KR20220067762A

KR20220067762A - 간독성 민감성 진단용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 예측 방법

Info

Publication number: KR20220067762A
Application number: KR1020200154346A
Authority: KR
Inventors: 윤준원; 황다빈
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2020-11-18
Filing date: 2020-11-18
Publication date: 2022-05-25
Also published as: KR102503293B1

Abstract

본 발명은 약물로 인해 유도되는 간독성에 대한 민감성을 진단하기 위한 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 간독성 민감성 예측 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 Dact2 (dishevelled binding antagonist of beta catenin 2)를 유효성분으로 함유하는 간독성 민감성 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.
시스플라틴과 같은 약물에 의해 간독성이 유발된 개체의 약물 투여 전 간 조직에서 Dact2의 발현 수준이 대조군에 비해 감소되어 있음을 확인함에 따라, 상기 Dact2를 시스플라틴 투여 전 간 조직에서 개체의 시스플라틴에 의한 간독성 민감성을 미리 예측하기 위한 간독성 민감성 진단용 바이오마커로 제공될 수 있고, 이를 이용하여 약물 투여로 인해 유도될 수 있는 간독성을 약물 투여 전에 미리 효과적으로 예측할 수 있다.

Description

간독성 민감성 진단용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 예측 방법{BIOMARKER COMPOSITION FOR DIAGNOSING SUSCEPTIBILITY TO HEPATOTOXICITY AND DIAGNOSING METHOD USING THEREOF}

본 발명은 약물로 인해 유도되는 간독성에 대한 민감성을 진단하기 위한 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 간독성 민감성 예측 방법에 관한 것이다.

간독성, 또는 간세포 독성은 약물 투여 등으로 인해 간이 손상된 상태를 의미한다. 간은 체내로 들어온 약물을 안전한 물질로 변환시켜 이에 대한 독성을 제거하는 역할을 하지만, 이러한 물질들이 체내로 과량 유입될 경우에는 간 독성이 일어날 수도 있다. 또한, 약물 이외에도 실험용이나 산업용으로 쓰이는 화학물질, 천연물 유래의 화합물, 약용식물 유래의 추출물도 간독성을 유발할 수 있다.

약물로 인해 유도된 간독성, 즉, 약인성 간손상(DILI, drug-induced liver injury)은 급성 간독성의 주요 원인이라고 할 수 있다. 약인성 간손상은 정도가 아주 약한 간독성에서부터 급성간부전증(acute liver failure)까지를 모두 포함할 수 있으며, 크게 내인성 간독성 및 특이체질성 간독성 현상으로 분류된다. 내인성 간독성은 주로 직접적인 약물 반응, 약물의 대사물에 대한 반응 등을 통해 유도되는 현상을 말하며, 특이체질성 간독성은 약물의 농도에 따라 유도되는 현상을 말한다.

이러한 간독성을 유발시키는 물질로 사염화탄소(Carbon tetrachloride; CCl₄), 알콜 및 갈락토사민(Galactosamine; GalN) 등이 대표적이며, 사염화탄소(CCl₄)는 간에서 CYP2E1이라는 효소에 의해 자유 라디칼을 지닌 CCl₃·와 산소와 반응한 CCl₃OO·의 형태가 되며, 이 산물들은 산화적 스트레스를 유도하며 DNA의 손상을 야기한다. 또한, 간성상세포의 활성을 유도하는 VEGF, TGF-β1 신호전달물질에 의해 간섬유증이 유발될 수 있으며, NF-κB 신호전달로 시작해서 IFN-γ, TNF-α, IL-6와 같은 사이토카인을 발현해 세포자살이나, 염증반응을 유도한다.

알콜은 간에 있는 효소인 ADH(alcohol dehydrogenase)에 의해 아세트알데하이드(acetaldehyde)로 분해되고 이때 NAD가 NADH로 환원되며, 높은 농도의 NADH는 지방산생산을 촉진하게 축적되어 지방간을 유래한다. 또한, 산화적 스트레스를 주어 IL-1, IL-6, IL-8등의 사이토카인을 분비해 염증 반응이나 세포사멸(apoptosis)을 일으킨다. 또한, 장에서 소화된 에탄올이 뿜는 내독소에 의해 간세포가 공격받으면 TNF-α같은 사이토카인을 분비해 간성상세포의 활성을 유도하고 간의 섬유화를 일으킨다.

갈락토사민(GalN)은 사이토크롬 p450과 같은 효소에 의해 산화되면 활성산소를 발생시킬 수 있는데, 이러한 산화적 스트레스를 받게 될 경우 IL-1β, IL-6, TNF-α와 같은 인자를 내보내 급성 간질환을 유발시킬 수 있으며, NF-κB, MAPK의 증가 또한 면역 반응으로 이어질 수 있어 PDCD4(programmed cell death 4) 단백질을 발현시키는 등 상기 두 가지 요인으로 인해 급성 간부전을 유발시킨다.

한편, 새로운 간독성 약물로 보고된 시스플라틴(Cisplatin)은 주로 고환암, 방광암, 난소암, 전립선암 등의 치료에 사용되는 1 세대 항암제로써 암세포와 일반세포 모두에 독성을 나타내는 것으로 보고되었다. 이러한 시스플라틴은 간에서 CYP2E1에 의해 대사가 이루어지면서 나오는 슈퍼옥사이드(superoxide) 같은 산화적 스트레스로 인해 DNA를 손상시키고, 미토콘드리아의 전자전달효소 1번 및 4번을 방해하여 ATP 생성을 저해한다. 또한, 미토콘드리아 막 전위의 감소로 칼슘이온의 섭취를 감소시키며, 항산화 기능의 이상을 초래해 독성을 유발한다.

더불어, 시스플라틴은 직접적으로는 DNA의 intra, interstrand의 구아닌(Guanine)에 붙어서 전사를 방해하여 세포자살을 유도하므로, 시스플라틴 약물 복용 전 약물에 대한 민감성을 나타낼 수 있는지 미리 예측할 수 있는 방법에 대한 연구가 필요하다.

대한민국 공개특허 제10-2015-0081632호 (2015.07.15 공개)

본 발명의 목적은 개체의 약물에 대한 간독성 민감도를 예측할 수 있는 바이오마커 조성물을 제공하며, 이를 이용하여 약물 투여로 인해 유도될 수 있는 간독성을 약물 투여 전에 미리 예측함으로써, 약물 투여에 따른 간독성을 사전에 예방하기 위한 방법을 제공하고자 한다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 Dact2 (dishevelled binding antagonist of beta catenin 2)를 유효성분으로 함유하는 간독성 민감성 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.

본 발명은 Dact2의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 간독성 민감성 진단용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 약물 투여 전 개체로부터 분리된 생물학적 시료를 수집하는 단계; 상기 수집된 시료 내 Dact2의 발현 수준을 확인하는 단계; 및 상기 Dact2 발현 수준을 대조군과 비교하여 감소 수준을 확인하는 단계;를 포함하는 간독성 민감성 예측 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 시스플라틴과 같은 약물에 의해 간독성이 유발된 개체의 약물 투여 전 간 조직에서 Dact2의 발현 수준이 대조군에 비해 감소되어 있음을 확인함에 따라, 상기 Dact2를 시스플라틴 투여 전 간 조직으로부터 개체의 시스플라틴에 의한 간독성 민감성을 미리 예측하기 위한 간독성 민감성 진단용 바이오마커로 제공될 수 있다.

상기 바이오마커 조성물을 사용하여, 약물 투여로 인해 유도될 수 있는 간독성을 약물 투여 전에 미리 효과적으로 예측할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 민감군(susceptible group) 및 둔감군(resistant group)의 약물 투여 전 간 조직 내 Dact2 mRNA 발현량을 비교한 결과이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명하기로 한다.

본 발명의 발명자들은 개체마다 선천적으로 발현차이를 나타내는 간 조직의 유전자 중 약물에 의해 유발되는 간독성의 민감도와 관련이 높은 유전자가 있을 것으로 예상하고, 시스플라틴 투여 후 간독성이 나타난 실험동물과 시스플라틴 투여 후에도 간독성이 둔감하게 나타난 실험동물의 약물 투여 전 간 조직에서 유전자 발현 패턴을 확인한 결과, 간독성이 나타난 개체의 시스플라틴 투여 전 간 조직에서 Dact2의 발현 수준이 간독성이 둔감하게 나타난 개체의 발현 수준보다 낮은 것을 확인함에 따라, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 Dact2 (dishevelled binding antagonist of beta catenin 2)를 유효성분으로 함유하는 간독성 민감성 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.

본 명세서에서, "Dact2 (dishevelled binding antagonist of beta catenin 2; NM_001107464)"는 염색체 6q27에 존재하며 DACT gene family에 속한다. 베타-카테닌(beta-catenin) 단백질에 직접적으로 붙어 핵으로 이동하는 것을 막아 윈트/베타-카테닌(Wnt/beta-catenin) 신호전달을 방해하는 것으로 알려져 있으며, Dishellved 라는 단백질을 분해(degradation)하여 beta-catenin 파괴 복합체의 형성을 좀 더 자유롭게 함으로써 Wnt/beta-catenin 신호전달을 방해한다. 또한, 대장암, 유방암, 간암 등의 환자 암세포주에서는 Dact2 유전자 부위가 메틸화(methylation)되어 발현이 잘되지 않아 Wnt/beta-catenin 신호전달을 증가시켜 암의 성장을 촉진시키므로, Dact2가 암의 진행을 억제하는 유전자로 알려져 있지만, 간독성 민감성 진단에 대해서는 보고된 바 없다.

상기 Dact2는 약물 투여 전, 간 조직에서 그 발현 주준을 확인하는 것일 수 있다.

상기 간독성은 약물에 의해 유도되는 것일 수 있고, 바람직하게는 시스플라틴(cisplatin)에 의해 유도되는 것일 수 있다.

본 명세서에서, "바이오마커"란, 몸 안의 변화를 알아낼 수 있는 지표로서, 생명체의 정상 또는 병리적인 상태, 이의 변화 여부 등을 확인할 수 있는 물질로, 폴리펩타이드, 핵산, 지질, 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함할 수 있고, 이를 이용하여 본 발명과 같이 약물에 의한 간독성 민감성 여부를 진단할 수 있다.

상기 Dact2의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 Dact2 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브, 상기 Dact2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드, 앱타머 또는 화합물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서, "프라이머(primer)"는 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxl group)를 가지는 핵산 서열로, 상보적인 주형과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 시점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA polymerase 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오타이드 트리포스페이트(nucleotide triphosphate)의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.

상기 프라이머는 상기 유전자에 특이적인 프라이머로, 통상적으로 7 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산일 수 있고, DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 한, 추가의 특징을 혼입할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당해 기술 분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다.

본 명세서에서, "프로브(probe)"는 mRNA와 특이적으로 결합을 이룰 수 있는, 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며, 라벨링 되어있어서 특정 mRNA의 존재 유무, 발현량을 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single strand DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double strand DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 형성될 수 있다. 적절한 프로브 및 혼성화 조건은 당해 기술 분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다.

본 명세서에서, "항체(antibody)"는 당해 기술 분야에 공지된 용어로서, 항원성 부위에 대하여 지시되는 특이적인 면역글로불린을 의미한다. 본 발명에서의 항체는 상기 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 당해 기술분야의 통상적인 방법에 따라 항체를 제조할 수 있다. 상기 항체의 형태는 폴리클로날(polyclonal) 항체 또는 모노클로날(monoclonal) 항체를 포함하며, 모든 면역글로불린 항체가 포함될 수 있다. 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 갖는 완전한 형태를 의미한다. 또한, 상기 항체는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함될 수 있다.

본 명세서에서 "펩타이드(peptide)"는 표적 물질에 대한 결합력이 높은 장점이 있고, 열/화학 처리 시에도 변성이 일어나지 않는다. 또한 분자 크기가 작기 때문에 다른 단백질에 붙여서 융합 단백질로의 이용이 가능하다. 구체적으로 고분자 단백질 체인에 붙여서 이용이 가능하므로 진단 키트 및 약물 전달 물질로 이용될 수 있다.

본 명세서에서 "앱타머(aptamer)"는 그 자체로 안정된 삼차 구조를 가지면서 표적 분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 특별한 종류의 단일가닥 핵산 (DNA, RNA, 또는 변형 핵산)으로 구성된 폴리뉴클레오티드(polynucleotide)의 일종을 의미한다. 상술한 바와 같이, 앱타머는 항체와 동일하게 항원성 물질에 특이적으로 결합할 수 있으면서도, 단백질보다 안정성이 높고, 구조가 간단하며, 합성이 용이한 폴리뉴클레오티드로 구성되어 있어, 항체를 대체하여 사용될 수 있다.

상기 키트는 프라이머 키트, DNA 칩 키트, 단백질 칩 키트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 키트는 간독성 민감성 진단을 위한, 선택적으로 마커를 인지하는 항체뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액, 또는 장치를 더 포함할 수 있다.

바람직하게는, 약물 투여 전 개체의 간 조직에서 발현 수준 변화가 나타난 Dact2 유전자 서열의 전부, 이의 일부를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 상보가닥 분자가 집적된, 시스플라틴으로 인해 유도되는 간독성 예측용 마이크로어레이 칩이 제공될 수 있다. 상기 마이크로어레이 칩은 약물 투여 전 간 조직에서 Dact2 유전자의 발현을 비교함으로써, 시스플라틴 투여로 인해 유도될 수 있는 간독성을 보다 유의 있고 정확하게 비교분석할 수 있다.

본 발명은 약물 투여 전 개체로부터 분리된 생물학적 시료를 수집하는 단계; 상기 수집된 시료 내 Dact2의 발현 수준을 확인하는 단계; 및 상기 Dact2 발현 수준을 대조군과 비교하여 감소 수준을 확인하는 단계;를 포함하는 간독성 민감성 예측 방법을 제공한다.

상기 개체는 간독성이 발생할 수 있는 동물이라면 그 종류를 한정하지 않으나, 구체적으로 포유동물일 수 있고, 예를 들어 인간(Homo sapiens)일 수 있다.

상기 생물학적 시료는 약물 투여 전 개체 또는 대조군으로부터 분리된 것으로, 상기 단백질 또는 이의 유전자의 발현수준이 정상 대조군과 차이나는 뇨, 혈액, 세포 및 조직으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 보다 바람직하게는 간 조직일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 유전자의 발현수준은 차세대 염기서열 분석(Next generation sequencing; NGS), 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), 마이크로어레이(microarray), 및 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 단백질의 발현 또는 활성 수준은 웨스턴 블랏(western blot), 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA), 방사선면역분석(radioimmunoassay; RIA), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역 전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법(immunoprecipitation assay), 보체고정분석법(complement fixation assay) 및 유세포 분석법(FACS)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 Dact2 발현 수준이 대조군의 발현 수준보다 낮을 경우, 약물에 의한 간독성 민감도가 높은 것으로 예측할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

<실시예 1> 간독성 민감도 예측을 위한 바이오마커 확인

SD rats (6주령, 수컷) 38마리를 시스플라틴(cisplatin) 투여 전 RNA를 추출하기 위해 마취한 뒤, 간의 한 엽을 선택해 조직을 소량 미리 채취해 동결 보존해 놓았다. 3주간의 회복기간을 가진 후, 시스플라틴 25mg/kg 농도로 생리식염수에 녹여서 복강 투여하였다.

투여 48시간 후에 부검하여 혈청분석 (ALT, AST, γ-GT)을 토대로 38마리 중 가장 간독성이 심한 민감군(susceptible group) 5마리와 간독성이 가장 약한 둔감군(resistant group) 5마리로 그룹화(grouping)하였다. 그 후 민감군과 둔감군의 미리 채취해둔 간 조직에서 RNA를 뽑고 RNA seq (Illumina Novaseq6000)를 수행하여 두 군간 본래의 유전자 발현 패턴을 비교 분석하였다 (Fold change 1.5 이상, p value 0.05 이하).

그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 둔감군(resistant group)에서 약물 투여 전 간 Dact2 mRNA의 발현량이 민감군(susceptible group)의 발현량에 비해 2.12배 높은 것을 확인하였다.

이 결과를 바탕으로 간에서 Dact2의 발현이 선천적으로 낮을 경우, 과량의 시스플라틴에 노출되면 간독성에 민감할 수 있는 것으로 판단할 수 있다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.

Claims

Dact2 (dishevelled binding antagonist of beta catenin 2)를 유효성분으로 함유하는 간독성 민감성 진단용 바이오마커 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 간독성은,
약물에 의해 유도되는 것을 특징으로 하는 바이오마커 조성물.
제 2 항에 있어서,
상기 약물은,
시스플라틴(cisplatin)인 것을 특징으로 하는 바이오마커 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 Dact2는,
약물 투여 전, 간 조직에서 발현 주준을 확인하는 것을 특징으로 하는 바이오마커 조성물.
Dact2의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 간독성 민감성 진단용 키트.
제 5 항에 있어서,
상기 Dact2의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는,
상기 Dact2 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브, 상기 Dact2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드, 앱타머 또는 화합물인 것을 특징으로 하는 간독성 민감성 진단용 키트.
약물 투여 전 개체로부터 분리된 생물학적 시료를 수집하는 단계;
상기 수집된 시료 내 Dact2의 발현 수준을 확인하는 단계; 및
상기 Dact2 발현 수준을 대조군과 비교하여 감소 수준을 확인하는 단계;를 포함하는 간독성 민감성 예측 방법.
제 7 항에 있어서,
상기 간독성은,
약물에 의해 유도되는 것을 특징으로 하는 간독성 민감성 예측 방법.
제 7 항에 있어서,
상기 약물은,
시스플라틴(cisplatin)인 것을 특징으로 하는 간독성 민감성 예측 방법.