, 어레이는 기준값과 비교하였을 때 PC결정인자 발현이 통계학적으로 유의하게 변경되었는지 여부를 측정하는 데 충분한 2개 이상의 PC결정인자 1-372에 결합하는 항체를 포함한다. 또다른 실시태양에서, PC결정인자는 핵산이고, 어레이는 기준값과 비교하였을 때 PC결정인자 발현이 통계학적으로 유의하게 변경되었는지 여부를 측정하는 데 충분한 유효량의 PC결정인자 1-372에 결합하는 올리고뉴클레오티드 또는 압타머를 포함한다.
또다른 실시태양에서, PC결정인자는 단백질이고, 어레이는 기준값과 비교하였을 때 PC결정인자 발현이 통계학적으로 유의하게 변경되었는지 여부를 측정하는 데 충분한, 표 1-7 중 어느 하나의 표 상에 열거되어 있는 유효량의 PC결정인자에 결합하는 항체를 포함한다. 또다른 실시태양에서, PC결정인자는 핵산이고, 어레이는 기준값과 비교하였을 때 PC결정인자 발현이 통계학적으로 유의하게 변경되었는지 여부를 측정하는 데 충분한, 표 1-7 중 어느 하나의 표 상에 열거되어 있는 유효량의 PC결정인자에 결합하는 올리고뉴클레오티드 또는 압타머를 포함한다.
또한, 본 발명은 하나 이상의 피험체로부터 유래된 샘플 중에 존재하는 유효량의 PC결정인자 양이 변경되었는지 여부를 검출하는 단계; 및 PC결정인자의 변경된 양 또는 활성이, 전이성 질환의 발병 위험성이 낮은 하나 이상의 피험체, 또는 전이성 질환에 대한 통상의 위험성 인자 중 어느 것도 나타내지 않는 피험체에서 측정된 기준선 값으로 돌아갈 때까지 하나 이상의 피험체를 하나 이상의 암 조절 약물로 치료하는 단계에 의해서, 전이성 종양이 발병될 위험성에 있는 하나 이상의 피험체를 치료하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 하나 이상의 피험체로부터 유래된 샘플 중에 존재하는 유효량의 PC결정인자의 수준이 변경되었는지 여부를 검출하는 단계; 및 PC결정인자의 변경된 양 또는 활성이, 전이성 종양의 발병 위험성이 낮은 하나 이상의 피험체에서 측정된 기준선 값으로 돌아갈 때까지 하나 이상의 피험체를 하나 이상의 암 조절 약물로 치료하는 단계에 의해서, 전이성 종양을 앓는 하나 이상의 피험체를 치료하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 제1 기간에 피험체로부터 유래된 제1 샘플 중 유효량의 PC결정인자(2개 이상일 수 있다)를 검출하는 단계, 제2 기간에 피험체로부터 유래된 제2 샘플 중 PC결정인자의 양을 검출하는 단계, 및 제1 시간 및 제2 기간에 검출된 PC결정인자의 양을 비교하는 단계에 의해 암 진단을 받은 피험체에서 전이성 전립선암으로의 발달 위험성의 변화를 평가하는 방법도 제공한다.
본 발명의 진단적 및 예후적 지시
본 발명을 통해서 원발성의 국소적인 침습성 및/또는 전이성 종양, 예로서, 암 유형들 중 예로서, 전립선암, 유방암을 진단 및 예후할 수 있다. 전이성 전립선암이 발병될 위험성은 시험 샘플(예로서, 피험체로부터 유래된 샘플) 중 유효량의 PC결정인자 단백질, 핵산, 다형체, 대사물, 및 기타 다른 분석물(2개 이상일 수 있다)을 측정하고, 대개는, 다중의 개별 PC결정인자 및 비분석물 임상적 파라미터의 결과로부터 얻은 정보를 단일의 측량 또는 지수로 조합시키기 위해 수학적 알고리즘 또는 식을 사용함으로써 상기 유효량을 기준 또는 지수 값과 비교함으로써 검출할 수 있다. 전이성 전립선암 또는 기타 다른 전이성 암 유형의 위험성이 증가된 것으로 확인된 피험체는 임의로, 예를 들면, 전이성 전립선암 또는 기타 다른 전이성 암 유형의 발병 개시를 예방하거나 지연시키는 예방학적 또는 치료학적 화합물을 투여하는 것과 같은 치료 요법을 받을 수 있도록 선택될 수 있다.
시험 샘플 중의 PC결정인자 단백질, 핵산, 다형체, 대사물, 또는 기타 다른 분석물의 양을 측정하고, 예로서, 기준 한도, 차별 한도, 또는 컷오프점 및 비정상 값을 정의하는 위험성 정의 역치와 같은 기법을 사용하여 "정상적인 대조군 수준"과 비교할 수 있다. "정상적인 대조군 수준"이란 전이성 종양을 앓지 않는 피험체에서 전형적으로 발견되는 하나 이상의 PC결정인자 또는 조합된 PC결정인자 지수의 수준을 의미한다. 그러한 정상적인 대조군 수준 및 컷오프점은 PC결정인자가 단독으로 사용되었는지 여부 또는 기타 다른 PC결정인자와 함께 지수로 조합하는 방식에 기반하여 달라질 수 있다. 별법으로, 정상적인 대조군 수준은 임상적으로 관련된 시간대에 걸쳐 전이성 종양이 발병되지 않았던 이전 시험된 피험체로부터 얻은 PC결정인자 패턴의 데이타베이스일 수 있다.
본 발명을 사용하여 전이성 전립선암, 또는 기타 다른 전이성 암 유형으로 전환될 위험성을 연속적 또는 범주별로 측정함으로써 전이성 이벤트를 가질 위험성이 있는 것으로 정의된 피험체 범주의 위험성 범위를 진단하고 정의할 수 있다. 범주화 경우에, 본 발명의 방법을 사용하여 정상 피험체 코호트와 질환을 앓는 피험체 코호트를 구별할 수 있다. 다른 실시태양에서, 전이성 이벤트를 가질 위험성이 있는 피험체를, 전이성 이벤트로의 진행이 보다 빠르게 진행되는 것인 피험체(또는 별법으로, 전이성 이벤트로의 가능한 시간대가 보다 짧은 피험체), 및 진행이 보다 느리게 진행되는 것인 피험체(또는 전이성 이벤트로의 시간대가 보다 긴 피험체)와 구별하거나, 전이성 암을 앓는 피험체를 정상 피험체와 구별하는 데 본 발명을 사용할 수 있다. 상기와 같이 다르게 사용하기 위해서는 개별 패널에서의 상이한 PC결정인자 조합, 수학적 알고리즘, 및/또는 컷오프점이 필요할 수 있지만, 사용 의도와 관련하여 정확도 및 성과 지표는 상기 언급한 방법으로 동일하게 측정할 수 있다.
전이성 이벤트를 가질 위험성이 있는 피험체를 확인함으로써 피험체에서 전이성 질환 상태로 전환되는 것을 지연, 감소, 또는 예방하기 위한 각종 치료학적 개입 또는 치료 요법을 선택할 수 있고, 개시할 수 있다. 또한, 유효량의 PC결정인자 단백질, 핵산, 다형체, 대사물, 또는 기타 다른 분석물 수준을 통해 전이성 질환 또는 전이성 이벤트의 치료 과정을 모니터링할 수 있다. 상기 방법에서, 생물학적 샘플은 암에 대해 치료 요법, 예로서, 약물 치료법을 받고 있는 피험체로부터 제공받을 수 있다. 바람직한 경우, 생물학적 샘플은 치료 전, 치료 중 또는 치료 후의 각종 시점에 피험체로부터 수득할 수 있다.
몇몇 PC결정인자는 작용적으로 활성을 띠기 때문에, 그의 작용을 규명해 냄으로써, 예를 들면, 높은 PC결정인자를 가지는 피험체는 TGFβ 신호전달을 통해 작용을 하는 것과 같은 상기 경로를 우선적으로 표적화하는 제제/약물로 처리할 수 있고, 이를 통해 피험체는 TGFβ 신호전달 경로의 각종 성분들을 차단하는 것을 증진시키는 제제로 치료될 수 있다.
본 발명은 또한 임의의 많은 환경하에서 환자 또는 피험체 군집을 스크리닝하는 데 사용될 수 있다. 예를 들면, 건강 관리 기관, 공중 보건체 또는 학교 보건 프로그램은 상기 기재된 바와 같이, 중재를 필요로 하는 환자 또는 피험체 군을 확인하기 위해, 또는 유행병학적 데이타를 수집하는 데 피험체 군을 스크리닝할 수 있다. 보험 회사(예를 들어, 건강, 생명 또는 상해)는 보장 범위 또는 보장 액수를 책정하는 과정에서 청구인을 스크리닝할 수 있거나, 가능한 중재에 대하여 현 의뢰인을 스크리닝할 수 있다. 그러한 군집 스크린에서 수집된 데이타는, 특히, 임의로는 임상적으로 암 또는 전이성 이벤트와 같은 병태로 진행될 수 있다는 것과 연관이 있는 경우에는 예를 들어 건강 관리 기관, 공중 보건 프로그램 및 보험 회사의 운영에서 중요할 것이다. 그러한 데이타 어레이 또는 수집 정보는 기계로 판독가능한 매체에 저장할 수 있고, 임의의 많은 건강 관련 데이타 관리 시스템에서는 개선된 건강 관리 서비스, 비용면에서 효율적인 건강 관리, 개선된 보험 운영 등을 제공하기 위해서 상기를 사용할 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 출원 번호 2002/0038227; 미국 특허 출원 번호 US 2004/0122296; 미국 특허 출원 번호 US 2004/0122297; 및 미국 특허 번호 5,018,067을 참조할 수 있다. 그러한 시스템은 본원에서 추가로 상세히 설명되는 바와 같이, 내부 데이타 저장소로부터 직접 데이타에 접근할 수 있거나, 하나 이상의 데이타 저장 사이트로부터 원격으로 데이타에 접근할 수 있다.
기계로 판독가능한 저장 매체는 기계로 판독가능한 데이타 사용을 위한 지시 명령으로 프로그램화되어 있는 기계를 사용할 때에 다양한 목적으로 사용될 수 있는, 예로서, 제한없이, 시간 경과에 따라, 또는 약물 요법에 대한 반응으로 나타나는 전이성 질환 위험성 인자와 관련된 피험체 정보와 같이, 기계로 판독가능한 데이타 또는 데이타 어레이로 코딩된 데이타 저장 물질을 포함할 수 있다. 본 발명의 유효량의 바이오마커의 측정 및/또는 결과적으로 상기 바이오마커로부터의 위험성을 평가하는 것은 특히 프로세서, 데이타 저장 시스템(휘발성 및 비휘발성 기억 및/또는 저장 소자), 적어도 하나의 입력 장치, 및 적어도 하나의 출력 장치를 포함하는 프로그래밍가능한 컴퓨터에서 실행되는 컴퓨터 프로그램으로 실시될 수 있다. 프로그램 코드는 입력 데이타에 적용되어, 상기 기재된 기능을 이행하고 출력 정보를 생성시킬 수 있다. 출력 정보는 당업계에 공지된 방법에 따라 하나 이상의 출력 장치에 적용될 수 있다. 컴퓨터는 예를 들어 개인용 컴퓨터, 마이크로컴퓨터, 또는 종래 디자인의 워크스테이션일 수 있다.
각 프로그램은 컴퓨터 시스템과 소통하기 위해 높은 수준의 절차 또는 객체 지향 프로그래밍 언어로 이행될 수 있다. 그러나, 바람직할 경우, 프로그램은 어셈블리 또는 기계 언어로 이행될 수 있다. 언어는 컴파일 언어 또는 통합 언어일 수 있다. 그러한 각 컴퓨터 프로그램은 저장 매체 또는 장치가 본원에 기술된 방법을 수행하기 위해 컴퓨터에 의해 판독될 때 컴퓨터를 구성하고 작동시키기 위해, 일반용 또는 전문가용의 프로그램 작동이 가능한 컴퓨터에 의해 판독가능한 저장 매체 또는 장치(예를 들어, ROM 또는 자기 디스켓 또는 본 개시내용의 다른 부분에서 정의된 바와 같은 기타 다른 매체 또는 장치)에 저장될 수 있다. 본 발명의 건강 관련 데이타 관리 시스템은 또한 컴퓨터 프로그램과 함께 구성되는, 컴퓨터로 판독가능한 저장 매체로서 이행되는 것으로 간주될 수 있고, 여기서 상기와 같이 구성된 저장 매체는 컴퓨터가 본원에 기술된 각종 작용을 수행하기 위한 기정의 특수 방식으로 작동하도록 한다.
이어서, 유효량의 PC결정인자 단백질, 핵산, 다형체, 대사물, 또는 기타 다른 분석물의 수준을 측정하고, 기준값, 예를 들어 전이성 상태가 알려져 있는 대조군 피험체 또는 군집, 또는 지수 값 또는 기준선 값과 비교할 수 있다. 기준 샘플 또는 지수 값 또는 기준선 값은 치료법에 노출된 바 있는 하나 이상의 피험체로부터 수득되거나 유래된 것일 수 있거나, 암 또는 전이성 이벤트의 발병 위험성이 낮은 하나 이상의 피험체로부터 수득되거나 유래된 것일 수 있거나, 또는 치료법에 노출된 결과로서 개선이 된 피험체로부터 수득되거나 유래된 것일 수 있다. 별법으로, 기준 샘플 또는 지수 값 또는 기준선 값은 치료법에 노출된 바 없는 하나 이상의 피험체로부터 수득되거나 유래된 것일 수 있다. 예를 들면, 샘플은 암 또는 전이성 이벤트에 대한 초기 치료, 및 치료의 진행을 모니터링하기 위한 암 또는 전이성 이벤트에 대한 후속 치료를 받은 피험체로부터 수집될 수 있다. 기준값은 또한 본원에 개시된 것과 같은 군집 연구로부터의 위험성 예측 알고리즘 또는 산출된 지수로부터 유도된 값도 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명의 PC결정인자를 사용하여 암을 앓지 않거나, 또는 전이 이벤트를 가질 위험성이 없고, 암 또는 전이성 이벤트도 발병될 것으로 예상되지 않는 피험체의 "기준 PC결정인자 프로파일"을 작성할 수 있다. 본원에 개시된 결정인자는 또한 암을 가지거나 전이성 이벤트를 가질 위험성이 있는 피험체로부터 취해진 "피험체 결정인자 프로파일"을 발생시키기 위해 사용될 수 있다. 본원에 개시된 PC결정인자 또한 이를 사용하여 암을 앓거나, 전이성 이벤트를 가질 위험성에 있는 피험체로부터 얻은 "피험체 PC결정인자 프로파일"을 작성할 수 있다. 피험체 PC결정인자 프로파일을 기준 PC결정인자 프로파일과 비교하여 암 또는 전이성 이벤트가 발병될 위험성에 있는 피험체를 진단하거나 확인할 수 있고, 질환의 진행 뿐만 아니라, 질환의 진행 속도를 모니터링할 수 있고, 또한 치료 방식의 유효성을 모니터링할 수 있다. 본 발명의 기준 및 피험체 PC결정인자 프로파일은 기계로 판독가능한 매체, 예로서, 제한하는 것은 아니지만, 특히, VCR, CD-ROM, DVD-ROM, USB 플래쉬 매체에 의해 판독가능한 것과 같은 아날로그 테이프에 포함될 수 있다. 그러한 기계로 판독가능한 매체는 또한 추가의 시험 결과, 예로서, 제한없이, 임상적 파라미터 및 통상적 실험실 위험 인자의 측정치를 포함할 수 있다. 별법으로 또는 추가로, 기계로 판독가능한 매체는 또한 예로서, 병력 및 임의의 관련된 가족력과 같은 피험체 정보도 포함할 수 있다. 기계로 판독가능한 매체는 또한 예로서, 본원에 기술된 것들과 같은 기타 다른 질환-위험성 알고리즘 및 산출된 지수에 관한 정보도 포함할 수도 있다.
피험체의 유전적 구성의 차이로 인해 암 또는 전이성 이벤트의 증상 또는 위험성 인자를 조절할 수 있는 각종 약물들을 대사시킬 수 있는 그들의 상대적 능력에도 차이가 날 수 있다. 암을 앓거나, 암 또는 전이성 이벤트가 발병될 위험에 있는 피험체는 연령, 인종 및 기타 다른 파라미터로 다양할 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 PC결정인자를 단독으로 사용하거나, 또는 약물 대사를 위한 공지의 유전적 인자와 함께 조합하여 사용하는 것은 선택된 피험체에서 시험하고자 하는 추정 치료제 또는 예방제가 피험체에서 암 또는 전이성 이벤트를 치료 또는 예방하는 데 적합할 것이라는 소정의 예측가능성 수준을 허용한다.
특정 피험체에 적절한 치료제 또는 약물을 확인하기 위해, 피험체로부터 유래된 시험 샘플 또한 치료제 또는 약물에 노출시킬 수 있고, PC결정인자 단백질, 핵산, 다형체, 대사물 또는 기타 다른 분석물 중 하나 이상의 수준을 측정할 수 있다. 하나 이상의 PC결정인자의 수준을 치료제 또는 약물로 치료받기 전후 또는 치료제 또는 약물에 노출되기 전후의 피험체로부터 유래된 샘플과 비교할 수 있거나, 또는 그러한 치료법 또는 노출의 결과로서 위험성 인자(예로서, 임상적 파라미터 또는 통상적 실험실 위험 인자)가 개선이 된 하나 이상의 피험체로부터 유래된 샘플과 비교할 수 있다.
피험체 세포(즉, 피험체로부터 단리된 세포)를 후보 제제의 존재하에서 인큐베이션시킬 수 있고, 시험 샘플 중 PC결정인자의 발현 패턴을 측정하여 기준 프로파일, 예로서, 전이성 질환 기준 발현 프로파일 또는 무질환 기준 발현 프로파일 또는 지수 값 또는 기준선 값과 비교한다. 시험 제제는, 식이 보충제를 비롯한 임의의 화합물 또는 조성물 또는 그의 조합일 수 있다. 예를 들면, 시험 제제는 암 치료 요법에 빈번하게 사용되는 제제이고, 이는 본원에 기술되어 있다.
상기 언급한 본 발명의 방법은 암 진단을 받고, 외과적 중재를 받은 바 있는 피험체의 진행 및/또는 개선을 평가하거나 모니터링하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 성능 및 정확도 측정
본 발명의 성능 및 이에 따른 절대적 및 상대적인 임상적 유용성은 상기 언급한 다중 방식들로 평가할 수 있다. 성능에 대한 각종 평가들 중, 본 발명은 임상적 진단 및 예후에 정확도를 제공하기 위한 것이다. 진단 또는 예후 시험, 분석법 또는 방법의 정확도는 암을 앓거나, 또는 암 또는 전이성 이벤트의 위험성이 있는 피험체들 사이를 구별할 수 있는 시험, 분석접 또는 방법의 능력에 관한 것이고, 이는 피험체의 PC결정인자의 수준이 "유의한 변경"(예로서, 임상적으로 유의한 변경, 진단학적으로 유의한 변경)인지의 여부에 기초한다. "유효량"이란, PC결정인자(들)에 대한 소정의 컷오프점(또는 역치)과 상이하고, 이에 따라 피험체가 암을 앓거나, 또는 PC결정인자(들)가 그에 대한 결정인자가 되는 전이성 이벤트를 가질 위험성이 있음을 지시하는 "유의하게 변경"(예로서, PC결정인자의 발현 또는 활성의 수준)시키는 적절한 수의 PC결정인자(하나 이상일 수 있다)의 측정값을 의미한다. 정상과 비정상 사이의 PC결정인자의 수준 간의 차이는 통계학적으로 유의적인 것이 바람직하다. 하기에서 언급하는 바와 같이, 및 본 발명에 의한 어떤 제한없이, 통계학적 유의성을 달성하고, 이에 따라 바람직한 분석적, 진단적, 및 임상적 정확도를 달성하기 위해서는, 항상 그러한 것은 아니지만, 일반적으로는 통계학적으로 유의적인 PC결정인자 지수를 달성하기 위해 수개의 PC결정인자 조합을 패널로 함께 사용하고 수학적 알고리즘과 조합하여야 한다.
질환 상태의 분류별 진단에 있어, 시험(또는 분석법)의 컷트점 또는 역치를 변화시키면 일반적으로는 감도 및 특이성이 변하게 되지만, 정성적으로는 역 관계에 있다. 그러므로, 피험체의 병태를 평가하는 데 제안된 의료 시험, 분석법 또는 방법의 정확도 및 유용성을 평가할 때, 항상 감도 및 특이성, 둘 모두를 고려하여야 하고, 감도 및 특이성은 컷트점 범위에 걸쳐 유의적으로 달라질 수 있기 때문에 어떠한 컷트점에서 감도 및 특이성이 보고되는지를 염두해두어야 한다. 예로서, 모든 잠재적 컷트점 값들을 포괄하는, AUC와 같은 통계를 이용하는 것이 본 발명을 이용한 대부분의 분류별 위험성 측정에 바람직하지만, 연속 위험성 측정에 있어서는, 관찰된 결과의 적합도 및 보정 또는 기타 다른 절대적 표준(gold standards) 통계가 바람직하다.
소정의 예측가능성 수준이란, 방법이 허용가능한 수준의 임상적 또는 진단 정확도를 제공한다는 것을 의미하는 것이다. 그러한 통계를 사용하여, "허용가능한 정도의 진단 정확도"가 본원에서 AUC(시험 또는 분석에 있어 ROC 곡선하 면적)이 적어도 0.60, 바람직하게 적어도 0.65, 더욱 바람직하게 적어도 0.70, 바람직하게는 적어도 0.75, 더욱 바람직하게는 적어도 0.80, 및 가장 바람직하게는 적어도 0.85인 시험 또는 분석(예로서, PC결정인자의 임상적으로 유의적인 존재를 측정하고, 이로써 암의 존재 및/또는 전이성 이벤트를 가질 위험성을 지시할 수 있는 본 발명의 시험)으로서 정의된다.
"매우 높은 진단 정확도"란, AUC(시험 또는 분석에 있어 ROC 곡선하 면적)이 적어도 0.75, 0.80, 바람직하게는 적어도 0.85, 더욱 바람직하게는 적어도 0.875, 바람직하게는 적어도 0.90, 더욱 바람직하게는 적어도 0.925, 및 가장 바람직하게는 적어도 0.95인 시험 또는 분석을 의미한다.
별법으로, 본 방법은 암, 전이성 암 또는 요법에 대한 반응의 존재 또는 부재를 적어도 75% 정확도, 더욱 바람직하게는 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 이상의 정확도로 예측한다.
임의의 시험의 예측성 값은 시험의 감도 및 특이성, 및 시험하는 군집에서 병태의 발병률에 따라 달라진다. 베이스(Bayes') 정리에 기초한 이 개념은, 스크리닝되는 병태가 개체 또는 군집에 존재할 가능성(시험전 확률)이 크면 클수록, 양성 시험의 유효성은 커지고, 결과가 진정한 양성일 가능성은 더 커진다는 것을 제공한다. 따라서, 존재하는 병태의 가능성이 낮은 임의의 군집에서의 시험을 이용할 때의 문제는, 양성 결과가 제한된 값을 가진다는 것이다(즉, 허위 양성일 가능성이 더 크다), 유사하게, 고위험군에서는, 음성 시험 결과가 허위 음성일 가능성이 더 크다.
그 결과, ROC 및 AUC는 질환 발병률이 낮은 시험 군집(연간 발생율(발병율)이 1% 미만, 또는 특정된 시간대에 걸친 누적 발병률이 10% 미만인 것으로 정의되는 군집)에서 시험의 임상적 유용도와 관련하여 실제와 다를 수도 있다. 별법으로, 본 개시내용의 다른 부분에서도 정의된 바와 같이, 절대적 위험성비 및 상대적 위험성비가 임상적 유용도를 측정하는 데 사용될 수 있다. 시험되는 피험체 군집은 또한 시험 측정값에 의해 사분위수로 분류화될 수 있는데, 여기서, 상단 사분위수(군집의 25%)는 암 또는 전이성 이벤트의 발병 위험성이 상대적으로 가장 높은 피험체군을 포함하고, 하단 사분위수는 암 또는 전이성 이벤트의 발병 위험성이 상대적으로 가장 낮은 피험체군을 포함한다. 일반적으로, 시험 또는 분석으로부터 유도된 값에서 상단으로부터 하단 사분위수로의 상대적 위험성이 2.5배를 넘을 경우, 이는 "높은 진단 정확도"를 가지는 것으로 간주되고, 각 사분위수에 대한 상대적 위험성이 5 내지 7배인 경우, "매우 높은 진단 정확도"를 가지는 것으로 간주된다. 그럼에도 불구하고, 시험 또는 분석으로부터 유도된 값에서 각 사분위수에 대한 상대적 위험성이 단지 1.2 내지 2.5배인 경우, 이는 임상적으로 유용한 상태로 남고, 이는 총 콜레스테롤의 경우와 같이 질환에 대한 위험성 인자로서, 또한 향후 전이성 이벤트 예측과 관련된 다수의 염증성 바이오마커로서 널리 사용된다. 종종 상기와 같이 진단 정확도가 더 낮은 시험은 상기 언급한 전반적인 위험성 평가 지수와 함께 수행되는 것과 같이, 치료 중재법에 대한 유의한 임상적 역치를 유도하기 위해 추가의 파라미터와 함께 조합되어야 한다.
건강 경제 효용 함수는 각각에 대한 임상적 값 및 경제적 값의 실제 측정값에 기초하여 잠재적인 분류별 시험 결과를 가중화시키는 것으로 구성되는, 주어진 시험의 성능 및 임상적 값을 측정하는 또다른 수단이다. 건강 경제 성능은 건강 경제 효용 함수가 시험 피험체의 정확한 분류의 이점 및 오분류 비용에 대한 경제적 값을 구체적으로 지정하기 때문에 정확도와 밀접한 관계가 있다. 성능 측정값으로서, 시험은 시험의 표적 비용을 초과하여 (비용을 시험하기 이전에) 시험당 건강 경제 값을 증가시키는 성능 수준에 도달하여야 하는 것은 당연한 것이다.
일반적으로, 진단 정확도를 측정하는 대안적 방법은, 치료제 용도에 대한 역치가 확립되어 있지 않거나, 또는 질환 이전의 진단에 대한 절대적 표준이 없는 경우인, 질환 범주 또는 위험성 범주(예로서, 전이성 이벤트를 가질 위험이 있는 범주)가 관련 의학회 및 의료 행위에 의해 명확히 정의되지 않은 경우에, 연속 측정을 위해 통상 사용된다. 위험의 연속 측정을 위해, 산출된 지수에 대한 진단 정확도의 측정은 전형적으로 예측된 연속값과 실제의 관찰값(또는 기존 지수 산출값) 사이의 곡선 피트 및 보정에 기초하고, R 제곱, 호스머-레메쇼(Hosmer-Lemeshow) P-값 통계값 및 신뢰 구간과 같은 측정값을 이용한다. 그러한 알고리즘을 이용하는 예측값은 제노믹 헬쓰 인코포레이티드(캘리포니아주 레드우드 시티 소재의 Genomic Health, Inc.,)에 의해 상용화되는 향후의 유방암 재발의 위험에 대한 시험에서와 같이, 기존의 관찰된 코호트의 예측에 기초하여 신뢰 구간(통상 90% 또는 95% CI)을 포함한다고 보고된 것은 당연한 것이다.
일반적으로, 진단 정확도, 즉 ROC 곡선 상에서의 커트점을 정의하고, 허용가능한 AUC 값을 정의하며, 본 발명의 유효량의 PC결정인자를 구성하는 것의 상대 농도의 허용가능한 범위를 결정함으로써, 당업자는 소정의 예측가능성 수준 및 성능을 사용함으로써 피험체를 확인, 진단 또는 예후하기 위해 PC결정인자를 사용할 수 있게 된다.
본 발명의 위험성 마커 ( PC 결정인자)
본 발명의 바이오마커 및 방법을 통해 당업자는 암 또는 전이성 이벤트의 어떠한 증상도 나타내지 않으나, 그럼에도 불구하고 암 또는 전이성 이벤트가 발생할 위험이 있을 수 있는 피험체를 확인하거나, 진단하거나, 또는 다르게는, 평가할 수도 있게 된다.
본 발명자들은 마우스 전립선 상피에서 Pten 및 Smad4 유전자가 결실되어 있는 것인, 침습성 및 전이성 전립선암에 대한 뮤린 마우스 모델을 제공한다. 표 1A는 과다발현된/증폭된, 또는 하향조절된/결실된 유전자 284개(284)를 포함한다. 표 1B는 본 발명의 과다발현된/증폭된, 또는 하향조절된/결실된 표현형과 상관관계에 있는 인간 상동체 PC결정인자 372개(372)를 포함한다.
유전자 명칭
상향 조절된 유전자
Abl2: v-abl 아벨손(Abelson) 뮤린 백혈병 바이러스 온코진 2(arg, 아벨손 관련 유전자)
Actn1: 액티닌, 알파 1
Adam19: 디스인테그린 및 메탈로펩티다제 도메인 19(멜트린 베타)
Adam8: 디스인테그린 및 메탈로펩티다제 도메인 8
Adamts 12: 트롬보스폰딘 1형 모티프를 동반한 디스인테그린 유사 및 메탈로펩티다제 (리프로리신형), 12
Adcy7: 아데닐레이트 사이클라제 7
Agtrl1: 안지오텐신 수용체 유사 1
Ak1: 아데닐레이트 키나제 1
Aldh1a2: 알데히드 데하이드로게나제 패밀리 1, 서브패밀리 A2
Aldh1a3: 알데히드 데하이드로게나제 패밀리 1, 서브패밀리 A3
Angptl4: 안지오포이에틴 유사 4
Antxr2: 탄저균 독소 수용체 2
Arg1: 아르기나제 1, 간
Axl: AXL 수용체 티로신 키나제
B4galt5: UDP-Gal: 베타GlcNAc 베타 1,4-갈락토실트랜스퍼라제, 폴리펩티드 5
Bcl10: B 세포 백혈병/림프종 10
Birc5: 배큘로바이러스 IAP 반복부 함유 5
Bmp1: 골 형성 단백질 1
Bnip2: BCL2/아데노바이러스 E1B 상호작용 단백질 1, NIP2
4632434I11Rik: RIKEN cDNA 4632434I11 유전자
6330406I15Rik: RIKEN cDNA 6330406I15 유전자
C1qb: 보체 성분 1, q 서브성분, 베타 폴리펩티드
1500015O10Rik: RIKEN cDNA 1500015O10 유전자
1110032E23Rik: RIKEN cDNA 1110032E23 유전자
Ccl20: 케모카인(C-C 모티프) 리간드 20
Ccnd1: 사이클린 D1
Ccnd2: 사이클린 D2
Ccr1: 케모카인 (C-C 모티프) 수용체 1
Cd200: Cd200 항원
Cd248: Cd248 항원, 엔도시알린
Cd44: Cd44 항원
Cd53: Cd53 항원
Cd93: Cd93 항원
Cdc2a: 세포 분열 주기 2 상동체 A (S. 폼베(S. pombe))
Cdca8: 세포 분열 주기 관련 8
Cdh11: 카드헤린 11
Cdkn2b: 사이클린 의존성 키나제 억제인자 2B(p15, CDK4 억제)
Cebpb: CCAAT/인핸서 결합 단백질(C/EBP), 베타
Cenpa: 동원체 단백질 A
Chl1: L1CAM과 상동성인 세포 부착 분자
Chst11: 당질 설포트랜스퍼라제 11
Clec4n: C형 렉틴 도메인 패밀리 4, 구성원 n
Clec7a: C형 렉틴 도메인 패밀리 7, 구성원 a
Clic4: 클로라이드 세포내 채널 4(미토콘드리아)
Cnn2: 칼포닌 2
Col10a1: 프로콜라겐, X형, 알파 1
Col12a1: 프로콜라겐, XII형, 알파 1
Col18a1: 프로콜라겐, XVIII형, 알파 1
Col1a1: 프로콜라겐, I형, 알파 1
Col1a2: 프로콜라겐, I형, 알파 2
Col3a1: 프로콜라겐, III형, 알파 1
Col4a1: 프로콜라겐, IV형, 알파 1
Col4a2: 프로콜라겐, IV형, 알파 2
Col5a1: 프로콜라겐, V형, 알파 1
Col5a2: 프로콜라겐, V형, 알파 2
Col8a1: 프로콜라겐, VIII형, 알파 1
Coro1a: 코로닌, 액틴 결합 단백질 1A
Cotl1: 코액토신 유사 1(딕티오스텔리움(Dictyostelium))
Cp: 세룰로플라스민
Crlf1: 사이토카인 수용체 유사 인자 1
Csrp1: 시스테인 및 글리신이 풍부한 단백질 1
Cthrc1: 콜라겐 삼중 나선 반복부 함유 1
Ctsz: 카텝신 Z
Cxcl2: 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 2
Cxcl5: 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 5
Cxcr4: 케모카인 (C-X-C 모티프) 수용체 4
Cybb: 사이토크롬 b-245, 베타 폴리펩티드
Cyr61: 시스테인이 풍부한 단백질 61
Ddah1: 디메틸아르기닌 디메틸아미노하이드롤라제 1
Dpysl3: 디하이드로피리미디나제 유사 3
Dsc2: 데스모콜린 2
Dusp4: 이중 특이성 포스파타제 4
Dusp6: 이중 특이성 포스파타제 6
1110006O17Rik: RIKEN cDNA 1110006O17 유전자
Emilin2: 엘라스틴 미세섬유 인터페이서 2
Emp1: 상피막 단백질 1
Endod1: 엔도뉴클레아제 도메인 함유 1
Ets1: E26 조류 백혈병 온코진 1, 5' 도메인
Fbln2: 피브린 2
Fbn1: 피브릴린 1
Fcer1g: Fc 수용체, IgE, 고친화성 I, 감마 폴리펩티드
Fcgr3: Fc 수용체, IgG, 저친화성 III
Fcgr2b: Fc 수용체, IgG, 저친화성 IIb
Fgf13: 섬유아세포 성장 인자 13
Fgfbp1: 섬유아세포 성장 인자 결합 단백질 1
Fkbp10: FK506 결합 단백질 10
Flnb: 필라민, 베타
Fn1: 피브로넥틴 1
Fos: FBJ 골육종 온코진
Frzb: 프리즐(frizzled) 관련 단백질
Fscn1: 파신 상동체 1, 액틴 근속 단백질(스트롱길로켄트로투스 푸르푸라투스(Strongylocentrotus purpuratus))
Fstl1: 폴리스타틴 유사 1
Gatm: 글리신 아미디노트랜스퍼라제(L-아르기닌: 글리신 아미디노트랜스퍼라제)
Gja1: 간극 연접 막 채널 단백질 알파 1
Gjb2: 간극 연접 막 채널 단백질 베타 2
Glipr1: GLI 발병기전 관련 1(신경아교종)
Gpm6b: 당단백질 m6b
Gpr124: G 단백질 커플링 수용체 124
Gpx2: 글루타티온 퍼옥시다제 2
Hp: 합토글로빈
Igf1: 인슐린 유사 성장 인자 1
Igj: 면역글로불린 연결 쇄
Il1b: 인터루킨 1 베타
Il4ra: 인터루킨 4 수용체, 알파
Inhbb: 인히빈 베타 B
Itgam: 인테그린 알파 M
Itgax: 인테그린 알파 X
Itgb2: 인테그린 베타 2
Jag1: 재깅형(jagged) 1
Jub:아주바(ajuba)
2810417H13Rik: RIKEN cDNA 2810417H13 유전자
Kpna3: 캐리오페린(임포린) 알파 3
Krt14: 케라틴 14
Krt17: 케라틴 17
Krt5: 케라틴 5
Krt6a: 케라틴 6A
Lamb1-1: 라미닌 B1 서브유닛 1
Lbh: 상지싹 및 심장
Lgals1: 렉틴, 갈락토스 결합, 가용성 1
Lgals7: 렉틴, 갈락토스 결합, 가용성 7
Lgmn: 레구메인
Lhfp: 지방종 HMGIC 융합 파트너
Lox: 리실 옥시다제
Loxl2: 리실 옥시다제 유사 2
Mcm5: 미니염색체 유지 결핍 5, 세포 분열 주기 46(S. 세레비시아에(S. cerevisiae))
Mmd: 단핵구에서 대식세포로의 분화 관련
Mmp13: 매트릭스 메탈로펩티다제 13
Mmp14: 매트릭스 메탈로펩티다제 14(막 삽입형)
Mmp3:매트릭스 메탈로펩티다제 3
Mrc2: 만노스 수용체, C형 2
Ms4a6b: 막 전체에 펼쳐져 있는 4 도메인, 서브패밀리 A, 구성원 6B
Msn:모에신
Msrb3: 메티오닌 설폭시드 리덕타제 B3
Myo1b: 미오신 1B
Nap1l1: 뉴클레오좀 조립 단백질 1 유사 1
Ncf4: 중성구 세포질 인자 4
Nid1: 니도겐
Nrp1: 뉴로필린 1
Olfml2b: 올펙토메딘 유사 2B
Osmr: 온코스타틴 M 수용체
Palld: 팔라딘, 세포골격 관련 단백질
Pcdh19: 프로토카드헤린 19
Pdgfb: 혈소판 유래 성장 인자, B 폴리펩티드
Pdgfrb: 혈소판 유래 성장 인자 수용체, 베타 폴리펩티드
Pdpn: 포도플라닌
Pla2g7: 포스포리파제 A2, VII군(혈소판 활성화 인자 아세틸하이드롤라제, 혈장)
Plek: 플렉스트린
Plod2: 프로콜라겐 리신, 2-옥소글루타레이트 5-디옥시게나제 2
Postn: 페리오스틴, 골아세포 특이 인자
Ppic: 펩티딜프롤릴 이소머라제 C
Ptgs2: 프로스타글란딘 엔도퍼옥시드 신타제 2
Ptprc: 단백질 티로신 포스파타제, 수용체 유형, C
Pxdn: 퍼옥시다신 상동체(초파리)
Rbp1: 레티놀 결합 단백질 1, 세포성
Rftn1: 래프틀린 지질 뗏목 링커 1
Rgs4: G 단백질 신호전달 조절인자 4
C79267: 발현된 서열 C79267
Rrm2: 리보뉴클레오티드 리덕타제 M2
Serpine1: 세린(또는 시스테인) 펩티다제 억제인자, 클레이드 E, 구성원 1
Serpinf1: 세린(또는 시스테인) 펩티다제 억제인자, 클레이드 F, 구성원 1
Serpinh1: 세린(또는 시스테인) 펩티다제 억제인자, 클레이드 H, 구성원 1
Sfn: 스트라티핀
Sfrp1: 분비된 프리즐 관련 서열 단백질 1
Sh3pxd2b: SH3 및 PX 도메인 2B
Slc15a3: 용질 운반체 패밀리 15, 구성원 3
Slc16a1: 용질 운반체 패밀리 16(모노카르복실산 수송체), 구성원 1
Slc20a1: 용질 운반체 패밀리 20, 구성원 1
Slpi: 분비성 백혈구 펩티다제 억제인자
Socs2: 사이토카인 신호전달 억제인자 2
Socs3: 사이토카인 신호전달 억제인자 3
Socs6: 사이토카인 신호전달 억제인자 6
Sparc: 분비된 산성 시스테인이 풍부한 당단백질
Sfpi1: SFFV 프로바이러스 통합 1
Spon1: 스폰딘 1, (f-스폰딘) 세포외 기질 단백질
Spp1: 분비된 인단백질 1
St3gal4: ST3 베타-갈락토시드 알파-2,3-시알릴트랜스퍼라제 4
Steap4: STEAP 패밀리 구성원 4
Stom: 스토마틴
Svep1: 수시, 폰 빌러브란트 인자 A형, EGF 및 펜트락신 도메인 함유 1
Trf: 트랜스페린
Tgfb3: 형질전환 성장 인자, 베타 3
Tgfbi: 형질전환 성장 인자, 베타 유도성
Tgfbr2: 형질전환 성장 인자, 베타 수용체 II
Thbs2: 트롬보스폰딘 2
Timp1: 메탈로프로테이나제 조직 억제인자 1
Timp3: 메탈로프로테이나제 조직 억제인자 3
Tm4sf1: 트랜스막 4 수퍼패밀리 구성원 1
Tnc: 테나신 C
Tnfaip2: 종양 괴사 인자, 알파-유도성 단백질 2
Tnfaip3: 종양 괴사 인자, 알파-유도성 단백질 3
Tnfrsf12a: 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리, 구성원 12a
Top2a: 토포이소머라제(DNA) II 알파
Tpm4: 프로토미오신 4
Tubb6: 튜불린, 베타 6
Tyrobp: TYRO 단백질 티로신 키나제 결합 단백질
Ube2c: 유비퀴틴 접합 효소 E2C
Uck2: 우리딘 시티딘 키나제 2
Uhrf1: 유비퀴틴 유사, PHD 및 RING 핑거 도메인 함유, 1
Vcl: 빈쿨린
Vim: 비멘틴
하향조절된 유전자
A4galt: 알파 1,4-갈락토실트랜스퍼라제
Abcc3: ATP 결합 카세트, 서브패밀리 C(CFRT/MRP), 구성원 3
Abcg5: ATP 결합 카세트, 서브패밀리 G(WHITE), 구성원 5
Abhd12: 압하이드롤라제 도메인 함유 12
Adh1: 알코올 데하이드로게나제 1(부류 1)
Aldh1a1: 알데히드 데하이드로게나제 패밀리 1, 서브패밀리 A1
Anxa13: 아넥신 A13
Ap1s3: 어댑터 관련 단백질 복합체 AP1, 시그마 3
Arhgef4: Rho 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자(GEF) 4
Atoh1: 애토널(atonal) 상동체 1(초파리)
Atrn: 어트랙틴
AA986860: 발현된 서열 AA987860
2310007B03Rik: RIKEN cDNA 2310007B03 유전자
Camk1d: 칼슘/칼모듈린 의존성 단백질 키나제 1D
Capn13: 칼파인 13
Chka: 콜린 키나제 알파
Crym: 크리스탈린, mu
Ctse: 카텝신 E
Cyb5b: 시토크롬 b5 B형
Degs2: 퇴행성 정모세포 상동체 2(초파리), 지질 데새튜라제
Dgat2: 디아실글리세롤 O-아실트랜스퍼라제 2
Epb4.1l4b: 적혈구 단백질 밴드 4.1 유사 4b
Fmo2: 플라빈 함유 모노옥시게나제 2
Fmo3: 플라빈 함유 모노옥시게나제 3
Gata2: GATA 결합 단백질 2
Gata3: GATA 결합 단백질 3
Gpld1: 글리코실포스파티딜이노시톨 특이 포스포리파제 D1
Gsn: 겔솔린
Gsto1: 글루타티온 S 트랜스퍼라제 오메가 1
Hmgcs2: 3-하이드록시-3-메틸글루타릴-코엔자임 A 신타제 2
Hmgn3: 고유동성 군 뉴클레오좀 결합 도메인 3
Hpgd: 하이드록시프로스타글란딘 데하이드로게나제 15(NAD)
4632417N05Rik: RIKEN cDNA 4632417N05 유전자
Id1: DNA 결합 억제인자 1
Id2: DNA 결합 억제인자 2
Id3: DNA 결합 억제인자 3
Id4: DNA 결합 억제인자 4
Ihh: 인디안 헤지호그
Iqgap2: IQ 모티프 함유 GTP아제 활성화 단백질 2
Kbtbd11: kelch 반복부 및 BTB(POZ) 도메인 함유 11
2310057J16Rik: RIKEN cDNA 2310057J16 유전자
Krt15: 케라틴 15
Krt4: 케라틴 4
Ltb4dh: 류코트리엔 B4 12-하이드록시데하이드로게나제
Mal: 미엘린 및 림프구 단백질, T 세포 분화 단백질
Mettl7a: 메틸트랜스퍼라제 유사 7A
Mid1: 미들린 1
AA536749: 발현된 서열 AA536749
Ms4a8a: 막 전체에 펼쳐져 있는 4 도메인, 서브패밀리 A, 구성원 8A
Ncoa4: 핵 수용체 공활성인자 4
Nnat: 뉴로나틴
Padi1: 펩티딜 아르기닌 데이미나제, I형
Papss2: 3'-포스포아데노신 5'-포스포설페이트 신타제 2
Pdk2: 피루베이트 데하이드로게나제 키나제, 이소효소 2
Pfn2: 프로필린 2
Pink1: PTEN 유도성 추정 키나제 1
Pllp: 혈장 막 프로테오지질
Pparg: 퍼옥시좀 증식인자 활성화된 수용체 감마
Psca: 전립선 줄기 세포 항원
Ptgs1: 프로스타글란딘 엔도퍼옥시드 신타제 1
Rab17: RAB17, 구성원 RAS 온코진 패밀리
Rab27b: RAB27b, 구성원 RAS 온코진 패밀리
Gm106: 유전자 모델 106, (NCBI)
Rtn4rl1: 레티큘론 4 수용체 유사 1
Scnn1a: 나트륨 채널, 비전압 개폐, I형, 알파
Slc12a7: 용질 운반체 패밀리 12, 구성원 7
Sord: 소르비톨 데하이드로게나제
Sprr2a: 소형 프롤린이 풍부한 단백질 2A
Stard10: START 도메인 함유 10
Stat5a: 신호전달 인자 및 전사 활성인자 5A
Tbx3: T 박스 3
Tesc: 테스칼신
Tff3: 트레포일 인자 3, 간질
Timp4: 메탈로프로테이나제 조직 억제인자 4
Tmem159: 트랜스막 단백질 159
Tmem45b: 트랜스막 단백질 45b
Trim2: 3부로 된 모티프 단백질 2
Tspan8: 테트라스파닌 8
Ttr: 트랜스티레틴
Ugt2b35: UDP 글루쿠로노실트랜스퍼라제 2 패밀리, 폴리펩티드 B35
Upk1a: 유로플라킨 1A
Upk1b: 유로플라킨 1B
Zbtb16: 아연 핑거 및 BTB 도메인 함유 16
Zdhhc14: 아연 핑거, DHHC 도메인 함유 14
[표 1b]
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
당업자는, 본원에 제시된 PC결정인자는 다형체, 이소폼, 돌연변이체, 유도체, 전구체(핵산 및 프로단백질 포함), 절단 생성물, 수용체(가용성 및 트랜스막 수용체 포함), 리간드, 단백질-리간드 복합체, 및 번역후 변형된 변이체(예로서, 가교 또는 당화), 단편, 및 분해 생성물 뿐만 아니라, 완전하게 조립된 구조물의 구성 서브유닛로서 PC결정인자 중 임의의 것으로 구성된, 임의의 다중유닛 핵산, 단백질, 및 당단백질 구조물을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 모든 형태들 및 변이체들을 포함한다는 것을 이해할 것이다.
당업자는, 상기 열거된 PC결정인자가 전이성 질환과 관련된다고는 통상 수용되고 있지 않은 다수의 것을 비롯한, 각종 세트의 생리학적 및 생물학적 경로들로부터 유래된 것임을 이해할 것이다. 유의성이 높은 구역 내에서 수행되는 것이기는 하지만, 상기와 같이 상이한 PC결정인자를 군별로 분류하면 질환의 단계 또는 질환 진행의 속도를 상이한 신호로 예상할 수 있다. 상기와 같이 PC결정인자를 달리 군별로 분류하면 PC결정인자로부터 더욱 생물학적으로 상세하고 임상적으로 유용한 신호 뿐만 아니라, 다중 PC결정인자 신호들을 조합하는 PC결정인자 알고리즘 내의 패턴 인식 기회를 얻을 수 있다.
하나의 측면에서, 본 발명은 PC결정인자의 서브세트에 관한 것인데; 본 연구로부터 제공되는 주어진 신호 및 정보하에서는 상기 표 1에 열거되어 있지 않지만, 상기 생리학적 및 생물학적 경로들과 관련된 기타 다른 PC결정인자 및 심지어는 바이오마커까지도 유용한 것으로서 입증될 수 있다. 기타 다른 바이오마커 경로 참가인자(즉, 상기 표 1의 PC결정인자의 목록 내에 포함되어 있는 바이오마커와 공통된 경로에 있는 기타 다른 바이오마커 참가인자)가 또한 암 또는 전이성 이벤트에 있어 관련된 경로 참가인자라는 점에서, 이는 지금까지 표 1에 상기 개시된 바이오마커와 작용면에서 등가일 수 있다. 단, 이러한 기타 다른 경로 참가인자가 우수한 바이오마커의 특정의 정의된 특징들(본원에 개시된 생물학적 공정에 관여하는 것, 및 또한 예로서, 유용하고 접근가능한 샘플 기질, 예로서, 혈청 또는 종양 생검 중 유용한 신호 대 잡음비에서의 상기 바이오마커의 생체이용성과 같은 분석적으로 중요한 특징, 이 둘 모두를 포함한다)을 추가로 공유하는 한, 상기 참가인자 또한 본 발명과 관련하여 PC결정인자로서 간주된다. 상기와 같은 요건이 전형적으로는 생물학적 경로의 많은 구성원들의 진단적 유용성을 제한하고, 빈번하게는 세포의 원형질막에 접근가능한 것 뿐만 아니라, 암 또는 전이성 이벤트의 질환 진행과의 관련 여부와는 상관없이 아포프토시스에 기인한, 또는 기타 다른 이유, 예로서, 내피 리모델링 또는 기타 다른 세포 전환 또는 세포 괴사 과정으로 인해 세포 사멸시에 혈청내로 방출되는 것인, 분비성 물질을 구성하는 경로 구성원 내에서만 빈번하게 일어난다. 그러나, PC결정인자에 대한 상기와 같은 높은 표준을 충족시켜주는 현 바이오마커 및 향후 바이오마커가 매우 중요할 수 있다. 가능성이 크다.
또한, 열거되지 않은 기타 다른 바이오마커는 표 1에 PC결정인자로서 열거된 바이오마커와 매우 높은 상관관계에 있을 것이다(본 출원의 목적을 위해, 임의의 2개의 변수가 0.5 이상의 결정 계수(R 2 )를 가질 경우, "매우 높은 상관관계에 있는" 것으로 간주될 것이다). 본 발명은 상기 언급된 PC결정인자에 대한 작용적 등가물 및 통계학적 등가물을 포함한다. 또한, 그러한 추가적인 PC결정인자의 통계학적 유용도는 실질적으로 다중 바이오마커들 간의 교차 상관에 따라 달라지고, 임의의 신규 바이오마커는 종종 기본 생물학적 성질의 의미를 상술하기 위해서 패널 내에 작용할 필요가 있을 것이다.
열거된 PC결정인자들 중 1개 이상, 바람직하게는 2개 이상이 본 발명의 수행 시에 검출될 수 있다. 예를 들면, 2개(2), 3개(3), 4개(4), 5개(5), 10개(10), 15개(15), 20개(20), 40개(40), 50개(50), 75개(75), 100개(100), 125개(125), 150개(150), 175개(175), 200개(200), 210개(210), 220개(220), 230개(230), 240개(240), 250개(250), 260개(260) 이상, 270개(270) 이상, 280개(280) 이상, 290개(290) 이상, 300개(300) 이상, 310개(310) 이상, 320개(320) 이상, 330개(330) 이상, 340개(340) 이상, 350개(350) 이상, 360개(360) 이상, 370개(370) 이상의 PC결정인자가 검출될 수 있다.
몇몇 측면에서, 본원에 열거된 372개의 PC결정인자 모두가 검출될 수 있다. 그러한 수의 PC결정인자가 검출될 수 있는 바람직한 범위에는 전체 알려진 PC결정인자까지의 임의의 최대수, 특히, 4개, 5개, 10개, 20개, 50 및 75와 쌍을 형성하는개, 1 내지 372개, 특히개, 2개, 4개, 5개, 10개, 20개, 50개, 75개, 100개, 125개, 150개, 175개, 200개, 210개, 220개, 230개, 240개, 250으로부터 선택되는 임의의 최소수에 의해 한정되는 범위가 포함된다. 특히 바람직한 범위에는 2-5개(2-5), 2-10개(2-10), 2-50개(2-50), 2-75개(2-75), 2-100개(2-100), 5-10개(5-10), 5-20개(5-20), 5-50개(5-50), 5-75개(5-75), 5-100개(5-100), 10-20개(10-20), 10-50개(10-50), 10-75개(10-75), 10-100개(10-100), 20-50개(20-50), 20-75개(20-75), 20-100개(20-100), 50-75개(50-75), 50-100개(50-100), 100-125개(100-125), 125-150개(125-150), 150-175개(150-175), 175-200개(175-200), 200-210개(200-210), 210-220개(210-220), 220-230개(220-230), 230-240개(230-240), 240-250개(240-250) 및 250-260개(250-260)이 포함된다.
PC 결정인자 패널의 구성
PC결정인자를 군별로 분류한 것인 "패널"에 포함될 수 있다. 본 발명의 범주 내에서의 "패널"은 1 초과의 PC결정인자들을 포함하는 바이오마커의 군(이들이 PC결정인자, 임상적 파라미터, 또는 통상적 실험실 위험 인자인지의 여부 불문)을 의미한다. 패널은 또한 표 1에 열거된 PC결정인자들의 선택된 군과 함께 조합된, 암 또는 암 전이에 존재하거나 그것과 관련된 것으로 알려진, 추가의 바이오마커, 예로서, 임상적 파라미터, 통상적 실험실 위험 인자를 포함할 수 있다.
상기 언급한 바와 같이, 단독 사용되고 PC결정인자의 다중 바이오마커 패널의 구성원으로서는 사용되지 않을 경우, 열거된 PC결정인자, 임상적 파라미터, 및 통상적 실험실 위험 인자들 중 다수는 선택된 일반 군집 중 개개의 정상 피험체, 전이성 이벤트를 가질 위험이 있는 피험체, 및 암을 앓는 피험체를 서로로부터 신뢰가능하게 구별하는 데에 있어서는 임상적으로는 거의 사용되지 않거나, 전혀 사용되지 않으며, 따라서, 임의의 피험체를 상기 3가지 상태들로 분류하는 데에는 단독으로 신뢰가능하게 사용될 수 없다. 심지어 충분한 영향력이 있는 연구에서 통상적으로 일어나는 바와 같이, 각각의 상기 군집들에서의 그 평균 측정값에 통계학적으로 유의적인 차이가 있는 경우에도, 상기 바이오마커는 개개의 피험체에 대해 그를 적용시킬 수 있는 가능성은 여전히 제한된 상태로 남아 있으며, 피험체에 대한 진단적 또는 예후적 예측에도 거의 기여하지 못하고 있다. 통계학적 유의도의 통상의 측정값은 p 값이며, 이는 우연히 단독 관찰을 행하게 되는 확률을 가리키고; 바람직하게, 그러한 p 값은 0.05 이하이며, 이는 우연히 관심을 갖고 관찰을 행하게 되는 기회가 5% 이하임을 나타낸다. 그러한 p 값은 수행하는 연구의 수행력에 유의적으로 의존한다.
이러한 개개 PC결정인자의 성능, 및 오직 통상의 임상적 파라미터와 극소수의 통상적 실험실 위험 인자를 조합하는 식의 일반적인 성능에도 불구하고, 본 발명자들은 2개 이상의 PC결정인자들의 특정의 구체적인 조합 또한 하나 이상의 생리학적 또는 생물학적 경로에 관여하는 것으로 알려진 PC결정인자들의 조합을 포함하는 다중바이오마커 패널로서도 사용될 수 있다는 것과, 그러한 정보는 개개의 PC결정인자들의 수행 특징을 넘어서는 조합의 성능 특징을 조합하고 많은 경우에는 그 성능 특징을 확장시키면서, 통계학적 분류 알고리즘 등을 비롯한 각종 식을 통해 조합될 수 있고, 임상적으로 유용한 정보가 될 수 있다는 것에 주목하였다. 이 특정 조합은 허용가능한 수준의 진단 정확도를 나타내고, 다중 PC결정인자들로부터의 충분한 정보가 훈련된 식으로 조합될 때, 한 군집에서 또다른 군집으로부터 이송가능한 고수준의 진단 정확도를 종종 신뢰가능할 정도로 달성한다.
특이성이 더 낮거나, 또는 성능이 더 낮은 2개의 PC결정인자가 어떻게 의도하는 지시를 위한 신규의 보다 유용한 조합물로 조합되는지에 관한 일반 개념이 본 발명의 핵심 측면이다. 종종 다중 바이오마커는 적절한 수학 및 임상적 알고리즘이 사용될 때 개별 성분보다 더 우수한 성능을 발휘할 수 있고; 이는 종종 감도 및 특이성 모두에 있어 명백하고, 보다 큰 AUC을 가져온다. 두번째로는 필요에 따라서는 새로운 식을 통해 감도 또는 특이성 수준을 개선시키기 위해 종종 현 바이오마커에 신규의 비인식 정보가 포함된다. 일반적으로 그 자체적으로 차선의 임상적 성능을 가지는 것으로 간주되는 바이오마커에 대해서 조차도 상기와 같은 정보 정보는 유효할 수 있다. 실제로, 높은 허위 양성 비율의 측면에서 단독으로 측정된 단일의 바이오마커에 대한 차선의 성능은 제2 바이오마커와 수학식과의 조합이 부재하는 것으로 규명되지 않은 정보와 같은 몇몇 중요한 추가의 정보가 바이오마커 결과 내에 포함되어 있다는 것을 나타내는 지시자가 될 수도 있다.
당업계에 알려진 수개의 통계학적 알고리즘 및 모델링 알고리즘을 사용하여 최상의 PC결정인자를 선택하는 데 도움을 줄 수도 있고, 이들 선택을 조합하는 알고리즘을 최적화시킬 수도 있다. 예로서, 인자 및 교차 바이오마커 상관관계/공분산 분석과 같은 통계학적 도구는 패널 구성에 대한 더욱 합리적으로 접급할 수 있게 한다. PC결정인자들 간의 유클리드(Euclidean) 표준화 거리를 나타내는 수학적 클러스터링 및 분류 트리가 유리하게 사용될 수 있다. 그러한 통계학적 분류 기법의 경로 공지 시딩 또한 특정 경로 또는 생리학적 작용 전체에 그가 관여하는 것에 기초하여 개개의 PC결정인자를 선택하는 것을 기반으로 하는 합리적인 접근법과 같이 사용될 수 있다.
궁극적으로, 예로서, 통계학적 분류 알고리즘과 같은 식은, PC결정인자를 선택하는 데에도, 및 다중 PC결정인자로부터 얻은 결과를 단일 지수로 조합하는 데 필요한 최적 식을 선택하고 그에 훈련하는 데에도 사용될 수 있다. 종종 예로서, 전방 선택(0의 잠재적 설명 파라미터로부터의 선택) 및 후방 선택(모든 이용가능한 잠재적 설명 파라미터로부터의 선택)과 같은 기법이 사용되고, 정보 기준, 예컨대 AIC 또는 BIC를 사용하여, 패널의 성능 및 진단 정확도와 사용된 PC결정인자의 수 간의 트레이드오프를 정량화한다. 전방 또는 후방 선택된 패널 상에 있는 개개의 PC결정인자의 위치는 알고리즘에 대한 증분 정보 내용의 제공과 밀접한 관계가 있을 수 있고, 이에 기여 순서는 패널 중의 기타 다른 구성 PC결정인자에 매우 의존적이다.
임상적 알고리즘의 구성
임의의 식을 사용하여, PC결정인자 결과를 본 발명을 수행하는 데 유용한 지수에 조합시킬 수 있다. 상기 명시된 바와 같이, 그리고 제한없이, 상기 지수는 각종의 기타 다른 지시들 중에서도, 확률, 우도, 절대적 또는 상대적 위험성, 하나의 질환 상태에서 또다른 질환 상태로의 전환 시간 또는 전환 속도를 가리킬 수 있거나, 또는 전이성 질환의 향후 바이오마커 측정을 예측할 수 있다. 이는 특정 시간 또는 시간대 동안, 또는 평생 위험성 상태인 시간 동안일 수 있거나, 단순히 또다른 기준 피험체 군집에 대한 상대적인 지수로서 제공될 수 있다.
각종 바람직한 식들이 본원에 기술되어 있지만, 본원 및 상기 정의에 언급된 식들 외에도 수개의 기타 다른 모델들 및 식 유형들이 당업자에 주지되어 있다. 사용된 실제 모델 유형 또는 식 자체가 훈련 군집에서의 그 결과의 성능 및 진단 정확도 특징에 기초하여 잠재적 모델의 분야로부터 선택될 수 있다. 식 그 자체의 특이 사항은 통상적으로 관련 훈련 군집에서의 PC결정인자 결과로부터 유도될 수 있다. 기타 다른 용도 중에서도 그러한 식은 베이시안(Bayesian) 접근법을 사용하여 위험성(예를 들어, 암 또는 전이성 이벤트의 위험성)의 확률 함수 예측을 유도하거나, 또는 부류-조건부 확률을 예측한 후, 베이스 규칙을 사용하여, 이전 사례에서와 같이 부류 확률 함수를 형성하기 위해 하나 이상의 PC결정인자 입력값으로부터 유도된 특성 공간을 피험체 부류의 한 세트(예를 들어, 피험체를 정상적인 피험체, 전이성 이벤트를 가질 위험이 있는 피험체, 및 암을 앓는 피험체 부류의 구성원 소속을 예측하는 데 유용한 세트)로 지도화하기 위한 것이다.
바람직한 식에는 통계학적 분류 알고리즘의 광범위한 부류, 및 특히 판별 분석의 사용이 포함된다. 판별 분석의 목적은, 기존 확인된 특성 세트로부터 부류 구성원 소속을 예측하는 것이다. 선형 판별 분석(LDA: linear discriminant analysis)의 경우에서, 몇몇 기준에 의해 군들 간의 분리를 최대화하는 특성의 선형 조합이 확인된다. 특성은 상이한 역치를 사용한 고유유전자(eigengene) 기반의 접근법(ELDA), 또는 분산의 다변량 분석(MANOVA: multivariate analysis of variance)에 기반한 단계별 알고리즘을 사용하여, LDA에 대해 확인할 수 있다. 호텔링-로리(Hotelling-Lawley) 통계에 기반한 분리가 없을 확률을 최소화하는 전방 알고리즘, 후방 알고리즘, 및 단계별 알고리즘을 수행할 수 있다.
고유유전자 기반의 선형 판별 분석(ELDA: Eigengene-based Linear Discriminant Analysis)은 문헌 [Shen et al. (2006)]에 의해 개발된 특성 선택 기법이다. 그 식은 가장 중요한 고유벡터와 관련된 특성을 확인하기 위해 변형된 고유 분석을 이용하는 다가변량 프레임워크 내 특성(예로서, 바이오마커)을 선택한다. "중요하다"는 것은 일부 역치에 대해 상대적으로 분류되도록 하고자 하는 샘플들 간의 차이의 대부분의 분산을 설명하는 고유벡터로 정의된다.
지지 벡터 기계(SVM: support vector machine)는 두 부류를 분리하는 초평면을 찾기 위해 시도하는 분류 식이다. 이 초평면은 초평면으로부터 떨어진 정확한 여백 거리인 데이타 점인 지지 벡터를 포함한다. 분리 초평면이 데이타의 현 차원에 존재하지 않을 가능성이 있는 경우, 차원은 원래의 변수의 비선형 함수를 취하여 큰 차원으로 데이타를 투사함으로써 크게 확장된다(문헌 [Venables and Ripley, 2002]). 필요한 것은 아니지만, SVM에 대한 특성을 여과하면 종종 예측은 개선될 수 있다. 특성(예로서, 바이오마커)이 최적의 단일변량 특성을 선택하기 위해 비파라미터 크루스칼-발스(Kruskal-Walhs)(KW) 시험을 사용하여 지지 벡터 기계에 대해 확인될 수 있다. 가장 중요한 바이오마커 조합을 확인하는 데 랜덤 포레스트(RF: random forest)(문헌 [Breiman, 2001]) 또는 재발 분획화(RPART, 문헌 [Breiman et al., 1984]) 또한 별도로 또는 조합하여 사용될 수 있다. KW 및 RF, 두가지 모두 다수의 특성들이 총체로부터 선택될 것을 필요로 한다. RPART는 이용가능한 바이오마커의 서브세트를 사용하여 단일 분류 트리를 생성한다.
예측성 식에 제시하기 전에 개별 PC결정인자 측정 결과를 더욱 중요한 형태의 정보로 미리 처리하기 위해 기타 다른 식이 사용될 수 있다. 가장 중요하게, 군집의 평균 값과 관련하여, 정상 분포 위치 또는 기타 분포 위치로서 대수 함수 또는 기호논리학 함수와 같은 통상의 수학적 변형을 이용한 바이오마커 결과의 정규화는 모두 당업자에게 주지되어 있다. 임상적 파라미터, 예로서, 연령, 성별, 인종 또는 성별에 기초한 정규화 세트가 특히 관심의 피험체가 되며, 여기서, 특정 식은 한 부류 내의 피험체에 대해서만 사용되거나, 입력값으로서 임상적 파라미터를 연속적으로 조합한다. 다른 경우에, 분석물 기반의 바이오마커가 산출된 변수로 조합될 수 있고, 그 변수는 후속하여 식에 제시된다.
잠재적으로 정규화될 수 있는 한명의 피험체의 개별 파라미터 값 이외에도, 모든 피험체들 또는 임의의 알려진 부류의 피험체들에 대한 전반적인 예측성 식 그 자체는 문헌 [D'Agostino et al., (2001) JAMA 286 180-187]에 개략적으로 설명되어 있는 기법 또는 기타 다른 유사의 정규화 및 재보정 기법에 따라 군집의 예상 발병율 및 평균 바이오마커 파라미터 값에 대한 조정에 기초하여 재보정되거나 다르게는 조정될 수 있다. 그러한 유행병학적 조정 통계학적 값은 기계로 판독가능할 수 있는, 모델에 제시된 과거 데이타의 등록을 통해, 다르게는 또는 때로는 상기 파라미터 및 통계학적 값의 기존 연구에 대한 저장된 샘플 또는 기준의 회고적 질의를 통해, 포착, 확인, 개선 및 업데이트될 수 있다. 식 재보정 또는 기타 다른 조정의 피험체가 될 수 있는 추가의 예로는 오즈비의 한도에 관한 문헌 [Pepe, M. S. et al., 2004]; ROC 곡선에 관한 문헌 [Cook, N R, 2007]에 의한 연구에서 사용되는 통계가 포함된다. 마지막으로, 분류자 식 자체의 수치 결과는 절대적 위험에 대해 보정하고 분류자 또는 위험성 식의 다양한 수치 결과에 대한 신뢰도 구간을 제공하기 위해, 실제 임상적 군집 및 연구 결과와 관찰 종점을 기준으로 하여 프로세싱한 후에 변환될 수 있다. 이의 일례로는 절대적 위험성, 및 제노믹 헬쓰 인코포레이티드(미국 캘리포니아주 레드우드 시티 소재의 Genomic Health, Inc.)의 온코타입 Dx 제품에서 재발 점수 식의 출력값을 기준으로 하여 선택되는, 실제 임상 연구를 이용하여 유도된 상기 위험에 대한 신뢰도 구간의 제시가 있다. 추가 변형은 분류자 또는 위험성 식의 출력값에 기초하고 예로서, 연령 또는 성별과 같은 임상적 파라미터에 의해 정의되고 선택되는, 연구의 보다 작은 서브군집에 대해 보정하는 것이다.
임상적 파라미터 및 통상적 실험실 위험 인자의 조합
상기 언급한 임상적 파라미터들 중 임의의 파라미터는 본 발명을 실시함에 있어서 식으로의 PC결정인자 입력값으로서 또는 특정 PC결정인자 패널 및 식을 이용하여 측정되는 관련 군집을 한정하는 예비선별 기준으로서 사용될 수 있다. 상기 언급한 바와 같이, 임상적 파라미터는 또한 바이오마커 정규화 및 전처리, 또는 PC결정인자 선택, 패널 구성, 식 유형 선택 및 유도, 및 식 결과 후처리에 유용할 수 있다. 하나의 유사한 접근법이 식에의 입력값으로서 또는 예비선별 기준으로서 통상적 실험실 위험 인자와 함께 선택될 수 있다.
PC 결정인자의 측정
PC결정인자의 수준 또는 양을 실제 측정하는 것은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용하여 단백질 또는 핵산 수준으로 측정될 수 있다. 예를 들면, 핵산 수준으로는, 노던 및 서던 하이브리제이션 분석 뿐만 아니라, 상기 서열들 중 하나 이상을 특이적으로 인식하는 프로브를 사용한 리보뉴클레아제 보호 분석법을 사용함으로써 유전자 발현을 측정할 수 있다. 별법으로, PC결정인자의 양은 역전사 기반의 PCR 분석법(RT-PCR: reverse-transcription-based PCR assay)을 사용하여, 예로서, 차별적으로 발현되는 유전자 서열에 대해 특이적인 프라이머를 사용하거나, 파노믹스 인코포레이티드(Panomics, Inc.)에 의한 분지쇄 RNA 증폭 및 검출 방법에 의해 측정될 수 있다. PC결정인자의 양은 또한 단백질 수준으로, 예로서, 본원에 기술된 유전자 생성물에 의해 코딩되는 펩티드 수준, 또는 세포 이하 위치화 또는 그의 활성 수준을 기술 플랫폼, 예를 들면, AQUA®(코네티컷주 뉴헤이븐 소재의 HistoRx) 또는 미국 특허 번호 7,219,016의 것을 이용하여 측정함으로써 측정될 수 있다. 그러한 방법은 당업계에 공지되어 있고, 이에는 예를 들어 유전자, 압타머 또는 분자 임프린트에 의해 코딩되는 단백질에 대한 항체에 기초한 면역분석법이 포함된다. 임의의 생물학적 물질은 단백질 또는 그의 활성의 검출/정량화를 위해 사용될 수 있다. 별법으로, 분석되는 각 단백질의 활성에 따라 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 활성을 측정하기 위해 적당한 방법이 선택될 수 있다.
PC결정인자 단백질, 폴리펩티드, 돌연변이, 및 그의 다형체가 임의의 적당한 방식으로 검출될 수 있으나, 전형적으로는 피험체로부터 유래된 샘플을 PC결정인자 단백질, 폴리펩티드, 돌연변이, 또는 다형체에 결합하는 항체와 접촉시킨 후, 반응 생성물의 존재 또는 부재를 검출함으로써 검출된다. 항체는 상기에서 상세힌 논의된 바와 같이 상기의 모노클로날, 폴리클로날, 키메라 또는 그의 단편일 수 있고, 반응 생성물을 검출하는 단계는 임의의 적합한 면역분석법을 사용하여 수행될 수 있다. 피험체로부터 유래된 샘플은 전형적으로 상기 기재된 바와 같은 생물학적 체액이고, 상기 기재된 방법을 수행하는 데 사용되는 생물학적 체액의 동일한 샘플일 수 있다.
본 발명에 따라 수행되는 면역분석법은 동종 분석법 또는 이종 분석법일 수 있다. 동종 분석법에서, 면역학적 반응은 통상 특이적 항체(예로서, 항PC결정인자 단백질 항체), 표지화된 분석물, 및 관심의 피험체가 되는 샘플을 포함한다. 표지로부터 발생하는 신호는 항체가 표지화된 분석물에 결합할 때 직접적으로 또는 간접적으로 변형된다. 면역학적 반응 및 그 반응도 검출은 모두 동종성인 용액 중에서 수행될 수 있다. 이용될 수 있는 면역화학적 표지로는 자유 라디칼, 방사선동위원소, 형광 염료, 효소, 박테리오파지, 또는 조효소를 포함한다.
이종 분석 접근법에서, 시약은 통상 샘플, 항체, 및 검출가능한 신호 생성 수단이다. 상기 기재된 바와 같은 샘플이 사용될 수 있다. 항체는 지지체, 예로서, 비드(예로서, 단백질 A 및 단백질 G 아가로스 비즈), 플레이트 또는 슬라이드 상에 고정화되어, 액체 상 중 항원을 함유하는 것으로 의심되는 표본과 접촉될 수 있다. 이어서, 지지체를 액체상으로부터 분리하고, 상기와 같은 신호를 생성하는 수단을 이용하여 검출가능한 신호에 대해 지지체상 또는 액체상을 조사한다. 신호는 샘플내 분석물의 존재와 관련이 있다. 검출가능한 신호를 생성하는 수단은 방사선활성 표지, 형광 표지 또는 효소 표지를 사용하는 것을 포함한다. 예를 들어, 검출하고자 하는 항원이 제2 결합 부위를 포함하는 경우, 그 부위에 결합하는 항체를 검출가능한 기에 접합시키고, 분리 단계 이전에 액체상 반응 용액에 첨가할 수 있다. 고체 지지체 상의 검출가능한 기의 존재는 시험 샘플내 항원의 존재를 가리킨다. 적합한 면역분석의 예로는 올리고뉴클레오티드, 면역블로팅, 면역형광 방법, 면역침전, 화학발광 방법, 전기화학발광(ECL: electrochemiluminescence) 또는 효소 결합 면역분석법이 있다.
본원에 개시된 방법을 수행하는 데 유용할 수 있는 다수의 특이적인 면역분석법 포맷 및 그의 변형은 당업자에게 자명할 것이다. 일반적으로, 문헌 [E. Maggio, Enzyme-Immunoassay, (1980) (CRC Press, Inc., Boca Raton, Fla.)을 참조할 수 있고; 또한, 미국 특허 번호 4,727,022(Skold et al.)(발명의 명칭: "Methods for Modulating Ligand-Receptor Interactions and their Application"), 미국 특허 번호 4,659,678(Forrest et al.)(발명의 명칭: "Immunoassay of Antigens"), 미국 특허 번호 4,376,110(David et al.)(발명의 명칭: "Immunometric Assays Using Monoclonal Antibodies"), 미국 특허 번호 4,275,149(Litman et al.)(발명의 명칭: "Macromolecular Environment Control in Specific Receptor Assays"), 미국 특허 번호 4,233,402(Maggio et al.)(발명의 명칭: "Reagents and Method Employing Channeling"), 및 미국 특허 번호 4,230,767(Boguslaski et al.)(발명의 명칭: "Heterogenous Specific Binding Assay Employing a Coenzyme as Label")을 참조할 수 있다.
항체는 예컨대 수동 결합과 같은 공지된 기법에 따라 진단 분석법(예를 들어, 비드, 예로서, 단백질 A 또는 단백질 G 아가로스, 마이크로스피어, 플레이트, 슬라이드, 또는 예로서, 라텍스 또는 폴리스티렌과 같은 물질로부터 형성된 웰)에 적합한 고체 지지체에 접합될 수 있다. 본원에 기술된 바와 같은 항체는 유사하게 공지된 기법에 따라, 검출가능한 표지 또는 기, 예로서, 방사선표지(예를 들어, 35S, 125I, 131I), 효소 표지(예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제), 및 형광 표지(예를 들어, 플루오레신, 알렉사, 녹색 형광 단백질, 로다민)에 접합될 수 있다.
항체는 또한 PC결정인자 단백질, 폴리펩티드, 돌연변이, 및 다형체의 번역후 변형, 예컨대 티로신 인산화, 트레오닌 인산화, 세린 인산화, 당화(예를 들어, O-GlcNAc)에 유용할 수 있다. 그러한 항체는 관심의 피험체가 되는 단백질 또는 단백질들 내의 인산화된 아미노산을 특이적으로 검출하고, 본원에 기술된 면역블롯팅, 면역형광, 및 ELISA 분석법에 사용될 수 있다. 이러한 항체는 당업자에게 공지되어 있고, 상업적으로 이용가능하다. 번역후 변형은 또한 반사경 매트릭스-지원 레이저 탈착 이온화-시간 비행 시간 분광분석(MALDI-TOF: matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry)으로 전이가능한 이온을 이용하여 측정될 수 있다(문헌[Wirth, U. et al.(2002) Proteomics 2(10) 1445-51]).
효소 활성을 가지는 것으로 알려진 PC결정인자 단백질, 폴리펩티드, 돌연변이, 및 다형체에 있어 활성은 당업계에 공지된 효소 분석법을 이용하여 시험관내 측정될 수 있다. 그러한 분석법으로는 다수의 다른 것들 중에서도 제한없이, 키나제 분석법, 포스파타제 분석법, 리덕타제 분석법을 포함한다. 효소 활성의 동력학 성질의 조절은 공지된 알고리즘, 예로서, 힐 플롯(Hill plot), 마이클리스-멘텐(Michaelis-Menten) 방정식, 선형 회구 플롯, 예로서, 라인위버-버크(Lineweaver-Burk) 분석, 및 스캐차드(Scatchard) 플롯을 이용한 속도 상수 KM을 측정함으로써 측정될 수 있다.
PC결정인자 서열에 대한 데이타베이스 엔트리에 의해 제공되는 서열 정보를 이용함으로써 당업자에게 공지된 기법을 이용하여 (존재하는 경우) PC결정인자 서열의 발현을 검출할 수 있고, 측정할 수 있다. 예를 들면, PC결정인자 서열에 상응하는 서열 데이타베이스 엔트리 내의 서열, 또는 본원에 개시된 서열 내의 서열을 사용하여 예를 들면, 노던 블롯 하이브리제이션 분석 또는 특이적이고 바람직하게는 정량적으로 특이 핵산 서열을 증폭시키는 방법으로, PC결정인자 RNA 서열을 검출하기 위한 프로브를 구성할 수 있다. 또다른 예로서, 서열은, 예를 들면, 증폭 기반의 검출 방법, 예로서, 역전사 기반의 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR: reverse-transcription based polymerase chain reaction)에서 PC결정인자 서열을 특이적으로 증폭시키기 위한 프라이머를 구성하는 데 사용될 수 있다. 유전자 발현 내 변경이 유전자 증폭, 결실, 다형체, 및 돌연변이와 관련된 경우, 시험 군집 및 기준 군집에서의 서열 비교는 시험 및 기준 세포 군집 내 조사된 DNA 서열의 상대량을 비교함으로써 수행될 수 있다.
본원에 개시된 유전자의 발현은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용하여 RNA 수준에서 측정될 수 있다. 예를 들면, 상기 서열들 중 하나 이상을 특이적으로 인식하는 프로브를 이용한 노던 하이브리제이션 분석을 사용하여 유전자 발현을 측정할 수 있다. 별법으로, 발현은 역전사 기반의 PCR 분석법(RT-PCR)을 이용하여, 예로서, 차별적으로 발현되는 서열에 대해 특이적인 프라이머를 이용하여 측정될 수 있다. RNA는 또한 예를 들면, 다른 표적 증폭 방법(예를 들어, TMA, SDA, NASBA), 또는 신호 증폭 방법(예를 들어, bDNA) 등을 이용하여 정량화될 수 있다.
별법으로, PC결정인자 단백질 및 핵산 대사물을 측정할 수 있다. "대사물"이라는 용어에는 대사 공정의 임의의 화학적 또는 생화학적 생성물, 예로서, 생물학적 분자(예를 들어, 단백질, 핵산, 당질, 또는 지질)의 공정처리, 절단 또는 소모에 의해 생산된 임의의 화합물이 포함된다. 대사물은 회절 지수 분광법(RI: refractive index spectroscopy), 자외선 분광법(UV: ultra-violet spectroscopy), 형광 분석, 방사선화학적 분석, 근적외선 분광법(near-IR: near-infrared spectroscopy), 핵자기 공명 분광법(NMR: nuclear magnetic resonance spectroscopy), 광 분산 분석(LS: light scattering analysis), 질량 분광분석, 열분해 질량 분광분석, 혼탁법, 분산 라만 분광법, 질량 분광분석과 조합된 기체 크로마토그래피, 질량 분광분석과 조합된 액체 크로마토그래피, 질량 분광분석과 조합된 매트릭스-지원 레이저 이온화-시간 비행 분석(MALDI-TOF), 질량 분광분석과 조합된 이온 분무 분광법, 모세관 전기영동, NMR 및 IR 검출을 비롯한, 당업자에게 공지된 각종 방법들로 검출될 수 있다(WO 04/056456 및 WO 04/088309(상기 문헌 각각의 전문이 본원에서 참고로 인용된다) 참조). 이와 관련하여, 기타 다른 PC결정인자 분석물이 상기 언급한 검출 방법, 또는 당업자에게 알려진 기타 다른 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 순환 칼슘 이온(Ca2 +)이 그 중에서도 플루오(Fluo) 계열, 푸라(Fura)-2A, 로드(Rhod)-2와 같은 형광 염료를 이용하여 샘플 내에서 검출될 수 있다. 기타 다른 PC결정인자 대사물이 상기 대사물을 검출하기 위해 특이적으로 설계되거나 적합화된 시약을 이용함으로써 유사하게 검출될 수 있다.
키트
본 발명은 또한 키트의 형태로 함께 패키징된 PC결정인자 핵산의 부분에 상보적인, 상동성 핵산 서열, 예로서, 올리고뉴클레오티드 서열, 또는 상기 PC결정인자 핵산에 의해 코딩되는 단백질에 대한 항체를 가짐으로써 하나 이상의 PC결정인자 핵산을 특이적으로 확인하는 핵산과 같은, PC결정인자 검출 시약을 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 PC결정인자 유전자의 단편일 수 있다. 예를 들면, 올리고뉴클레오티드는 길이가 200개, 150개, 100개, 50개, 25개, 10개 이하의 뉴클레오티드일 수 있다. 키트는 특히 분리된 용기 내에 특히 핵산 또는 항체(이미 고체 매트릭스에 결합되어 있거나, 매트릭스에 그것을 결합시키기 위한 시약과 함께 따로 패킹된 핵산 또는 항체), 조절 제제(양성 및/또는 음성), 및/또는 검출가능한 표지, 예로서, 플루오레신, 녹색 형광 단백질, 로다민, 시아닌 염료, 알렉사 염료, 루시퍼라제, 방사선표지를 포함할 수 있다. 분석을 수행하기 위한 사용설명서(예를 들어, 서면, 테이프, VCR, CD-ROM 등)가 키트 내에 포함될 수 있다. 분석은 예를 들면, 당업계에 공지된 바와 같은 노던 하이브리제이션 또는 샌드위치 ELISA의 형태일 수 있다.
예를 들어, PC결정인자 검출 시약은 예로서, 다공성 스트립과 같은 고체 매트릭스 상에 고정화되어, 적어도 하나의 PC결정인자 검출 부위를 형성할 수 있다. 다공성 스트립의 측정 또는 검출 부위는 핵산을 함유한 복수 개의 부위를 포함할 수 있다. 시험 스트립은 또한 음성 및/또는 양성 대조군에 대한 부위를 포함할 수 있다. 별법으로, 대조군 부위는 시험 스트립과는 별도의 스트립 상에 위치할 수 있다. 임의로, 다른 검출 부위는 다른 양의 고정화된 핵산을, 예를 들면, 제1 검출 부위에는 더 많은 양으로, 또한 후속 부위에는 더 적은 양으로 상기와 같은 핵산을 포함할 수 있다. 시험 샘플을 첨가할 때, 검출가능한 신호를 나타내는 부위의 수가 샘플 내에 존재하는 PC결정인자의 양을 정량적으로 지시한다. 검출 부위는 임의의 적합하게 검출될 수 있는 형상을 띨 수 있고, 전형적으로는 시험 스트립 폭 전반에 걸친 막대 또는 점의 형상을 띨 수 있다.
별법으로, 키트는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 핵산 기판 어레이를 포함한다. 어레이 상의 핵산은 PC결정인자 1-372에 의해 표시되는 하나 이상의 핵산 서열을 특이적으로 확인시켜 준다. 다양한 실시태양에서, PC결정인자 1-372 에 의해 표시되는 서열 중 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개, 20개, 25개, 40개, 50개, 100개, 125개, 150개, 175개, 200개, 250개, 275개 이상의 발현은 어레이에의 결합에 의해 확인될 수 있다. 기판 어레이는, 예를 들어, 고체 기판, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,744,305에 기재된 바와 같은 "칩" 상에 존재할 수 있다. 별법으로, 기판 어레이는 용액 어레이, 예로서, xMAP(미국 텍사스주 오스틴 소재의 Luminex), 사이베라(Cyvera)(미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 Illumina), 셀카드(CellCard)(미국 캘리포니아주 마운틴뷰 소재의 Vitra Bioscience) 및 콴텀 도츠 모자이크(Quantum Dots' Mosaic)(미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 Invitrogen)일 수 있다.
PC결정인자 검출용 항체에 대한 적합한 공급원으로는 예를 들면, 아바자임(Abazyme), 압노바(Abnova), 어피니티 바이오러지칼즈(Affinity Biologicals), 안티바디숍(AntibodyShop), 바이오제네시스(Biogenesis), 바이오센스 라보라토리즈(Biosense Laboratories), 칼바이오켐(Calbiochem), 셀 사이언시스(Cell Sciences), 케미콘 인터내셔널(Chemicon International), 케모카인(Chemokine), 클론테크(Clontech), 사이토랩(Cytolab), 다코(DAKO), 다이아그노스틱 바이오시스템즈(Diagnostic BioSystems), 이바이오사이언스(eBioscience), 엔도크린 테크놀로지즈(Endocrine Technologies), 엔조 바이오켐(Enzo Biochem), 유로젠텍(Eurogentec), 퓨젼 안티보디즈(Fusion Antibodies), 제네시스 바이오테크(Genesis Biotech), 글로보자임스(GloboZymes), 헤마톨로직 테크놀로지즈(Haematologic Technologies), 이뮤노디텍트(Immunodetect), 이뮤노다이아그노스틱(Immunodiagnostik), 이뮤노메트릭스(Immunometrics), 이뮤노스타(Immunostar), 이뮤노비젼(Immunovision), 바이오제넥스(Biogenex), 인비트로젠, 잭슨 이뮤노리서치 라보라토리(Jackson ImmunoResearch Laboratory), KMI 다이아그노스틱스(KMI Diagnostics), 코마 바이오테크(Koma Biotech), 랩프론티어 라이프 사이언스 인스티튜트(LabFrontier Life Science Institute), 리 라보라토리즈(Lee Laboratories), 라이프스크린(Lifescreen), 마인 바이오테크놀로지 서비시스(Maine Biotechnology Services), 메디클론(Mediclone), 마이크로팜 리미티드(MicroPharm Ltd.), 모디퀘스트(ModiQuest), 몰레큘러 이노베이션즈(Molecular Innovations), 몰레큘러 프로브즈(Molecular Probes), 메오클론(Neoclone), 뉴로믹스(Neuromics), 뉴잉글런드 바이오랩스(New England Biolabs), 노보카스트라(Novocastra), 노부스 바이오라지칼즈(Novus Biologicals), 온코젠 리서치 프로덕츠(Oncogene Research Products), 오르비젠(Orbigen), 옥스포드 바이오테크놀로지(Oxford Biotechnology), 판베라(Panvera), 퍼킨엘머 라이프 사이언시즈(PerkinElmer Life Sciences), 파민젠(Pharmingen), 피닉스 파마슈티칼즈(Phoenix Pharmaceuticals), 피어스 케미칼 컴퍼니(Pierce Chemical Company), 폴리문 사이언티픽(Polymun Scientific), 폴리사이언시스 인코포레이티드(Polysiences, Inc.), 프로메가 코포레이션(Promega Corporation), 프로테오제닉스(Proteogenix), 프로토스 이뮤노리서치(Protos Immunoresearch), QED 바이오사이언시즈 인코포레이티드(QED Biosciences, Inc.), R&D 시스템즈(R&D Systems), 레플리젠(Repligen), 리서치 다이아그노스틱스(Research Diagnostics), 로보스크린(Roboscreen), 산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology), 세이카가쿠 아메리카(Seikagaku America), 세로라지칼 코포레이션(Serological Corporation), 세로텍(Serotec), 시그마알드리히(SigmaAldrich), 스템셀 테크놀로지즈(StemCell Technologies), 시냅틱 시스템즈 게엠베하(Synaptic Systems GmbH), 테크노팜(Technopharm), 테라 노바 바이오테크놀로지(Terra Nova Biotechnology), 티터맥스(TiterMax), 트릴륨 다이아그노스틱스(Trillium Diagnostics), 업스테이트 바이오테크놀로지(Up상태 Biotechnology), US 바이오라지칼(US Biological), 벡터 라보라토리즈(Vector Laboratories), 와코 퓨어 케미칼 인더스트리즈(Wako Pure Chemical Industries) 및 젭토메트릭스(Zeptometrix)와 같은 상업적으로 이용가능한 공급원들을 포함한다. 그러나, 당업자라면 표 1의 PC결정인자 중 임의의 것에 대한 항체, 핵산 프로브, 예로서, 올리고뉴클레오티드, 압타머, siRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드를 통상적 방식으로 제작할 수 있을 것이다.
암을 치료 또는 예방하는 방법
본 발명은 PC결정인자 1-245의 발현 또는 활성을 감소시키거나, PC결정인자 246-272의 발현 또는 활성을 증가시킴으로써 피험체에서 암의 증상을 치료, 예방 또는 완화시키는 방법을 제공한다. 암이 발병될 위험성(암이 발병되기 쉬운 위험성)으로 고생하는 피험체에게 치료학적 화합물을 예방학적으로 또는 치료학적으로 투여한다. 상기 피험체는 표준 임상적 방법을 사용함으로써, 또는 (예로서, PC결정인자 1-372의) 발현 또는 활성의 비정상적인 수준을 검출함으로써 확인된 피험체이다. 치료제로는 세포 주기 조절, 세포 증식, 및 단백질 키나제 활성의 억제제를 포함한다.
치료 방법은 암 세포가 유래된 조직 유형과 동일한 조직 유형의 정상 세포와 비교하여 그 발현이 암 세포에서 감소된 유전자("과소발현된 유전자")의 유전자 생성물 하나 이상의 발현, 또는 작용, 또는 그 둘 모두를 증가시키는 것을 포함한다. 상기 방법에서, 피험체에서 과소발현된 유전자 하나 이상의 양을 증가시키는 것인, 유효량의 화합물로 피험체는 치료된다. 투여는 전신 투여 또는 국소 투여일 수 있다. 치료학적 화합물은 과소발현된 유전자의 폴리펩티드 생성물, 또는 그의 생물학적으로 활성인 단편, 과소발현된 유전자를 코딩하고 암 세포에서 발현을 허용하는 발현 제어 요소를 포함하는 핵산; 예를 들면, 암 세포에 내인성인 상기 유전자의 발현 수준을 증가시키는 제제(즉, 과소발현된 유전자 또는 유전자들의 발현을 상향조절시키는 제제)를 포함한다. 상기 화합물을 투여하면 피험체 세포에서 비정상적으로 과소발현된 유전자 또는 유전자들의 효과에 대한 반대작용을 일으켜 피험체의 임상적 병태는 개선된다.
본 방법은 또한 그 발현이 정상 세포와 비교하여 암 세포에서 비정상적으로 증가된 유전자("과다발현된 유전자")의 유전자 생성물 하나 이상의 발현, 또는 작용, 또는 그 둘 모두를 감소시키는 것을 포함한다. 발현은 당업계에 공지된 수개의 방법들 중 어느 것으로 억제시킬 수 있다. 예를 들면, 과다발현된 유전자 또는 유전자들의 발현을 억제시키거나 길항시키는 핵산, 예로서, 과다발현된 유전자 또는 유전자들의 발현을 파괴시키는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 피험체에게 투여함으로써 발현을 억제시킬 수 있다.
별법으로, 과다발현된 유전자의 유전자 생성물 하나 이상의 작용은 유전자 생성물에 결합하거나, 다르게는 그의 작용을 억제시키는 화합물을 투여함으로써 억제시킬 수 있다. 예를 들면, 상기 화합물은 과다발현된 유전자 생성물 또는 유전자 생성물들에 결합하는 항체이다.
이러한 조정 방법은 생체외 또는 시험관내에서(예로서, 세포를 상기 제제와 함께 배양함으로써), 또는 별법으로, 생체내에서(예로서, 상기 제제를 피험체에게 투여함으로써) 수행될 수 있다. 상기 방법은 차별적으로 발현된 유전자의 비정상적인 발현 또는 활성에 반대작용을 일으키는 요법으로서 단백질, 또는 단백질 조합물, 또는 핵산 분자 또는 핵산 조합물, 분자를 투여하는 것을 포함한다.
(해당 질환 또는 질병을 앓지 않는 피험체와 비교하여) 유전자의 수준 또는 생물학적 활성이 증가된 것을 특징으로 하는 질환 및 질병은, 과다발현된 유전자 또는 유전자들의 활성을 길항시키는(즉, 감소시키거나 억제시키는) 치료제로 치료할 수 있다. 활성을 길항시키는 치료제는 치료학적으로 또는 예방학적으로(예로서, 백신) 투여된다.
사용될 수 있는 치료제로는 예로서, (i) 과다발현된 또는 과소발현된 서열 또는 서열들의 폴리펩티드, 또는 그의 유사체, 유도체, 단편, 또는 상동체; (ii) 과다발현된 또는 과소발현된 서열 또는 서열들에 대한 항체; (iii) 과다발현된 또는 과소발현된 서열 또는 서열들을 코딩하는 핵산; (iv) 안티센스 핵산, 또는 (즉, 하나 이상의 과다발현된 또는 과소발현된 서열의 코딩 서열 내 이종성 삽입으로 인한) "기능장애성" 핵산; 또는 (v) 조절인자(즉, 과다발현된/과소발현된 폴리펩티드와 그의 결합 파트너 사이의 상호작용을 변경시키는 억제제, 효현제 및 길항제)를 포함한다. 기능장애성 안티센스 분자는 상동성 재조합에 의해 폴리펩티드의 내인성 작용을 "넉아웃"시키는 데 사용된다(예로서, 문헌 [Capecchi, Science 244: 1288-1292 1989] 참조).
(해당 질환 또는 질병을 앓지 않는 피험체와 비교하여) 수준 또는 생물학적 활성이 감소된 것을 특징으로 하는 질환 및 질병은 활성을 증가시키는 치료제(즉, 상기 활성에 대한 효현제)로 치료할 수 있다. 활성을 상향조절시키는 치료제를 ㅊ료학적 또는 예방학적 방식으로 투여할 수 있다. 사용될 수 있는 치료제로는 생체이용성을 증가시키는 폴리펩티드(또는 그의 유사체, 유도체, 단편, 또는 상동체) 또는 효현제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
트랜스제닉 동물 생성
본 발명의 트랜스제닉 동물은 비작용성 형태의, Pten 및 Smad4 유전자의 내인성 대립유전자 중 하나 또는 그 둘 모두를 가진다. 불활성화는 내인성 유전자의 변형에 의해, 일반적으로는 상기 유전자의 결실, 치환, 또는 코딩 부위로 부가에 의해 달성될 수 있다. 변형을 통해 유전자 생성물이 합성되지 않을 수 있거나, 작용 활성이 결여된 유전자 생성물이 생성될 수 있다. 전형적인 변형은 엑손 내에 외인성 세그먼트, 예로서, 선별 마커를 도입함으로써 엑손을 파괴하거나 엑손을 결실시키는 것이다.
마우스에서 내인성 유전자를 불활성화시키는 것은 마우스 배아 줄기(ES: embryonic stem) 세포 중의 내인성 유전자와 표적 구성물 사이의 상동성 재조합을 통해 달성될 수 있다. 전형적으로, 표적 구성물은 표적하고자 하는 유전자 세그먼트 측면에 양성 선별 마커를 포함한다. 일반적으로, 상기와 같은 세그먼트는 표적하고자 하는 유전자와 동일한 종(예로서, 마우스)으로부터 유래된 것이다. 그러나, 단, 세그먼트가 표적하고자 하는 유전자와 충분한 서열 동일성을 가짐으로써 그와 함께 상동성 재조합을 수행할 수 있다면, 세그먼트는 예로서, 인간과 같은 또다른 종으로부터 수득될 수 있다. 전형적으로, 구성물은 또한 내인성 유전자와 상동성 재조합을 수행하도록 디자인된 세그먼트들 중 하나 또는 그 둘 모두의 바깥쪽에 위치하는 음성 선별 마커를 포함한다(미국 특허 번호 6,204,061 참조). 임의로, 구성물은 또한 내인성 유전자와 상동성 재조합을 수행하도록 디자인된 세그먼트 내부에 또는 그의 말단에 위치하는 한쌍의 부위 특이 재조합 부위, 예로서, frt를 포함한다. 그러한 구성물은 일반적으로 전기천공에 의해 ES 세포 내로 도입되고, 내인성 유전자와 상동성 재조합을 수행함으로써 내인성 유전자 내로 양성 선별 마커 및 측면 세그먼트 부분(및 존재한다면, frt 부위)을 도입하게 된다. 원하는 재조합이 이루어진 ES 세포는 양성 및 음성 선별에 의해 선별될 수 있다. 양성 선별은 원하는 상동성 재조합이 이루어진 세포를 선별하고, 음성 선별은 음성 재조합이 이루어진 세포에 대해서 선별을 하게 된다. 이러한 세포는 시험관내에서 배양된 착상전 배아로부터 수득된 것이다(문헌 [Bradley et al., Nature 309, 255 258 (1984)](상기 문헌의 전문이 모든 목적을 위해 본원에서 참고로 인용된다)). 형질전환된 ES 세포를 비인간 동물로부터 유래된 포배와 조합한다. ES 세포는 배아를 콜로니화하고, 몇몇 배아에서는 생성된 키메라 동물의 생식계를 형성하거나, 그에 기여한다(문헌 [Jaenisch, Science, 240, 1468 1474 (1988)](상기 문헌의 전문이 모든 목적을 위해 본원에서 참고로 인용된다) 참조). 키메라 동물을 비트랜스제닉 동물과 교배시켜 이형접합성 트랜스제닉 동물을 생성할 수 있다. 이형접합성 동물을 서로 교배시켜 동형접합성 동물을 생성할 수 있다. flp 리콤비나제를 발현하는 트랜스제닉 동물과 이형접합성 동물 또는 동형접합성 동물 중 어느 것을 교배시킬 수 있다. 리콤비나제가 발현되면, 존재할 경우, 도입된 frt 부위 사이에서 DNA 부분이 절제되게 된다.
작용성 불활성화는 또한 기타 다른 종에 대해서도 달성될 수 있으며, 기타 다른 종으로는 예로서, 래트, 토끼, 및 기타 다른 설치류, 소과, 예로서, 양, 염소과, 예로서, 염소, 돼지과, 예로서, 돼지, 및 소과, 예로서, 축우 및 들소가 적합하다. 마우스를 제외한 동물의 경우, 작용이 불활성화된 유전자를 생성하는 데에는 핵 전달 기술이 바람직하다(문헌 [Lai et al., Sciences 295, 1089 92 (2002)] 참조). 핵을 난모세포로 전달하는 데 공여자로서 각종 유형의 세포가 사용될 수 있으며, 그 예로 ES 세포 및 태아 섬유세포를 포함한다. 공여자 핵은 상기 기술한 바와 같이, 구성물이 그 안으로 도입되어 내인성 유전자와 상동성을 재조합을 수행하는 것인, 시험관내에서 배양된 세포로부터 수득된다(WO 98/37183 및 WO 98/39416(이들 각각의 전문이 모든 목적을 위해 본원에서 참고로 인용된다) 참조). 공여자 핵은 전기적으로 또는 화학적으로 유도되는 융합에 의해(WO 97/07669, WO 98/30683 및 WO 98/39416 중 어느 하나 참조), 또는 미세주사에 의해(WO 99/37143(상기 문헌의 전문이 모든 목적을 위해 본원에서 참고로 인용된다) 참조) 난모세포로 도입된다. 이어서, 이식받은 난모세포를 배양하여 배아로 발생시킨 후, 가임신한 암컷 동물의 난관에 이식하여 트랜스제닉 자손을 출생시킨다(WO 97/07669, WO 98/30683 및 WO 98/39416 중 어느 하나 참조). 이형접합성 트랜스진을 보유하는 트랜스제닉 동물을 서로 교배시켜 동형접합성 트랜스진을 보유하는 트랜스제닉 동물을 생성시킬 수 있다.
본 발명의 트랜스제닉 동물 중 몇몇은 Pten 및 Smad4 유전자의 내인성 대립유전자 중 하나 또는 그 둘 모두가 불활성화된 것, 및 전립선암, 그의 병리학적 성질 또는 근본적인 생화학적 과정과 관련된 추가의 표현형을 부여하는 제2의 트랜스진, 둘 모두를 가진다. LoxP 부위가 포매되어 있는 Pten 또는 Smad 유전자(즉, 현 균주)의 리콤비나제 매개 절제에 의해서, 또는 예를 들면, 돌연변이 넉인, 및 계내에서 또는 세포 배양물 중에서 생식계 구조물 또는 전립선 상피가 형질도입된 체세포 형질도입물에서 상기 유전자를 RNAi를 매개로 하여 소거한 후, 상기 1차 세포를 신장 피막 내로 또는 동소에 재도입시킴으로써 상기와 같은 파괴는 이루어질 수 있다. 생식계 전파를 방해하는 표적화된 ES 클론을 사용하여 키메라를 형성하는 것을 비롯한, 기타 다른 공학처리 전략법 또한 명백하다.
실시예
실시예 1: 일반적 방법
Pten 및 Smad4 조건부 대립유전자, 유전형 및 발현 분석
Pten loxP 및 Smad4 loxP 조건부 넉아웃 대립유전자는 어디에나 기술되어 있다. PB-Cre425에 의해 전립선 상피 특이 결실을 수행하였다. (i) Pten에 대한 PCR 유전자형 분석 전략법은 프라이머 1(5'-CTTCGGAGCATGTCTGGCAATGC-3'; 서열번호 1), 2 (5'-CTGCACGAGACTAGTGAGACGTGC-3'; 서열번호 2), 및 3(5'-AAGGAAGAGGGTGGGGATAC-3'; 서열번호 3)을 사용하고, (ii) Smad4에 대한 PCR 유전자형 분석 전략법은 프라이머 1(5'-GGGAACAGAGCACAGGCCTCTGTGACAG-3'; 서열번호 4) 및 2(5'-TTCACTGTGTAGCCCCGCCTGTCCTGGA-3'; 서열번호 5)를 사용하였다. Smad4가 결실된 대립유전자를 검출하기 위해서는 프라이머 2 및 3(5'-TGCTCTGAGCTCACAATTCTCCT-3'; 서열번호 6)을 사용하였다.
웨스턴 블롯을 위해, 완전 미니 프로테아제 억제제(로슈(Roche)) 및 포스포타제 억제제를 함유하는 RIPA 완충액(20 mM Tris(pH 7.5), 150 mM NaCl, 1% 노니데트(Nonidet) P-40, 0.5% 데옥시콜산나트륨, 1 mM EDTA, 0.1% SDS)을 사용하여 조직 및 세포를 용해시켰다. 20-50 ㎍의 용해물 단백질을 사용하여 웨스턴 블롯을 수득하고, Smad4, p53(1C12), pSmad2/3, pSmad1/5/8. (Cell Signaling Technology), p21Cip1(M-19) 및 PTEN(A2B1)(Santa Cruz Biotechnology)에 대한 항체와 함께 인큐베이션시켰다.
조직 분석
정상 조직과 종양 조직을 10% 중성으로 완충처리된 포르말린(Sigma) 중에서 밤새도록 고정시키고, 1X PBS를 사용하여 1회에 걸쳐 세척하고, 70% 에탄올로 옮기고, 4℃에서 저장하였다. 표준 프로토콜에 따라 히스토세르브 인코포레이티드(메릴랜드주 게이스버그 소재의 Histoserv Inc.)에 의해 조직을 에탄올로 처리하여 탈수시키고, 파라핀 중에 포매시켰다. 항체 검출 및 헤마토실린 및 에오신(H&E) 염색을 위해 절편(5 ㎛)을 제조하였다. 면역조직화학적 연구를 위해, 포르말린에 고정시키고 파라핀에 포매된 절편을 토끼 폴리클로날 항PTEN 또는 항p53 항체와 함께 밤새도록 인큐베이션시킨 후, HRP 접합된 염소 항토끼 IgG(H+L) 2차 항체(Vector)와 함께 인큐베이션시키고, 절편을 DAB(Vector)와 함께 인큐베이션시켜 시각화하고, 헤마토실린 및 에오신을 사용하여 대비염색시켰다. 면역형광 연구를 위해, 전립선 종양 세포를 5,000개의 세포/웰로 Lab-Tec 8 웰 상에 시딩하고, 10분 동안 -20℃에서 메탄올을 사용하여 고정시키고, 항CK8 및 CK18 항체(CM5, Vector Laboratories)를 사용하여 염색하고, 이미지 J(Image J)(v1.38)를 통해 시각적으로 공정 처리하였다. 스튜던트 t 검정에 의해 통계학적 유의도를 정하였다. 각종 유전자형의 전립선 조직 중 노화를 평가하기 위해 냉동된 6 ㎛ 절편을 본원 어디에나 기재되어 있는 바와 같이 SA-β-Gal에 대해 염색하였다.
1차 및 tet 유도성 세포주의 확립
앞서 기술된 바와 같이, 전립선암 조직을 Pten loxp / loxp ;Smad4 loxp / loxp ;PB - Cre4 + 마우스로부터 절개하고, 민스시키고, 0.5% I형 콜라게나제(Invitrogen)로 분해시켰다. 40 ㎛ 메쉬를 통해 여과시킨 후, I형 콜라겐(BD Pharmingen)으로 코팅된 조직 배양 디쉬 중에 포획된 단편을 플레이팅시켰다. 전형적인 상피 형태를 갖는 세포를 수집하고, 단일 세포를 96웰 플레이트의 각 웰에 시딩하였다. 3개의 독립적인 세포주(3132-1, -2, 및 -3)를 확립하고, DMEM+10% 우태아 혈청(FBS: fetal bovine serum; Omega Scientific), 25 ㎍/mL 소 뇌하수체 추출물, 5 ㎍/mL 소 인슐린, 및 6 ng/mL 재조합 인간 표피 성장 인자(Sigma-Aldrich) 중에 유지시켰다. Smad4 유도성 세포주를 확립하기 위해 마우스 Pten/Smad4 널 전립선 종양 세포주에 인간 SMAD4 코딩 부위를 포함하는 pTRE-Tight 벡터(Clontech)를 형질도입시키고, 제조사의 프로토콜에 따라 tet-on 안정한 세포주를 확립하였다. 1 ㎍/ml 독시사이클린(dox)을 사용하여 SMAD4를 유도시키고, 웨스턴 블롯 분석법에 의해 확인하였다.
세포 배양 기반 분석법
세포 생존가능성 분석을 위해, 전립선 상피 세포를 100 ㎕의 5%의 활성탄으로 처리된 FBS를 함유하는 배지(5%의 활성탄으로 처리된 FBS를 함유하는 배지) 중에서 96웰 플레이트에 5000개의 세포/웰로 플레이팅시켰다. 2일 동안 인큐베이션시킨 후, 배지를 대체하였다. 4일째 제조사의 프로토콜에 따라 셀티터-글로 루미네센트 셀 비아빌러티 키트(CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Kit)(위스콘신주 매디슨 소재의 Promega)를 사용하여 세포 생존가능성을 측정하였다.
트랜스크립토믹 , 게놈 및 인실리코 프로모터 분석 .
트랜스크립토믹 분석을 위해, 크기 및 단계가 유사한 국소 원발성 Pten pc -/- 및 Pten pc -/ - Smad4 pc -/ - 마우스 전립선 종양을 단리시키고, 전체 RNA를 추출하고, 표지하고, 제조사의 프로토콜에 따라 다나-파머 캔서 인스티튜트 마이크로어레이 코어 퍼실러티(Dana-Farber Cancer Institute Microarray Core Facility)가 어피매트릭스 진칩® 마우스 게놈 430 2.0 어레이(Affymetrix GeneChip® Mouse Genome 430 2.0 Arrays)에 하이브리제이션시켰다. 어피매트릭 마우스 MOE430 미가공 데이타(CEL 파일)는 바이오컨덕터(Bioconductor)의 어피 패키지 중 확고한 다중 어레이 분석법(RMA: multi-array analysis)을 사용하여 미리 프로세싱하였다. 이어서, 마이크로어레의 유의성 분석(SAM: significance analysis of microarray)을 사용하여 배경이 보정된 강도 데이타 및 정규화된 강도 데이타를 분석함으로써 차별적으로 발현된 유전자를 확인하였다. 2개의 컷오프를 사용하여, 본 발명자들은 Pten pc -/ - Smad4 pc-/ - 대 Pten pc -/- 를 구별하는 교사하의 유전자 목록을 작성하였다. 뮤린 목록을 인간 유전자 목록과 교차시킴으로써 284개의 유전자(200개의 상향조절된 유전자 및 84개의 하향조절된 유전자)로 구성된 Pten/Smad4 오솔로그 세트를 얻었다.
인실리코 프로모터 분석을 위해, TRANSFAC 프로페셔날(TRANSFAC Professional)로부터 척추동물에서 보존되는 결합 부위에 대한 위치 빈도 형렬(PFM: positional frequency matrix)을 구하였다. TFBS 모듈을 사용하여 PFM으로부터 위치 가중 행렬(PWM: positional weight matrix)을 수행하였다. 3-kb 프로모터 서열 내 결합 부위에 대하여 스캐닝하는 데에도 또한 TFBS 모듈을 사용하였으며, 상기 3-kb 프로모터 서열은 바이오마트(Biomart)를 통해 엔셈블(Ensembl)로부터 다운로드하였다. 표적 유전자 세트 중의 관찰된 전사 인자 결합 부위를 무작위로 선택된 배경(마우스 게놈) 유전자 세트 중의 전사 인자 결합 부위와 비교하였다. z 점수 및 p 값(통계: CPAN으로부터 분포)을 산출하여 주어진 결합 부위가 표적 유전자 세트에서 과도하게 나타났는지 여부를 결정하였다.
뮤린 Pten/Smad4가 인간 전립선암에서 카피수 변경에 대하여 표적화되는지 여부를 측정하기 위해, 본 발명자들은 앞서 기술된 바와 같이 원형 2진 세분화에 의해 프로세싱된 전이성 인간 전립선암 ACGH 프로파일인 GSE8026 중 최소 공통 부위(MCR: minimum common region)에 있는 상주 유전자를 사용하였다. 임상이라는 주석이 달린 샘플을 컴퓨터로 추가 분석하기 위해 Pten pc -/- 과 Pten pc -/ - Smad4 pc -/ - 마우스 전립선 종양 사이에서 유의적으로 차별적인 발현을 나타낼 뿐만 아니라, 전이성 인간 전립선 종양에서 카피수 변경도 나타내는 공통된 오솔로그 유전자를 선택하였다.
인제뉴어티 패쓰웨이 분석 프로그램 (http://www.ingenuity.com/index.html)을 사용하여 Pten pc -/- 과 Pten pc -/ - Smad4 pc -/ - PCA 모델에서 유의적으로 조절되는 세포 작용 및 경로를 추가로 분석하였다.
임상적 결과 분석
본 발명자들은 뮤린 Pten/Smad4 트랜스크립톰 시그너처 또는 그의 전이성 인간 전립선 ACGH 데이타세트와의 교차로부터 판명된 66개의 Smad 표적 유전자 목록을 사용하여 "교차종 발현 모듈 비교" 접근법(도 7A)을 이행하였다27. 전립선암 및 유방암 발현 프로파일을 사용하여 상기 유전자 세트의 예후 값을 평가하였다. 스피어만 순위 상관(Spearman's rank correlation)을 사용하여 66개의 유전자 및 16개의 유전자 mRNA 발현에 기초하는, 임상적으로 국소인 전립선암 샘플의 주된 클러스터 2개를 확인하였다. 통계학적 유의도를 입증하기 위해, 본 발명자들은 또한 Glinsky 전립선암 또는 the Chang 유방암 프로파일링 연구(refs)로부터 17개의 유전자로 구성된 무작위 세트 군 10개를 선택하였다.
통계학적 분석 .
상기 기술된 바와 같이, 카플란-마이어 분석을 통해 비침습성 및 누적 생존 곡선을 얻었다. 그래프패즈 프리즘 4(GraphPad Prism 4) (캘리포니아주 샌디에고 소재의 GraphPadSoftware)를 사용하여 통계학적 분석을 수행하였다. 카플란-마이어 분석법을 사용하여 종양 발병률을 플롯팅하였다. 로그-순위 검정을 사용하여 통계학적 유의도를 측정하였다.
실시예 2: PTEN 널 전립선 종양은 마킹된 TGFβ- SMAD4 경로 활성화를 나타낸다.
Pten 종양 억제인자의 전립선 특이 결실을 통해 장기간의 잠복기 후 전립선 상피내 신생물(PIN: prostate intraepithelial neoplasia)이 발병되며, 비록 최소의 침습성 및 전이성 특성을 갖기는 하지만, 때로는 병변이 선암종으로 진행될 수도 있다. 침습성 및 전이성 선암종으로 진행되는 것을 억제시킬 수 있는, Pten 결핍 PIN에서 활성화된 검사점을 정의하기 위해 본 발명자들은 Ptenloxp / loxp Pb-Cre4 종양에서 일어나는 전립선 전엽의 고등급의 PIN 질환 대 15주령된 Pb-Cre4 마우스로부터 유래된 전엽에서 차별적으로 발현된 유전자에 관한 정보에 기반한 경로 분석을 사용하여 비편견 조사를 수행하였다. 이러한 경로 분석을 통해서는, 상위 3개의 네트워크가 무작위로 작성된 유전자 목록을 사용하였을 때 관찰된 것보다 높게 나타남에 따라 간 지방증, BMP, 및 TGFβ가 밝혀졌다(도 1A).
TGFβ로 구성된 TGFβ 리간드 수퍼패밀리, 골 형성 단백질(BMP: bone morphogenetic protein) 및 액티빈 패밀리가 II형 수용체에 결합하게 되면, 이는 I형 수용체를 동원하여 이를 인산화시킨다. 결국 최종적으로 I형 수용체는 수용체-조절된 SMAD(R- SMAD)를 인산화시킨다. TGFb에 의해 Smad2/3이, 및 BMP에 의해 Smad1/5/8이 활성화되면, 이들 수용체-활성화된 R-Smad는 공통의 공매개인자 Smad4에 결합하여 작용성 단백질 복합체를 형성하게 되고, 이는 핵으로 이동하여 다양한 암 관련 유전자 표적을 조절하게 된다. 차별적으로 발현되는 유전자 목록에서 BMP 및 TGFβ 신호전달 네트워크, 둘 모두가 강화되었을 때 그들의 공통된 공매개인자 Smad4의 직접적인 분자 확인은 촉진되었다. 이러한 이유에서, 야생형 전립선 조직과 비교하였을 때 Pten-/- PIN 질환에서는 Smad4 발현, 포스포르-활성화된 Smad2/3, 및 Smad-반응성 표적인 ID1이 현저히 상향조절되어 있는 것이 웨스턴 블롯 및 IHC 분석법을 통해 보고되었다(도 1B 및 C). 비교시, 구성적으로 발현된 pSmad1/5/8은 야생형 전립선 조직과 비교하여 Pten-/- 종양에서 단지 아주 조금 증가한 것으로 나타났다(도 1B). 다시 말해, 이러한 무통성 Pten-/- 전립선 종양에서는 BMP/TGFβ-Smad4 신호전달 경로가 활성화된 것이 뚜렷이 나타났고, 이는 Smad4가 전립선암 진행을 차단하는 관여할 수 있다는 것을 제안한다. 이러한 가설은, 원발성으로부터 전이성 질환으로 진행되는 동안 인간 PCA에서 Smad4 발현이 유의적으로 하향조절되었다는 관찰 결과와 연관이 있다(도 1D-F).
실시예 3: SMAD4 가 PTEN 결핍 전립선 종양의 진행을 억제시킨다 .
진행성 질환에서 상기 가설의 Smad4 의존성 진행 차단 및 그의 후속 불활성화를 유전적으로 다루기 위해 본 발명자들은 전립선 특이 결실인자인 Pb-Cre4를 사용하여 전립선 상피에서 Pten 및/또는 Smad4를 특이적으로 결실시켰다. Ptenloxp / loxp Pb-Cre4 및 Smad4loxp / loxp Pb-Cre4 마우스(이하, Pten pc -/- 및 Smad4 pc -/- )는 앞서 보고된 바와 같이18 , 20, 오직 전립선에서만, 특히, 전립선 전엽, 배쪽 전립선엽 및 등쪽 전립선엽(데이타는 나타내지 않았다)에서 확고한 Cre 매개 재조합이 나타났다. 이전 Pten에 관한 연구18 , 20와 연관하여, Pten pc -/- 마우스의 경우 9주령된 빠른 시기에도 상기의 엽들 3개 모두에서 고등급의 PIN이 발생한 반면, 대조적으로, PB-Cre4(이하 WT) 및 Smad4 pc -/- 한배 새끼는 정상적인 전립선 조직학적 성질을 나타내었다(도 2A). 2세가 될 때까지 내내(도 9A 및 B), Smad4 결핍은 전립선의 조직학적 성질에 어떠한 분별가능한 영향을 미치지도 않았고, 종양이 발생되지 않은 상태로 남아있었다(n=15; 데이타는 나타내지 않았다)는 것은 주목할 만하였다.
Pten pc -/- 모델에서는 서서히 진행되는 신생물성 표현형이 나타났고, 17주령 내지 24주령 이후에는 침습성 특성이 나타났으며; 대부분의 마우스는 1세까지는 생존하였다(도 2B). 상기와는 현저히 대조적으로, Pten pc -/- Smad4 pc -/- 마우스에서는 9주령때까지 고도로 공격적인 침습성 PCA가 발생하였고(도 2A,d), 모든 사례에서 32주령째까지는 마침내 사망하게 되었다(도 2B,C). 이와 같이 거대한 전립선 종양은 방광 출구를 폐쇄시키고, 유출 폐쇄로 인한 수신증-신장의 팽만을 일으키며, 그 결과 가능하게는 신부전증이 사망의 원인이 될 수 있게 된다(도 10).
우선적으로 Pten pc -/- Smad4 pc -/- 진행 표현형에 대한 종양의 생물학적인 기본 원리를 이해하기 위해, 본 발명자들은 Smad4 상태가 발병 중인 전립선 종양에서의 증식, 아포프토시스 및 노화 수준에 미치는 효과에 대하여 평가하였다. 본 발명자들은 Pten pc -/- Smad4 pc -/- 종양의 경우, 특히, 침습성 종양 전두부와 함께 증식이 현저히 증가한 것을 관찰할 수 있었던 반면; Pten pc -/- 종양의 경우에는 보다 적당한 별로 크지 않는 증식 활성이 나타났다(도 3A, C). 또한, 이와 같이 상이한 증식 프로파일과 일관되게, 본 발명자들은 Pten pc -/- 종양과 비교하여 Pten pc -/- Smad4 pc -/- 종양에서 SA-β-Gal 활성이 현저히 감소된 것을 관찰할 수 있었으며, 이는 온조진 유도성 노화(OIS: oncogene induced senescence) 검사점이 탈활성화되었다는 것과도 일관된다. 최종적으로, TUNEL 분석법에 의해 측정된 바, Ptenpc -/-Smad4pc -/- 및 Ptenpc -/- 종양은 아포프토시스 세포 사멸에서 어떠한 차이도 보이지 않았다(도 3A,D).
실시예 4: SMAD4 손실이 전반적으로 침투적인 침습성 및 전이성 표현형을 유도한다
인간의 치명적 PCA의 절대적인 특징은 침습성 및 전이성 질환으로 진행된다는 것으로서, 이는 Pten pc -/- Smad4 pc -/- 종양의 조직병리학적 성질에 관한 상세한 일련의 종점 연구를 촉진시킨다. Pten pc -/- Smad4 pc -/- 종양은 9주령된 빠른 시기에도 기저막을 통해 침투하는 것으로 나타난 반면(n=7 검사); 같은 기간 동안 모든 Pten pc -/- 신생물(n=7 검사)에서는 기저막에 의해 제한되어졌다(데이타는 나타내지 않았다). 최종의 종점 연구에서, 종양을 보유하는 Pten pc -/- Smad4 pc -/- 마우스 25마리 모두에서 배출 림프절로 전이성 확산이 나타났고, 상기 마우스 중 2마리는 또한 폐 전이도 포함하였다(도 4A, 4B, a,b)는 것은 주목할 만하였다. 보고된 전이성 질환의 전립선 상피 기점은 사이토케라틴(CK) 8 및 사이토케라틴 수용체(AR: androgen receptor)에 대한 양성 염색에 의해 확인하였다(도 4C, e,f). Pten pc -/- Smad4 pc -/- 마우스 25마리 중 어떤 마우스에서도 방광 폐쇄로 인한 조기 사망과 관련될 수 있는 골 전이는 나타나지 않았다는 점 및/또는 Smad4 손실 이외의 유전적 이벤트가 인간 PCA에서 이와 같이 중요한 특징을 발휘할 수 있어야 한다는 점은 주목할 만하다(도 10). 대조적으로, 비록 8마리의 1.5세를 넘는 마우스에서는 1개의 허리 림프절 및 1개의 폐 전이가 보고되기는 하였지만, Pten pc -/- 종양을 보유하는 마우스 25마리 중 어떤 마우스에서도 1세까지는 전이성 병변이 발생하지 않았고(도 4A), 이러한 관찰 결과는 이전 보고와 일치하는 것이었다. 본 발명자들의 지식에 기초하면, 이는 인간 PCA와 유사한 것으로서, CK 및 AR의 전립선 마커를 보유하는, 제1의 전체적으로 침투성인 전이성 전립선 선암종 모델이다.
실시예 5: PC 결정인자 확인 및 인간 전립선암에서의 그의 예후적 유용성
Pten pc -/- 및 Pten pc -/- Smad4 pc -/- PCA 모델의 현저히 다른 진행 표현형 및 서열 특이성인 전사 인자로서의 Smad4의 가장 핵심적인 작용이 어떻게 Smad4가 악성 진행, 특히 전립선에서의 악성 진행을 억제시키는 작용을 할 수 있는지를 밝혀내는 비교 트랜스크립토믹 분석에 대한 이상적인 프레임워크를 제공하였다. 그와 같이 하기 위해서 본 발명자들은 15주령된 2마리의 모델 둘 모두로부터 크기가 유사한 조기 단계의 원발성 전립선 전엽 종양을 수득하였다-조직학적 검사를 통해 상기 마우스에는 전이성 질환이 없는 것으로 보고되었다(데이타는 나타내지 않았다). 종양 샘플을 조직학적 성질, 면역조직화학적 성질을 위해 처리하고, 유전자 발현 프로파일링을 위해 RNA 추출을 수행하였다. 각 유전자형으로부터의 3개의 종양을 사용한 초기 비교 분석에서 284개의 차별적으로 발현되는 PC결정인자가 확인되었다(표 1A). 각 유전자형으로부터의 5개의 종양으로 구성된 확장형 군을 사용한 후속 분석에서 372개의 차별적으로 발현되는 PC결정인자로 구성된 확장형 군이 확인되었다(표 1B). 비교사 분류를 통해 Pten pc -/- ; Smad4 pc -/- 및 Pten pc -/- 종양을 쉽게 분류하였다는 것은 당연한 일이다(데이타는 나타내지 않았다). 상기 두 모델 간의 표현형의 차이를 고려하였을 때, 284개의 차별적으로 발현된 유전자(200개의 상향조절된 유전자 및 84개의 하향조절된 유전자)의 정보에 기반한 경로 분석을 통해 상기 전이성 이전의 Pten pc -/- Smad4 pc -/- 원발성 종양에서 강화된 세포 이동이 가장 유의적인 작용성 범주로서 지목되고, 이어서, 암, 세포 사멸, 및 세포 성장 및 증식이 지목되었다는 점은 만족스러운 결과였다(도 11).
이어서, 본 발명자들은 뮤린 전립선 종양 발현 프로파일의 비교를 통해 발견하게 된 PC결정인자가 인간 암과 관련이 있는지를 확인하고자 하였다. 그와 같이 하기 위해서, 본 발명자들은 시간 경과에 따른 PSA 재발(소위, 생화학적 재발)이라고 주석이 달린, 79개의 임상적으로 국소화된 표본으로 구성된, 문헌 [Glinsky and colleagues]1에 의한 인간 PCA 유전자 발현 데이타세트를 사용하였다. 표 1A 상에 열거된 284개의 PC결정인자를 사용하여 계층적 클러스터링에 의한 비교사 분류를 통해 임상적 환자 샘플을 재발에 대해 유의적인 임상 결과를 갖는 서브군으로 계층 분류하였다(도 5, p<0.0001).
실시예 6: 통합적 분석을 통해 전이할 수 있는 능력이 있는 원발성 종양에서의 예측된 SMAD4 표적 세트가 정의되었다
이어서, 본 발명자들은 진화적으로 보존되는 Smad 결합 요소에 대하여 284개의 PC결정인자의 프로모터를 스캐닝하여 66개의 예측된 직접적인 Smad4 전사 표적을 확인하게 되었다(도 7A; 완전한 목록에 대하여 표 2 참조). 상기 66개의 Smad4 전사 표적(45개의 상향조절된 표적 및 21개의 하향조절된 표적)의 정보에 기반한 경로 분석을 통해 상기 전이성 이전의 Pten pc -/- Smad4 pc -/- 원발성 종양에서 강화된 세포 이동(p=2.46x10-12)이 다시 또 가장 유의적인 작용성 범주로서 지목되었고, 이어서, 암(p=3.77x10-10), 세포 성장 및 증식(p=4.14x10-8), 및 세포 사멸(p=5.75x10-7)이 지목되었다(도 7B). 놀랍게도, 66개의 유전자 중 28개가 작용에 따라 세포 이동 유전자인 것으로 주석을 달았다. 중요한 Smad4 의존성 진행 유도자 이벤트 그 스스로가 진행성 질환에서 게놈 변경에 대해 표적화될 것이라고 논하면서, 즉, Smad4 손실시에 상향조절된 유전자는 그 스스로가 증식에 대해 표적화될 것이며, 하향조절된 유전자는 결실될 것이라고 논하면서, 상기 66개의 유전자 목록을 인간 전이성 PCA19의 어레이-CGH 프로파일과 추가로 교차시켰다. 이러한 교차종을 통해 17개의 유전자를 수득하게 되었고(도 8A), 그중 5개(FSCN1, ID3, KRT6A, SPP1, 및 ZBTB16)는 세포 이동과 연관이 있는 것으로 알려져 있다. 흥미롭게도, 최근 흑색종에서의 비교 온코게노믹스 분석을 통해 중요한 전이 및 예후 PC결정인자로서 FSCN1이 확인되었고(데이타는 나타내지 않았다), 이는 본 발명의 유전자 시그너처가 다중 종양 유형 전체에서 침습성 및 전이성 과정 및 임상적 결과와 관련이 있을 수 있다는 가능성을 불러 일으켰다.
실시예 7: 교차종으로 3각 측량된 SMAD4 전사 표적은 임상적 결과와 연관이 있었다.
상기의 진화적으로 보존되는 예측된 Smad4 표적에 대한 인간과의 관련성을 입증하는 증거를 수집하고, 추가로 전이성 PCA에 대한 상기와 같은 신규 모델로서의 자격을 얻기 위해 본 발명자들은 오직 뮤린에만 있는 66개의 유전자 목록에 비해 인간 PCA에서 PSA-재발을 계층 분류할 수 있는 17개의, 교차종으로 3각 측량된 유전자의 능력을 평가하였다. 그와 같이 하기 위해서, 본 발명자들은 본 발명자들은 시간 경과에 따른 PSA 재발(소위, 생화학적 재발)이라고 주석이 달린, 79개의 임상적으로 국소화된 표본으로 구성된, 문헌 [Glinsky and colleagues]15에 의한 인간 PCA 유전자 발현 데이타세트를 사용하였다. 17개의 유전자 목록을 사용하여 계층적 클러스터링에 의한 비교사 분류를 통해 상기의 환자 종양을 2개의 주요 분기 중 하나로 지정하였다(도 7C). 통계학적 유의도를 위한 샘플 크기로서는 너무 작기는 하지만, 상기 코호트에서 5개의 전이성 표본 중 4개가 상기 17개의 유전자에 의해 정의된 고위험군으로 클러스터링되었다(도 7B). 또한, 상기 17개의 유전자 목록에 의해 계층 분류된 2개의 서브부류에 관한 카플란-마이어 분석을 통해 시간 경과에 따른 재발에 있어 유의적인 차이가 있는 것으로 나타났지만(p=0.0086)(도 7D), 문헌 [Glinsky] 프로파일링 연구15로부터의 17개의 유전자 세트 중 무작위로 선택된 목록(n=10)은 통계학적으로 유의적인 분류를 수행하지 못했다(P=0.8610; 0.6086; 0.1827; 0.8338; 0.6391; 0.7918; 0.1814; 0.9851; 0.3946; 0.9201;). 비교시, 교차종 필터가 66개의 유전자 목록으로부터 잡음을 일으키는 방관자를 효과적으로 선별해었다는 것을 입증하면서, 66개의 유전자 세트는 환자를 차별적인 결과 서브부류로 계층 분류하지 못했다(p=0.0626)(도 12).
이어서, 17개의 유전자 목록이 전립선에 대해 특이성을 띠는지 평가하기 위해, 본 발명자들은 295개의 원발성 유방암으로부터 얻은 결과로 주석이 달린 발현 데이타를 사용하여 유사한 분석을 수행하였다. 도 8E에 나타낸 바와 같이, 17개의 유전자를 사용하여 비교사 클러스터링함으로써 상기 유방 종양 샘플을 전반적인 생존(p<0.0001) 및 무전이 생존(p=0.0005; 도 8F)에서 유의적인 차이를 보이는 2개의 군으로 서브분류하였다. 무작위로 선택된 17개의 유전자 목록(n=10)은 다시 카플란-마이어 곡선(상기 정보 또는 도면)의 어떤 유의적인 분류도 달성하지 못했다. 반면 66개의 유전자 세트는 상기 과제-전반적인 생존(p=0.0263) 및 무전이 생존(p=0.0886)에 있어서 경계선상의 수행자였다.
모두 합쳐서, 다중 인간 종양 유형에서는 진행되는 동안 Smad4이 빈번히 유의적으로 하향조절된다는 것도 함께(온코민 데이타, 박스플롯 표시), 인간 전립선 및 유방 선암종을 우수 및 열악한 결과의 서브부류로 분류할 수 있는 상기의 진화적으로 보존되는 Smad4 표적의 능력을 입증하는 상기 상관관계 분석은 Pten pc -/- Smad4 pc-/- 마우스를 인간 PCA에 존재하는 시그너처 이벤트에 의해서 유도되는 고도한 관련성을 가진 전이성 전립선 모델로서 입증하는 역할을 하고, 본 발명자들의 통합적 교차종 분석 접근법을 지지하는 역할을 한다.
실시예 8 : 인실리코 분석을 통해, 세포 이동 유전자는 무통성 PTEN 종양과 비교하여 전이성 PTEN / SMAD4 종양에서 차별적으로 발현된다는 것이 밝혀졌다.
Pten pc -/- 및 Pten pc -/- Smad4 pc -/- PCA 모델의 현저히 다른 진행 표현형 및 인간 PCA 환자 군집을 계층 분류할 수 있는 284개의 유전자 패널의 능력은 PC결정인자가 전이성 진행을 작용적으로 유도한다는 것을 강조한다. 상기 유전자들에 의해 부여받은 생물학적 활성 유형에 대한 빠른 통찰력을 수집하기 위해 본 발명자들은 인제뉴어티 패쓰웨이 분석(IPA)(캘리포니아주 레드우드 시티 소재의 Ingenuity Systems Inc.)을 사용하여 정보에 기반한 경로 분석을 수행하였다(도 6). 세포 이동 범주의 순위는 침습성이지만 전이성은 아닌 Pten pc -/- ; p53 pc -/- 종양에서는 #18이었지만(도 6B), 세포 이동 유전자의 순위는 전이성 경향이 있는 Pten pc -/- ; Smad4 pc -/- 종양에서는 #1이었다(도 6A).
실시예 9: PC 결정인자는 인간 전립선암에서 진행과 상관관계에 있는 발현을 나타내었다.
게놈 불안정성은, 공통 및 특이한 유전적 프로파일을 가진 세포로 이루어진 이종성 서브군집으로 구성된 원발성 종양을 형성하면서 종양발생을 유도한다는 것이 잘 확립되어 있다. 따라서, 원발성 종양 내의 PC결정인자를 발현하는 서브군집이 증식성 이점을 부여받고, 최종적으로는 파종된다면, 보다 동종성인 유도체 전이성 병변에서는 강화되어 나타남으로써 PC결정인자의 발현은 증가하게 될 것이라는 것은 당연한 것이다. 그러한 진행과 관련된 발현을 평가하기 위해 372개의 PC결정인자를 온코민에 대한 전립선암 발현 프로파일링 데이타 대요에서 조사하였다. 일흔네개(74)의 PC결정인자가 인간 전립선암에서 진행과 상관관계에 있는 발현을 나타내는 것으로 밝혀졌고(표 4), 이는 추가로 PC결정인자와 인간 암 사이의 관련성을 강조하였다.
실시예 10: 교차종 및 교차 플랫폼으로 3각 측량된 PC 결정인자는 인간 전립선암에서 예후성을 띤다.
이어서, 전이성 경향이 있는 마우스 종양 대 무통성 마우스 종양에서 RNA 수준에 있어 차별적으로 발현되는 372개의 PC결정인자로 구성된 상기의 전이 시그너처를, 인간 전이성 전립선암 데이타세트19 중 카피수 변이(CNA: copy number aberration)에 귀속하는 유전자 대요와 결부시켰다. 본 발명자들은 앞서 기술된 바와 같이24, 원형 2진 세분화에 의해 프로세싱된 전이성 인간 전립선암 ACGH 프로파일인 GSE8026 19 중 최소 공통 부위(MCR)에 있는 상주 유전자를 사용하였다. 컴퓨터로 추가 분석하기 위해 Pten pc -/- 과 Pten pc -/ - Smad4 pc -/ - 마우스 전립선 종양 사이에서 유의적으로 차별적인 발현을 나타낼 뿐만 아니라, 전이성 인간 전립선 종양에서 카피수 변경도 나타내는 공통된 오솔로그 유전자를 선택하였다. 상기 분석을 통해 전이경향이 있는 마우스 종양에서는 RNA 수준에서, 및 전이성 인간 전립선암에서는 DNA 수준에서 차별적으로 발현되는 56개의 PC결정인자(표 7)가 확인되었다(도 6A).
이어서, 56개의 유전자 세트(표 7)를 전립선암 유전자 발현 데이타세트에 대한 예후적 유용성에 대하여 평가하였다. 환자 샘플을 56개의 유전자 시그너처에 의해 정의된 2개의 주요 클러스터(저위험군 및 고위험군)로 분류화하였다. 56개의 유전자 클러스터에 의해 정의된 군에 기반한 생화학적 재발(BCR) PSA 수준(>0.2 ng/ml)에 관한 카플란-마이어 분석. "저위험군" 코호트와 비교하여 "고위험군" 코호트의 경우, BCR PSA 무재발 생존(P=0.0018)은 통계학적으로 유의적인 것으로 나타났다(도 21B).
실시예 11: 침습성에 작용적으로 관여하는 PC 결정인자를 확인하는 유전적 스크린
유전적 스크린은 전이를 작용적으로 유도하는 PC결정인자의 서브세트를 확인하는 데 유용하다(도 22). 특정 PC결정인자(특히, PC결정인자 1-245)의 이종성 과다발현은 인간 세포에서 침습성 활성을 증가시킨다. 유사하게, 특정 PC결정인자(특히, PC결정인자 246-372)의 하향조절은 침습성을 증진시킨다.
실시예 12: PC 결정인자는 시험관내에서 침습성을 직접적으로 유도한다
상향조절된 및 하향조절된 PC결정인자를 나타내는 cDNA 클론을 pMSCV 레트로바이러스 시스템에서 발현시켰다. 레트로바이러스 상등액을 인간 전립선암 세포주 PC3에 개별적으로 형질도입하고, 표준 24웰 마트리겔 침습성 챔버를 사용하여 침습성에 대하여 3중으로 분석하였다. 각 유전자의 침습성을 GFP 대조군과 비교하였다(표 5). SPP1 및/또는 GFP 대조군을 과다발현하는 PC3 세포를 사용하여 3중으로 실시한 대표적인 보이든 챔버 침습성 분석을 나타내었다(도 23A). 침습성 분석에 의해서 SPP1의 보강된 발현을 통해 인간 PCA PC3 세포의 침습성 활성을 유의적으로 증진시킬 수 있는 SPP1의 능력을 확인하였다. 침습성의 차별적인 수준은 통계학적으로 유의성을 띠었다(P<0.05)(도 23B). 특정의 침습성 촉진 PC결정인자에는 세포 이동 유전자라는 주석이 달린 반면, 기타 다른 것에는 세포 이동 유전자라는 주석을 달리지 않았다(표 5, 도 23C). 흥미롭게도, 본 발명자들은 PC3 세포에서 상기 28개의 세포 이동 유전자로부터 12개의 히트가 있었던 반면(43% 히트); 기타 다른 작용성 분류에 있는 38개의 유전자로부터는 단지 6개의 히트가 있었다(16% 히트)는 것을 발견하게 되었다. 따라서, 이와 같이 작용에 따라 확인한 결과, 유전자에 세포 이동을 할 수 있는 유전자라고 인실리코로 주석을 단 것은 정확하다는 것을 확인하게 되었다. 생체내 진행성 Pten pc -/- Smad4 pc -/- 종양 표현형과 인실리코 세포 유동성 분자 프로파일을 배경으로 하여 추정 Smad4-Pten 표적의 침습성 이전의 활성을 보고하는 상기의 작용성 데이타는, 상기와 같은 침습성 차단이 TGFβ/BMP-Smad4 신호전달 네트워크에 의한 진행 억제의 주요 기전이 되며, 추가의 임상적 확인을 우선 순위화하는데 사용될 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 13: PC 결정인자의 소규모 패널이 인간 전립선암에서 예후성을 띤다.
특정 실시태양에서, 개별 종양이 전이하는지에 대한 성향과 관련된 예후적인 정보를 제공하기 위해 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 110개, 150개, 200개, 250개, 300개, 350개, 또는 327개 모두의 PC결정인자를 측정하는 것은 이롭다. 다른 실시태양에서, 상기와 예후적인 정보를 제공하기 위해 소규모 패널 PC결정인자를 수단으로 하는 것을 이롭다. 도 5, 8, 12, 및 21을 통해서, 인간 PCA 또는 유방 결과를 계층 분류하는 >16 PC결정인자로 구성된 패널을 확인할 수 있다. 이어서, 본 발명자들은 PC결정인자의 보다 더 작은 소규모의 패널의 유용성에 관하여 조사하였다(도 24). 이어서, 관련된 사이클린 D1(증식/노화) 및 SPP1(유동성 네트워크)과 함께 조절 기능에 장애가 있는 Pten 및 Smad4 발현은 전립선암 유전자 발현 데이타세트 상에서 인간 전립선암 진행과 상관관계에 있는 것으로 나타났다(도 24A). 환자 샘플을 PTEN, SMAD4, 사이클린 D1, 및 SPP1 시그너처에 의해 정의된 K-평균(고위험군 및 저위험군)에 의해서 2개의 주요 클러스터로 분류화하였다. 고위험군 환자는 카플란-마이어 분석에 의해 생화학적 재발(BCR) PSA 수준(>0.2 ng/ml)에서 통계학적으로 유의적인 것으로 나타났다. PCA 진행에서의 PTEN, SMAD4, 사이클린 D1, 및 SPP1 시그너처의 유의적인 상관관계는 c-통계를 사용하여 독립적인 내과의 건강 연구회(PHS) 데이타세트로 확인하였다. 치명적인 결과 예측에 있어 PTEN, SMAD4, 사이클린 D1, 및 SPP1은 글리슨 점수와 유사한 능력을 발휘하였다. PTEN, SMAD4, 사이클린 D1, 및 SPP1 유전자를 글리슨 점수에 부가하였을 때 치명적인 결과를 예측함에 있어서 PHS에서 오직 글리슨 점수만을 단독으로 하는 모델보다 유의적으로 개선된 것으로 나타났다(도 24B). 또한, PTEN, SMAD4, 사이클린 D1, 및 SPP1 4개의 유전자 세트는 몰레큘라 시그너처 데이타베이스 오브 더 브로드 인스티튜트(MSigDB, version 2.5)에서 큐레이팅된 244개의 양방향 시그너처 중에서 가장 강화된 순위에 등급되었으며, 이는 치명적인 결과를 예측함에 있어서 4개의 유전자 시그너처가 확고한 유의성을 띤다는 것을 시사한다(도 24C).
실시예 14: PC 결정인자는 유방에서 예후성을 띤다.
전립선암과 관련하여 발견되는 동안, PC결정인자는 가능하게는 다중의 암 유형과 관련된 중심적인 전이성 과정을 조절할 수 있는 것으로 보였다. 이러한 가능성을 조사하기 위해, 본 발명자들은 56개의 교차종/교차 플랫폼으로 여과된 PC결정인자(표 7)를 유방 선암종 데이타세트에 대한 예후적 유용성에 대하여 평가하였다. 환자 샘플을 56개의 유전자 시그너처에 의해 정의된 2개의 주요 클러스터(저위험군 및 고위험군)로 분류화하였다. 56개의 유전자 클러스터에 의해 정의된 군에 기반하여 생존 가능성(p=0.00358)(도 25A) 및 무전이 생존(p=00492)(도 25B)에 관해 카플란-마이어 분석을 수행하였다. 추가로, 이어서, 본 발명자들은 전립선암에서 진행과 상관관계에 있는 발현을 나타내는 74개의 PC결정인자(표 4), 및 유방암에서도 또한 진행과 상관관계에 있는 발현을 나타내는, 확인된 20개의 PC결정인자를 조사하였다. 전립선암 및 유방암, 둘 모두에서 진행과 상관관계에 있는 발현을 나타내는 20개의 PC결정인자(표 6)를 유방 선암종 데이타세트에 대한 예후적 유용성에 대하여 평가하였다. 환자 샘플을 20개의, 진행과 상관관계에 있는 유전자 시그너처에 의해 정의된 2개의 주요 클러스터로 분류화하였다. 20개의 PC결정인자에 의해 정의된 군에 기반하여 생존 가능성(p=2.93e-11)(도 26A) 및 무전이 생존(p=4.62e-10)(도 26B)에 관해 카플란-마이어 분석을 수행하였다.
추정 SMAD4 표적
명칭 설명
ARG1 Arg1: 아르기나제 1, 간
ABHD12 Abhd12: 압하이드롤라제 도메인 함유 12
ALDH1A1 Aldh1a1: 알데히드 데하이드로게나제 패밀리 1, 서브패밀리 A1
CCND2 Ccnd2: 사이클린 D2
CD44 Cd44: CD44 항원
COL12A1 Col12a1: 프로콜라겐, XII형, 알파 1
COL18A1 Col18a1: 프로콜라겐, XVIII형, 알파 1
COL1A1 Col1a1: 프로콜라겐, I형, 알파 1
COL1A2 Col1a2: 프로콜라겐, I형, 알파 2
COL3A1 Col3a1: 프로콜라겐, III형, 알파 1
COL4A1 Col4a1: 프로콜라겐, IV형, 알파 1
COL4A2 Col4a2: 프로콜라겐, IV형, 알파 2
COL5A1 Col5a1: 프로콜라겐, V형, 알파 1
COL5A2 Col5a2: 프로콜라겐, V형, 알파 2
CP Cp: 세룰로플라스민
CRLF1 Crlf1: 사이토카인 수용체 유사 인자 1
CTSE Ctse: 카텝신 E
DEGS2 Degs2: 퇴행성 정모세포 상동체 2(초파리), 지질 데새튜라제
FBLN2 Fbln2: 피브린 2
FBN1 Fbn1: 피브릴린 1
FN1 Fn1: 피브로넥틴 1
FSCN1 Fscn1: 파신 상동체 1, 액틴 근속 단백질(스트롱길로켄트로투스 푸르푸라투스)
FSTL1 Fstl1: 폴리스타틴 유사 1
GJA1 Gja1: 간극 연접 막 채널 단백질 알파 1
GPX2 Gpx2: 글루타티온 퍼옥시다제 2
GSN Gsn: 겔솔린
ID1 Id1: DNA 결합 억제인자 1
ID3 Id3: DNA 결합 억제인자 3
IGJ Igj: 면역글로불린 연결 쇄
INHBB Inhbb: 인히빈 베타 B
KRT14 Krt14: 케라틴 14
KRT17 Krt17: 케라틴 17
KRT6A Krt6a: 케라틴 6a
LGALS1 Lgals1: 렉틴, 갈락토스 결합, 가용성 1
LHFP Lhfp: 지방종 HMGIC 융합 파트너
LOX Lox: 리실 옥시다제
METTL7A Mettl7a: 메틸트랜스퍼라제 유사 7A
MID1 Mid1: 미들린 1
MSN Msn:모에신
NCOA4 Ncoa4: 핵 수용체 공활성인자 4
OSMR Osmr: 온코스타틴 M 수용체
PLLP Pllp: 혈장 막 프로테오지질
PLOD2 Plod2: 프로콜라겐 리신, 2 옥소글루타레이트 5 디옥시게나제 2
POSTN Postn: 페리오스틴, 골아세포 특이 인자
PSCA Psca: 전립선 줄기 세포 항원
SCNN1A Scnn1a: 나트륨 채널, 비전압 개폐, I형, 알파
SERPINH1 Serpinh1: 세린(또는 시스테인) 펩티다제 억제인자, 클레이드 H, 구성원 1
SFRP1 Sfrp1: 분비된 프리즐 관련 서열 단백질 1
SLPI Slpi: 분비성 백혈구 펩티다제 억제인자
SPARC Sparc: 분비된 산성 시스테인이 풍부한 당단백질
SPON1 Spon1: 스폰딘 1, (f-스폰딘) 세포외 기질 단백질
SPP1 Spp1: 분비된 인단백질 1
STAT5A Stat5a: 신호전달 인자 및 전사 활성인자 5A
STEAP4 Steap4: STEAP 패밀리 구성원 4
TESC Tesc: 테스칼신
TFF3 Tff3: 트레포일 인자 3, 간질
TGFBI Tgfbi: 형질전환 성장 인자, 베타 유도성
THBS2 Thbs2: 트롬보스폰딘 2
TIMP1 Timp1: 메탈로프로테이나제 조직 억제인자 1
TM4SF1 Tm4sf1: 트랜스막 4 수퍼패밀리 구성원 1
TMEM45B Tmem45b: 트랜스막 단백질 45b
TNC Tnc: 테나신 C
TTR Ttr: 트랜스티레틴
UPK1A Upk1a: 유로플라킨 1A
UPK1B Upk1b: 유로플라킨 1B
ZBTB16 Zbtb16: 아연 핑거 및 BTB 도메인 함유 16
이는 17개의 SMAD4 표적을 나타낸다
명칭 설명
ALDH1A1 Aldh1a1: 알데히드 데하이드로게나제 패밀리 1, 서브패밀리 A1
CP Cp: 세룰로플라스민
FBN1 Fbn1: 피브릴린 1
FSCN1 Fscn1: 파신 상동체 1, 액틴 근속 단백질(스트롱길로켄트로투스 푸르푸라투스)
GPX2 Gpx2: 글루타티온 퍼옥시다제 2
ID3 Id3: DNA 결합 억제인자 3
KRT14 Krt14: 케라틴 14
KRT17 Krt17: 케라틴 17
KRT6A Krt6a: 케라틴 6a
LHFP Lhfp: 지방종 HMGIC 융합 파트너
OSMR Osmr: 온코스타틴 M 수용체
PLOD2 Plod2: 프로콜라겐 리신, 2 옥소글루타레이트 5 디옥시게나제 2
PSCA Psca: 전립선 줄기 세포 항원
SPP1 Spp1: 분비된 인단백질 1
TM4SF1 Tm4sf1: 트랜스막 4 수퍼패밀리 구성원 1
UPK1B Upk1b: 유로플라킨 1B
ZBTB16 Zbtb16: 아연 핑거 및 BTB 도메인 함유 16
온코마인 데이타베이스 내의, 전립선암에서 진행과 상관관계에 있는 발현 패턴을 나타내는 PC 결정인자
명칭 설명
상향조절된 유전자
ADAM8 Adam8: 디스인테그린 및 메탈로펩티다제 도메인 8
AK1 Ak1: 아데닐레이트 키나제 1
ANGPTL4 Angptl4: 안지오포이에틴 유사 4
B4GALT5 B4galt5: UDP-Gal: 베타GlcNAc 베타 1,4-갈락토실트랜스퍼라제, 폴리펩티드 5
BIRC5 Birc5: 배큘로바이러스 IAP 반복부 함유 5
BST1 골수 기질 세포 항원 1
CCND1 Ccnd1: 사이클린 D1
CDC2 Cdc2a: 세포 분열 주기 2 상동체 A (S. 폼베)
CDCA8 Cdca8: 세포 분열 주기 관련 8
CENPA Cenpa: 동원체 단백질 A
COL18A1 Col18a1: 프로콜라겐, XVIII형, 알파 1
COL1A1 Col1a1: 프로콜라겐, I형, 알파 1
COL3A1 Col3a1: 프로콜라겐, III형, 알파 1
COL5A2 Col5a2: 프로콜라겐, V형, 알파 2
ETS1 Ets1: E26 조류 백혈병 온코진 1, 5' 도메인
FSCN1 Fscn1: 파신 상동체 1, 액틴 근속 단백질(스트롱길로켄트로투스 푸르푸라투스)
HMGB2 고유동성 군 박스 2
ITGB2 Itgb2: 인테그린 베타 2
KIAA0101 2810417H13Rik: RIKEN cDNA 2810417H13 유전자
KLK7 칼리크레인 관련 펩티다제 7
KRT6A Krt6a: 케라틴 6A
LAMB1 Lamb1-1: 라미닌 B1 서브유닛 1
LRIG1 류신이 풍부한 반복부 및 면역글로불린 유사 도메인 1
MCM5 Mcm5: 미니염색체 유지 결핍 5, 세포 분열 주기 46(S. 세레비시아)
MKI67 모노클로날 항체 Ki-67에 의해 확인된 항체
NCF4 Ncf4: 중성구 세포질 인자 4
OLFML2B Olfml2b: 올펙토메딘 유사 2B
PDPN Pdpn: 포도플라닌
PLOD2 Plod2: 프로콜라겐 리신, 2 옥소글루타레이트 5 디옥시게나제 2
SLC16A1 Slc16a1: 용질 운반체 패밀리 16(모노카르복실산 수송체), 구성원 1
SPI1 Sfpi1: SFFV 프로바이러스 통합 1
SPP1 Spp1: 분비된 인단백질 1
STEAP3 STEAP 패밀리 구성원 3
THBS2 Thbs2: 트롬보스폰딘 2
TNFRSF12A Tnfrsf12a: 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리, 구성원 12a
TOP2A Top2a: 토포이소머라제(DNA) II 알파
UBE2C Ube2c: 유비퀴틴 접합 효소 E2C
VCAN 베르시칸
하향조절된 유전자
ALDH1A1 Aldh1a1: 알데히드 데하이드로게나제 패밀리 1, 서브패밀리 A1
ATRN Atrn: 어트랙틴
BEX4 뇌 발현, X 연관 4
CYB5B Cyb5b: 시토크롬 b5 B형
FMOD 피브로모듈린
GSN Gsn: 겔솔린
GSTM5 글루타티온 S 트랜스퍼라제 mu 5
GSTO1 Gsto1: 글루타티온 S 트랜스퍼라제 오메가 1
ID1 Id1: DNA 결합 억제인자 1
ID2 Id2: DNA 결합 억제인자 2
IQGAP2 Iqgap2: IQ 모티프 함유 GTP아제 활성화 단백질 2
KRT15 Krt15: 케라틴 15
LASS4 LAG1 상동체, 세라미드 신타제 4
METTL7A Mettl7a: 메틸트랜스퍼라제 유사 7A
MID1 Mid1: 미들린 1
MSMB 마이크로세미노단백질, 베타-
NCOA4 Ncoa4: 핵 수용체 공활성인자 4
ONECUT2 원 컷트 호메오박스 2
PEX1 퍼옥시좀 생체발생 인자 1
PINK1 Pink1: PTEN 유도성 추정 키나제 1
PTEN 포스파타제 및 텐신 상동체
PTGS1 Ptgs1: 프로스타글란딘 엔도퍼옥시드 신타제 1
RAB27B Rab27b: RAB27b, 구성원 RAS 온코진 패밀리
SATB1 SATB 호메오박스 1
SCNN1A Scnn1a: 나트륨 채널, 비전압 개폐, I형, 알파
SLC25A26 용질 운반체 패밀리 25, 구성원 26
SMAD4 SMAD 패밀리 구성원 4
SPINT1 세린 펩티다제 억제인자, 쿠니츠형 1
STAT5A Stat5a: 신호전달 인자 및 전사 활성인자 5A
SUOX 설파이트 옥시다제
TBX3 Tbx3: T 박스 3
TFF3 Tff3: 트레포일 인자 3, 간질
TGM4 트랜스글루타미나제 4(전립선)
TMEM45B Tmem45b: 트랜스막 단백질 45b
TRIM2 Trim2: 3부로 된 모티프 단백질 2
UPK1A Upk1a: 유로플라킨 1A
시험관내에서 작용적으로 침습성에 영향을 미치는 PC 결정인자
명칭 설명 결과
(변화 배수) 		주석
GSN Gsn: 겔솔린 0.1 세포 이동
ID4 Id4: DNA 결합 억제인자 4 0.1 기타
ID1 Id1: DNA 결합 억제인자 1 0.2 세포 이동
ZBTB16 Zbtb16: 아연 핑거 및 BTB 도메인 함유 16 0.2 세포 이동
PINK1 Pink1: PTEN 유도성 추정 키나제 1 0.4 기타
TTR Ttr: 트랜스티레틴 0.4 기타
UGT2B15 UDP 글루쿠로노실트랜스퍼라제 2 패밀리, 폴리펩티드 B35 0.4 기타
CTSE Ctse: 카텝신 E 0.5 세포 이동
MID1 Mid1: 미들린 1 0.5 기타
CD53 Cd53: Cd53 항원 1.8 세포 이동
SLPI Slpi: 분비성 백혈구 펩티다제 억제인자 2.2 세포 이동
CD44VE Cd44VE: CD44 항원 이소폼은 10개의 가변 CD44 엑손 중 8개를 포함한다(v3-v10) 2.4 세포 이동
LOX Lox: 리실 옥시다제 2.6 세포 이동
TM4SF1 Tm4sf1: 트랜스막 4 수퍼패밀리 구성원 1 2.64 기타
FSCN1 Fscn1: 파신 상동체 1, 액틴 근속 단백질(스트롱길로켄트로투스 푸르푸라투스) 3.1 세포 이동
LGALS1 Lgals1: 렉틴, 갈락토스 결합, 가용성 1 3.3 세포 이동
SPP1 Spp1: 분비된 인단백질 1 3.3 세포 이동
KRT6A Krt6a: 케라틴 6A 6.5 세포 이동
ABHD12 Abhd12: 압하이드롤라제 도메인 함유 12 노히트 기타
ADAM19 Adam19: 디스인테그린 및 메탈로펩티다제 도메인 19(멜트린 베타) 노히트 기타
ALDH1A1 Aldh1a1: 알데히드 데하이드로게나제 패밀리 1, 서브패밀리 A1 노히트 기타
ARG1 Arg1: 아르기나제 1, 간 노히트 기타
BIRC5 Birc5: 배큘로바이러스 IAP 반복부 함유 5 노히트 기타
C4orf18 1110032E23Rik: RIKEN cDNA 1110032E23 유전자 노히트 기타
CCND2 Ccnd2: 사이클린 D2 노히트 기타
CDCA8 Cdca8: 세포 분열 주기 관련 8 노히트 기타
COL3A1 Col3a1: 프로콜라겐, III형, 알파 1 노히트 기타
DDAH1 Ddah1: 디메틸아르기닌 디메틸아미노하이드롤라제 1 노히트 기타
FKBP10 Fkbp10: FK506 결합 단백질 10 노히트 기타
FSTL1 Fstl1: 폴리스타틴 유사 1 노히트 세포 이동
GJA1 Gja1: 간극 연접 막 채널 단백질 알파 1 노히트 세포 이동
ID3 Id3: DNA 결합 억제인자 3 노히트 세포 이동
IGF1 Igf1: 인슐린 유사 성장 인자 1 노히트 세포 이동
IL4R Il4ra: 인터루킨 4 수용체, 알파 노히트 세포 이동
INHBB Inhbb: 인히빈 베타 B 노히트 기타
ITGAX Itgax: 인테그린 알파 X 노히트 세포 이동
ITGB2 Itgb2: 인테그린 베타 2 노히트 세포 이동
JUB Jub:아주바 노히트 세포 이동
KRT14 Krt14: 케라틴 14 노히트 기타
KRT17 Krt17: 케라틴 17 노히트 기타
LGALS7 Lgals7: 렉틴, 갈락토스 결합, 가용성 7 노히트 기타
LHFP Lhfp: 지방종 HMGIC 융합 파트너 노히트 기타
LOXL2 Loxl2: 리실 옥시다제 유사 2 노히트 기타
METTL7A Mettl7a: 메틸트랜스퍼라제 유사 7A 노히트 기타
MSN Msn:모에신 노히트 세포 이동
NCOA4 Ncoa4: 핵 수용체 공활성인자 4 노히트 세포 이동
OLFML2B Olfml2b: 올펙토메딘 유사 2B 노히트 기타
OSMR Osmr: 온코스타틴 M 수용체 노히트 기타
PLLP Pllp: 혈장 막 프로테오지질 노히트 기타
PLOD2 Plod2: 프로콜라겐 리신, 2 옥소글루타레이트 5 디옥시게나제 2 노히트 기타
PSCA Psca: 전립선 줄기 세포 항원 노히트 기타
PTGS1 Ptgs1: 프로스타글란딘 엔도퍼옥시드 신타제 1 노히트 기타
PXDN Pxdn: 퍼옥시다신 상동체(초파리) 노히트 기타
SERPINH1 Serpinh1: 세린(또는 시스테인) 펩티다제 억제인자, 클레이드 H, 구성원 1 노히트 기타
SH3PXD2B Sh3pxd2b: SH3 및 PX 도메인 2B 노히트 기타
SPARC Sparc: 분비된 산성 시스테인이 풍부한 당단백질 노히트 세포 이동
SPI1 Sfpi1: SFFV 프로바이러스 통합 1 노히트 세포 이동
SPON1 Spon1: 스폰딘 1, (f-스폰딘) 세포외 기질 단백질 노히트 기타
SPRR2G Sprr2a: 소형 프롤린이 풍부한 단백질 2A 노히트 기타
STAT5A Stat5a: 신호전달 인자 및 전사 활성인자 5A 노히트 세포 이동
TESC Tesc: 테스칼신 노히트 기타
TFF3 Tff3: 트레포일 인자 3, 간질 노히트 세포 이동
TGFBI Tgfbi: 형질전환 성장 인자, 베타 유도성 노히트 세포 이동
TIMP1 Timp1: 메탈로프로테이나제 조직 억제인자 1 노히트 세포 이동
TMEM45B Tmem45b: 트랜스막 단백질 45b 노히트 기타
UPK1B Upk1b: 유로플라킨 1B 노히트 기타
인간 전립선 및 유방암, 둘 모두에서 진행과 상관관계에 있는 발현을 나타내는 PC 결정인자
명칭 설명
ADAM8 Adam8: 디스인테그린 및 메탈로펩티다제 도메인 8
ANGPTL4 Angptl4: 안지오포이에틴 유사 4
BIRC5 Birc5: 배큘로바이러스 IAP 반복부 함유 5
CCND1 Ccnd1: 사이클린 D1
CDC2 Cdc2a: 세포 분열 주기 2 상동체 A (S. 폼베)
CDCA8 Cdca8: 세포 분열 주기 관련 8
CENPA Cenpa: 동원체 단백질 A
KIAA0101 2810417H13Rik: RIKEN cDNA 2810417H13 유전자
MCM5 Mcm5: 미니염색체 유지 결핍 5, 세포 분열 주기 46(S. 세레비시아)
PLOD2 Plod2: 프로콜라겐 리신, 2 옥소글루타레이트 5 디옥시게나제 2
SLC16A1 Slc16a1: 용질 운반체 패밀리 16(모노카르복실산 수송체), 구성원 1
SPP1 Spp1: 분비된 인단백질 1
TOP2A Top2a: 토포이소머라제(DNA) II 알파
UBE2C Ube2c: 유비퀴틴 접합 효소 E2C
MKI67 모노클로날 항체 Ki-67에 의해 확인된 항체
SMAD4 SMAD 패밀리 구성원 4
TFF3 Tff3: 트레포일 인자 3, 간질
PTEN 포스파타제 및 텐신 상동체
FMOD 피브로모듈린
SUOX 설파이트 옥시다제
인간 전이성 PCA a CGH 데이타세트에서 DNA 카피수 변경이 변경된 56개의 PC결정인자
명칭 설명
상향조절된 유전자
ADAM19 Adam19: 디스인테그린 및 메탈로펩티다제 도메인 19(멜트린 베타)
ANTXR2 Antxr2: 탄저균 독소 수용체 2
C1QB C1qb: 보체 성분 1, q 서브성분, 베타 폴리펩티드
CD200 Cd200: Cd200 항원
CD248 Cd248: Cd248 항원, 엔도시알린
COL8A1 Col8a1: 프로콜라겐, VIII형, 알파 1
CP Cp: 세룰로플라스민
FBN1 Fbn1: 피브릴린 1
FKBP10 Fkbp10: FK506 결합 단백질 10
FRZB Frzb: 프리즐 관련 단백질
FSCN1 Fscn1: 파신 상동체 1, 액틴 근속 단백질(스트롱길로켄트로투스 푸르푸라투스)
GCNT2 글루코사미닐 (N-아세틸) 트랜스퍼라제 2, I-분지형 효소(I 혈액형군)
GPX2 Gpx2: 글루타티온 퍼옥시다제 2
HPR Hp: 합토글로빈
JAG1 Jag1: 재깅형 1
KLHL6 kelch 유사 6(초파리)
KRT14 Krt14: 케라틴 14
KRT17 Krt17: 케라틴 17
KRT5 Krt5: 케라틴 5
KRT6A Krt6a: 케라틴 6A
LGMN Lgmn: 레구메인
LHFP Lhfp: 지방종 HMGIC 융합 파트너
MKI67 모노클로날 항체 Ki-67에 의해 확인된 항체
MSRB3 Msrb3: 메티오닌 설폭시드 리덕타제 B3
NID1 Nid1: 니도겐
OSMR Osmr: 온코스타틴 M 수용체
PDPN Pdpn: 포도플라닌
PLA2G7 Pla2g7: 포스포리파제 A2, VII군(혈소판 활성화 인자 아세틸하이드롤라제, 혈장)
PLOD2 Plod2: 프로콜라겐 리신, 2 옥소글루타레이트 5-디옥시게나제 2
PPIC Ppic: 펩티딜프롤릴 이소머라제 C
RBP1 Rbp1: 레티놀 결합 단백질 1, 세포성
RGS4 Rgs4: G 단백질 신호전달 조절인자 4
SPP1 Spp1: 분비된 인단백질 1
TM4SF1 Tm4sf1: 트랜스막 4 수퍼패밀리 구성원 1
TOP2A Top2a: 토포이소머라제(DNA) II 알파
WISP1 WNT1 유도성 신호전달 경로 단백질 1
하향조절된 유전자
ALDH1A1 Aldh1a1: 알데히드 데하이드로게나제 패밀리 1, 서브패밀리 A1
ARHGEF4 Arhgef4: Rho 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자(GEF) 4
EPS8L3 EPS8 유사 3
GPLD1 Gpld1: 글리코실포스파티딜이노시톨 특이 포스포리파제 D1
HSPC105 4632417N05Rik: RIKEN cDNA 4632417N05 유전자
ID3 Id3: DNA 결합 억제인자 3
KBTBD11 Kbtbd11: kelch 반복부 및 BTB(POZ) 도메인 함유 11
KRT4 Krt4: 케라틴 4
LY6K 림프구 항원 6 복합체, 유전자좌 K
M-RIP AA536749: 발현된 서열 AA536749
PAPSS2 Papss2: 3'-포스포아데노신 5'-포스포설페이트 신타제 2
PEX1 퍼옥시좀 생체발생 인자 1
PITX2 쌍 형성 유사 호메오도메인 2
PSCA Psca: 전립선 줄기 세포 항원
PTEN 포스파타제 및 텐신 상동체
SLC16A7 용질 운반체 패밀리 16, 구성원 7 (모노카르복실산 수송체 2)
TMEM56 트랜스막 단백질 56
UPK1B Upk1b: 유로플라킨 1B
ZBTB16 Zbtb16: 아연 핑거 및 BTB 도메인 함유 16
ZDHHC14 Zdhhc14: 아연 핑거, DHHC 도메인 함유 14
참조
참조 목록
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014

Claims (57)

  1. 소정의 예측가능성 수준으로 피험체에서 암 재발 또는 전이성 암 발병의 위험성을 평가하는 방법으로서,
    a. 피험체로부터 유래된 샘플에서 PC결정인자 1-372로 구성된 군에서 선택되는 2개 이상의 PC결정인자의 수준을 측정하는 단계; 및
    b. 샘플 내 2개 이상의 PC결정인자의 수준에서 임상적으로 유의한 변경을 측정하는 단계로서, 여기서 변경은 피험체에서 암 재발 또는 전이성 암 발병 위험성 증가를 나타내는 것인 단계를 포함하는, 평가 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 2개 이상의 PC결정인자가
    a) 표 2;
    b) 표 3;
    c) 표 4;
    d) 표 5;
    e) 표 6;
    f) 표 7; 및
    g) 표 2-7로부터 선택되는 2 이상의 표에서 선택되는 것인 평가 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 PC결정인자가 PTEN, SMAD4, 사이클린 D1 및 SPP1을 포함하는 것인 평가 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 암과 관련된 1 이상의 표준 파라미터를 측정하는 단계를 더 포함하는 것인 평가 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 암이 전립선암이고, 상기 표준 파라미터가 글리슨 점수인 평가 방법.
  6. 제1항에 있어서, PC결정인자의 수준은 전기영동으로, 면역화학적으로 또는 비침습 영상화에 의해 측정되는 것인 평가 방법.
  7. 제6항에 있어서, 면역화학적 검출법은 방사선면역분석법, 면역형광분석법 또는 효소 결합 면역흡착 분석법에 의해 수행되는 것인 평가 방법.
  8. 제1항에 있어서, 피험체가 원발성 종양, 재발성 종양, 또는 전이성 전립선암을 갖는 것인 평가 방법.
  9. 제1항에 있어서, 샘플이 종양 생검, 혈액, 또는 생물학적 체액 중 순환 종양 세포인 평가 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 생검이 코어 생검, 절제 조직 생검 또는 절개 조직 생검인 평가 방법.
  11. 제1항에 있어서, 4개 이상의 PC결정인자의 발현 수준을 측정하는 것인 평가 방법.
  12. 소정의 예측가능성 수준으로 피험체에서 암 재발 또는 전이성 암 발병의 위험성을 평가하는 방법으로서,
    a. 피험체로부터 유래된 샘플에서 PC결정인자 1-372로 구성된 군에서 선택되는 2개 이상의 PC결정인자의 수준을 측정하는 단계; 및
    b. 2개 이상의 PC결정인자의 수준을 기준값과 비교하는 단계를 포함하는, 평가 방법.
  13. 제12항에 있어서, 기준값이 지수 값(index value)인 평가 방법.
  14. 소정의 예측가능성 수준으로 피험체에서 종양의 진행을 평가하는 방법으로서,
    a. 제1 기간에 피험체로부터 유래된 제1 샘플에서 PC결정인자 1-372로 구성된 군에서 선택되는 2개 이상의 PC결정인자의 수준을 검출하는 단계;
    b. 제2 기간에 피험체로부터 유래된 제2 샘플에서 2개 이상의 PC결정인자의 수준을 검출하는 단계; 및
    c. (a) 단계에서 검출된 2개 이상의 PC결정인자의 수준을 (b) 단계에서 검출된 수준, 또는 기준값과 비교하는 단계를 포함하는, 평가 방법.
  15. 제14항에 있어서, 제1 샘플이 종양 치료를 받기 전에 피험체로부터 채취된 것인 평가 방법.
  16. 제14항에 있어서, 제2 샘플이 종양 치료를 받은 후에 피험체로부터 채취된 것인 평가 방법.
  17. 소정의 예측가능성 수준으로 재발성 또는 전이성 암에 대한 치료의 유효성을 모니터링하는 방법으로서,
    a. 제1 기간에 피험체로부터 유래된 제1 샘플에서 PC결정인자 1-372로 구성된 군에서 선택되는 2개 이상의 PC결정인자의 수준을 검출하는 단계;
    b. 제2 기간에 피험체로부터 유래된 제2 샘플에서 2개 이상의 PC결정인자의 유효량의 수준을 검출하는 단계; 및
    c. (a) 단계에서 검출된 2개 이상의 PC결정인자의 수준을 (b) 단계에서 검출된 수준, 또는 기준값과 비교하는 단계로서, 여기서 치료의 유효성은 피험체로부터 유래된 2개 이상의 PC결정인자의 수준 변화를 통해 모니터링하는 것인 단계를 포함하는, 모니터링 방법.
  18. 제17항에 있어서, 피험체가 이전에 암 치료를 받은 것인 모니터링 방법.
  19. 제17항에 있어서, 제1 샘플이 암 치료를 받기 전에 피험체로부터 채취된 것인 모니터링 방법.
  20. 제17항에 있어서, 제2 샘플이 암 치료를 받은 후에 피험체로부터 채취된 것인 모니터링 방법.
  21. 제17항에 있어서, 제2 샘플이 암 재발 이후에 피험체로부터 채취된 것인 모니터링 방법.
  22. 제17항에 있어서, 제2 샘플이 암 재발 이전에 피험체로부터 채취된 것인 모니터링 방법.
  23. 소정의 예측가능성 수준으로 종양 진단을 받은 피험체에 대한 치료 섭생법을 선택하는 방법으로서,
    a. 제1 기간에 피험체로부터 유래된 제1 샘플에서 PC결정인자 1-372로 구성된 군에서 선택되는 2개 이상의 PC결정인자의 수준을 검출하는 단계;
    b. 경우에 따라 제2 기간에 피험체로부터 유래된 제2 샘플에서 2개 이상의 PC결정인자의 수준을 검출하는 단계;
    c. (a) 단계에서 검출된 2개 이상의 PC결정인자의 수준을 기준값, 또는 경우에 따라 (b) 단계에서 검출된 양과 비교하는 단계를 포함하는, 선택 방법.
  24. 제23항에 있어서, 피험체가 이전에 종양 치료를 받은 것인 선택 방법.
  25. 제23항에 있어서, 제1 샘플이 종양 치료를 받기 전에 피험체로부터 채취된 것인 선택 방법.
  26. 제23항에 있어서, 제2 샘플이 종양 치료를 받은 후에 피험체로부터 채취된 것인 선택 방법.
  27. PC결정인자 1-372로 구성된 군에서 선택되는 2개 이상의 마커의 마커 수준의 패턴을 포함하는, 전이성 전립선암 기준 발현 프로파일.
  28. 제27항의 프로파일을 생성시키는데 충분한, PC결정인자 1-372로 구성된 군에서 선택되는 상응하는 PC결정인자를 검출하는 복수 개의 PC결정인자 검출 시약을 포함하는 키트.
  29. 제28항에 있어서, 검출 시약이 하나 이상의 항체 또는 그의 단편을 포함하는 것인 키트.
  30. 제28항에 있어서, 검출 시약이 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것인 키트.
  31. 제28항에 있어서, 검출 시약이 하나 이상의 압타머를 포함하는 것인 키트.
  32. 제27항에 따른 하나 이상의 전이성 전립선암 기준 발현 프로파일, 및 경우에 따라, 추가의 시험 결과 및 피험체 정보를 포함하는, 기계 판독가능한 매체.
  33. 생리학적 또는 생화학적 경로 관련된 전이를 나타내는 하나 이상의 PC결정인자를 포함하는 PC결정인자 패널.
  34. 제33항에 있어서, 생리학적 또는 생화학적 경로가 세포 이동, 혈관형성, 세포외 기질 분해, 혈관외유출(extravasion), 콜로니화 또는 아노이키스를 포함하는 것인 패널.
  35. 종양의 진행을 나타내는 하나 이상의 PC결정인자를 포함하는 PC결정인자 패널.
  36. PC결정인자의 활성 또는 발현을 조절하는 화합물을 동정하는 방법으로서,
    (a) PC결정인자를 발현하는 세포를 제공하는 단계;
    (b) 후보 화합물을 포함하는 조성물과 상기 세포를 접촉시키는 단계; 및
    (c) 상기 물질이 PC결정인자의 발현 또는 활성을 변경시키는지 여부를 측정하는 단계를 포함하고,
    이를 통해, 화합물 존재하에서 관찰되는 변경이, 세포를 화합물이 없는 조성물과 접촉시켰을 때에는 관찰되지 않는다면, 동정된 화합물이 PC결정인자의 활성 또는 발현을 조절하는 것인, 동정 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 세포는 생체내, 생체외 또는 시험관내에서 접촉시키는 것인 동정 방법.
  38. 피험체에서 암을 치료하는 방법으로서, PC결정인자의 활성 또는 발현을 조절하는 화합물을 상기 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는, 치료 방법.
  39. 피험체에서 전립선암을 치료 또는 예방하는 방법으로서, PC결정인자의 활성 또는 발현을 조절하는 제제를 상기 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는, 치료 또는 예방 방법.
  40. 게놈이 내인성 Pten 유전자 및 Smad4 유전자 둘 모두의 동형접합성 파괴를 포함하고, 야생형 마우스와 비교하여 전립선 종양 형성에 대한 감수성이 증가한 것으로 나타나는 트랜스제닉 이중 넉아웃 마우스.
  41. 제40항의 트랜스제닉 마우스로부터 유래된 세포.
  42. 제41항에 있어서, 상기 세포가 상피 세포인 세포.
  43. 제41항에 있어서, 상기 상피 세포가 전립선 세포, 유방 세포, 결장 세포, 또는 폐 세포인 세포.
  44. 전립선암 진행을 억제하는 치료제에 대한 스크리닝 방법으로서, 후보 치료제를 제40항의 트랜스제닉 마우스에 투여하는 단계, 및 상기 마우스에서 전립선암 진행에 대한 상기 치료제의 효과를 평가하는 단계를 포함하는, 스크리닝 방법.
  45. 시험 화합물 부재하에서 제40항의 트랜스제닉 마우스로부터 수득된 제1 샘플의 유전자 발현, 게놈 또는 프로테옴 프로파일을, 시험 화합물 존재하에서 제40항의 트랜스제닉 마우스로부터 수득된 샘플의 프로파일과 비교하는 단계를 포함하는, 바이오마커의 동정 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 샘플이 세포 샘플, 혈액 샘플 또는 순환 종양 세포인 동정 방법.
  47. 제1 기간에 제40항의 트랜스제닉 마우스로부터 수득된 제1 샘플의 유전자 발현, 게놈 또는 프로테옴 프로파일을, 제2 기간에 제40항의 트랜스제닉 마우스로부터 수득된 샘플의 프로파일과 비교하는 단계를 포함하는, 바이오마커의 동정 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 샘플이 세포 샘플, 혈액 샘플 또는 순환 종양 세포인 동정 방법.
  49. PTEN, SMAD4, 사이클린 D1 및 SPP1의 검출 또는 정량화를 위한 시약, 및 키트 사용 설명서를 포함하는 키트.
  50. 전립선 조직이, 게놈이 내인성 Pten 유전자 및 Smad4 유전자 둘 모두의 동형접합성 파괴를 함유하는 세포를 포함하고, Pten 유전자 또는 Smad4 유전자에 상기와 같은 파괴를 포함하지 않는 대조군 포유동물과 비교하여 전립선암의 발병에 대한 감수성이 증가한 것으로 나타나며, Smad4 유전자가 아닌 오직 Pten 유전자에만 동형접합성 파괴를 포함하는 대조군 포유동물과 비교하여, 무통성 보다는, 전이성 전립선암의 발병에 대한 감수성이 증가한 것으로 나타나는, 트랜스제닉 비인간 포유동물.
  51. a) 암 세포가 2개 이상의 PC결정인자의 수준에 임상적으로 유의한 변경을 가지는 피험체를 제공하는 단계로서, 여기서 변경은 피험체에서 암 재발 또는 전이성 암 발병의 위험성이 증가됨을 나타내는 것인 단계; 및
    b) 관리 요법(care therapy)의 추가 표준으로 보조 요법을 사용하여 피험체를 치료하는 단계를 포함하는, 암의 치료 방법.
  52. 제51항에 있어서, 관리 요법의 표준이 수술, 방사선법 또는 안드로겐 절제법인 치료 방법.
  53. 전립선암 치료를 필요로 하는 피험체에서 전립선암을 치료하는 방법으로서,
    a) 피험체의 전립선암 조직으로부터 유래된 샘플에서 PTEN, SMAD4, 사이클린 D1 및 SPP1의 발현 수준에 대한 정보를 수득하는 단계;
    b) 상기 발현 수준에 기초하여 전립선암의 재발 또는 전이성암의 발병 위험성이 있는 것으로서 확인된 피험체에게 SPP1 억제제 또는 CD44 억제제를 투여하는 단계를 포함하는, 전립선암의 치료 방법.
  54. 제53항에 있어서, 상기 억제제가 항SPP1 항체, SPP1 siRNA, CD44 항체 또는 CD44 siRNA인 치료 방법.
  55. 피험체 암이 치료 섭생법으로부터 혜택을 얻는지 여부를 측정하는 방법으로서,
    a) 2개 이상의 PC결정인자 1-372의 수준을 검출하는 단계; 및
    b) (a) 단계에서 검출된 2개 이상의 PC결정인자의 수준을 기준값과 비교하는 단계를 포함하는, 측정 방법.
  56. 보조 요법을 필요로 하는 종양 환자를 선택하는 방법으로서, 2개 이상의 결정인자 1-372를 측정하여 환자에서 전이 위험성을 평가하는 단계로서, 여기서 환자로부터 유래된 종양 샘플 내 상기 2개 이상의 결정인자의 임상적으로 유의한 변경은, 환자가 보조 요법을 필요로 하는 것임을 나타내는 것인 단계를 포함하는, 선택 방법.
  57. 종양 환자에 대한 치료 결정을 통지하는 방법으로서,
    환자로부터 유래된 종양 샘플에서 2개 이상의 결정인자 1-372에 관한 정보를 수득하는 단계, 및
    상기 2개 이상의 결정인자가 임상적으로 유의한 방식으로 변경되는 경우 환자에서 종양 전이를 예방 또는 감소시키는 치료 섭생법을 선택하는 단계를 포함하는, 통지 방법.
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