MX2011000451A - Distintivos y determinantes asociados con cancer de próstata y métodos para utilizarlos. - Google Patents

Distintivos y determinantes asociados con cancer de próstata y métodos para utilizarlos.

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Dana Farber Cancer Inst Inc
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Abstract

La presente invención proporciona método para detectar cáncer mediante el uso de biomarcadores.

Description

DISTINTIVOS Y DETERMINANTES PC ASOCIADOS CON CÁNCER DE PRÓSTATA Y MÉTODOS PARA UTILIZARLOS SOLICITUD RELACIONADA Esta solicitud reclama el beneficio del documento U.S.S.N. 61/081,286 presentado el 16 de julio de 2008, cuyo contenido, en su totalidad, se considera parte de la presente, como referencia. i CAMPO DE LA INVENCIÓN ! La presente invención se relaciona con la identificación de distintivos biológicos asociados con DETERMINANTES PC (PCDETERMINANTS) genéticas y también se relaciona con estas DETERMINANTES PC genéticas que producen la metástasis de cáncer y con los métodos para usar estos distintivos biológicos y DETERMINANTES PC en el cribado, prevención, diagnóstico, terapia, monitoreo y pronóstico del cáncer. La invención también se relaciona con un modelo de cáncer de próstata metastático de ratón manipulado genéticamente.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El cáncer de próstata (PCA - prostate caríper) es I el cáncer más frecuente en personas del sexo masculino y la principal causa de muerte por cáncer en los Estados Unidos.
La mayoría de los hombres mayores tienen neoplasia I prostática y en la gran mayoría de los casos permanece localizada e inactiva sin necesidad de intervención terapéutica. Sin embargo, existe un grupo de cáncer de próstata (PCA) en fase precoz, con propensión j innata {"hardwired" ) hacia una etapa de comportamiento maligno i agresivo que si se deja sin tratamiento se diseminará fuera de la próstata y progresará de manera implacable ai cáncer metastásico y finalmente provocará la muerte.[ La incapacidad actual para distinguir con exactitud la enfermedad inactiva de la agresiva ha expuesto a! muchos hombres con enfermedad potencialmente inactiva a intervenciones terapéuticas innecesarias con¡ alta morbilidad.
Los métodos actuales de estratificaciión de tumores para pronosticar su evolución tienen como base factores clínicos y patológicos que incluyen la graduación de Gleason, antígeno prostático específico (PSA - pr state-specific antigen) y etapa tumoral . Aunque estas fórmulas son útiles , no pronostican plenamente la evolución ¡y sobre todo no están asociados de manera confiable con los criterios de evaluación clínicos más significativos de riesgo de enfermedad metastásica y de muerte específica por i PCA. Esta necesidad médica no satisfecha ha alimentiado los esfuerzos para definir las bases genéticas y biológicas de la progresión del PCA teniendo como objetivos la identificación de biomarcadores capaces de asignar el riesgo de progresión y brindar oportunidades para terapias intervencionistas dirigidas. Estudios genéticos del PCA humano han identificado varios eventos distintivos que incluyen la inactivación del supresor tumoral PTEN y la traslocación y desregulación de la familia ETS, así como otras muchas alteraciones genéticas y/o epigenéticas importantes que incluyen Nkx3.1, c- yc y SPINK. Los análisis moleculares globales también han identificado una matriz de recurrencia potencial/biomarcadores de metástasis, como ECAD, AIPC, Pim-1 cinasa, hepsina, AMACR y EZH2. Sin embargo, la intensa heterogeneidad del PCA humano ha limitado la utilidad de biomarcadores solos en el escenario clínico, impulsando así estudios de perfiles transcripcionales más exhaustivos para definir paneles de biomarcadores multigénicos o distintivos. Estos distintivos predictivos parecen ser más robustos; sin embargo, su utilidad clínica ha seguido incierta debido a las interferencias inherentes y a la naturaleza específica del contexto de los sistemas de transcripción y la extrema inestabilidad de los genomas de cáncer con los innumerables eventos genéticos y epigenéticos que producen bastante heterogeneidad en la enfermedad. Estos factores se han conjuntado para impedir la identificación de biomarcadores capaces de asignar con exactitud el riesgo de progresión de la enfermedad.
Por consiguiente, existe la necesidad de modelos más exactos de cáncer humano que se puedan usar junto con conjuntos complejos de datos humanos para identificar biomarcadores robustos que se puedan usar para pronosticar la aparición y comportamiento del cáncer, en particular en una fase precoz .
I RESUMEN DE LA INVENCIÓN \ La presente invención se relaciona en parte con el descubrimiento de que ciertos marcadores biológicos (denominados aquí "DETERMINANTES PC"), como proteínas, ácidos nucleicos, polimorfismos, metabolitos y otros analitos, así como ciertas condiciones y estados fisiológicos, están presentes o alterados en cáncer én fase precoz y le imparten a este neoplasma un mayor riesgo de recurrencia y progresión hacia cáncer metastásico. El cáncer es, por ejemplo, cáncer de próstata o cáncer de mama .
Por lo tanto, en un aspecto, la in†encion proporciona un método con un nivel predeterminado de previsibilidad para evaluar el riesgo de desarrollo de i cáncer metastásico en un individuo. El riesgo de desarrollar cáncer de próstata metastásico se determina i i midiendo el nivel de una DETERMINANTE PC en una muestra i proveniente del individuo. Un riesgo incrementado de i desarrollar cáncer metastásico en un individuo se determina por medición de una alteración clínicamente significativa en el nivel de la DETERMINANTE PC en la muestra.; Como alternativa, un riesgo incrementado de desarrollar | cáncer metastásico en el individuo se determina al comparar el i nivel de la cantidad eficaz de las DETERMINANTE PC ¡ con un valor de referencia. En algunos aspectos el valor de referencia es un índice. ¡ En otro aspecto, la invención proporciona un método con un grado predeterminado de previsibilidad para evaluar la progresión de un tumor en un individuo detectando el nivel de las DETERMINANTES PC en una primera muestra proveniente del individuo en un primer periiodo de tiempo, detectando el nivel de las DETERMINANTES PC j en una I segunda muestra proveniente del individuo en un ¡segundo periodo de tiempo y comparando el nivel de las ! DETERMINANTES PC detectadas contra un valor de refer Iencia. En algunos aspectos, la primera muestra se extrae del i individuo antes de que el tumor se someta a tratamiento y la segunda muestra extrae del individuo después de I que el tumor se somete a tratamiento. ¡ En otro aspecto, la invención proporciona un I método con un grado predeterminado de previsibilidad para I I monitorear la eficacia del tratamiento o para seleccionar un esquema de tratamiento para el cáncer metastásico, i mediante la detección del nivel de las DETERMINANTES PC en una primera muestra proveniente del individuo en un primer periodo de tiempo y opcionalmente, la detección del nivel de una cantidad eficaz de las DETERMINANTES PC en una segunda muestra proveniente del individuo en un segundo periodo de tiempo. El nivel de la cantidad eficaz de las DETERMINANTES PC detectadas en el primer periodo de: tiempo se compara con el nivel detectado en el segundo periodo de tiempo o como alternativa, con un valor de referencia. La eficacia de tratamiento se monitorea por un cambio en el nivel de la cantidad eficaz de las DETERMINANTES PC en el individuo .
Una DETERMINANTE PC incluye, por ejemplo, las 1 a 372 DETERMINANTES PC descritas aquí. Se miden uná, dos, tres, cuatro, cinco, diez o más DETERMINANTES PC. En algunas modalidades, se miden al menos dos DETERMINANTES PC seleccionadas entre las DETERMINANTES PC enlistadas en las Tablas 2, 3, 4, 5, 6 Ó 7. De preferencia, se miden las determinantes PTEN, SMAD4 , ciclina DI y SPPI . Como opción, los métodos de la invención también incluyen la medición de al menos un parámetro estándar asociado con un tumor. Un parámetro estándar es, por ejemplo, la puntuación de Gleason.
El nivel de una DETERMINANTE PC se mi'de por métodos electroforáticos o inmunoquímicos . Por ejemplo, el nivel de la DETERMINANTE PC se detecta por radioinmunoanálisis, inmunofluorescencia o por el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas. Como opción, la DETERMINANTE PC se detecta por medio de tecnología no invasiva de generación de imágenes. j El individuo tiene un tumor primario, uri tumor recurrente o un tumor metastásico. En algunos aspectos, la muestra se extrae de un individuo cuyo tumor ya ¡ se ha tratado previamente. Como alternativa, la muestra se extrae de un individuo antes de que el tumor s,e haya sometido a tratamiento. La muestra es una biopsia tümoral, por ejemplo, una biopsia con aguja gruesa, una biopsia de tejido por escisión o una biopsia de tejido por incisión.
La muestra es sangre o una célula tumoral circulante en un fluido biológico. ¡ También está incluido en la invención un ¡perfil de expresión de referencia de cáncer de próstata metastásico que contiene un patrón de niveles marcadores de ! una cantidad eficaz de dos o más marcadores seleccionados entre las DETERMINANTES PC 1 a 372. De preferencia, el perfil contiene un patrón de niveles de marcadores \ de las DETERMINANTES PC enlistadas en las tablas 1A, IB, 2¡ 3, 4, 5, 6 ó 7. También se incluye un medio automático de lectura que contiene uno o más perfiles de expresión de referencia de tumor metastático y opcionalmente resultados de análisis adicionales e información del individuo. En otro aspecto, la invención proporciona un estuche que comprende una pluralidad de reactivos de detección ;de las DETERMINANTES PC que detectan las DETERMINANTES PC correspondientes. Por ejemplo, el estuche incluye los reactivos de detección de PTEN, SMAD4 , ciclina DI y SPP1. El reactivo de detección consiste, por ejemplo, en anticuerpos o fragmentos de los mismos, oligonucleótidos o aptámeros .
En otro aspecto, la invención proporciona un panel de las DETERMINANTES PC que contiene una o más DETERMINANTES PC indicativas de una vía fisiológica o bioquímica asociada con metástasis o con la evolución de un tumor. La vía fisiológica o bioquímica incluye, por ejemplo, las vías de señalización P13K, RAC-RHO, FAK y RAS.
En otro aspecto más, la invención proporciona un método para identificar un biomarcador que es pronóstico de una enfermedad, mediante la identificación de uno 1 o más genes que se expresan de manera diferencial en la enfermedad comparados con un control y así producir una lista de genes seleccionados como objetivo o genes diana; e identificar uno o más genes de la lista seleccionada que estén asociados con un aspecto funcional del avance de la enfermedad. El aspecto funcional es, por ejemplo, migración celular, angiogénesis, colonización distal, degradación de la matriz extracelular o resistencia a anoikis. Como opción, el método incluye identificar uno o más genes en la lista de genes seleccionados como objetivo o diana, que incluyan un cambio evolutivamente conservado para producir una segunda lista de genes diana. La enfermedad es, por ejemplo, cáncer, como el cáncer invasivo o metastásico.
Los compuestos que modulan la actividad o expresión de una DETERMINANTE PC se identifican obteniendo una célula que expresa la DETERMINANTE PC, poniendo la célula en contacto (por ejemplo, in vivo, ex vivo o in vitro) con una composición que contenga un compuesto candidato; y determinando si el sustrato altera la expresión de actividad de la DETERMINANTE PC. 'Si la alteración observada en presencia del compuesto i no se observa cuando la célula entra en contacto con una composición carente del compuesto, el compuesto identificado modula la actividad o expresión de una DETERMINANTE PC.
En un individuo el cáncer se : trata administrándole un compuesto que modula la actividad o expresión de una DETERMINANTE PC o administrándole un agente que modula la actividad o expresión de un compuesto que es modulado por una DETERMINANTE PC.
El cáncer se trata eligiendo un individuo cuyas células cancerosas tengan una alteración clínicamente significativa en el nivel de las dos o más DETERMINANTES PC 1 a 372 y tratándolo con una terapia complementaria además de la cirugía o la radiación. La alteración en el nivel de las DETERMINANTES PC indica un aumento en el riesgo de recurrencia del cáncer o de desarrollo de cáncer metastásico en el individuo. De manera adicional, el cáncer de próstata se trata en un individuo que lo necesite, obteniendo información sobre los niveles de expresión de PTEN, SMAD4 , CICLINA DI y SPP1 en una muestra de tejido de cáncer prostático del individuo; y administrando un inhibidor de SPP1, un inhibidor de CD44 o los dos. El individuo es aquel que se identifica con riesgo de recurrencia de cáncer de próstata o de desarrollo de cáncer metastásico con base en los niveles de expresión de PTEN, SMAD4, CICLINA DI y SPP1.
En un aspecto, la invención proporciona un método para seleccionar un paciente portador de un tumor j y que necesita un tratamiento complementario, mediante la evaluación del riesgo de metástasis en el paciente por medición de una cantidad eficaz de las DETERMINANTES ¡PC, en donde la alteración clínicamente significativa de dos o más DETERMINANTES PC en una muestra de tumor proveniente del paciente, indica que el paciente necesita un tratamiento complementario. Por ejemplo, los métodos descritos aquí, son útiles para determinar si un individuo en particular es adecuado para una prueba clínica.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para fundamentar una decisión de tratamiento respecto a un paciente con tumor, al obtener información sobre una cantidad eficaz de las DETERMINANTES PC jen una muestra del tumor de un paciente y seleccionar un régimen de tratamiento que previene o reduce la metástasis del tumor en el paciente si dos o más DETERMINANTES PC están alteradas de manera clínicamente significativa. | En varias modalidades, la evaluación y/o monitoreo se logra con un nivel predeterminado de previsibilidad. Por nivel predeterminado de previsibilidad, se entiende que el método proporciona un nivel aceptable de exactitud de diagnóstico o exactitud clínica. La exactitud de diagnóstico o clínica se determina por métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, con los métodos descritos en la presente.
La invención también proporciona un ; ratón transgénico con doble inactivación génica (knockout)' , cuyo genoma contiene una modificación génica que permite el rompimiento homocigótico del gen Pten endógeno y del gen Smad4 en el epitelio prostático. El experto en la técnica reconocería que este rompimiento se puede lograr escisión mediada por recombinasa de los genes Pten o Smad con el sitio LoxP incorporado (es decir, la cepa actual) o por ejemplo, knock-in mutacional y la extinción de estos genes mediada por AR i ya sea en una configuración de línea germinal o en transduccion somática del epitelio prostático in situ o en cultivo celular seguido de la reintroducción de estas células primarias en la cápsula renal ' o por trasplante ortotópico. También resultan obvias,, otras estrategias de manipulación genética que incluyen la formación de quimeras mediante el uso de clones ES dirigidos que eviten la transmisión de la línea germinal. El ratón transgénico muestra mayor susceptibilidad para la formación de tumores prostáticos en comparación con un ratón tipo silvestre. El ratón también exhibe una mayor susceptibilidad para la formación de cáncer de próstata metastásico en comparación con un ratón transgénico que sólo tiene el gen Pten inactivado. También se incluyen las células provenientes del ratón. De preferencia, las células son células epiteliales como las células epiteliales de próstata, células epiteliales de¦ mama, células epiteliales de pulmón o células epiteliales de colon. ; A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente, tienen el mismo significado que para una persona con experiencia ordinaria en la técnica a la que pertenece la invención. Aunque en la práctica de la presente invención se puedan utilizar métodos y materiales similares o equivalentes a los aquí descritos, se describen los métodos y materiales adecuados. Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes y otras referencias mencionadas aquí, se consideran, en su totalidad, parte de la presente como referencia. En caso de conflicto, la presente solicitud, incluidas las definiciones, fungirá como control. Por otra parte, los materiales, métodos y ejemplos descritos aquí sólo son ilustrativos y no tienen fines limitativos.
Otras particularidades y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y de las reivindicaciones, las cuales ¡quedan comprendidas en éstas. I BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS | Las Figuras 1A-1F demuestran que la pérdida del gen Pten en próstata aumentó el nivel de expresión: de p-Smad2/Smad3 y Smad4. Figura 1A) Los resultados del programa Ingenuity Pathway Analysis en genes que se expresan de manera diferencial entre ratones Pten'0"''" (grupos de sondas 3331, en azul) se compararon con 10 grupos de genes extraídos al azar de igual tamaño. Figura IB) El análisis por transferencia Western de tejido AP de cada genotipo a las 15 semanas, muestra un aumento, en el nivel de pSmad2/3, regulación por incremento de Smad4 e inducción de Idl en ratones Pten*6"'- en comparación con los ratones de control. Figura 1C) Se llevó a cabo el análisis inmunohistoquímico de APs de 15 semanas para Smad4 y se demuestra la regulación por incremento en ratones Ptenpc_/" (panel C) en comparación con los ratones de control (panel a) . Ratones Smadpc"/_ utilizados como control negativo (panel b) . Barras a escala, 50 µp?. Figura ID, Figura 1E) Análisis Oncomine (http://www.oncomine.org) de la expresión de Smad4 entre PCA y metástasis en humanos. Mapa térmico de Smad4 diferencialmente expresado, en Yu et al. conjunto de datos de expresión de próstata Figura ID) . Las gráficas de caja (boxplots) de la expresión de Samd4 entre. PCA y metástasis en humanos en Yu et al. conjunto de datos de expresión de próstata y Dhanasekaran et al. (2001); Yu et al. conjunto de datos de expresión de próstata Figurja 1E) .
Las Figuras 2A a 2C demuestran que la pérdida de Smad4 no inicia tumores prostáticos pero vuelve letales a los carcinomas deficientes en Pten. Figura 2A) Análisis histopatológico (tinción con hematoxilina/eosina) de próstata anterior (AP - anterior prostate) en imitantes simples ? dobles WT, Smad4 y Pten a las 9 semanas de edad revelan glándulas normales en ratones WT y Smadpc , pero lesiones PIN en ratones Ptenpc~/" e invasión (flecha) en ratones Ptenpc_/"; Smadpc"/" . Barras a escala, 50 µ??. 1 Figura 2B) Análisis de supervivencia acumulativa general de Kaplan-Meier . Se encontró una disminución estadísticamente significativa en el periodo de vida (p < 0.0001) en comparación con la cohorte Ptenpc"/_ (n = 28) ara los ratones Ptenpc_ ~; cohorte Smadpc" _ (n = 26) (asterisco). Figura 2C) Anatomía burda (macroscópica) de WT, Smadpc~/~ y próstata anterior Ptenpc_/", Smadpc_/~ o tumor prostático a las 22 semanas de edad. Barras a escala, 0.5 cm. ' Las Figuras 3A a 3E demuestran que la pérdida de Smad4 intensificó la proliferación y evadió la senescencia celular inducida por la pérdida de Pten. Figura j3A) El análisis histopatológico de proliferación de AP de 15 semanas demostró un aumento en la proliferación en algunos focos de invasión (flecha, panel e) en mutantes ¡dobles Ptenpc" _; Smad1"^" (panel j). El análisis Túnel de !los AP de 15 semanas no mostró diferencias significativas en mutantes dobles Ptenp _ "; Smadpc~/~ (panel i, j) y tumores prostéticos (panel h) . H&E, hematoxilina/eosina . Barras a escala, 50 µp?. Figura 3B) la pérdida de Smad4 intensificó la proliferación y evadió la senescencia celular inducida por la pérdida de Pten. Análisis de la tinción ß-Gal del AP de 15 semanas. Barras a escala, 100 pm. Figura 3C) Cuantificación de la etiqueta pulso brdu de AP : de 15 semanas realizado como en Figura 3A, f-j) . Para cada genotipo se contaron secciones representativas de tres ratones. Figura 3D) Cuantificación del ensayo TUNEL para apoptosis en el AP de 15 semanas. Para cada genotipo se contaron secciones representativas de tres ratones. Figura 3E) Cuantificación de la tinción ß-Gal observada en las secciones del AP a las 15 semanas realizado como en; Figura 3B) . Para cada genotipo se contaron secciones representativas de tres ratones. Las barras de error en 3C-3E representan la desviación estándar para un experimento representativo realizado por triplicado. El asterisco indica significancia estadística entre los mutantes dobles Ptenpc_ "; Smad150"7" y Ptei?0' ' (P<0.05).
Las Figuras 4 demuestran que la pérdida dé Smad4 da lugar a que los carcinomas deficientes en Pten progresen I a metástasis a ganglios linfáticos y pulmón con penetración completa. Figura 4A) Curva de supervivencia libre de metástasis (gráfica de Kaplan-Meier) de cáncer de próstata. Los focos de metástasis en los ganglios linfáticos lumbares y/o pulmones se encontraron sólo en la cohorte Pten5'0"'" Smad130"^ de 16 a 32 semanas de edad. En comparación : con la cohorte Ptenpc"/" (n = 25) se encontró significancia estadística (P<0.0001) para la cohorte Ptenpc" " ; Smad^" " (n = 25) (asterisco) con penetración completa de metástasis.
Figura 4B) Anatomía burda de ganglios linfáticos lumbares (círculo punteado) y pulmón con focos de metástasis (flechas oscuras. Barras a escala, 0.5 cm. Figura 4C) H&E secciones teñidas muestran células de cáncer de próstata metastásico en ganglios linfáticos (flechas oscuras) y pulmón. El análisis inmunohistoquímico muestra que las células metastásicas en ganglios linfáticos y pulmón con CK8 positivas y AR positivas (marcadores epiteliales prostáticos) . Barras a escala, 50 µ??. Mets, metástasis; LN (ganglio linfático - lymph node) .
La Figura 5 demuestra que las 284 DETERMINANTES PC de la Tabla 1A pronostican la agresividad y metástasis del cáncer de próstata humano. En este experimento particular, las 284 DETERMINANTES PC enlistadas en lá Tabla 1A se derivaron de una comparación de 3 muestras de tumor provenientes de Pten y 3 muestras de tumor provenientes de Pten Smad4. Las 284 DETERMINANTES PC de la Tabla, 1A se evaluaron respecto a la utilidad pronostica a partir del conjunto de datos de expresión génica de cáncer de próstata j según Glinsky et al. (2004). La recurrencia bioquímica (BCR - jbioc.he.nical recurrence) se definió en función de los niveles de PSA (>0.2 ng/ml) . Las muestras del paciente se clasificaron en dos grupos principales (grupos de alto riesgo y de bajo riesgo) definidas por las 284 DETERMINANTES PC enlistadas en la Tabla 1A. : Las Figuras 6 ilustran que los genes de movimiento celular se expresan diferencialmente en los tumores prostáticos Smad4/Pten metastáticos en compáración con los tumores Pten inactivos. El análisis cion el programa Ingenuity Pathway Analysis (IPA) de las funciones moleculares de genes expresados diferencialmente revelaron que los genes del movimiento celular calificaron en el # 18 contra el # 1 para los tumores prostáticos Smad4/Pten metastáticos cuando cada uno se comparó con los tumores Pten. Figura 6A) El programa IPA para las funciones moleculares de genes expresados diferencialmente, entre los ratones mutantes dobles , revelaron que esos genes desempeñan funciones en el movimiento celular, muerte celular, crecimiento y proliferación celular, señalización célula a célula y desarrollo celular e interacción, morfología celular,; ciclo celular, señalización celular, modificación postraduccional , metabolismo de lípidos, bioquímica de molécula pequeña, metabolismo de medicamentos, metabolismo de vitaminas y minerales, función y mantenimiento celular, transporte molecular, expresión génica, replicación y reparación de ADN. Genes de movimiento celular calificados como #1. Figura 6B) El análisis con el programa IPA para las funciones moleculares de genes expresados diferencialmente , entre los ratones mutantes dobles PterP0'^' ; p53pc~J~ y P erf0'^ , revelaron que esos genes desempeñan funciones en la muerte celular, expresión génica, crecimiento y proliferación celular, desarrollo celular, metabolismo de aminoácidos, modificación pos raduceiona1 , bioquímica de la molécula pequeña, función y mantenimiento celular, morfología celular, ensamble y organización celular, ciclo celular, señalización e interacción célula a célula, metabolismo de medicamentos, metabolismo de lípidos, transporte molecular, compromiso celular, presentación de antígenos, movimiento celular, metabolismo de carbohidratos, daño y reparación de ARN, replicación y reparación de ADN, metabolismo de ácido nucleico, señalización celular, síntesis de proteínas. En contraste con los tumores PterPc' ; Smad4pc" " , el análisis IPA ¡de los tumores Pter¡pc~'~ ; p53pc~/~ mostraron que los genes de movimiento celular se califican con el # 18.
Las Figuras 7 ilustran el perfil génicó y el análisis de promotores revela un subgrupo de 66 presuntos genes diana de Smad4 expresados diferencialmente ¡ entre ratones Ptenpc_ " y doble mutantes Ptenpc_ ~; Smadpc_/" . Figura 7A) 66 genes expresados diferencialmente entre ratones Ptenpc_/" y doble mutantes Pten^" "; Smadpc_/" . Figura 7B) El análisis Ingenuity Pathway Analysis de funciones i moleculares reveló que estos 66 genes desempeñan funciones en el movimiento celular, cáncer, crecimiento y proliferación celular y muerte celular. ! Las Figuras 8 ilustran 17 distintivos de genes diana de Smad que pueden pronosticar la agresividad y la metástasis del cáncer. Figura 8A) Representación en diagrama del desarrollo de 17 distintivos de genes diana de Smad. El análisis por computadora reveló que hay 66 presuntos genes diana de Smad entre los 284 expresados diferencialmente entre los ratones doble mutantes Pten130"^; Smadpc-/" y los Ptenpc_/" . Se desarrollo un distintivo de 17 genes con base en el traslape con un conjunto de datos de PCA metastásico humano. Figura 8B) 17 genes expresados diferencialmente entre ratones doble mutantes Ptenpc~/_; Smadpc_ " y los Ptenpc" _ . Figura 8C) Los 17 presuntos genes diana de Smad se evaluaron después respecto a su utilidad pronostica sobre un conjunto de datos de expresión : génica de cáncer de próstata. Se presenta el agrupamiento jerárquico de las muestras del tumor (columnas) y los genes (filas) . El color rojo indica niveles relativamente altos i de expresión génica mientras que el color verde representa niveles relativamente bajos de expresión génica. Las barras horizontales en la parte superior de los ; mapas térmicos indican el estado de recurrencia en cada paciente (1, recurrencia bioquímica o tumoral ; 0 sin recurrencia) . Los pacientes se clasificaron en dos agrupamientos principales definidos por 17 distintivos génicos . La metástasis a nodos linfáticos y otras metástasis distales se indican por la flecha de color rojo. Figura 8D) Análisis de supervivencia de Kaplan-Meier con base en los grupos definidos por el agrupamiento de 17 genes. Figura 8E, Figura 8F) Igual que Figura 8C, los 17 : genes distintivos se evaluaron frente a un conjunto de datos de adenocarcinoma de mama. Se realizó análisis de Kaplan-Meier respecto a la probabilidad de supervivencia (Figura 8E) y la supervivencia libre de metástasis (Figura 8F) con base en los grupos definidos por el agrupamiento ' de 17 genes . ¡ Las Figuras 9 ilustran que la pérdida de Smad4 no inicia tumores de próstata de hasta 2 años de edad. El análisis histopatológico (tinción hematoxilina/eosina) de próstatas anteriores (AP) en mutantes simples Smad4 de un año (Figura 9A) y dos años de edad (Figura 9B) , revelaron glándulas normales en ratones Smad1'0"''" . Barras a escala, 50 Las Figuras 10 muestran el análisis histopatológico de hidronefrosis representativa en ratones Ptenpc_/"; Smad150"7". Figura 10A) Anatomía burda de ? ???_ "; Smad0"/" representativa con tumor de próstata a las 26 semanas de edad con un enorme tumor prostático (círculo punteado) . Barras a escala, 2 cm. Figuras 10B; 10C) Análisis histopatológico de riñon representativo de ratones Ptenpc~/_ Figura 10B) y ratones Ptenpc" ,· Smadpc~7~ con hidronefrosis (flecha) Figura 10C) . Teñidos con hematoxilina y eosina (H&E - hematoxylin & eosin) . i Barras a escala, 1 mm.
Las Figuras 11 muestran el análisis de micromatrices de un subgrupo de 282 (véase la Tabla 1A) genes relacionados con la biología del cáncer expresados diferencialmente entre ratones doble imitantes Ptenpc~/_ ; Smadpc- " y los Ptenpc_/~ . Figura 11A) 284 genes expresados I diferencialmente entre ratones Ptenpc y doble mútantes Ptenpc" _; Smadpc_/~. Figura 11B) El programa Ingenuity Pathway Analysis (IPA) para funciones moleculares ¡revela que estos 284 genes desempeñan funciones en el movimiento celular, cáncer, crecimiento y proliferación celular y muerte celular.
Figura 12A) Los 66 presuntos genes diana de Smad i se evaluaron después respecto a su utilidad pronostica en un conjunto de datos de expresión génica de cáncer de próstata. Se presenta el agrupamiento jerárquico de las muestras de tumor (columnas) y de genes (filas) . El color rojo indica niveles relativamente altos de expresión ¡génica mientras que el color verde representa niveles relativamente bajos de expresión génica. Las 'barras horizontales en la parte superior de los mapas térmicos indican el estado de recurrencia en cada paciente (1, recurrencia bioquímica o tumoral; 0 sin recurrencia) . Los pacientes se clasificaron en dos agrupamientos principales definidos por 66 distintivos génicos . La metástasis a nodos linfáticos y otras metástasis distales se indican por la flecha de color rojo. Figura 12B) Análisis de supervivencia de Kaplan-Meier con base en los grupos definidos por el agrupamxento de 66 genes.
Las Figuras 13 muestran que la pérdida de Smad4 puede evadir la senescencia provocada por la pérdida de Pten en fibroblastos embrionarios de ratón primarios ¡ (MEF -mouse embryonic fibroblast) a través de un sistema dependiente de p53. Figura 13A) Tinción de senescencia de MEF de WT (panel a) , Smad_/" (panel b) , Pten"''" (panel c) y Pten_ "; Smad_ " (panel d) . Secciones representativas de tres MEF independientes de cada genotipo. Figura 13B) Cuantificación de la tinción ß-Gal. Las barras de error representan la desviación estándar para un experimento representativo realizado por triplicado. El asterisco indica significancia estadística entre los mutantes ; dobles Ptenpc_ "; Smadpc_/~ y los Ptenpc_/~ (P<0.05) . Figura 13C) El análisis por transferencia Western de los MEF de cada genotipo muestra el nivel de expresión de p53 para un experimento representativo realizado por duplicado (de más de cuatro ratones por genotipo) . La actina se usó como control de carga interno.
Las Figuras 14 muestran células epiteliales de próstata de ratones doble mutantes Ptenpc~/~; Smadpc" " provenientes de tumores metastáticos ortotópicos con marcadores celulares epiteliales de próstata en ratones lampiños . Figura 14A) Inyección ortotópica de células epiteliales de próstata de doble mutantes Pten90'^ ; Smadpc~ " de tumor en próstata (círculo punteado) y de metástasis pulmonar (flechas) . Barras a escala, 1 cm. Figura Í4B) El análisis inmunohistoquímico muestra que los tumores ortotópicos y la metástasis pulmonar son CK8 positivos y #AR positivos (marcadores epiteliales prostáticos) . ¡Barras a escala, 50 µp?. i Las Figuras 15 muestran células epiteliales de próstata de tumores metastáticos ortotópicos de la forma doble mutante Ptenpc"/_; Smadpc_/", con marcadores celulares epiteliales de próstata en ratones lampiños. Figura 15A) implantación de riñon de células epiteliales de próstata de tumor de la forma doble mutante Ptenpc_/"; Sm d^"^" en próstata (círculo punteado) y de metástasis en ¡pulmón (flechas) . Barras a escala, 1 cm. Figura 15B) El análisis inmunohistoquímico muestra que los tumores renales1 y la metástasis en pulmón con CK8 positivos y #AR positivos (marcadores epiteliales prostáticos) . Barras a escala, 50 pm . ! La Figura 16 muestra que el reestablecimiento de Smad4 en células tumorales de próstata doblemente carentes de Pten-Smad4, disminuye la viabilidad celular cuando se tratan con TGF 1. Figura 16A) El reestablecimiento de Smad4 en células cancerosas de próstata deficientes en Smad4 , disminuye la viabilidad celular al tratarse con TGFpi. Células progenitoras de control (Contl) y Smád4-Tet en células (Smad4) se trataron con 0.016 ng/mL, 0.031 ng/mL, 0.063 ng/mL, 0.125 ng/mL, 0.25 ng/mL, 0.5 ng/mL de TGF l en presencia o ausencia de 1 pg/mL de doxiciclina (Dox) en un medio que contiene 5% de suero fetal de ! ovino (FBS - fetal bovine serum) tratado con carbón vegetal y la viabilidad celular se analizó por cuantificación de adenosina trifosfato. Las barras de error representan la desviación estándar (s.d.) para un experimento representativo realizado por triplicado. Barras negras, línea progenitora de control sin Dox; barras azules, línea progenitora de control con Dox; barras rojas, Smad4 Tet en i línea sin Dox barras verdes, Smad4-Tet en línea con Dox.
Figura 16B) El análisis por transferencia Western de la i expresión de Smad4 durante el tratamiento con Dox muestra la expresión de Smad4 Tet en línea, con tratamiento1 Dox o sin tratamiento Dox. Como control de carga interno ,se usó Ran. Figura 16C) Morfología de células con ¡o sin tratamiento ???ß?. Se tomaron fotografías de las células después de 4 días de tratamiento con ts?ß? o vehículo.
? Las Figuras 17 muestran que la pérdida de Smad4 evadió la autofagia inducida por la pérdida de Pten. Figura 17A) Morfología de células con o sin tratamiento TGFpi. Se tomaron fotografías de las células después de 4 días de tratamiento con TGF i o vehículo. Figura 17B) Microscopía electrónica de transmisión de células tumorales de próstata de ratones doble mutantes Pten50"^; Smadpc"/" y de ratones Ptenpc_/~ a las 15 semanas de edad.
Las Figuras 18 demuestran que los ratones Pten/Smad4 doble mutantes con ablación hormonal vía castración desarrollaron PCA metastásico resistentes a hormonas. Figura 18A) Análisis de supervivencia acumulativa general de Kaplan-Meier en animales castrados. Se observó un aumento estadísticamente significativo en el periodo de vida (P<0.0001) de la cohorte Ptenpc~/~; Smad^"'" castrada (n= 25) (asterisco) en comparación con la cohorte Ptenpc_ "; Smadp " " sin castración (n= 20). La flecha! indica la castración a las 15 semanas de edad. Figura Í8B) La castración no bloqueó la metástasis del cáncer de próstata en doble mutantes Pten150^"; Smadpc_ " . A la derecha se muestra una fotografía más amplificada (región enmarcada) (panel b) . Análisis histopatológico de metástasis de ganglios linfáticos representativos. Barras a escaía, 200 pm para el panel a y 50 pm para el panel b. Figura 18C) Los análisis histopatológico y de proliferación revelaron elevada proliferación (tinción de color café) en doble mutantes Ptenpc_/"; Smadpc-/" castrados en comparación con los ratones WT y Ptenpc_/" castrados. Tinción con H&E, hematoxilina/eosina . Barras a escala, 50 µ?t?. El análisis se realizó en ratones de 23 semanas de edad que se castraron a las 15 semanas de edad. Figura 18D) Cuantificación de la etiqueta pulso brdu en ratones de 23 semanas, castrados a las 15 semanas de edad. Para cada genotipo se contaron secciones representativas de tres ratones. El asterisco indica significancia estadística entre doble mutantes Ptenpc_/"; Smadpc_/~ y los ratones Ptenpc" /_ (P<0.05) . I La Figura 19 ilustra el modelo de cooperación entre Pten y Smad4 para controlar el inicio y la progresión del cáncer de próstata. La pérdida de Pten en la próstata da como resultado el desarrollo de tumor prostático, pero la progresión posterior se suprimió por el bloqueo proliferativo/senescencia inducidos por la pérdida de Pten. Tanto la pérdida de Pten como de Smad4 evade el ¿loqueo proliferativo/senescencia inducidos por la pérdida de Pten y posiblemente de otros mecanismos de supresión celular e intracelular como los que impiden el movimiento celular a través de las DETERMINANTES PC 1 a 372 o un subgrupo ¡de las DETERMINANTES PC 1 a 372, y a la larga lleva a las células tumorales de próstata a progresar a metástasis.
Las Figuras 20 demuestran que los j genes expresados diferencialmente , triangulados en especies cruzadas entre ratones doble mutantes Ptenpc"/_; Smadé ^^ y ratones Pten9 '^ están relacionados con resultados clínicos en PCA humano. Figura 20A) Representación en diagrama del desarrollo de un grupo de 56 genes con base en el traslape de genes expresados diferencialmente entre ratones doble mutantes Ptenvc~'~ ; Smad4pc"/_ y ratones Ptenpc_ ~ (Tabla IB) con un conjunto de datos de PCA metastásico humano19. Figura 20B) El conjunto de 56 genes (Tabla 7) se evaluó después respecto a su utilidad pronostica en un conjunto de datos de expresión génica de cáncer de próstata.1 Las muestras del paciente se clasificaron en dos grupos principales (grupo de bajo riesgo y de alto riesgo) definidos por el distintivo de 56 genes. Análisis Kaplan- Meier del nivel de PSA de recurrencia bioquímica (BCR) (> 0.2 ng/ml) con base en los grupos definidos ¿or el agrupamiento de 56 genes. Para la cohorte de "alto riesgo" se encontró una supervivencia libre de recurrencia PSA BCR estadísticamente significativa (P = 0.0018) en comparación con la cohorte de "bajo riesgo" . ¡ La Figura 21 ilustra los enfoques ' para identificar DETERMINANTES PC que impulsan o inhiben f ncionalmente la invasión in vitro.
Las Figuras 22 demuestran el uso del ensayo de invasión para validar de manera funcional los genes candidato. Un ensayo de invasión en cámara de : Boyden representativo, con células PC3 que sobreexpresan S P1 y/o GFP de control por triplicado. Figura 22A) La expresión forzada de SPP1 confirmó, mediante el ensayo de invasión, su capacidad para aumentar en forma significativa la actividad invasiva de las células PC3 de PCA humano. Figura 22B) La gráfica de barras indica significancia estadística entre SPP1 forzada y el control GFP (P 0.05) . Figura 22C) La tabla confirma que el ensayo identifica los genes promotores de invasión que se mencionan como participantes en el movimiento celular pero tambijn los genes no clasificados como participantes en el movimiento inducen propiedades invasivas y metastásicas in vi tro. Una frecuencia significativamente mayor (P = 0.02, prueba exacta de Fisher) de las DETERMINANTES PC validadas para invasión son anotadas como genes de movimiento celular en comparación con aquellas que no son de genes anotados de movimiento celular.
Las Figuras 23 muestran que un distintivo de CUATRO (4) genes DETERMINANTES PC PTEN-SMAD4 -Ciclina Dl-SPP1 el cual estuvo respaldado por los datos del transcriptoma Pten/Smad4, los datos histopatológicos, y los datos de validación de invasión, está relacionado con resultados clínicos en PCA humano. Figura 23A) La expresión desregulada de Pten y Smad4 junto con ciclina DI (proliferación/senescencia) y SPP1 (sistema de motilidad) demostró después, en un conjunto de datos de expresión génica de cáncer de próstata, que está correlacionada con la progresión del cáncer de próstata humano. Las muestras del paciente se clasificaron en dos grupos principales por K-media (grupos de alto riesgo y bajo riesgo) definidos por el distintivo PTEN, SMAD4 , ciclina DI y SPP1. \ Los pacientes del grupo de alto riesgo mostraron un nivel de PSA de recurrencia bioquímica (BCR) estadísticamente significativo (>0.2 ng/ml) por análisis Kaplan-rMeier . Figura 23B) La correlación significativa de los distintivos PTEN, SMAD4 , ciclina DI y SPP1 en la progresión del PCA se validó en un conjunto de datos del estudio Physicians' Health Study (PHS) con estadística c. El distintivo PTEN, SMAD4 , ciclina DI y SPP1 mostraron potencia similar! en la puntuación Gleason en cuanto al pronóstico de resultados letales. La adición de los genes PTEN, SMAD , ciclina DI y SPP1 a la evaluación Gleason mejoró significativamente el pronóstico de resultados letales con respecto al modelo Gleason solo en PHS. Por otra parte, el. conjunto dé los 4 genes PTEN, SMAD4 , ciclina DI y SPP1 calificó como ¡el más enriquecido entre los 244 distintivos bidireccionales curados en la base de datos Molecular Signature Daüabases del Broad Institute (MSigDB, versión 2.5) , indicando la robusta significancia de este distintivo de 4 genes en el pronóstico de resultados letales. i La Figura 24 demuestra que los genes expresados diferencialmente , triangulados en especies cruzadas entre ratones doble mutantes Ptenpc~/~; Sraad4pc"/_ y ratones Pfcenpc~/~ están relacionados con el resultado clínico en cáricer de mama humano. Figura 24A) El conjunto de 56 genes (Tabla 7) se evaluó después respecto a su utilidad pronostica' en un conjunto de datos de adenocarcinoma de mama. Las muestras de los pacientes se clasificaron en dos grupos principales (grupo de bajo riesgo y grupo de alto riesgo) definidos por el distintivo de 56 genes. El análisis Kaplan-Meier se llevó a cabo para determinar la probabilidad de supervivencia (p = 0.00358) Figura 24A) y la supervivencia libre de metástasis (p = 00492) Figura 24B) con base |en los grupos definidos por el agrupamiento de 56 genes.
Las Figuras 25 demuestran que las DETERMINANTES PC correlacionadas con la progresión del cáncer de próstata y el cáncer de mama están muy relacionadas con el resultado clínico en el cáncer de mama humano. Figura 25A) Las 20 DETERMINANTES PC que exhiben expresión correlacionada con progresión tanto en cáncer de próstata como en cáncer de mama (Tabla 6) , se evaluaron respecto a su utilidad pronostica en un conjunto de datos de adenocarcinoma de mama. Las muestras de los pacientes se clasificaron >en dos grupos principales (grupo de bajo riesgo y grupo de alto riesgo) definidos por el distintivo de 20 genes correlacionados con la progresión. El análisis Kaplan-Meier se realizó para determinar la probabilidad de supervivencia (p = 2.93e"i:L) Figura 25A) y supervivencia libre de metástasis (p = 4.62e"10) Figura 25B) con base en los grupos definidos por las 20 DETERMINANTES PC.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con la identificación de distintivos asociados con DETERMINANTES PC y también se relaciona con estas DETERMINANTES PC que conferidas en los individuos con cáncer de próstata metastásico o en los que están en riesgo de desarrollar cáncer de próstata metastásico. La invención también proporciona un modelo de ratón murino para cáncer de i próstata invasivo o metastásico, en donde el epitelio de próstata de ratón soporta la deleción u otro medio de extinción mutacional o epigenética de una lesión que inicia, como el gen Pten y Smad4. El experto en la técnica puede identificar que otra lesión que inicia, incluida la sobreexpresion de transgenes oncogenes se podría acoplar a la deleción de Smad4 y permitir la progresión del; tumor maligno. Este modelo de ratón se puede usar para identificar biomarcadores de detección de cáncer.
El cáncer humano aloja innumerables alteraciones genéticas y epigenéticas que presentan enormes retos para descifrar los cambios que conducen a un proceso maligno y determinan el comportamiento clínico del tumor J Es evidente, la necesidad de contar con biomarcadores que pronostiquen con exactitud el potencial maligno de uñ tumor en todos los tipos de cáncer, en particular, en el cáncer de próstata en el que los algoritmos de tratamiento actuales dan como resultado un tratamiento deficiente con el consecuente riesgo de muerte o la exposición a tratamientos mórbidos innecesarios.
Se ha demostrado que los modelos de , ratón manipulado genéticamente son muy potentes como "filtros" para extraer conjuntos de datos genómicos de alta complejidad en humanos. En particular, estos modelos de ratón genéticamente manipulados de cáncer humano han sido documentados en análisis oncogenómicos comparativos de alta resolución para mantener una superposición considerable en patrones de alteraciones de ADN cromosómico y transcripcional asociadas con cáncer, que finalmente dan como resultado una rápida y eficiente identificación de muchos nuevos genes de cáncer. Comparaciones similares de especies cruzadas del proteoma sérico también han demostrado eficacia en la identificación de biomarcadores de detección precoz para el cáncer de páncreas en humanos.
De este modo, es lógico fundamentar que el desarrollo de un modelo de ratón válido que recapitule el estado de metástasis de la enfermedad impulsado por genes de \ cáncer de próstata humano, de buena fe, facilitará mucho nuestros esfuerzos para desarrollar el biomarcadores de pronóstico y de detección precoz y posibles objetivos terapéuticos.
Los análisis de transcriptoma generales de lesiones PIN de próstata deficiente en Pten inactivas infirieron la presencia de un punto de comprobación i dependiente de Smad4 que induce la respuesta de senescencia en escenarios de inactivación de Pten, que bloquea la progresión de más allá de PIN. La deleción concomitante de Smad4 en el epitelio de la próstata de ratón junto con la deleción de Pten, en efecto, genera un modelo de próstata metastático fulminante de corta latencia, proporcionando una comprobación genética inequívoca de esta hipótesis. El hecho de que se trate de un modelo de ratón de cáncer de próstata metastásico impulsado por supresores de tumor de próstata, de buena fe, está sustentado por la demostración de una consistente regulación por disminución de( Smad4 durante la progresión de PCA primario a metastásico en humanos. La validez de este modelo se reforzó más por la demostración de que los 17 genes diana directos de¡ Smad4 pronosticados, conservados a través de dos especies son capaces de estratificar adenocarcinomas humanos de próstata y mama en dos grupos con diferencias significativas en el resultado según se determina mediante recurrencia o supervivencia. Por lo tanto, los inventores han establecido un modelo de ratón genéticamente manipulado, confiable, de PCA metastásico, que permite futuros estudios mecanísticos así como análisis genómicos y proteómicos comparativos en la búsqueda de biomarcadores de detección precoz o biomarcadores predictivos o de utilidad pronostica.
Se ha establecido que la pérdida de Pten 'es uno de los eventos genéticos más significativos en la carcinogénesis de próstata. La pérdida de Pten da como resultado tumorigénesis prostática en la próstata de ¡ratón,-sin embargo, esto también provoca senescencia celular que puede actuar como otro nivel supresor del tumor para bloquear la progresión de las células tumorales a una etapa invasiva. Dominar o ejercer control sobre la senescencia inducida por Pten a través de la inactivación de p53 contribuye a la progresión de tumores prostáticos de una i lesión poco activa a un tumor invasivo. Los inventores han descubierto que la pérdida de Smad4 también puede evadir la senescencia celular producida por la pérdida de Pten. Sobrepasar la senescencia por la pérdida de Smad4 coopera con la pérdida de Pten y puede contribuir a su función en la estimulación de células tumorales. Esto es congruente con el reporte previo de que la anulación de la senescencia por la pérdida de p53 coopera con la pérdida de Pten y contribuye a la progresión del tumor prostático ; a una lesión moderadamente invasiva pero no metastásica. Por lo tanto, este excepcional sistema de modelos Pten/Smad4 ofrece una herramienta para examinar detenidamente los eventos moleculares con relación a este importante proceso biológico tumoral a futuro.
Aunque la anulación de la senescencia da como resultado la progresión de las células tumorales de próstata de ratón doble mutante Pten/Smad4 hacia un estado invasivo y metastático, la anulación de la senescencia en un modelo de ratón con inactivación de Pten/p53 no da como resultado la metástasis. La sola inactivación de Pten en próstata de ratón puede generar algún fenotipo de i metástasis débil a una edad muy avanzada (más de un año) en una pequeña porción de los ratones Pten (2 de 8) . Estas observaciones indican que se necesitan alteraciones genéticas o epigenéticas adicionales además de la pérdida de Pten para que las células tumorales de próstata lleguen a un estado metastásico. La evasión de la senescencia celular puede ser un prerrequisito para la progresión pero probablemente se necesitan otros procesos biológicois como la desactivación de la autofagia para lograr un estado metastásico robusto. Como refuerzo respecto a la presencia de otros procesos biológicos, observamos que la reconstitución de Smad4 en células tumorales deficientes en Pten/Smad no reestablecen la senescencia pero hace a las células no metastásicas . Específicamente, establecimos un sistema Smad4tet-on inducible para reestablecer la expresión de Smad4 en función del tiempo y de la dosis. Se encontró que el reestablecimiento de Smad4 puede sensibilizar el tumor a la muerte celular como respuesta al tratamiento con ?T?ß .
El sistema clásico de TGFp-Smad comienza partir del complejo ligando-receptor y termina en el núcleo. Al unirse el ligando de la superfamilia TGF , el complejo receptor-R-Smad fosforilado se oligomeriza con el Smad4 y cambia de ubicación ( translocation) al núcleo y se une directamente a los elementos de unión a Smad en el ADN en donde puede inducir o reprimir diversas configuraciones de los genes. En el epitelio prostático benigno, al provocar diferenciación, inhibir proliferación e inducir apoptosis, el TGFfi proporciona un mecanismo para mantener la homeostasis en la próstata. De este modo, se especuló que esta rama principal del TGF desempeña una función crítica en la supresión de la progresión del tumor en próstata. La función supresora tumoral de la señalización de IGF se acentúa por la presencia de mutaciones que inactivan el receptor de TGF y la extinción de las proteínas ¡Smad2, Smad3 y Sraad4 en varios tipos de cáncer incluido el ; cáncer de próstata. Aunque se observó que el TGFp inhibe muchos tipos de células normales y el crecimiento de células tumorales, también está reportado que el TGFp intensifica el potencial maligno de tumores epiteliales, como proliferación, migración y la transición de epitelio a mesénquima de (EMT) -a, proceso por el cual los carcinomas avanzados adquieren un fenotipo indiferenci do y metastásico sumamente invasivo. Recientemente, j se ha demostrado que el TGF en el microentorno de un tumor de mama puede cebar células cancerosas para metástasis hacia el pulmón por inducción de 4 (ANGPTL4) análogo a angiopoyetina por TGF a través del sistema de señalización de Smad. Estas actividades paradójicas de supresión y estimulación tumoral probablemente dependen de las actividades de otras vías de señalización en células ; dadas , que son determinadas por los diferentes contextos celulares así como la interacción con otro tejido. El modelo Pten/Smad4 ha clarificado ahora la función del sistema TGFp en el cáncer de próstata al demostrar con claridad que la sola pérdida de Smad4 no es suficiente para iniciar el desarrollo de la lesión prostática, pero promueve la aceleración y progresión del tumor prostático j hacia metástasis con penetración completa al menos en el entorno de deficiencia de Pten (Figuras 3A-3E) . El estudio del modelo Pten/Smad4 demostró con claridad que la pérdida de Smad4 puede dominar o ejercer control sobre la senescencia inducida por la pérdida de Pten. De aquí que dominar la senescencia por la pérdida de p53 en un entorno de deficiencia de Pten da como resultado la progresión de un tumor de próstata inactivo a una lesión invasiva pero no a metástasis. De este modo, se considera que la senescencia es una barrera precoz durante la tumorigénesis de próstata a partir de un estado inactivo a uno invasivo. El reestablecimiento de Smad4 en las células tumorales de próstata doble mutantes Pten/Smad4 no reestablecen la senescencia (no se muestran datos) . Sin embargo, el i reestablecimiento de Smad4 disminuyó la viabilidad ¡de las células al tratarlas con ?T?ß?. Por lo tanto, la barrera de senescencia puede ser una respuesta celular transitoria a las señales oncogénicas para bloquear la progresión del tumor .
Por otra parte, los análisis transcriptómicos comparativos a nivel molecular de tumores de próstata carentes de Pten y Pten/Smad en etapa precoz equivalente (n = 5 para cada genotipo) revelaron la expresión diferencial de 372 genes de los cuales al menos 66 genes contienen elementos de unión a Smad en sus promotores. A través de la integración de especies cruzadas con perfiles de número de copia de tumores de próstata metastásico humano, identificamos 17 de estos genes diana de Smad4 que están muy asociados con riesgo de recurrencia en cáncer de próstata humano y con riesgo de metástasis y supervivencia en cáncer de mama, por lo que respaldan la relevancia de este nuevo modelo de próstata metastásica y su uso en el descubrimiento de las DETERMINANTES PC genéticas que determinan la progresión de la enfermedad en muchos tipos de tumores a través de oncogenómica comparativa. ! En consecuencia, la invención proporciona un modelo animal para cáncer de próstata metastásicó. El modelo animal de la presente invención encuentra así una utilidad particular como herramienta de cribado para elucidar los mecanismos de los diversos genes involucrados I en poblaciones de pacientes normales y enfermos.
La invención también proporciona métodos para identificar individuos que tienen cáncer de próstata metastásicó o que están en riesgo de desarrollar cáncer de próstata metastático, mediante la detección de las DETERMINANTES PC asociadas con el tumor metastásicó, incluidos aquellos individuos que son asintomáticos respecto al tumor metastásicó. Estos distintivos y DETERMINANTES PC ten son útiles para monitorear individuos sometidos a tratamientos y terapias para el cáncer ¡y para seleccionar o modificar terapias y tratamientos que serían eficaces en individuos con cáncer, en donde la selección y i uso de estos tratamientos y terapias reducen la progresión del tumor o retrasan de forma considerable o previenen su aparición o reducen o previenen la incidencia \ de la metástasis del tumor.
Definiciones "Exactitud" se refiere al grado de conformidad de una cantidad medida o calculada (un valor reportado [ en una prueba) respecto a su valor real (o verdadero) . La exactitud clínica se relaciona con la proporción de resultados verdaderos (positivos verdaderos (TP - true positives) o negativos verdaderos (TN - true negatives) frente a resultados mal clasificados (positivos falsos (FP false positives) o negativos falsos (FN - ; false negatives) ) y puede establecerse como sensibilidad, especificidad, valores diagnóstico positivos (PPV positive predictive valúes) o valores diagnóstico negativos (NPV - negative predictive valúes) o como probabilidad, i razón de momios, entre otras medidas. ; En el contexto de la presente invención el i término "DETERMINANTES PC" abarca, entre otros, proteínas, ácidos nucleicos y metabolitos, junto con sus polimorfismos, mutaciones, variantes, modificaciones, subunidades, fragmentos, complejos proteína- ligando y productos de degradación, complejos proteína- ligando, elementos, metabolitos relacionados y otros analitos o mediciones provenientes de muestras. Las DETERMINANTES PC también pueden incluir proteínas mutadas o ácidos nucleicos mutados . Las DETERMINANTES PC también abarcan factores no sanguíneos o marcadores fisiológicos del estado de salud, distintos de los analitos, por ejemplo, "parámetros clínicos" definidos en la presente, así como "factores de riesgo de laboratorio tradicionales", también definidos en la presente. Las DETERMINANTES PC también incluyen cualquier índice calculado generado matemáticamente o combinaciones de una o más de las mediciones anteriores, que incluyen tendencias temporales y diferencias. Si estuvieran disponibles y a menos que se indique de otro modo, las DETERMINANTES PC que son productos génicos se identifican con base en las abreviaturas alfabéticas oficiales o el símbolo génico asignado por el International Human Genome Organization Naming Committee (HGNC) y enlistados a la fecha de esta presentación en la dirección de Internet del Centro Nacional para Información en Biotecnología de los Estados Unidos (NCBI-National !Center for Biotechnology Information) (http : //www . ncbi . nlm . nih. gov/sites/entrez?db=gene) , también conocido como Entrez Gene. : LOS términos "DETERMINANTE PC" o "DETERMINANTES PC" abarcan uno o más ácidos nucleicos o polipéptidos cuyos niveles se encuentran cambiados en individuos que tienen un tumor metastásico o están propensos a desarrollar un tumor metastásico o en riesgo de tener un tumor metastásico. Las DETERMINANTES PC individuales se resumen en la Tabla IB y colectivamente se denominan aquí, entre otras denominaciones, "proteínas asociadas a tumor metastático", "polipéptidos DETERMINANTES PC" o "proteínas DETERMINANTES PC" . Los ácidos nucleicos correspondientes que codifican para polipéptidos se denominan "ácidos nucleicos asociados a tumor metastático", "genes asociados a tumor metastático", "ácidos nucleicos DETERMINANTES PC" o "genes DETERMINANTES PC". A menos que se indique de otro modo, los términos "DETERMINANTE PC", "proteínas asociadas a tumor metastático", "ácidos nucleicos asociados a; tumor metastático", se refieren a cualquiera de las secuencias expuestas en la presente. Los metabolitos correspondientes de las proteínas o ácidos nucleicos DETERMINANTES PC también se pueden medir, así como cualquiera de los metabolitos marcadores de riesgo tradicionales anteriormente mencionados.
A los marcadores fisiológicos del estado de1 salud (por ejemplo, edad, historia familiar y otras mediciones de uso común como factores de riesgo tradicionales) se les denomina "fisiología DETERMINANTE PC". Los índices calculados generados a partir de la combinación matemática de mediciones de una o más, de preferencia, dos o más clases de las DETERMINANTES PC anteriormente mencionadas, se denominan "índices DETERMINANTES PC". ! El término "parámetros clínicos" abarca todos los biomarcadores , distintos de la muestra y los analitos, del estado de salud del individuo u otras características, entre otras, por ejemplo, edad (Edad), etnia (RAZA) , ( género (Sexo) o historia familiar (FamHX) . ' Una "célula endotelial circulante" (CEC circulating endotelial cell) es una célula endotelial de la pared interna de los vasos sanguíneos que, en ciertas circunstancias, incluida la inflamación, se desprende y entra al torrente sanguíneo, y contribuye a la formación de nueva vasculatura asociada con la patogénesis del cáncer. Las CEC pueden ser útiles como marcador de la progresión de un tumor y/o la respuesta a la terapia antiangiogénica .
Una "célula tumoral circulante" ("CTC" circulating tumor cell) es una célula tumoral de origen epitelial que en la metástasis se desprende del! tumor primario y entra a la circulación. El número de células tumorales circulantes en la sangre periférica está asociado con la progresión en pacientes con cáncer metastásico. Estas células se pueden separar y cuantificar por métodos inmunológicos que detectan células epiteliales y su expresión de las DETERMINANTES PC se puede cuantificar por ? qRT-PCR, inmunofluorescencia u otros métodos. | "FN" significa negativo falso, que en una prueba para determinar el estado de la enfermedad significa clasificar incorrectamente a un individuo enfermo como no enfermo o normal . iippn significa positivo falso, que en una ; prueba para determinar el estado de la enfermedad significa clasificar incorrectamente a un individuo normal ' como enfermo. ¡ Una "fórmula", "algoritmo" o "modelo" es cualquier ecuación matemática, proceso algorítmico, analítico o programado o técnica estadística que toma una o más entradas continuas o categóricas (aquí denominadas "parámetros") y calcula un valor de salida, algunas veces denominado "índice" o "valor índice". Ejemplos no exclusivos de "fórmulas" incluyen sumas, cocientes y operaciones de regresión, como coeficientes y exporientes, transformaciones y normalizaciones del valor biomarcador (incluidos, entre otros, aquellos esquemas de normalización que tienen como base parámetros clínicos, como género, edad o etnia) , reglas y lineamientos , modelos de clasificación estadísticos y sistemas de redes neurales experimentados en poblaciones históricas. Al combinar DETERMINANTES; PC y otras DETERMINANTES PC se usan, en particular, ecuaciones lineales y no lineales y análisis de clasificación estadísticos para determinar la relación entre los niveles de las DETERMINANTES PC detectadas en la muestra de un individuo y el riesgo de enfermedad metastásica eri éste. En un panel y en construcción de combinación son de interés particular los algoritmos de clasificación estadística estructural y sináptica y los métodos de generación de índice de riesgo que utilizan particularidades de reconocimiento de patrones, que incluyen técnicas establecidas como relación cruzada, análisis de componentes principales (PCA - Principal Components Analysis) , rotación de factor, regresión logística (LogReg) , análisis discriminante lineal (LDA - Linear Discriminant Analysis) , análisis discriminante lineal eigengene (ELDA - Eigengene Linear Discriminant Analysis) , máquinas vectoriales de soporte (SVM - Support Vector Machines) , bosque aleatorio (RF - Random Forest) , árbol de particiones recursivas (RPART - Recursive Partitioning Tree) , así como1 otras técnicas de clasificación relacionadas con el árbol de decisiones, Shrunken Centroids (SC) , StepAIC, Kth-Nearest Neighbor, Boosting, árboles de decisiones, redes neyrales, redes Bayesianas Networks, máquinas vectoriales de soporte y modelos de Markov ocultos, entre otras. Se pueden emplear otras técnicas en el análisis de riesgo de i supervivencia y tiempo para un suceso, que incluyen, los modelos Cox, Weibull, Kaplan-Meier y Greenwood, muy conocidos para los expertos en la técnica. Muchas de estas técnicas son útiles combinadas con una técnica de selección de la DETERMINANTE PC, como la selección en avance, la selección retroactiva o la selección gradual, enumeración completa de todos los paneles potenciales de un tamaño dado, algoritmos genéticos o pueden incluir en su propia técnica metodologías de selección de biomarcadores . Estas pueden asociarse con criterios de información como el criterio de información de Akaike (AIC - Akaike ' s Information Criterion) o criterio de información Bayes (BIC - Bayes Information Criterion) a fin de cuantifi'car el intercambio entre biomarcadores adicionales y la mejora del modelo y contribuir en la disminución del sobreajusté. Los modelos predictivos resultantes se pueden validar en otros estudios o validarse por cruzamiento en el estudio en el se experimentaron originalmente, mediante el uso de técnicas i como Bootstrap, Leave-One-Out (LOO) y validación cruzada 10-Fold (10-Fold CV) . En varias etapas, se pueden estimar índices de descubrimiento falsos por permutación de valor según las técnicas conocidas. La expresión "función de utilidad en economía sanitaria" se refiere a una fórmula que se deriva de la combinación de la probabilidad esperada de un grupo de resultados clínicos en una población de pacientes aplicable e ideal, antes y después de introducir una intervención diagnóstica o terapéutica en el ésquema estándar de atención. Esto incluye, estimar la exactitud, eficacia y características de desempeño de esta í intervención y una medición del costo y/o valor (utilidad) asociada con cada resultado, que puede derivarse ¡de los costos de atención reales del sistema de salud (servicios, abastecimientos, dispositivos y medicamentos, etc.) ¡y/o un valor aceptable estimado por año de vida ajustado según la calidad (QALY - quality adjusted Ufe year) que genera cada resultado. Considerando todos los resultados pronosticados, la suma del producto del tamaño de población pronosticado para un resultado multiplicado ppr la respectiva utilidad esperada para el resultado, es la utilidad en la economía sanitaria total de un estándar de atención dado. La diferencia entre (i) la utilidad total en la economía sanitaria calculada para el estándar de atención con la intervención, frente a (ii) la utilidad total en la economía sanitaria para el estándar de atención i sin la intervención da como resultado una medición \ global del costo en la economía sanitaria o valor ¡de la intervención. Esto puede ser dividido entre el ' grupo completo de pacientes que se analizan (o sólo entre el grupo de intervención) para llegar a un costo unitario por intervención y para orientar decisiones tales, como posicionamiento en el mercado, precios y presupuesto's para aceptación en el sistema sanitario. Estas funciones de utilidad económica sanitaria son de uso común para comparar la rentabilidad de la intervención pero también se pueden transformar para estimar el valor aceptable según QALY que el sistema sanitario está dispuesto a pagar o las características de desempeño clínico rentable requeridas para una nueva intervención.
Para intervenciones diagnósticas (o pronosticas) de la invención, puesto que cada resultado (que en una prueba diagnóstica de clasificación de la enfermedad puede ser TP, FP, TN o FN) implica un costo diferente, una función de utilidad en economía sanitaria puede favorecer preferencialmente a la sensibilidad con respecto; a la especificidad o PPV respecto a NPV con base en la situación clínica y los costos y valores de resultados individúales y ofrecer así otra medida del desempeño y valor económico sanitario que puede ser diferente de las mediciones de desempeño analíticas o clínicas más directas. , Estas mediciones diferentes e intercambios relativos convergen, por lo general, sólo en el caso de una prueba perfecta, con índice de error cero (a.k.a., clasificaciones erróneas de resultados para un individuo pronosticado con cero ó FP y FN) , que todas las mediciones de desempeño favorecerán sobre la imperfección, pero en diferentes grados. ! Los términos "medir" o "medición" o como alternativa "detectar" o "detección" se refieren a evaluar la presencia, ausencia, actividad o cantidad (que puede ser una cantidad eficaz) de una sustancia dada en una muestra clínica o extraída de un individuo, incluida la derivación de los niveles de concentración cualitativos o cuantitativos de esas sustancias o de otro modo, evaluar los valores o la categorización de los parámetros clínicos de un individuo, distintos de los analitos .
El "valor predictivo negativo" o "NPV" se calcula por TN/ (TN + FN) o la fracción negativa verdadera de todos los resultados de prueba negativos. En sí, este: valor también es influenciado por la prevalencia de la enférmedad y la probabilidad previa a la prueba de la población destinada a evaluarse.
Véase, por ejemplo, O'Marcaigh AS, Jacobson RM, "Estimating The Predictive Valué Of A Diagnostic Test, How To Prevent Misleading Or Confusing Results" , Clin. Ped. 1993, 32 (8) ¡485-491, que trata de especificidad, sensibilidad y valores predictivos positivos y negativos de una prueba, por ejemplo, una prueba de diagnóstico clínico. Con frecuencia, en enfoques binarios de clasificación de la enfermedad que usan una medición de la prueba de diagnóstico continua, la sensibilidad y especificidad se resumen mediante las curvas de características de operación receptoras (ROC - Receiver Operating Characteristics) según Pepe et al., "Limitations of the Odds Ratio in Gauging the Performance of a Diagnostíc, Prognostic or Screening marker" , Am. J. Epidemiol 2004, 159(9): 882-890, y resumidas por el área bajo la curva (AUC - Area Under the Curve) o estadística "c", indicador que permite la representación de la sensibilidad y especificidad ide una prueba, ensayo o método a través del intervalo completo de los valores de corte de la prueba (o ensayo) con apenas un solo valor. Véase también, por ejemplo, Shultz, "Clinical Interpretation Of Laboratory Procedures", capítulo 14 de Teitz, Fundamentáis of Clinical Chemistry, Burtis y Ashwood (eds.), 4th edición 1996, W.B. Saunders Company, págs . 192-199; y Zweig et al., "ROC Curve Analysis: An Example Showing The Relationships Among Serum Lipid And Apolipoprotein Concentrations In Identifying Subjects With Coronary Artery Disease" , Clin. Chem., 1992, 38(8):; 1425-1428. Un enfoque alternativo que utiliza funciones de probabilidad, razones de momios, teoría de información, valores predictivos, calibración (que incluye la prueba de la bondad del ajuste {goodness-of-fit) ) y mediciones de reclasificación se resume según Cook, " !7se and Misuse of the Receiver Operating Characteristic Curve iri Rísk Prediction" , Circulation 2007, 115: 928-935.
Por último, los cocientes de riesgos instantáneos y cocientes de riesgos absolutos y relativos dentro de cohortes del individuo definidas por una prueba, constituyen otra medición de exactitud y utilidad clínica. Con frecuencia se usan varios métodos para definir valores anormales o de enfermedad, que incluyen límites de referencia, límites de discriminación y umbrales de riesgo.
El término "exactitud analítica" se refiere a la reproducibilidad y previsibilidad del propio proceso de medición y se puede resumir en mediciones tales como i coeficientes de variación y pruebas de concordancia y calibración de las mismas muestras o controles con diferentes tiempos, usuarios, equipo y/o reactivos. Estas y otras consideraciones en la evaluación de nuevos biomarcadores también se resumen en Vasan, 2006. ¡ "Desempeño" es un término que se relaciona con la utilidad general y la calidad de una prueba de diagnóstico o pronóstico, que incluye, entre otros, exactitud clínica y analítica, otras características analíticas y de proceso, como las características de uso (por ejemplo, estabilidad, facilidad de uso), valor económico sanitario y costos relativos de los componentes de la prueba. Cualquiera de estos factores puede ser el origen de un mejor desempeño y en consecuencia de la utilidad de la prueba y se ¡pueden medir mediante una "métrica de desempeño" apropiada, como AUC, tiempo para obtener resultado, vida de anaquel,! etc., según sea pertinente.
El "valor positivo predictivo" o "PPV" se calcula por TP/ (TP + FP) o la fracción positiva verdadera dé todos los resultados de prueba positivos. En sí, este valor también es influenciado por la prevalencia de la enfermedad y la probabilidad previa a la prueba de la población destinada a evaluarse.
En el sentido que se utiliza en la presente el término "riesgo" se relaciona con la probabilidad de que ocurra un evento durante un periodo de tiempo específico, como sucede en la conversión a eventos metastáticos y puede significar un riesgo "absoluto" o un riesgo "relativo" en el individuo. El riesgo absoluto se puede medir con relación a la observación real, posterior a la medición, de la cohorte de tiempo correspondiente o con relación a los valores índice desarrollados a partir de cohortes históricas estadísticamente válidas que se han observado durante un periodo de tiempo correspondiente. El riesgo relativo se refiere a la relación de riesgos absolutos de un individuo comparados con los riesgos absolutos de I cohortes de bajo riesgo o un riesgo poblacional promedio, que puede variar según sean evaluados los factores de riesgo clínico. Las razones de momios, proporción! entre eventos positivos y eventos negativos para un resultado de prueba dado, también se usan comúnmente (momios según la fórmula p/ (1-p) en done p es la probabilidad de evento y (1-p) es la probabilidad de no evento) para cuando ho hay conversión.
"Evaluación del riesgo" o "evaluación de riesgo" en el sentido que se utilizan en la presente consiste en elaborar una predicción de la probabilidad, pronóstico o verosimilitud de que pueda suceder un evento ; o la conversión de la enfermedad de un estado a otro, la tasa de ocurrencia del evento o conversión de un estado de enfermedad a otro, es decir, de un tumor primario a un tumor metastásico o a un punto de riesgo de desarrollar un i tumor metastásico o del riesgo de un evento metastásico primario a un evento metastásico secundario. La evaluación de riesgo también puede incluir la predicción de futuros parámetros clínicos, valores de factores de riesgo de laboratorio tradicionales u otros índices de cáncer, en términos absolutos o relativos con relación a una población en la que previamente se hicieron mediciones . Los métodos de la presente invención se pueden emplear para' hacer mediciones continuas o categóricas del riesgo de un tumor metastático, diagnosticando y definiendo así el espectro de riesgo de una categoría de individuos definida cómo de riesgo para tumor metastásico. En el escenario categórico, la invención se puede usar para discriminar entre cohortes de individuos normales y otras que tienen alto riesgo de desarrollar tumores metastásicos . Estos usos diferentes puede requerir diferentes combinaciones de1 las DETERMINANTES PC y paneles individualizados, algoritmos matemáticos y/o valores límite, pero estar sujetos a las mismas mediciones anteriormente mencionadas de exactitud y desempeño para el respectivo uso al que se destinan.
En el sentido que se utiliza en la presente "muestra", es una muestra biológica aislada de un individuo y puede incluir entre otras, por ejemplo, biopsias de tejido, sangre completa, suero, plasma, células sanguíneas, células endoteliales , células tumorales circulantes, líquido linfático, ascites, líquido intersticial (conocido también como "líquido extracelular" y abarca los fluidos que se encuentran en los espacios que hay entre las células, incluido, entre otros, el líquido crevicular gingival), médula espinal, líquido cefalorraquídeo ¡(CSF -cerebrospinal fluid) , saliva, moco, esputo, sudor, orina o cualquier otra secreción, excreción u otro fluido corporal. i La "sensibilidad" se calcula por TP/ (TP +, FN) o la fracción positiva verdadera de individuos enfermos.
La "especificidad" se calcula por TN/ (TN + FN) o la fracción negativa verdadera de individuos sin la enfermedad o normales. j "Estadísticamente significativo" significa que la alteración es mayor de lo que se podría esperar que ocurriera sólo por casualidad (lo cual sería un "positivo falso"). La significancia estadística se puede determinar por cualquiera de los métodos conocidos en la técnica. Las medidas de significancia que son de uso común incluyen el valor p, que presenta la probabilidad de obtener un resultado al menos tan extremo como un punto de datos dado, asumiendo que el punto de datos fue el resultado, de la casualidad. Un resultado se considera con frecuencia muy significativo a un valor p de 0.05 o menos.
En el sentido que se utiliza en la presente un "individuo" es, de preferencia, un mamífero. El mamífero puede ser una persona, un primate no humano, un i ratón, perro, gato, caballo o vaca, aunque no se limita a estos ejemplos. Los mamíferos distintos de los seres humanos se pueden utilizar de manera ventajosa como individuos que representen modelos animales de metástasis tumoral . El individuo puede ser de sexo masculino o femenino. Un individuo puede ser aquel que se haya diagnosticado i previamente o identificado como portador de un tumor o un tumor metastásico y opcionalmente se haya sometido o se esté sometiendo a una intervención terapéutica para el tumor. Como alternativa, el individuo también puede ser alguien que no se haya diagnosticado previamente como enfermo de cáncer de próstata. Por ejemplo, el individuo puede ser alguien que manifieste uno o más factores de riesgo para cáncer de próstata metastásico. ; "TN" es negativo verdadero, que para una prueba I del estado de la enfermedad significa clasificar correctamente a un individuo como no enfermo o normal.
"TP" es positivo verdadero, que para una ' prueba del estado de la enfermedad significa clasificar correctamente a un individuo como portador de la enfermedad.
Los "factores de riesgo de laboratorio tradicionales" corresponden a biomarcadores aislados o provenientes de muestras del individuo y que actualmente se evalúan en los laboratorios clínicos y se usan en algoritmos de evaluación de riesgo global tradicional. Los factores de riesgo de laboratorio tradicionales para metástasis del tumor incluyen, por ejemplo, puntuación de Gleason, profundidad de invasión, densidad de los : vasos, índice proliferativo, etc. Hay otros factores de riesgo de laboratorio tradicionales para la metástasis de un tumor que son conocidos para los expertos en la técnica. ; MÉTODOS Y ÜSOS DE LA INVENCIÓN ! Los métodos expuestos aquí se usan para en individuos que están en riesgo de desarrollar cáncer de próstata metastásico o en otros individuos con cáncer, como los enfermos de cáncer de mama, que se hayan o no diagnosticado con cáncer de próstata metastásico u: otros tipos de cáncer y en individuos sometidos a tratamiento y/o terapias para un tumor primario o cáncer de próstata metastático y otros tipos de cáncer. Los métodos de la presente invención también se pueden emplear para monitorear o seleccionar un régimen de tratamiento para un individuo que tenga un tumor primario o cáncer de próstata metastásico y otros tipos de cáncer y para detectar mediante cribado individuos que no hayan sido diagnosticados previamente como portadores de cáncer de próstata metastático, por ejemplo, individuos que manifiestan factores de riesgo de metástasis.! De preferencia, los métodos de la presente invención se usan para identificar y/o diagnosticar individuos qúe son asintomáticos para cáncer de próstata metastásico. "Asintomático" significa que no presenta los signos y síntomas tradicionales.
Los métodos de la presente invención también se pueden usar para identificar y/o diagnosticar a individuos que ya tienen alto riesgo de desarrollar cáncer de próstata y otros tipos de cáncer metastático, con base solamente en los factores de riesgo tradicionales.
Un individuo que tiene cáncer de próstata metastásico y otros tipos de cáncer metastático, se puede identificar por medición de las cantidades (que incluyen la presencia o ausencia) de un número eficaz (que pueden ser dos o más) - de las DETERMINANTES PC en una muestra proveniente del individuo y luego, las cantidades se comparan con un valor de referencia. Se identifican las alteraciones en las cantidades y patrones de expresión de biomarcadores como proteínas, polipéptidos , ácidos nucleicos y polinucleótidos , polimorfismo de proteínas, polipéptidos, ácidos nucleicos y polinucleótidos, proteínas, polipéptidos, ácidos nucleicos y polinucleótidos imitados, o alteraciones en las cantidades moleculares de metabolitos u otros analitos en la muestra del individuo, comparados con el valor de referencia.
Un valor de referencia puede ser relativo a un número o valor derivado de estudios de población, que incluyen, entre otros, individuos que tienen el mismo tipo de cáncer, individuos que tienen igual o similar intervalo de edad, individuos que son del mismo grupo étnico o un grupo similar, individuos que tienen historias familiares de cáncer, o puede ser relativo a la muestra inicial, de un individuo sometido a tratamiento antineoplásico . Estos valores de referencia se pueden derivar de análisis estadísticos y/o datos de predicción de riesgo en poblaciones obtenidos a partir de algoritmos matemáticos e índices calculados de metástasis de cáncer. También se i pueden generar y usar los índices DETERMINANTES j PC de referencia mediante el uso de algoritmos y otros métodos de clasificación estadística y estructural.
En una modalidad de la presente invención, el valor de referencia es la cantidad de las DETERMINANTES PC en una muestra de control proveniente de uno o más individuos que no están en riesgo o tienen bajo riesgo de desarrollar un tumor metastásico. En otra modalidad de la presente invención, el valor de referencia es la cantidad de las DETERMINANTES PC en una muestra de control proveniente de uno o más individuos que son asintomáticos i y/o carecen de los factores de riesgo tradicionales para cáncer de próstata metastásico. En otra modalidad; estos individuos se monitorean y/o periódicamente se reevalúan durante un periodo de tiempo pertinente desde el punto de vista del diagnóstico ("estudio longitudinales") y se da seguimiento al análisis para verificar si continúa la ausencia del cáncer de próstata metastásico (enfermedad o supervivencia sin eventos) . Este periodo de tiempo puede ser de un año, dos años, dos a cinco años, cinco años, cinco a diez años, diez años o diez o más años a partir de la fecha de análisis inicial para la determinación del valor de referencia. Por otra parte, la medición retrospectiva de las DETERMINANTES PC en muestras de individuos con datos históricos adecuadamente ordenados en i bancos de datos, se puede usar para establecer^ estos i valores de referencia y reducir así el tiempo requerido para el estudio.
Un valor de referencia también puede! estar constituido por las cantidades de las DETERMINANTES PC derivadas de individuos que manifiestan una mejora! en los factores de riesgo metastásico como resultado de tratamientos y/o terapias para el cáncer. Un valor de referencia también puede estar constituido pór las cantidades de las DETERMINANTES PC derivadas de individuos en los que se ha confirmado la enfermedad mediante las técnicas invasivas o no invasivas conocidas o en los que tienen alto riesgo de desarrollar tumor metastájsico o quienes han padecido cáncer de próstata metastásico. ' En otra modalidad, el valor de referencia es un valor índice o un valor inicial. Un valor índice o un valor inicial es una muestra compuesta de una cantidad eficaz de las DETERMINANTES PC de uno o más individuos que I no tengan tumor metastásico o individuos que son asintomáticos por metástasis. Un valor inicial también puede consistir en las cantidades de las DETERMINANTES PC en una muestra proveniente de un individuo que haya manifestado una mejora en los factores de riesgo tumoral Í como resultado de tratamiento o terapias antineoplásicos . En esta modalidad, para hacer comparaciones con la rtvuestra proveniente del individuo, las cantidades d'e las DETERMINANTES PC se calculan de manera similar! y se comparan con el valor índice. Como opción, los individuos Í I identificados como portadores de tumor metastático o que tienen alto riesgo de desarrollar un cáncer de próstata metastásico se eligen para recibir un régimen terapéutico que disminuya el avance del cáncer o disminuya o prevenga el riesgo de desarrollar cáncer de próstata metastásico.
La progresión del cáncer de próstata metastásico o la eficacia de un régimen de tratamiento antineoplásico, se puede monitorear detectando una DETERMINANTE PC ' en una cantidad eficaz (que pueden ser dos o más) de muestras extraídas de un individuo durante un tiempo y comparando la cantidad de las DETERMINANTES PC detectadas. Por e!jemplo, se puede obtener una primera muestra antes de que el individuo reciba el tratamiento y se extraen una' o más muestras consecutivas después o durante el tratamiento del individuo. Se considera que el cáncer es progresivo' (o que el tratamiento no previene la progresión) si la cantidad de de las DETERMINANTES PC cambia con el tiempo respecto al valor de referencia, mientras que el cáncer 'no es progresivo si la cantidad de las DETERMINANTES PC permanece constante en el tiempo (con relación a la población de referencia o "constante" según se define en la presente) . El término "constante" en el sentido que se utiliza en la presente invención, incluye los cambios a través j de un ! tiempo con respecto al valor de referencia.
Por ejemplo, los métodos de la invención se pueden usar para discriminar la agresividad y/o evaluar la etapa del tumor (por ejemplo, etapa I, II, II o IV) . Esto permitirá que los pacientes se estratifiquen en grupos de alto o bajo riesgo y se traten como corresponde.
Por otra parte, los agentes terapéuticos o profilácticos adecuados para administración a un individuo particular, se pueden identificar al detectad una DETERMINANTE PC en una cantidad eficaz (que pueden ser dos o más) en una muestra obtenida a partir de un individuo y i exponiendo la muestra proveniente del individuo! a un compuesto de prueba que determina la cantidad (que pueden ser dos o más) de las DETERMINANTES PC en la muestra proveniente del individuo. En consecuencia, se ¡pueden seleccionar los tratamientos o regímenes terapéuticos para usarse en individuos que tienen cáncer o individuos con riesgo de desarrollar un tumor metastático, con base | en las cantidades de las DETERMINANTES PC en muestras extraídas de los individuos y compararse con un valor de referencia. Dos o más tratamientos o regímenes terapéuticos se pueden evaluar en paralelo para determinar cuál tratamiento o régimen terapéutico sería el más eficaz para usarsej en un individuo y retrasar la aparición o disminuir la progresión del cáncer. ! La presente invención también ofrece un método de cribado para cambios en la expresión de marcadores asociados con cáncer de próstata metastásico, mediante la determinación de la cantidad (que puede ser de dos o más) de las DETERMINANTES PC en una muestra proveniente de un individuo, comparando las cantidades de las DETERMINANTES PC en una muestra de referencia e identificando alteraciones en cantidades en la muestra del individuo en comparación con la muestra de referencia.
La presente invención también ofrece un ;i método para el tratamiento de un paciente portador de un tumor, mediante la identificación del paciente con el tumor, en donde una cantidad eficaz de las DETERMINANTES PC están alteradas de manera clínicamente significativa según se mide en una muestra proveniente del tumor, y tratando al paciente con un régimen terapéutico que previene o > reduce la metástasis del tumor.
Por otra parte, la invención ofrece un método para seleccionar un paciente con tumor que necesita un tratamiento complementario, mediante la evaluación del riesgo de metástasis en el paciente por medición de una cantidad eficaz de las DETERMINANTES PC en donde una alteración clínicamente significativa de dos p más DETERMINANTES PC en una muestra de tumor proveniente del paciente, indica que el paciente necesita tratamiento complementario.
La información relativa a una decisión de tratamiento para un paciente enfermo de cáncer al obtener información sobre una cantidad eficaz de las DETERMINANTES PC en una muestra del tumor proveniente del paciente y seleccionar un régimen de tratamiento que evite o reduzca la metástasis del tumor en el paciente si dos o más DETERMINANTES PC se encuentran alteradas en 1 forma clínicamente significativa.
Si la muestra de referencia, por ejempío, una muestra de control es de un individuo que no tiene ; cáncer metastásico o si la muestra de referencia refleja un valor relativo a una persona que tiene alta probabilidad de rápida progresión a cáncer de próstata metastásico, una similitud en la cantidad de la DETERMINANTE PC en la muestra de prueba y en la muestra de referencia indica que el tratamiento es eficaz. Sin embargo, una diferencia en la cantidad de la DETERMINANTE PC en la muestra de prueba y la muestra de referencia, indica un resultado clínico o un pronóstico menos favorables .
El término "eficacia" significa que el tratamiento produce una disminución en la cantidad o actividad de una DETERMINANTE PC sea proteína, , ácido nucleico, polimorfismo, metabolito u otro analito;. La evaluación de los factores de riesgo descritos , en la presente se puede hacer por medio de los protocolos clínicos estándar. La eficacia se puede determinar junto con cualquier método conocido para diagnosticar, identificar o tratar un enfermedad metastásica.
La presente invención también ofrece paneles de las DETERMINANTES PC que incluyen una o más DETERMINANTES PC que son indicativas de un sistema fisiológico general asociado con una lesión metastásica. Por ejemplo,' una o más DETERMINANTES PC que se puedan usar para excluir o distinguir entre diferentes estados de la enfermedad o secuelas asociadas con la metástasis. Una¡ sola DETERMINANTE PC puede tener varias de las características anteriormente mencionadas según la presente invención y como alternativa se puede usar en la sustitución de una o más DETERMINANTES PC según corresponda para la aplicación dada de la invención. ¡ La presente invención también comprende un estuche con un reactivo de detección que se une a una o más DETERMINANTES PC sea proteína, ácido nucleico, polimorfismo, metabolito u otro analito. La invención también ofrece un juego de reactivos de detección, por ejemplo, anticuerpos y/o oligonucleótidos que se jpueden unir a dos o más proteínas o ácidos nucleicos DETERMINANTES PC, respectivamente. En una modalidad, las DETERMINANTES PC son proteínas y el juego de reactivos contiene anticuerpos que se unen a una cantidad eficaz de 1' a 372 DETERMINANTES PC suficiente para medir una alteración I estadísticamente significativa en la expresión de la DETERMINANTE PC en comparación con un valor de referencia. En otra modalidad, las DETERMINANTES PC son i ácidos nucleicos y el juego de reactivos contiene oligonucléótidos o aptámeros que se unen a una cantidad eficaz de 1 a 372 DETERMINANTES PC para medir una alteración estadísticamente significativa en la expresión de la DETERMINANTE en comparación con un valor de referencia.
En otra modalidad, las DETERMINANTES PC son proteínas y el juego de reactivos contiene anticuerpos que se unen a una cantidad eficaz de las DETERMINANTES PC enlistadas en las Tablas 1 a 7, suficiente para medir una alteración estadísticamente significativa en la expresión de la DETERMINANTE PC en comparación con un valor de referencia. En otra modalidad las DETERMINANTES PC son ácidos nucleicos y el juego de reactivos contiene i oligonucléótidos o aptámeros que se unen a una cántidad eficaz de las DETERMINANTES PC enlistadas en las Tablas 1 a 7, suficiente para medir una alteración estadísticamente significativa en la expresión de la DETERMINANTE ! PC en comparación con un valor de referencia.
La invención también ofrece un método para tratar a uno o más individuos que están en riesgo de desarrollar un tumor metastásico al detectar cantidades alteradas de una cantidad eficaz de las DETERMINANTES PC presentes en una muestra proveniente de uno o más individuos; y tratando al o los individuos con uno o más medicamentos moduladores del cáncer hasta que las cantidades alteradas o actividad de las DETERMINANTES PC regresen a un valor inicial determinado en uno o más individuos con bajo riesgo de desarrollar una enfermedad metastásica o como alternativa, en individuos que no manifiestan ninguno de los factores de riesgo tradicionales de enfermedad metastásica.
La presente invención también ofrece un , método para tratar a uno o más individuos que tienen! tumor metastásico al detectar la presencia de niveles alterados de una cantidad eficaz de las DETERMINANTES PC presentes en una muestra del o los individuos; y tratando al o los individuos con uno o más medicamentos moduladores de ! cáncer hasta que las cantidades alteradas o actividad de las DETERMINANTES PC regresen a un valor inicial determinado en j uno o más individuos con bajo riesgo de desarrollar un tumor metastático.
La presente invención también ofrece un método para evaluar cambios en cuanto al riesgo de desarrollar cáncer de próstata metastásico en un individuo diagnosticado con cáncer, mediante la detección de una cantidad eficaz de las DETERMINANTES PC (que pueden ser dos o más) en una primera muestra proveniente del individuo en un primer periodo de tiempo, la detección de las cantidades de las DETERMINANTES PC en una segunda muestra proveniente del individuo en un segundo periodo de tiempo y comparación de las cantidades de las DETERMINANTES detectadas! en el i primero y en el segundo periodo de tiempo. ] Indicaciones de diagnóstico y pronóstico de la invención La invención permite el diagnóstico y el pronóstico de un tumor primario, localmente invasivo y/o metastático, como cáncer de próstata, de mama, ente ; otros . El riesgo de desarrollar cáncer de próstata metastásico se puede detectar al medir una cantidad eficaz de las DETERMINANTE PC sea proteína, ácido nucleico, polimorfismo, metabolito y otros analitos (que pueden ser dos o más) en una muestra de prueba (por ejemplo, una muestra proveniente de un individuo) y comparando las cantidades eficaces con índices o valores de referencia, con frecuencia utilizando fórmulas y algoritmos matemáticos con el fin de combinar información de resultados de varias DETERMINANTES PC individuales y de parámetros clínicos distintos de los analitos, en un solo índice o medición. Los individuos que se hayan identificado con mayor riesgo de tumor metastásico pueden seleccionarse para recibir regímenes de tratamiento, como la administración de compuestos profilácticos o terapéuticos para prevenir o retardar la aparición del cáncer de próstata metastático o de otros tipos de ; cáncer metastásico .
La cantidad de las DETERMINANTES PC sea prpteína, i ácido nucleico, polimorfismo, metabolito u otro analito, se puede medir en una muestra de prueba y comparar con el "nivel control normal" utilizando técnicas como límites de referencia, límites de discriminación o umbrales de : riesgo que definen valores de corte y valores anormales. El "nivel control normal" se refiere al nivel de una o más DETERMINANTES PC o índices DETERMINANTES PC combinados que normalmente se encuentran en un individuo que no padece un tumor metastásico. Este nivel control normal y valores de corte pueden variar si una DETERMINANTE PC se usa sola o con una fórmula de combinación con otras DETERMINANiTES PC como índice. Como alternativa, el nivel control : normal puede ser una base de datos de patrones de las DETERMINANTES PC derivados de individuos previamente evaluados que no desarrollaron un tumor metastásico durante un horizonte de tiempo clínicamente pertinente.
La presente invención se puede usar para hacer mediciones continuas o categóricas del riesgo de conversión a cáncer de próstata metastático u otros tipo de ! cáncer metastásico, diagnos icando y definiendo así el espectro de riesgo de una categoría de individuos definidos como grupo de riesgo para experimentar un evento metastático. ', En el escenario categórico, los métodos de la presente invención se pueden usar para distinguir entre cohortes de individuos normales e individuos enfermos. En otras modalidades, la presente invención se puede usar para distinguir entre los individuos normales y aquellos que están en riesgo de tener un evento metastático, aquellos que tienen un avarice más rápido (o alternativamente los que tienen un horizonte de tiempo más corto para un evento metastásico) hacia un evento metastático, los que tienen un avance más lento (o alternativamente los que tienen un horizonte de tiempo más largo para un evento metastásico) o los que tienen uh tumor metastásico. Estos usos diferentes pueden requerir diferentes combinaciones de las DETERMINANTES PC eri panel i individual, algoritmo matemático y/o valores de corté, pero están sujetos a las mismas mediciones anteriormente mencionadas de exactitud y otras mediciones de desempeño importantes para el uso que se pretende.
Identificar al individuo que está en riesgo de desarrollar un evento metastático permite la selección e iniciación de varias intervenciones terapéuticas o regímenes de tratamiento con el fin de retardar, reducir o i prevenir la conversión del individuo a un estado de enfermedad metastásica. Los niveles de la cantidad eficaz de las DETERMINANTE PC sea proteína, ácido nucleico, polimorfismo, metabolito u otro analito, también permiten monitorear la evolución del tratamiento de una enfermedad metastásica o evento metastático. En este método, se puede obtener una muestra biológica proveniente de un individuo sometido a regímenes de tratamiento para el cáncer. Si se desea, las muestras biológicas se obtienen a partir del individuo en varios puntos de evaluación antes, durante o después del tratamiento. i En virtud de algunas DETERMINANTES PC que son funcionalmente activas, por elucidación de su función, los individuos con DETERMINANTES PC elevadas, por ejemplo, se pueden tratar con agentes/medicamentos que de manera preferencial se dirigen a esas vías, que funcionan a ' través de señalización de TGF , de este modo, los individuos se pueden tratar con agentes que aumenten el bloqueo de varios componentes de la vía de señalización de TGFp . ; La presente invención también se puede usar para cribar poblaciones de pacientes o individuos en cualquiera de diversos escenarios. Por ejemplo, una organización de mantenimiento sanitario, una entidad de salud pública o un programa de salud escolar pueden someter a cribado un grupo de individuos para identificar aquellos que requieren intervenciones, como se describió en lo anterior o para la recolección de datos epidemiológicos . Las compañías i aseguradoras (por ejemplo, de salud, vida o incapacidad) pueden someter a cribado a los solicitantes en el proceso para determinar cobertura o costos o los clientes existentes para una posible intervención. Los; datos recopilados en estos cribados poblacionales , en particular si están asociados con alguna evolución clínica hacia padecimientos como cáncer o eventos metastáticos, serán valiosos en operaciones, como por ejemplo, organizaciones de mantenimiento sanitario, programas de salud pública y aseguradoras. Estos conjuntos o colecciones de datos se pueden almacenar en medios automáticos utilizados en varios de los sistemas de manejo de datos sanitarios con el; fin de proporcionar servicios sanitarios mejorados, asistencia sanitaria económica, mejor operación de los seguros, etc. Véase, por ejemplo, la Solicitud de Patente de los Estados Unidos Núm. 2002/0038227; Solicitud de Patente de los Estados Unidos Núm. 2004/0122296; Solicitud de Patente de los Estados Unidos Núm. 2004/0122297 y Patente de los Estados Unidos Núm. 5,018,067. Estos sistemas pueden recuperar los datos directamente a partir de un medio de almacenamiento de datos interno o en forma remota a ¡partir de uno o más sitios de almacenamiento de datos como se verá con detalle más adelante.
Un medio de almacenamiento automático ; puede comprender un material de almacenamiento de ¡ datos codificado con datos o matrices de datos de lectura automática que cuando utilizan una máquina programada con instrucciones para usar tales datos, es capaz de usar para una variedad de propósitos, entre otros, por e emplo, información de un individuo relativa a factores de riesgo de enfermedad metastásica a través del tiempo o como respuesta a terapias farmacológicas. Las mediciones de cantidades eficaces de biomarcadores de la invención y/o la evaluación de riesgo resultante de esos biomarcadores, se puede implementar un programas de cómputo que se ejecutan en computadoras programables , que comprenden, entre otros componentes, un procesador, u sistema de almacenamiento de datos (que incluye memoria volátil y no volátil y/o elementos de almacenamiento) , al menos un dispositivo de entrada y al menos un dispositivo de salida. Se puede aplicar un código de programa para introducir datos que desempeñen las funciones descritas en lo anterior y generen información de salida. La información de salida se puede aplicar a uno o más dispositivos de salida, según los métodos conocidos en la técnica. La computadora puede ser, por ejemplo, una computadora personal, una microcomputadora o una estación de trabajo de diseño convencional. 1 Cada programa se puede implementar en lenguaje de programación orientado a objetos o a procedimientos , de alto nivel, para comunicarse con un sistema de cómputo. Sin embargo, si se desea, los programas se !pueden implementar en lenguaje compilador o de máquina.1 El lenguaje puede ser un lenguaje compilado o un lenguaje interpretado. Cada uno de estos programas de cómputo se puede almacenar en un medio o dispositivo de almacenamiento (por ejemplo, ROM o disco magnético u otros que se definen en alguna parte de esta exposición) susceptible de , leerse mediante una computadora programable especial o de tipo general, para configurar y operar la computadora cuándo el medio o dispositivo de almacenamiento es leído por la computadora para realizar los procedimientos descritos en la presente. También se puede considerar que el sistema de administración de datos sanitarios de la invención se implemente como un medio de almacenamiento susceptible de leerse por computadora y configurarse con un programa de cómputo, en donde el medio de almacenamiento así configurado hace que la computadora funcione de una ; manera específica y predefinida para realizar las diversas funciones descritas aquí. ! Los niveles de una cantidad eficaz de las DETERMINANTE PC sea proteína, ácido nucleico, polimorfismo, metabolito u otro analito, se pueden determinar y comparar con un valor de referencia, por ejemplo, una población o individuo de control cuyo estado metastásico sea conocido o con un valor índice o un valor inicial. La muestra de referencia o valor índice o valor inicial se puede tomar o derivar de uno o más individuos que se hayan expuesto al tratamiento o se puede tomar o derivar de uno o más individuos que tengan bajo riesgo de desarrollar cáncer o un evento metastásico o se puede tomar o derivar de uno o más individuos que hayan manifestado mejoría como resultado de la exposición al tratamiento. Como alternativa, la muestra de referencia o valor índice o valor inicial o se puede tomar o derivar de uno o más individuos que no se hayan expuesto al tratamiento. Por ejemplo, las muestras se puede recolectar a partir de individuos que hayan recibido tratamiento inicial para el cáncer o un , evento metastásico y tratamiento posterior para el cáncer o un evento metastásico para monitorear el avance del tratamiento. Un valor de referencia también ; puede consistir en un valor derivado de algoritmos de predicción de riesgo o índices calculados a partir de estudios poblacionales como los que se exponen en la presente.' Las DETERMINANTES PC de la presente invención se puede usar entonces para generar un "perfil DETERMINANTE PC de referencia" de aquellos individuos que no tienen ; cáncer o que no están en riesgo de tener un evento metastásico y de los que no se esperaría que desarrollaran cáncer o un evento metastásico. Las DETERMINANTES PC expuestas' en la presente, también se pueden usar para generar un "perfil DETERMINANTE PC de un individuo" proveniente de individuos i que tienen cáncer o que están en riesgo de tener un evento metastásico. El perfil de la DETERMINANTE PC individual se puede comparar con un perfil de la DETERMINANTE PC de referencia para diagnosticar o identificar individuos que están en riesgo de desarrollar cáncer o un ¦ evento metastásico, para monitorear la progresión de la enfermedad, así como la velocidad de progresión \ de la enfermedad y monitorear la eficacia de las modalidades del tratamiento. Los perfiles de las DETERMINANTES PC de referencia e individual de la presente invención, pueden residir en un medio susceptible de leerse de manera i automática, por ejemplo, cintas como las que pueden ser leídas en VCR, CD-ROM, DVD-ROM, USB flash, entre otros. Estos medios susceptibles de leerse de manera automática también pueden contener resultados de análisis adicionales, entre otros, como por ejemplo, mediciones de parámetros clínicos y factores de riesgo de laboratorio tradicionales.
Como alternativa o adicionalmente , el medio susceptible de í leerse de manera automática también puede incluir información del individuo como la historia clínica y cualquier antecedente familiar importante. El ' medio susceptible de leerse de manera automática también puede contener información relativa a otros algoritmos de i riesgo de enfermedad e índices calculados como los que se describen aquí.
Las diferencias en la estructura genética de los individuos puede dar lugar a diferencias en sus capacidades relativas para metabolizar varios medicamentos, que ; pueden modular los síntomas o factores de riesgo de cáncer o eventos metastásicos . Los individuos que tienen cáncer o están en riesgo de desarrollar cáncer o un evento metastásico pueden variar en cuanto a edad, etnia y otros parámetros. En consecuencia, el uso de las DETERMINANTES PC expuestas aquí, solas o en combinación con factores genéticos conocidos respecto al metabolismo de medicamentos, permiten que con un nivel predeterminado de previsibilidad se evalúe una posible terapéutica o profilaxis en un individuo seleccionado, que sea la adecuada para el tratamiento o prevención del cáncer o un evento metastásico en el individuo.
Para identificar la terapéutica ?{ los medicamentos que son adecuados para un individuo específico, una muestra de prueba del individuo se puede exponer también a un agente terapéutico o a un medicamento y se puede determinar el nivel de una o más DETERMINANTES PC sea proteína, ácido nucleico, polimorfismo, metabolito u otros analitos. El nivel de una o más DETERMINANTES PC se puede comparar con una muestra proveniente del individuo antes y después del tratamiento o la exposición a un jagente terapéutico o medicamento o se puede comparar con muestras provenientes de uno o más individuos que hayan manifestado mejoras en los factores de riesgo (por ejemplo, parámetros clínicos o factores de riesgo de laboratorio tradicionales) como resultado del tratamiento o la exposición.
Una célula del individuo (es decir, una ! célula aislada de un individuo) se puede incubar el presencia de un agente candidato y el patrón de la expresión de las DETERMINANTES PC en la muestra de prueba se mide y se compara con un perfil de referencia, por ejemplo, un; perfil de expresión de referencia para enfermedad metastasica o un perfil de expresión de referencia sin la enfermedad o un valor índice o un valor inicial. El agente de prueba puede ser cualquier compuesto o composición o combinación de los mismos, incluidos los complementos dietéticos. | Por ejemplo, los agentes de prueba son agentes de uso frecuente en regímenes de tratamiento del cáncer y se describen aquí .
Los métodos de la invención anteriormente mencionados se pueden usar para evaluar o monitorear la progresión y/o mejora de los individuos a los que se les ha diagnosticado cáncer y quienes se han sometido a i intervenciones quirúrgicas . ¡ Medidae de desempeño y exactitud de la invención ' El desempeño y por lo tanto la utilidad clínica absoluta y relativa de la invención se puede evaluar de varias formas, tal como se señaló en lo anterior. Entre las diversas evaluaciones de desempeño, la invención está destinada a proporcionar exactitud en el diagnóstico y el pronóstico clínico. La exactitud de una prueba, ensayo o método de diagnóstico o pronóstico que se refiere a la capacidad de la prueba, ensayo o método para distinguir entre individuos que tienen cáncer o que están en riesgo de padecer cáncer o un evento metastásico, tiene como base el hecho de que exista o no en los individuos una "alteración significativa" (por ejemplo, clínicamente significativa "significativa desde el punto de vista del diagnóstico") en los niveles de una DETERMINANTE PC. El término "cantidad eficaz" significa que la medición de un número apropiado de las DETERMINANTES PC (que pueden ser una o más) que produce una "alteración significativa" (por ejemplo, nivel de expresión o actividad de las DETERMINANTES PC) es diferente del valor de corte predeterminado (o umbral) para esa o esas DETERMINANTES PC y por lo tanto indica que el individuo tiene cáncer o está en riesgo de experimentar un evento metastásico en el que la DETERMINANTE ' PC o DETERMINANTES PC es clave. La diferencia en el nivel de las DETERMINANTES PC entre normal y anormal es, de preferencia, estadísticamente significativo. Cojno se señala más adelante y sin limitación alguna de la invención, tener significancia estadística y de este modo la exactitud analítica, diagnóstica y clínica preferida, por lo general, aunque no siempre, requiere que las combinaciones de algunas DETERMINANTES PC se usen juntas en paneles y se combinen con algoritmos matemáticos para lograr un índice de las DETERMINANTE PC estadísticamente significativo. : En el diagnóstico categórico de un estado de enfermedad, cambiar el valor de corte o valor umbral ; de una prueba (o ensayo) normalmente cambia la sensibilidad y especificidad, pero en una relación cualitativamente inversa. Por lo tanto, al evaluar la exactitud y utilidad de una prueba médica, ensayo o método propuesto para evaluar el estado de un individuo, siempre se deberá considerar tanto la sensibilidad como la especificidad y darse cuenta de a qué valor de corte se reportan la sensibilidad y la especificidad porque la sensibilidad y la especificidad pueden variar significativamente en todo el intervalo de valores de corte. El uso de herramientas estadísticas como el AUC (área bajo la curva) , abarcando todos los valores de corte potenciales, se prefiere para la mayoría de las mediciones de riesgo categórico que se utilizan en la invención, mientras que para medicidnes de riesgo continuo, se prefiere la estadística de la prueba de la bondad del ajuste {goodness-of-fit) y calibración con los resultados observados u otro criterio de referencia.
Por "nivel predeterminado de previsibilidad" se entiende que el método ofrece un nivel aceptable de exactitud clínica y diagnóstica. Mediante el uso de estas herramientas estadísticas, en el sentido que se utiliza en la presente "grado aceptable de exactitud diagnóstica" se define como una prueba o ensayo (como la prueba! de la invención para determinar la presencia clínicamente significativa de las DETERMINANTES PC, las cuales indican la presencia de cáncer y/o el riesgo de tener un evento metastásico) en el que la AUC (área bajo la curva ROC para la prueba o ensayo) es al menos 0.60, convenientemente al menos 0.65, con más conveniencia, al menos 0.70, de preferencia al menos 0.75, con más preferencia al menos 0.80 y con máxima preferencia al menos 0.85.
"Grado muy alto de exactitud diagnóstica" significa que una prueba o ensayo en el que el AUC (área bajo la curva ROC para la prueba o ensayo) al menos 0.75, 0.80, convenientemente al menos 0.85, con más conveniencia, al menos 0.875, de preferencia al menos 0.90, con más preferencia al menos 0.925 y con máxima preferencia al i menos 0.95. ; Como alternativa, los métodos pronostican la presencia o ausencia de cáncer, cáncer metastásico o la respuesta a la terapia con al menos 75% de exactitud, con más preferencia 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ó mayor i exactitud.
El valor pronóstico o predictivo de cualquier prueba depende de la sensibilidad y especificidad de la prueba y de la prevalencia del padecimiento en la población que se evalúa. Esta noción, con base en el teorema de Bayes, permite que a mayor probabilidad de que el padecimiento que se somete a cribado esté presente en un individuo o en la población (probabilidad previá a la prueba) mayor sea la validez de una prueba positiva y mayor sea la probabilidad de que el resultado sea positivo verdadero. De este modo, el problema de usar una prueba en cualquier población en la que haya una baja probabilidad de que el padecimiento esté presente es que el resultado positivo tiene valor limitado (es decir, es más probable que sea positivo falso) . Del mismo modo, en poblaciones con muy alto riesgo, es más probable que un resultado de prueba negativo sea un negativo falso.
Como resultado, los valores ROC y AUC pueden ser engañosos para la utilidad clínica de una prueba en poblaciones evaluadas con baja prevalencia anual , de la enfermedad (definidas como aquellas con menos de ¡ 1% de eventos (incidencia) o menos de 10% de prevalencia acumulativa con respecto a un horizonte de ¡ tiempo especificado) . Como alternativa, las proporciones de riesgo absoluto y riesgo relativo según se definen en alguna parte de esta exposición, se pueden emplear para determinar el grado de utilidad clínica. Las poblaciones de individuos a analizar también se pueden clasificar en cuartiles por valores de medición de la prueba, en donde el cuartil superior (25% de la población) comprende el grupo de individuos con el riesgo relativo más alto para desarrollar cáncer o un evento metastásico y el cuartil inferior comprende el grupo de individuos que tienen el riesgo relativo más bajo para desarrollar cáncer o un evento metastásico. Por lo general, los valores derivados de las pruebas o ensayos que tienen 2.5 veces el ¡ riesgo relativo del cuartil superior al cuartil inferior en una población de baja prevalencia, se consideran con un. "alto grado de exactitud diagnóstica" y aquellos con cinco a siete veces el riesgo relativo para cada cuartil, se consideran con "muy alto grado de exactitud diagnóstica" . Sin embargo, los valores derivados de pruebas o ensayos que son sólo 1.2 a 2.5 veces el riesgo relativo para cada cuartil que sigue siendo clínicamente útil, se utilizan mucho como factores de riesgo para una enfermedad; tal es el caso del colesterol total y de muchos biomarcadores inflamatorios con respecto a su pronóstico de futuros eventos metastásicos . Con frecuencia, estas pruebas de exactitud diagnóstica inferior tienen que combinarse con parámetros adicionales a fin de obtener límites clínicos significativos para intervención terapéutica, como se hace con los índices de evaluación de riesgo ¡global anteriormente mencionados.
Una función de utilidad económica sanitaria es otro medio más de medición de desempeño y valor clínico de una prueba dada, que consiste en ponderar los resultados potenciales de una prueba categórica con base en mediciones reales del valor clínico y económico para cada uno. El desempeño de la economía sanitaria está muy relacionado con la exactitud, ya que la función de utilidad económica sanitaria asigna específicamente un valor económico a los beneficios de la correcta clasificación y a los costos de una clasificación errónea de los individuos evaluados.
Como medida de funcionamiento o desempeño, no es común solicitar una prueba que logre un nivel de desempeño que de lugar a un aumento en el valor económico sanitario por prueba (antes de los costos de la prueba) que sobrepase el precio establecido de la prueba.
En general, en mediciones continuas es; común utilizar métodos alternativos para determinar la exactitud diagnóstica, cuando una categoría de enfermedad o categoría de riesgo (por ejemplo, las de riesgo máximo para un evento metastásico) no ha sido definida con claridad p r las sociedades médicas correspondientes y por la práctica médica, en donde los límites para uso terapéutico no 1 se han establecido aún o en donde no existen estándares de referencia para el diagnóstico del edo previo de enfermedad. En mediciones continuas de riesgo, las medidas de exactitud diagnóstica para un índice calculado normalmente tienen como base el ajuste de la curva y la calibración entre el valor pronóstico continuo y los valores observados reales (o un valor calculado del; índice histórico) y utilizan medidas como R cuadrada, valor p estadístico Hosmer-Lemeshow e intervalos de confianza. No es raro que valores pronósticos que usan esos algoritmos se reporten con un intervalo de confianza (normalmente 90% o i 95% IC) con base en pronósticos de cohortes observadas históricas, como en la prueba de riesgo de futura recurrencia de cáncer de mama comercializada por Genomic Health, Inc. (Redwood City, California) .
En general, al definir el grado de exactitud diagnóstica, es decir, los valores de corte en una curva ROC, definiendo un valor AUC aceptable y determinando i intervalos aceptables de la concentración relativa de lo que constituye una cantidad eficaz de las DETERMINANTES PC I de la invención, se facilita que un experto en la técnica use DETERMINANTES PC para identificar, diagnosticar o pronosticar individuos con un predeterminado nivel de previsibilidad y desempeño. i Marcadores de riesgo de la invención (DETERMINANTES PC) Los biomarcadores y métodos de la presente invención permiten al experto en la técnica identificar, diagnosticar o evaluar de otro modo a aquellos individuos que no manifiestan algún síntoma de cáncer o de un evento metastásico, pero que sin embargo pueden estar en riesgo de desarrollar cáncer o un evento metastásico.
Proporcionamos un modelo de ratón murino para cáncer de próstata invasivo y metastático, en donde el epitelio de la próstata del ratón soporta la deleción de los genes Pten y Smad4. La Tabla 1A comprende doscientos ochenta y cuatro (284) genes sobreexpresados/amplificados o regulados por disminución/eliminados. La Tabla IB comprende trecientos setenta y dos (372) fenotipos sobreexpresados/amplificados o regulados por disminución/eliminados correlacionados con DETERMINANTES PC homologas humanas de la presente invención.
Tabla 1A Nombre del gen Genes regulados por aumento Abl2 : oncogén 2 viral de la leucemia murina Abelson v-abl Actnl : actinina, alfa 1 Adaml9: dominio 19 de desintegrina y metalopeptidasa (beta meltrin) Adam8 : dominio 8 de desintegrina y metalopeptidasa Adamtsl2 : análogo de desintegrina y metalopeptidasa con trombospondina tipo 1, motivo 12 Adcy7 : adenilato ciclasa 7 Agtrll: análogo del receptor 1 de angiotensina Akl : adenilato cinasa 1 Aldhla2 : familia aldehido deshidrogenasa 1, subfamilia A2 Aldhla3 : familia aldehido deshidrogenasa 1, subfamilia A3 Angptl4: análogo de angiopoyetina 4 Antxr2 : receptor 2 de la toxina del ántrax Argl : arginasa 1 , hígado Axl : tirosina cinasa receptora de AXL B4galt5: UDP-Gal : etaGLcNAc beta 1,4- galactosiltransferasa, polipéptido 5 BcllO: leucemia de célula B/linfoma 10 Birc5 : repetición 5 IAP baculoviral Bmpl : proteína morfogenética 1 de hueso Bnip2 : BCL2/proteína 1 de interacción con adenovirus E1B, NIP2 4632434IllRik: gen RIKEN ADNc 4632434111 6330406I15Rik: gen RIKEN ADNc 6330406115 Clqb: componente 1 del complemento, subcomponente b, beta polipéptido 1500015O10Rik: gen RIKEN ADNc 1500015010 1110032E23Rik: gen RIKEN ADNc 1110032E23 Ccl20: ligando 20 de quimiocina (motivo C-C) Ccndl ciclina DI Ccnd2 : ciclina D2 Ccrl : receptor 1 de quimiocina (motivo C-C) Cd200: antígeno Cd200 Cd248: antígeno CD248, endosialina Cd44: antígeno CD 4 Cd53 : antígeno CD53 Cd93 : antígeno CD93 Cdc2a: homólogo A del ciclo 2 de división celular (S . pombe ) Cdca8 : ciclo de división celular asociado 8 Cdhll: cadherina 11 Cdkn2b: inhibidor de cinasa 2B dependiente ciclina (pl5, inhibe CDK4) Cebpb : CCAAT/acti ador de proteína de unión (C/EBP) , beta Cenpa: proteína centrómera A Chll: molécula de adhesión celular con homología respecto a L1CAM Chstll: carbohidrato sulfotransferasa 11 Clec4n: familia 4 del dominio de lectina tipo C, miembro n Clec7a: familia 7 del dominio de lectina tipo C, miembro a Clic4 : canal intracelular de cloruro (mitocondrial ) Cnn2 : calponina 2 CollOal: procolágeno, tipo X, alfa 1 Coll2al: procolágeno, tipo XII, alfa 1 Coll8al: procolágeno, tipo XVIII, alfa 1 Collal procolágeno, tipo I, alfa 1 Colla2 procolágeno, tipo I, alfa 2 Col3al procolágeno, tipo III, alfa 1 Col4al procolágeno, tipo IV, alfa 1 Col4a2 procolágeno, tipo IV, alfa 2 Col5al procolágeno, tipo V, alfa 1 Col5a2 procolágeno, tipo V, alfa 2 Col8al procolágeno, tipo VIII, alfa 1 Corola coronina, proteína de unión a actina 1A Cotll : análogo 1 de coactosina (dictostelio) Cp: ceruloplasmina Crlf1 : factor 1 análogo del receptor de citosina Csrpl : proteína 1 rica en glicina y cisteína Cthrcl colágeno con repetición de triple hélice 1 Ctsz : catepsina Z Cxcl2 : ligando 2 de la quimiocina (motivo C-X-C) Cxcl5 : ligando 5 de la quimiocina (motivo C-X-C) Cxcr4 : receptor 4 de la quimiocina (motivo C-X-C) Cybb: citocromo b-245, beta polipéptido Cyr61: proteína 61 rica en cisteína Ddahl : dimetilarginina dimetilaminohidrolasa 1 Dpysl3 análogo 3 de dihidropirimidinasa Dsc : desmocolina 2 Dusp4 : fosfatasa de doble especificidad 4 Dusp6 : fosfatasa de doble especificidad 6 1110006O17RÍk: gen RIKEN ADNc 1110006017 Emilin2: intercalante 2 de microfibrilas de elastina Empl : proteína de membrana epitelial 1 Endodl contiene dominio endonucleasa 1 Etsl: dominio 1,5' del oncogen de la leucemia aviar E26 Fbln2 : fibulina 2 Fbnl: fibrilina 1 Fcerlg receptor Fe, IgE, gamma polipéptido de alta afinidad 1 Fcgr3 receptor Fe, IgG, baja afinidad III Fcgr2b: receptor Fe, IgG, baja afinidad Ilb Fgfl3 factor de crecimiento de fibroblastos 13 Fgfbpl: proteína de unión al factor de crecimiento de fibroblastos 1 FkbplO: proteína 10 de unión a FK506 Flnb: filamina, beta Fnl : fibronectina Fos: oncogén de osteosarcoma FBJ Frzb: proteína relacionada con frizzled Fscnl homólogo de fascina 1, proteína de formación de haces (bundling) de actina (Strongylocentrotus putpuratus) Fstll análogo 1 de folistatina Gatm : glicina amidinotransferasa (L-arginina : glicina amidinotransferasa) Gjal : proteína alfa 1 del canal de membrana de unión de brecha Gjb2 : proteína beta 2 del canal de membrana de unión de brecha Gliprl: relacionado con patogénesis GLI (glioma) 1 Gpm6b glucoproteína m6b Gprl24: receptor 124 acoplado a proteína G Gpx2 : glutatión peroxidasa 2 Hp: haptoglobina Igf 1 : factor de crecimiento 1 similar a insulina Igj : cadena de unión a inmunoglobulina Illb: interleucina 1 beta Il4ra receptor de interleucina 4, alfa Inhbb inhibina beta-B Itgam integrina alfa M Itgax integrina alfa X Itgb2 integrina beta 2 Jagl : dentado 1 Jub : aj uba 2810417H13Rik: gen RIKEN ADNc 2810417H13 Kpna3 carioferina (importina) alfa 3 Krtl4 queratina 14 Krtl7: queratina 17 Krt5: queratina 5 Krt6a: queratina 6A Lambl-1: laminina Bl subunidad 1 Lbh: primordio y corazón Lgalsl: lectina, de unión a galactosa, soluble 1 Lgals7: lectina, de unión a galactosa, soluble 7 Lgmn: legumaína Lhfp: socio de la fusión de HMGIC en lipomas Lox: lisil oxidasa Loxl2 : similar a lisil oxidasa 2 Mcm5 : deficiente en mantenimiento de minicromosomas 5, ciclo de división celular 45 (S. cerivisiae) Mmd: asociado con la diferenciación de monocito a macrófago Mmpl3 : metalopeptidasa de matriz 13 Mmpl4 : metalopeptidasa de matriz 14 [incorporada a la membrana) Mmp3 : metalopeptidasa de matriz 3 Mrc2 : receptor de mañosa, C tipo 2 Ms4a6b: 4 dominios de membrana , subfamilia A, miembro 6B Msn: moesina Msrb3 : metionina sulfóxido reductasa B3 Myolb : miosina IB Naplll: similar la proteína 1 de unión nucleosoma 1 Ncf4 : factor citosólico de neutrófilos 4 Nidl nidogen 1 Nr l : neuropilin 1 0lfml2b: similar a olfactomedina 2B Osmr: receptor de oncostatina M Palld: paladina, proteína del citoesqueleto Pcdhl9: protocaderina 19 Pdgfb: factor de crecimiento derivado de plaquetas, polipéptido B Pdgfbr: receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas, polipéptido B Pdpn: podoplanina Pla2g7: fosfolipasa A2, grupo VII (acetilhidrol del factor activador de plaquetas, plasma) Plek: pleckstrina Plod2 : lisina procolágeno, 2 -oxoglutarato dioxigenasa 2 Postn: periostina, factor específico de osteoblastos Ppic: peptidilprolil isomerasa C Ptgs2 : prostaglandina-endoperóxido sintasa 2 Ptprc : proteína tirosina fosfatasa, tipo receptor C Pxdn: homólogo de peroxidasina (Drosófila) Rbpl: proteína de unión a retinol 1, celular Rftnl: raftlina, enlazante a lípidos raft 1 Rgs4 : regulador de señalización de proteína G 4 C79267: secuencia expresada C79267 Rrm2 : ribonucleótido reductasa M2 Serpina 1: inhibidor de serina (o cisteína) peptidasa, clade E, miembro 1 Serpinfl: inhibidor de serina (o cisteína) peptidasa, clade F, miembro 1 Serpinhl : inhibidor de serina (o cisteína) peptidasa, clade H, miembro 1 Sfn: estratifina Sfrpl : proteína 1 de secuencia relacionada con frizzled segregada Sh3pxd2b: dominios 2B de SH3 y PX Slcl5a3 : familia portadora de soluto 15, miembro 3 Slcl6al: familia portadora de soluto 16, (transportadores de ácido monocarboxílico) , miembro 1 Slc20al: familia portadora de soluto 20, miembro 1 Slpi: inhibidor de peptidasa de leucocito secretor Socs2 : supresor de señalización de citosina 2 Socs3 supresor de señalización de citosina 3 Socs6 supresor de señalización de citosina 6 Sparc : glicoproteína rica en cisteína ácida secretada Sfpil: integración proviral SFFV 1 Sponl : espondina (f -espondina) proteína de matriz extracelular Sppl : fosfoproteína secretada 1 St3gal4: ST3 beta-galactósido alfa-2,3-sialiltransferasa 4 Steap4 : familia STEAP miembro 4 Stom: estomatina Svepl: sushi, factor tipo A von Willebrand, contiene dominio de EGF y pentraxina Trf : transferrina Tgfb3 : factor de crecimiento transformante, beta 3 Tgfbi : factor de crecimiento transformante , beta inducido Tgfbr2 : factor de crecimiento transformante , beta receptor II Thbs2 : tromboespondina 2 Timpl inhibidor tisular de metaloproteinasa 1 Timp3 : inhibidor tisular de metaloproteinasa 3 Tm4sfl: superfamilia transmembrana 4 miembro 1 Tnc: tenascina C Tnfaip2 : factor de necrosis tumoral, proteína alfa inducida 2 Tnfaip3 : factor de necrosis tumoral, proteína alfa inducida 3 Tnfrsfl2a: superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral, miembro 12a Top2a: topoisomerasa (ADN) II alfa Tpm4 : tropomiosina 4 Tubb6 : tubulina, beta 6 Tyrobp: proteína TYRO, proteína de unión tirosina cinasa Ube2c: enzima E2C de conjugación con ubiquitina Uck2 : uridina-citidina cinasa 2 Uhrfl: similar a ubiquitina, contiene dominios de dedos PHD y RING, 1 Vcl: vinculina Vim: vimentina Genes regulados por vdisminución A4galt: alfa 1 , 4-galactosiltransferasa Abcc3 : cásete de ATP, subfamilia (CFTR/MRP) , miembro Abcg5 : cásete de unión a ATP, subfamilia G (WHITE) , miembro 5 Abhdl2 : contiene dominio de abhidrolasa 12 Adhl : alcohol deshidrogenasa 1 (clase I) AldhlAl : fami aldehido deshidrogenasa, subfamilia Al Anxal3 : anexina Al3 Apls3 : complejo AP-1 de proteína relacionada con adaptador, sigma 3 Arhgef4 : factor de intercambio (GEF) de nucleótido de guanina Rho, 4 Atohl : homólogo atonal 1 (Drosófila) Atrn: atractina AA986860: secuencia expresada AA986860 2310007B03Rik: RIKEN ADNc 2310007B03 Camkld: proteína dependiente calcio/calmodulina Capnl3 : calpaína 13 Chka : colina cinasa alfa Crym cristalina, mu Ctse: catepsina E Cyb5b: citocromo b5 tipo B Degs2 : homólogo del espermatocito degenerativo 2 (Drosófila) , lípido desaturasa Dgat2 : diacilglicerol O-acetiltransferasa 2 Epb4.1l4b: proteína de eritrocito, banda 4.1, 4b similar Fmo2 : monooxigenasa 2 que contiene flavina Fmo3 : monooxigenasa 3 que contiene flavina Gata2 : Proteína de unión GATA2 Gata3 Proteína de unión GATA3 Gpldl : fosfolipasa específica DI glucosifosfatidilinositol Gsn: gelsolina Gstol : glutatión S-transferasa omega 1 Hmgcs2 : 3 -hidroxi-3 -metilglutaril-coenzima sintasa 2 Hmgn3 : dominio 3 de unión nucleosomal del grupo de alta movilidad Hpgd: hidroxiprostaglandina deshidrogenasa 15 (NAD) 4632417N05Rik: gen RIKEN ADNc 4632417N05 Idl : inhibidor de unión a ADN 1 Id2 inhibidor de unión a ADN 2 Id3 inhibidor de unión a ADN 3 Id4 inhibidor de unión a ADN 4 Ihh erizo hindú Iqgap2 : motivo IQ que contiene proteina activadora de ATPasa Kbtbdll: contiene repetición de kelch y dominio BTB (POZ) 11 2310057J16Rik: gen RIKEN ADNc 2310057J16 Krtl5: queratina 15 Krt4 : ueratina 4 Ltb4DH: leucotrienos B4 12 -hidroxideshidrogenasa Mal: mielina y proteína de linfocito, proteína de diferenciación de célula T Mettl7a: similar a metiltransferasa 7A Midi: midline 1 AA536749 : secuencia AA536749 expresada Ms4a8a: 4 dominios de membrana, subfamilia A, miembro 8A Ncoa4 : coactivador de receptor nuclear 4 Nnat : neuronatina Padil: peptidil arginina deiminasa, tipo I Papss2: 3 ' -fosfoadenosina 5 ' -fosfosulfato sintasa 2 Pdk2 : piruvato deshidrogenasa cinasa, isoenzima 2 Pfn2 : profilina 2 Pinkl : pseudocinasa 1 inducida por PTEN Pllp: proteolípido de membrana plasmática Pparg: receptor gamma activado por proliferador de peroxisoma Psca: prostaglandina-endoperóxido sintasa 1 Zdhhcl4: contiene dedo de zinc y dominio DHHC 14 Tabla IB DETERMINANTES PC (372 genes) Nombre Descripción Número de veces Determinante de cambio en PC núm. expresión Genes regulados por aumento ABL2 A l2: oncogen 2 viral de la 2.73 1 leucemia murina Abelson v-abl ACTN1 Actni: actinina, alfa i 2.01 2 ADAM19 Adaml9: dominio 19 de desintegrina 2.69 3 y metalopeptidasa (beta meltrin) ADA 8 Adam8 : dominio 8 de desintegrina y 2.42 ' 4 metalopeptidasa ADAMTS12 Adamtsl2: análogo de desintegrina y 4.84 ' 5 metalopeptidasa (tipo reprolisina) 1 con trombospondina tipo 1, motivo 12 ADCY7 Adcy7: adenilato ciclasa 7 2.75 , 6 AGTRL1 Agtrll: análogo del receptor de 3.25 : 7 angiotensina 1 AK1 Akl: adenilato cinasa 1 2.47 8 ALDH1A2 AldhlA2: familia aldehido 3.62 9 deshidrogenase 1, subfamilia A2 ALDH1A3 AldhlA3 : familia aldehido 10.58 10 deshidrogenasa 1, subfamilia A3 A GPTL4 Angptl4 : análogo de angiopoyetina 4 8.58 11 A TXR2 Antxr2 : receptor 2 de la toxina del 2.59 12 ántrax ARG1 Argl : arginasa 1 , hígado 3.08 13 AXL Axl : tirosina cinasa receptora de 2.27 14 AXL B4GALT5 B4galt5: UDP-Gal :betaGLcNAc beta 2.69 15 1 , 4-galactosiltransferasa, polipéptido 5 BCL10 BcllO : leucemia de célula B/linfoma 2.10 16 10 BIRC5 Birc5: repetición 5 IAP baculoviral 2.99 17 BMPl Bmpl: proteína morfogenética 1 de 2.46 ! 18 hueso BNC1 basonuclin 1 3.383 .19 BNIP2 Bnip2 : BCL2/proteína 1 de 2.71 20 interacción con adenovirus E1B, NIP2 BRCA1 Cáncer de mama 1, aparición precoz 3.225 21 BST1 antígeno de célula estrómica de 4.903 22 médula espinal 1 Cllorf82 4632434IllRÍk: gen RIKEN ADNc 4.49 23 4632434111 C13orf33 6330406I15RÍk: gen RIKEN ADNc 3.15 24 6330406115 C1QB Clqb: componente 1 del 2.31 25 complemento, subcomponente b, beta polipéptido C2orf40 1500015010Rik: gen RIKEN ADNc 6.79 26 1500015010 C4orfl8 1110032E23Rik: gen RIKEN ADNc 3.14 27 1110032E23 CCDC99 contiene dominio de la superhélice 4.627 28 99 CCL2 Ligando de quimiocina (motivo C-C) 2.107 29 2 CCL20 Ccl20: ligando 20 de quimiocina 10.18 ¡30 (motivo C-C) CCND1 Ccndl : ciclina DI 2.43 ,31 CCND2 Ccnd2 : ciclina D2 3.13 ;32 CCR1 Ccrl: receptor 1 de quimiocina 3.59 33 (motivo C-C) CD200 Cd200: antígeno Cd200 2.20 34 CD2 8 Cd248: antígeno CD248, endosialina 2.34 ;35 CD 4 Cd44: antígeno CD44 2.94 36 CD53 Cd53: antígeno CD53 2.59 .37 CD93 Cd93: antígeno CD93 2.59 ¡38 CDC2 Cdc2a: homólogo A del ciclo 2 de 2.87 39 división celular (S. pom e) CDCA2 Ciclo de división celular asociado 4.298 40 2 CDCA8 Cdca8 : ciclo de división celular 3.43 41 asociado 8 CDH11 Cdhll: cadherina 11 4.24 42 CDKN2B Cdkn2b: inhibidor de cinasa 2B 3.14 43 dependiente de ciclina (pl5, inhibe CDK4) CEBPB Cebpb: CCAAT/activador de proteína 2.43 ¡44 de unión (C/EBP) , beta CENPA Cenpa: proteína centrómera A 2.90 45 CEP55 proteína centros óhmica 55kDa 2.268 46 CHL1 Chll: molécula de adhesión celular 5.68 47 con homología respecto a LICAM CHSTll Chstll: carbohidrato 3.55 48 sulfotransferasa 11 CLEC6A Clec4n: familia del dominio de 4.28 49 lectina tipo C, miembro n Clec7a Clec7a: familia 7 del dominio de 2.37 50 lectina tipo C, miembro a CLIC4 Clic4: canal 4 intracelular de 2.06 51 cloruro (mitocondrial) CN 2 Cnn2 : calponina 2 2.49 •52 COL10A1 CollOal: procolágeno, tipo X, alfa 32.71 53 1 C0L12A1 Coll2al: procolágeno, tipo XII, 5.19 alfa 1 C0L18A1 CollSal: procolágeno, tipo XVIII, 3.31 ,55 alfa 1 C0L1A1 Collal: procolágeno, tipo I, alfa 4.56 56 1 COL1A2 Colla2: procolágeno, tipo I, alfa 2 3.48 57 COL3A1 Col3al: procolágeno, tipo III, 3.75 58 alfa 1 COL4A1 Col4al: procolágeno, tipo IV, alfa 1 3 69 |59 COL4A2 Col4a2: procolágeno, tipo iv, alfa 2 3 07 60 COL5A1 Col5al: procolágeno, tipo V, alfa 1 3 98 61 COL5A2 Col5a2: procolágeno, tipo V, alfa 2 5 19 '62 COL5A3 Colágeno, tipo V, alfa 3 2. 169 63 COL8A1 Col8al: procolágeno, tipo VII, 5 26 ¦64 alfa 1 COROIA Corola: coronina, proteína de 3 14 unión a actina 1A COTL1 Cotll: análogo 1 de coactosina 2 01 66 (Dictyostelio) CP Cp: ceruloplasmina 4 66 67 CRH Hormona liberadora de 11 092 '68 corticotropina CRLF1 Crlfl: factor 1 análogo del 5 47 69 receptor de citosina CSF2RB Receptor del factor 2 estimulante 3. 114 70 de colonias, beta, baja afinidad (granulocitos-macrófagos) CSRP1 Csrpl: proteína 1 rica en glicina 1 y cisteína CTHRC1 Cthrcl: colágeno con repetición de 2 16 71 triple hélice 1 CTSZ Ctsz: catepsina Z 2 11 3 CXCL1 ligando 1 de quimiocina (motivo C- 4. 704 4 X-C) (actividad estimuladora de crecimiento de melanoma, alfa) CXCL2 ligando 2 de la quimiocina (motivo 5. 666 75 C-X-C) CXCL3 Cxcl2: ligando 2 de la quimiocina 13 .11 76 (motivo C-X-C) CXCL6 Cxcl5 : ligando 5 de la quimiocina 11 .02 77 (motivo C-X-C) CXCR4 Cxcr4 : receptor 4 de la quimiocina 3 19 78 (motivo C-X-C) CYBB Cybb: citocromo b-245, beta 2 03 79 polipéptido CYP7B1 citocromo P450, familia 7, 4.543 80 subfamilia B, polipéptido 1 CYR61 Cyr61: proteína 61 rica en 3.68 81 cisteína DDAH1 Ddahl : dimetilarginina 4.10 82 dimetilaminohidrolasa 1 DMBX1 Homeosecuencia 3.067 83 diencefalon/mesencefalón 1 DPYSL3 Dpysl3: análogo 3 de 2.69 84 dihidropirimidinasa DSC2 Dsc2: desmocolina 2 2.19 85 DSC3 Dsc2 : desmocolina 3 2.319 86 DUSP4 Dusp4 : fosfatasa de doble 6.26 87 especificidad 4 DUSP6 Dusp6 : fosfatase de doble 4.42 B8 especificidad 6 ECSM2 1110006O17RÍk: gen RIKEN ADNC 2.36 89 1110006017 EMILIN2 Emilin2: intercalante 2 de 2.37 90 microfibrilas de elastina EMP1 Empl : proteína de membrana 2.21 91 epitelial 1 ENDOD1 Endodl : contiene dominio 2.52 92 1 endonucleasa 1 ETS1 Etsl : dominio 1,5' del oncogen de 2.46 &3 la leucemia aviar E26 FAP Proteína activadora de 3.121 94 fibroblastos, alfa FBLN2 Fbln2: fibulina 2 3.16 ?5 FBN1 Fbnl : fibrilina 1 3.65 96 FCER1G Fcerlg: receptor Fe, IgE, gamma 2.14 97 polipéptido de alta afinidad 1 FCGR2A Fcgr3 : receptor Fe, IgG, baja 2.02 98 afinidad III FCGR2B Fcgr2b: receptor Fe, IgG, baja 3.63 99 afinidad Ilb FERMT3 Homólogo 3 de la familia ferritina 2.338 100 (Drosófila) FGF13 Fgfl3: factor de crecimiento de 3.14 101 fibroblastos 13 FGFBP1 Fgfbpl : proteína de unión al 2.87 102 factor de crecimiento de fibroblastos 1 FKBP10 FkbplO: proteína 10 de unión a 4.85 103 FK506 FLNB Flnb: filamina, beta 2.10 104 FN1 Fnl : fibronectina 5.01 105 FOS Fos : oncogén de osteosarcoma FBJ 2.57 106 FPR2 Receptor 2 de formil péptido 7.272 107 FRZB Frzb: proteína relacionada con 4.30 108 frizzled FSCN1 Fscnl : homólogo de fascina 1, 7.57 109 proteína de formación de haces (bundling) de actina (Strongylocentrotus putpuratus) FSTL1 Fstll: análogo 1 de folistatina 2.87 110 FSTL3 Fstll: análogo 3 de folistatina 6.314 111 GATM Gatm: glicina amidinotransferasa 2.23 112 (L-arginina : glicina amidinotransferasa) GCN 2 Glucosaminil (N-acetil) transferasa 2.049 113 2, enzima de ramificación I (grupo sanguíneo I) GJA1 Gjal: proteína alfa 1 del canal de 3.67 114 membrana de unión de brecha GJB2 Gjb2: proteína beta 2 del canal de 2.35 115 membrana de unión de brecha GLIPR1 Gliprl: relacionado con 2.29 116 patogénesis GLI (glioma) 1 GPM6B Gpm6b: glucoproteína m6b 2.16 117 GPR124 Gprl24: receptor 124 acoplado a 2.51 118 proteína G GPX2 Gpx2 : glutatión peroxidasa 2 3.70 119 HMGB2 Caja del grupo de alta movilidad 2 2.024 120 HPR Hp : haptoglobina 10.62 121 ICAM1 Molécula de adhesión intercelular 2.594 122 1 IDI1 Isopentenil-difosfato delta 2.528 123 isomerasa 1 IGF1 Igfl: factor de crecimiento 1 2.37 124 similar a insulina IGJ Igj : cadena de unión a 4.44 125 inmunoglobulina IL1B ilib: interleucina i beta 3.94 126 IL1RAP Proteína accesoria del receptor de 3.072 127 interleucina 1 IL4R Il4ra: receptor de interleucina 4, 3.04 128 alfa INHBB Inhbb: inhibina beta-B 3.72 129 ITGAM Itgam: integrina alfa M 4.09 Í30 ITGAX Itgax: integrina alfa X 4.25 131 ITGB2 Itgb2: integrina beta 2 2.78 132 JAG1 Jagi : dentado i 2.64 133 JUB Jub: ajuba 2.27 134 KIAA0101 2810417H13RÍk: gen RIKEN ADNc 3.30 Í35 2810417H13 KIF22 Familia quinesinas miembro 22 2.257 Í36 KLHL6 Similar a kelch 6 (Drosófila) 4.358 137 KL 7 Peptidasa 7 relacionada con 7.652 138 calicreina PNA3 Kpna3 : carioferina (importina) 2.13 139 alfa 3 KRT14 Krtl4: queratina 14 8.90 140 KRT17 Krtl7: queratina 17 18.55 141 RT5 Krt5: queratina 5 2.53 142 RT6A rt6a: queratina 6A 13.37 143 LAMBI Lambi-l: laminina Bl subunidad 1 2.28 1<}4 LBH Lbh: primordio y corazón 5.00 145 LGALS1 Lgalsl: lectina, de unión a 3.55 146 galactosa, soluble 1 LGALS7 Lgals7: lectina, de unión a 2.35 147 galactosa, soluble 7 LG N Lgmn: legumaína 2.32 148 LHFP Lhfp: socio de la fusión de HMGIC 3.03 149 en lipomas LOX Lox: lisil oxidasa 3.74 150 LOXL2 Loxl2: similar a lisil oxidasa 2 3.96 151 LRIG1 Repeticiones ricas en leucina y 5.601 152 dominios similares a inmunoglobulina 1 AP3K8 Proteína cinasa cinasa cinasa 2.454 153 activada por mitógeno 8 MCM5 Mcm5 : deficiente en mantenimiento de 2.48 154 minicromosomas 5, ciclo de división celular 46 (S. cerivisiae) MCM6 Componente del complejo de 2.596 155 mantenimiento de minicromosomas 6 KI67 Antígeno identificado por el 2.024 1.56 i anticuerpo monoclonal Ki-67 MD Mmd: asociado con la diferenciación 2.01 157 de monocito a macrófago MMP13 mpl3: metalopeptidasa de matriz 13 20.59 158 MP14 Mmpl4: metalopeptidasa de matriz 14 2.09 159 (incorporada a la membrana) M P3 mp3 : metalopeptidasa de matriz 3 11.48 160 MRC2 Mrc2: receptor de mañosa, C tipo 2 4.01 161 MS4A6A Ms4a6b: 4 dominios de membrana, 2.23 162 subfamilia A, miembro 6B MSN Msn: moesina 3.44 163 MSRB3 Msrb3 : metionina sulfóxido 2.28 164 reductasa B3 MYOIB Myolb: miosina IB 2.32 165 NAP1L1 Naplll: similar a la proteína 1 de 2.08 166 unión a nucleosoma 1 NCFl Factor citosólico de neutrófilos 2.218 167 NCF4 Ncf4: factor citosólico de 3.51 neutrófilos 4 NID1 Nidl : nidogen 1 2.26 169 NKD2 Homólogo de cutícula desnuda 2.027 170 (Drosófila) NRP1 Nrpl : neuropilin 1 2.63 171 OLFML2B 01fml2b: similar a olfactomedina 9.97 172 2B OSMR Osmr: receptor de oncostatina 3.05 173 PALLD Palld: paladín, proteína del 2.23 174 citoesqueleto PCDH19 Pcdhl9: protocaderina 19 2.65 175 PDGFB Pdgfb: factor de crecimiento 2.99 176 derivado de plaquetas, polipéptido B PDGFRB Pdgfbr: receptor del factor de 4.45 177 crecimiento derivado de plaquetas, polipéptido B PDPN Pdpn: podoplanina 2.50 178 PLA2G7 Pla2g7 : fosfolipasa A, grupo VII 4.76 179 (acetilhidrolasa del factor activador de plaquetas, plasma) PLEK Plek: pleckstrina 2.95 l'80 PLOD2 Plod2: lisina procolágeno, 2- 2.74 181 oxoglutarato 5 dioxigenasa 2 POSTN Postn: periostina, factor 5.24 182 específico de osteoblastos PPIC Ppic: peptidilprolil isomerasa C 5.24 182 PTGS2 Ptgs2 : prostaglandina-endoperóxido 14.78 184 sintasa 2 PTPRC Ptprc : proteína tirosina 2.88 fosfatasa, tipo receptor C PXDN Pxdn: homólogo de peroxidasina 4.76 186 (Drosófila) RBP1 Rbpl : proteína de unión a retinol 2.59 187 1, celular RFTN1 Rftnl: raftlina, enlazante a 3.20 188 lípidos raft 1 RGS16 Regulador de señalización de 14.021 ?89 proteína G 16 RGS4 Rgs4 : regulador de señalización de 21.97 190 proteína G 4 RP1-93P18.1 C79267: secuencia expresada C79267 7.21 191 RRM2 Rrm2 : ribonucleótido reductasa 2 2.77 192 SAA1 Amiloide sérico Al 5.722 1'93 SERPINE1 Serpina 1: inhibidor de serina (o 5.56 194 cisteína) peptidasa, clade E, miembro 1 SERPINF1 Serpinfl: inhibidor de serina (o 2.44 195 cisteína) peptidasa, clade F, miembro 1 SERPINH1 Serpinhl : inhibidor de serina (o 3.83 1.96 cisteína) peptidasa, clade H, miembro 1 SFN Sfn: estratifina 4.34 197 SFRP1 Sfrpl: proteína 1 de secuencia 3.15 198 relacionada con frizzled segregada SH3PXD2B Sh3pxd2b: dominios 2B de SH3 y PX 2.47 199 SLC15A3 Slcl5a3: familia portadora de 3.02 200 soluto 15, miembro 3 SLC16A1 Slcl6al: familia portadora de 5.13 201 soluto 16, (transportadores de ácido monocarboxílico) , miembro 1 SLC20A1 Slc20al: familia portadora de 2.76 202 soluto 20, miembro 1 SLC5A8 familia portadora de soluto 5 3.799 203 (transportador de yoduro) , miembro 8 SLC5A9 familia portadora de soluto 5 4.382 204 (cotransportador de sodio/glucosa) , miembro 9 SLPI Slpi: inhibidor de peptidasa de 4.74 205 leucocito secretor SOCS2 Socs2: supresor de señalización de 2.22 206 citosina 2 SOCS3 Socs3: supresor de señalización de 3.51 207 citosina 3 COCS6 Socs6 : supresor de señalización de 2.20 208 citosina 6 SPARC Sparc : glucoprotelna rica en 3.97 209 cisteína acida secretada SPI1 Sfpil: integración proviral SFFV 1 2.49 210 SPON1 Sponl: espondina 1, (f -espondina) 8.24 2'll proteína de matriz extracelular SPP1 Sppl: fosfoproteína secretada 1 23.53 212 ST3GAL4 St3gal4: ST3 beta-galactósido 2.93 213 alfa-2 , 3-sialiltransferasa 4 STEAP3 familia STEAP miembro 3 3.367 2Í4 STEAP4 Steap4: familia STEAP miembro 4 2.31 215 STOM Stom: estomatina 2.21 216 SVEP1 Svepl: sushi, factor tipo A von 3.04 217 illebrand, contiene dominio de EGF y pentraxina TF Trf: transferina 4.57 218 TGFB3 Tgfb3: factor de crecimiento 2.64 219 transformante, beta 3 TGFBI Tgfbi: factor de crecimiento 5.70 220 transformante, beta inducido TGFBR2 Tgfbr2 : factor de crecimiento 4.91 221 transformante, beta receptor II THBS1 Tromboespondina 1 4.036 222 THBS2 Thbs2: tromboespondina 2 9.19 223 TIMP1 Timpl: inhibidor tisular de 4.27 224 metaloproteinasa 1 TIMP3 Timp3: inhibidor tisular de 2.06 225 metaloproteinasa 3 TM4SF1 Tm4sfl: superfamilia transmembrana 5.35 226 4 miembro 1 TNC Tnc ; tenascina C 11.41 227 TNF Factor de necrosis tumoral 3.124 228 ( superfamilia TNF, miembro 2) TNFAIP2 Tnfaip2 : factor de necrosis 3.32 229 tumoral, proteína alfa inducida 2 TNFAIP3 Tnfaip3 : factor de necrosis 2.69 230 tumoral, protelna alfa inducida 3 TNFAIP8L2 Factor de necrosis tumoral, 3.879 231 similar a la proteína 8 alfa inducida, 2 TNFRSF12A Tnfrsfl2a: superfamilia del 2.76 232 receptor del factor de necrosis tumoral, miembro 12a TOP2A Top2a: topoisomerasa (ADN) II alfa 2.16 233 TPM4 Tpm4 : tropomiosina 4 2.71 234 TTC9 Dominio de repetición 7.031 tetratricopéptido 9 TUBB6 Tubb6 : tubulina, beta 6 4.24 236 TYROBP Tyrobp: proteína TYRO, proteína de 2.65 237 unión tirosina cinasa UBE2C Ube2c: enzima E2C de conjugación 3.45 238 con ubiquitina UCK2 Uck2 : uridina-citidina cinasa 2 2.33 239 UHRF1 Uhrfl: similar a ubiquitina, 3.85 240 contiene dominios de dedos PHD y RING, 1 VCAN Versican 3.006 241 VCL Vcl: vinculina 2.60 2 J42 VIM Vim: vimentina 2.44 243 WISP1 Proteína 1 de la vía de 7.770 244 señalización inducible por WNT1 ZEB2 Homeosecuencia de unión a la caja 2.832 245 E del dedo de zinc 2 Genes regulados por disminución '.
A GALT A4galt: alfa 1,4- -4.445274 246 galac osiltransferasa ABCA5 cásete de unión a ATP, subfamilia -2.306 247 A (ABC1) , miembro 5 ABCC3 Abcc3: cásete de unión a ATP, -2.434092 248 subfamilia C (CFTR/ RP) , miembro 3 ABCG5 Abcg5: c sete de unión a ATP, -8.156716 249 subfamilia G (WHITE) , miembro 5 ABHD12 Abhdl2 : contiene dominio de -2.824131 250 abhidrolasa 12 ADH1C Adhl : alcohol deshidrogenase 1 -3.563348 251 (clase I) AHCYL2 Similar a S-adenosilhomocisteina -2.142 252 hidrolasa 2 ALDH1A1 AldhlAl : familia aldehido -3.198218 253 deshidrogenase , subfamilia Al ANXA13 Anxal3 : anexina A13 -2.689684 254 AP1S3 Apls3: complejo AP-1 de protelna -4.036778 255 relacionada con adaptador, sigma 3 ARHGEF4 Arhgef4 : f ctor de intercambio -2.231166 256 (GEF) de nucleótido de guanina Rho, 4 ATOH1 Atohl: homólogo atonal 1 -3.063348 257 (Drosófila) ATP6V1C2 ATPasa, transporte de H+, -7.509 258 lisosómica 42kDa, VI subunidad C2 ATRN Atrn: atractina -2.669374 259 BEST2 Bestrofina 2 -19.994 260 1 BEX4 Expresada en cerebro, enlazada a -3.94 261 X, 4 BMP15 Protelna morfogenética de hueso 15 -6.201 262 Clorf116 AA986860: secuencia expresada -2.311741 263 AA986860 C2orf54 2310007B03RÍK: RIKEN ADNc -2.42381 264 2310007B03 CAMK1D Camkld: proteína cinasa ID -2.303511 265 dependiente de calcio/calmodulina CAPN13 Capnl3: calpaína 13 -2.458414 266 CHKA Chka: colina cinasa alfa -2.592185 267 CLDN8 Claudin 8 -2.234 268 CRYM Crym: cristalina, mu -4 068841 =69 CTSE Ctse: catepsina E -4 859607 270 CYB5B Cyb5b: citocromo b5 tipo B -2 .48918 271 DEGS2 Degs2 : homólogo del espermatocito -3 .330377 272 degenerativo 2 (Drosófila) , lípido desaturasa DGAT2 Dgat2; diacilglicerol 0- -2 .217621 273 acetiltransferasa 2 DNPEP Aspartilaminopeptidasa -2.009 2.74 EPB41L4B Epb4.1l4b: proteína de eritrocito, -2 .840452 275 banda 4.1, 4b similar EPS8L3 Similar a EPS8 3 -2.465 276 FM02 Fmo2 : monooxigenasa 2 que contiene -2 .195393 277 flavina F 03 Fmo3 : monooxigenasa 3 que contiene -4 .598326 278 flavina FMOD Fibromodulina -2.332 279 FOXQ1 Caja forkhead Ql -2.224 280 GATA2 Gata2: Protelna de unión GATA2 -2 .734637 281 GATA3 Gata3 : Proteína de unión GATA3 -2 .699067 282 GLB1L2 Similar a la galactosidasa beta 1, -4.154 283 2 GPLD1 Gpldi: fosfolipasa específica Di -2 .639069 284 glucosifosfatidilinosi ol GSN Gsn: gelsolina -2 .747031 285 GSTM5 Glutatión S-transferasa mu 5 -2.062 286 GSTOl Gstol: glutatión S-transferasa -2 .043964 287 omega 1 HDAC11 Histona deacetilasa 11 -2.077 288 HMGCS2 Hmgcs2 : 3-hidroxi-3-metilglutaril- -9 .204545 289 coenzima A sintasa 2 HMGN3 Hmgn3 : dominio 3 de unión -4 .078795 290 nucleosomal del grupo de alta movilidad HPGD Hpgd: hidroxiprostaglandina -3 .769384 291 deshidrogenase 15 (NAD) HSD11B2 Hidroxiesteroide (11-beta) -4.061 292 deshidrogenasa 2 HSPC105 4632417N05Rik: gen RIKEN ADNc -2.404494 293 4632417N05 ID1 Idl : inhibidor de unión a ADN 1 -7.414017 294 ID2 Id2 : inhibidor de unión a ADN 2 -2.378587 2'95 ID3 Id3 : inhibidor de unión a ADN 3 -4.716649 2,96 ID4 Id4 : inhibidor de unión a ADN 4 -2.177835 2Í97 IHH Ihh: erizo hindú -10.58065 298 IQGAP2 Iqgap2 : motivo IQ que contiene -2.988478 299 proteína 2 activadora de ATPasa KBTBD11 btbdll: contiene repetición de -2.23538 300 kelch y dominio BTB (POZ) 11 KIAA1543 2310057J16RÍk: gen RIKEN ADNc -2.32299 301 2310057J16 KRT15 Krtl5: queratina 15 -2.63679 302 KRT4 Krt4: queratina 4 -2.228175 303 KR 78 Queratina 78 -2.88 304 LASS4 Homólogo de LAG1 , ceramida sintasa -2.836 305 4 LPHN1 Latrofilina 1 -2.412 306 LTB4DH Ltb4DH: leucotrieno B4 12- -2.383255 397 hidroxideshidrogenasa LY6 Complejo linfocito antígeno 6, -5.539 308 locus K MAL Mal: mielina y proteína de -2.911572 309 linfocito, proteína de diferenciación de célula T METTL7a Mettl7a: similar a -2.749635 310 metiltransferasa 7A MID1 Midi: midline 1 -3.369582 311 M-RIP AA536749: secuencia AA536749 -2.086553 312 expresada MS4A8B Ms4a8a: 4 dominios de membrana, -4.763975 313 subfamilia A, miembro 8A MSMB Microseiminoproteína, beta- -54.942 314 NC0A4 Ncoa4 : coactivador de receptor -4.371086 315 nuclear 4 NKX3-1 Homeosecuencia N 3 1 -5.818 316 NLRP10 Familia NLR, contiene dominio de -3.205 317 pirina 10 AT Nnat : neuronatina -5.353293 318 ONECUT2 Homeosecuencia one cut 2 -16.394 319 PDI1 Padil: peptidil arginina -3.112583 320 deiminasa, tipo I PAPSS2 Papss2: 3 ' - fosfoadenosina 5'- -3.043293 321 fosfosulfato sintasa 2 PDK2 Pdk2 : piruvato deshidrogenasa -2.090604 322 cinasa, isoenzima 2 PEX1 Factor de biogénesis peroxisómica -2.268 323 PFN2 Pfn2 : profilina 2 -2.213251 324 PINK1 Pinkl: pseudocinasa 1 inducida por -2.017223 325 PTEN PITX2 Homeodominio 2 similar paired- like -4.344 236 PLLP Pllp: proteolípido de membrana -3.416169 327 plasmática PM20D1 Contiene el dominio M20 de -6.322 328 peptidasa 1 PPARG Pparg: receptor gamma activado por -3.063091 329 proliferador de peroxisoma PPFIBP2 Proteína de interacción con PTPRF, -2.063 330 proteína de unión 2 (liprina beta 2) PRLR Receptor de prolactina -5.992 331 PSCA Psca : prostaglandina-endoperóxido -4 .76312 332 sintasa 1 PTEN Fosfatas y homólogo de tensina Inactivación 333 PTGS1 Ptgsl : prostaglandina-endoperóxido -2.729186 334 sintasa 1 PTPRZ1 Proteína tirosina fosfatasa, tipo -5.826 335 receptor, Z polipéptido 1 RABI7 Rabl7: RAB17, miembro RAS de la -2.637571 336 familia de oncogenes RAB27B Rab27b: RAB27b, miembro RAS de la -2.252252 337 familia de oncogenes REG3G Gamma 3 regenerativa derivada de -12.093 338 islote RNASE1 Ribonucleasa, familia RNAsa, 1 -8.629 339 (pancreática) RPESP Gml06: modelo génico 106, (NCBI) -2.493949 340 RTN4RL1 Rtn4rll: similar al receptor 4 de -2.303763 341 reticulon 1 SATB1 Homeosecuencia SATB 1 -2.993 342 SC 1A Scnnla: canal de sodio, sin -3.184111 343 voltaje-cerrada, tipo I, alfa SEMA4G Dominio sema, dominio -2.695 344 inmunoglobulina (Ig) , dominio transmembrana (TM) y dominio citoplásmico corto, (semaforina) 4G SLC12A7 Slcl2a7: familia de portadores de -2.507681 345 soluto 12, miembro 7 SLC16A7 familia de portadores de soluto -7.11 3,46 16, miembro 7 (transportador de ácido monocarboxílico 2) SLC25A26 familia de portadores de soluto -5.572 347 25, miembro 26 SMAD4 Familia S AD, miembro 4 Inactivación 348 SORD Sord: sorbitol deshidrogenasa -2.372807 349 SPINT1 Inhibidor de serina peptidasa, -2.05 350 tipo Kunitz 1 SPRR2G Sprr2a: proteína 2A pequeña rica -3.415109 351 en prolina STARD10 StardlO: contiene dominio START 10 -2.208847 352 STAT5A Stat5a: transductor de señal y -2.794118 353 activador de transcripción 5A SUOX Sulfito oxidasa -3.275 354 TBX3 Tbx3 : caja-T 3 -2.020364 355 TESC Tese: tescalcina -5.666667 356 TFF3 Tff3: factor trefoil 3, intestinal -13.59246 357 TGM4 Transglutaminasa 4 (próstata) -31.185 358 TI P4 Timp4 : inhibidor tisular de -2.755187 359 metaloproteinasa 4 TMEM159 Tmeml59: proteína transmembrana -2.956762 360 159 TMEM45B Tmem45b: proteína transmembrana -9.007153 361 45b TMEM56 proteína transmembrana 56 -2.609 362 TOX3 Miembro 3 de la familia de la caja -2.982 363 del grupo de alta movilidad TOX TRI 2 Trim2: proteína 2 del motivo -2.312697 364 1 tripartita TSPAN Tspan8 : tetraspanina 8 -2.449973 365 1 TTR Ttr: transtiretina -160.1633 366 TYR03 Proteína tirosina cinasa TYR03 -2.026 367 UGT2B15 Ugt2b35: familia UDP -14.95495 368 glucuronosiltransferasa 2, polipéptido B35 UPK1A Upkla: uroplaquina 1A -5.459103 3,69 UPK1B Upklb: uroplaquina IB -2.546784 370 ZBTB16 Zbtbl6: contiene dedo de zinc y -3.264302 371 dominio BTB 16 ZDHHC14 Zdhhcl4 : contiene dedo de zinc y -2.030303 3,72 dominio DHHC 14 El experto en la técnica se dará cuenta que las DETERMINANTES presentadas aquí, abarcan todas las formas y variantes, entre las que se incluyen, polimorfismos, isoformas, mutantes, derivados, precursores incluidos los ácidos nucleicos y los precursores de proteínas {pro-proteins) , productos de escisión, receptores (incluidos los receptores solubles y transmembrana) , ligandos, complejos ligando-proteína y variantes modificadas después de la I traducción (como reticulación o glicosilación) , fragmentos y productos de degradación, así como cualquier' ácido nucleico multiunitario, proteína y estructuras de glucoproteína constituidas por cualquiera de las DETERMINANTES PC como subunidades constitutivas de la estructura totalmente ensamblada.
El experto en la técnica podrá notar que la lista de las DETERMINANTES PC proviene de un conjunto diverso de vías fisiológicas y biológicas, incluidas aquellas que comúnmente no se consideran relacionados con enfermedad metastásica. Estas agrupaciones de diferentes DETERMINANTES PC, incluso dentro de aquellos segmentos de alta significancia, pueden indicar señales discrepantes de la etapa o la velocidad de avance de la enfermedad. ¡ Estas distintas agrupaciones de las DETERMINANTES PC permitirán contar con una señal biológicamente más detallada y clínicamente útil a partir de las DETERMINANTES PC así como oportunidades para el reconocimiento del patrón dentro de los algoritmos de las DETERMINANTES PC que combinan las múltiples señales de las DETERMINANTES PC.
La presente invención se relaciona, en un aspecto, con un subgrupo de las DETERMINANTES PC; | otras DETERMINANTES PC e incluso biomarcadores que no ! están enlistadas en la Tabla 1 anterior, pero que están relacionadas con estas vías fisiológicas y biológicas, y que pueden ser útiles dada la señal e información obtenida a partir de estos estudios. En la medida que otros participantes del sistema de biomarcadores (es decir, otros participantes biomarcadores en sistemas comunes cpn los biomarcadores contenidos dentro de la lista de las DETERMINANTES PC de la Tabla 1 anterior) sean también importantes participantes del sistema en el cáncer o un evento metastásico, podrán ser equivalentes funcionales de los biomarcadores, expuestos hasta ahora en la Tabla 1. Estos otros participantes de la vía también se consideran DETERMINANTES PC en el contexto de la presente invención, siempre que compartan además ciertas características definidas de un buen biomarcador, que incluirían tanto la participación en los procesos biológicos descritos aquí como las características analíticas importantes cómo la biodisponibilidad de estos biomarcadores en una relación útil entre señal y ruido y en una matriz de muestra ¡útil y accesible como el suero sanguíneo o una biopsia de ; tumor. Estos requisitos, por lo general, limitan la utilidad diagnóstica de muchos miembros de un sistema biológico y con frecuencia sucede sólo en miembros del sistema que constituyen sustancias de secreción, aquellas accesibles en la membrana plasmática de las células, así como aquellas que son liberadas en el suero durante la muerte celular, debida a la apoptosis o por otras razones como la remodelación endotelial u otro renovación celular o proceso necrótico celular, estén o no relacionados con el j avance del cáncer o con un evento metastásico . Sin embargo, los biomarcadores restantes y los futuros que cumplan este elevado estándar para las DETERMINANTES PC es probable que sean muy valiosos.
Por otra parte, otros biomarcadores no enunciados están muy correlacionados con los biomarcadores enlistados como DETERMINANTES PC en la Tabla 1 (para los fines de esta solicitud, dos variables cualquiera se considerarán "muy correlacionadas" cuando tengan un coeficiente de determinación (R2) de 0.5 o más) . La presente invención abarca estos equivalentes funcionales y estadísticos de las DETERMINANTES PC anteriormente mencionadas. Por otra parte, la utilidad estadística de estas DETERMINANTES adicionales depende, en esencia, de la correlación cruzada entre varios biomarcadores y con frecuencia, se requerirá algún nuevo biomarcador para funcionar dentro de un panel a fin de explicar el sentido de la biología subyacente.
Uno o más, de preferencia, dos o más de las DETERMINANTES PC enlistadas se pueden detectar len la práctica de la presente invención. Por ejemplo, se pueden detectar dos (2) , tres (3) , cuatro (4) , cinco (5) ; diez (10) , quince (15) , veinte (20) , cuarenta (40) , cincuenta (50) , setenta y cinco (75) , cien (100) , ciento veinticinco (125) , ciento cincuenta (150) , ciento setenta y! cinco (175) , doscientos (200) , doscientas diez (210) , doscientas veinte (220) , doscientas treinta (230) , doscientas cuarenta (240) , doscientas cincuenta (250) , doscientas sesenta (260) o más, doscientas setenta (270) o más, doscientas ochenta (280) o más, doscientas noventa (290) o más, trescientas (300) o más, trescientas diez (310) o más, trescientas veinte (320) o más, trescientas treinta (330) ? más, trescientas cuarenta (340) o más, trescientas cincuenta (350) o más, trescientas sesenta (360) o más y trescientas setenta (370) o más DETERMINANTES PC. ; En algunos aspectos, se pueden detectar las 372 DETERMINANTES PC enlistadas en la presente. Los intervalos preferidos a partir de los cuales se puede detectar el número de las DETERMINANTES PC incluye los intervalos limitados por cualquier mínimo seleccionado entre uno y 372, en particular, dos, cuatro, cinco, diez, veinte, cincuenta, setenta y cinco, cien, ciento veinticinco, ciento cincuenta, ciento setenta y cinco, doscientos, doscientos diez, doscientos veinte, doscientos treinta, doscientos cuarenta, doscientos cincuenta, emparejado con cualquier máximo hasta el total de las DETERMINANTES PC conocidas, en particular, cuatro, cinco, diez, veinte, cincuenta y setenta y cinco. Los intervalos preferidos, en particular, incluyen dos a cinco (2-5) , dos a diez (2-10) , dos a cincuenta (2-50) , dos a setenta y cinco (2-75) , dos a cien (2-100) , cinco a diez (5-10) , cinco a veinte (5-20) , cinco a cincuenta (5-50), cinco a setenta y cinco '(5-75), cinco a cien (5-100), diez a veinte (10-20), diez a cincuenta (10-50) , diez a setenta y cinco (10-75) , diez a cien (10-100) , veinte a cincuenta (20-50) , veinte a setenta y cinco (20-75) , veinte a cien (20-100) , cincuenta a setenta y cinco (50-75), cincuenta a cien (50-100), cien a ciento veinticinco (100-125), ciento veinticinco a ; ciento cincuenta (125-150), ciento cincuenta a ciento setíenta y cinco (150-175) , ciento setenta y cinco a doscientos (175-200) , doscientos a doscientos diez (200-210) , doscientos diez a doscientos veinte (210-220) , doscientos veinte a doscientos treinta (220-230) , doscientos treinta a doscientos cuarenta (230-240) , doscientos cuarenta a doscientos cincuenta (240-250) , doscientos cincuenta a i doscientos sesenta (250-260) . ' Construcción de paneles de DETERMINANTES PC Las agrupaciones de las DETERMINANTES PC se pueden incluir en "paneles" . En el sentido que se utiliza en la presente, un "panel" se refiere a un grupo de biomarcadores (ya sean DETERMINANTES PC, parámetros clínicos o factores de riesgo de laboratorio tradicionales) que incluyen más de una DETERMINANTE PC. Un panel también pueden comprender biomarcadores adicionales, por eijemplo, parámetros clínicos, factores de riesgo de laboratorio tradicionales que se sabe están presentes o asociados con cáncer o metástasis de cáncer, en combinación con un grupo seleccionado de las DETERMINANTES PC enlistadas en la Tabla 1.
Como se señaló en lo anterior, muchas de las DETERMINANTES PC individuales, parámetros clínicos y factores de riesgo de laboratorio tradicionales enlistados, cuando se usan solos y no como miembros de un panel de varios biomarcadores de las DETERMINANTES PC, tienen poco o ningún uso clínico en distinguir de manera confiable entre individuos normales, individuos en riesgo de tener un evento metastásico e individuos que tienen cáncer, ¡en una población general seleccionada y por lo tanto, solos no se pueden usar, de manera confiable, para clasificar a un individuo en esos tres estados. Incluso en donde haya diferencias estadísticamente significativas en las i mediciones medias en cada una de estas poblaciones, como es común que suceda en estudios que son suficientemente potentes, estos biomarcadores pueden seguir limitados en su aplicabilidad a un sujeto individual y contribuyen poco al diagnóstico o pronóstico para este individuo. Una , medida común con significancia estadística es el valor p, el cual indica la probabilidad de que una observación haya surgido sólo por casualidad; de preferencia, estos valores p son 0.05 o menores, representando 5% o menos probabilidad de que la observación de interés haya surgido por casualidad. Estos valores p dependen significativamente de la potencia del estudio realizado.
Independientemente de este desempeño de la DETERMINANTE PC individual y el desempeño general de las fórmulas que combinan sólo los parámetros clínicos tradicionales y posos factores de riesgo de laboratorio tradicionales, los inventores de la presente han observado que ciertas combinaciones específicas de dos o más DETERMINANTES PG también se pueden usar como paneles de múltiples biomarcadores que comprenden combinaciones de las DETERMINANTES PC que se sabe participan en uno ¡ o más i sistemas fisiológicos o biológicos y que esta información se puede combinar y hacerla clínicamente útil a través del i uso de varias fórmulas que incluyen algoritmos de clasificación estadística y otros, combinando y en muchos i casos extendiendo las características de desempeño i de la combinación más allá de las DETERMINANTES PC individuales. Estas combinaciones específicas muestran un aceptable nivel de exactitud diagnóstica y cuando hay suficiente información de múltiples DETERMINANTES PC se combina ¡en una fórmula experimentada, es frecuente que se logre de 'manera confiable un alto nivel de exactitud diagnóstica transportable de una población a otra.
El concepto general de cómo se combinan dos DETERMINANTES PC menos específicas o de más bajo desempeño en combinaciones novedosas y más útiles para las indicaciones que se pretenden, es un aspecto ; de la invención. Con frecuencia, varios biomarcadores tienen mejor f ncionamiento que los componentes individuales cuando se usan algoritmos matemáticos y clínicos adecuados; con frecuencia, esto es evidente tanto en sensibilidad como en especificidad, y da como resultado una AUC mayor. En i segundo lugar, a menudo hay información que' pasa desapercibida en los biomarcadores existentes, tal como fue necesario a fin de lograr a través de la nueva fórmula un nivel mejorado de sensibilidad o especificidad. Esta i información oculta puede ser verdadera incluso: para biomarcadores, que generalmente se consideren, de por sí, con un desempeño clínico por debajo del óptimo. De ¡hecho, el desempeño inferior al óptimo en términos de alta proporción de positivos falsos en un solo biomarcador medido solo, puede ser muy bien un indicador de que |alguna información adicional importante está contenida dentro de los resultados del biomarcador, información que no se elucidaría como ausente en la combinación con un segundo biomarcador y una fórmula matemática. I Se pueden usar varios algoritmos estadísticos y de modelos conocidos en la técnica para ayudar en las elecciones de selección de las DETERMINANTES PC y optimizar los algoritmos combinando estas elecciones. Las herramientas estadísticas como los análisis de correlación/covarianza de factores y biomarcadores cruzados permiten enfoques racionales en la construcción de paneles. La agrupación matemática y el árbol de clasificación que muestran la distancia euclidiana estandarizada entre las DETERMINANTES PC, se pueden usar de manera ventajosa. También se puede emplear la diseminación informada de sistemas de estas técnicas de clasificación estadística, así como enfoques racionales que tengan como base la selección de las DETERMINANTES PC en función de su participación en vías o funciones fisiológicas particulares.
Por último, fórmulas tales como los algoritmos de clasificación estadística se pueden usar directamente para seleccionar DETERMINANTES PC y para generar y experimentar la fórmula óptima necesaria para combinar los resultados de las DETERMINANTES PC múltiples en un solo índice. Con frecuencia, se usan técnicas como la selección en avance (a partir de parámetros explicativos de potencial cero) y en retrospectiva (a partir de parámetros explicativos de potencial disponible) y también se usan criterios de información, como AIC o BIC para cuantificar el intercambio entre el desempeño y la exactitud diagnóstica del panel y el número de las DETERMINANTES PC utilizadas. La posición de la DETERMINANTE PC individual en un panel seleccionado en avance o en retrospectiva puede estar muy relacionada con su disposición del contenido de información creciente para el algoritmo, así, el grado de contribución es bastante dependiente de la otra DETERMINANTE PC constitutiva en el panel. ; Construcción de algoritmos clínicos Se puede usar cualquier fórmula para combinar resultados de las DETERMINANTES PC como índices útiles en la práctica de la invención. Como se indicó en lo anterior y sin limitaciones, estos índices pueden indicar, j entre otras muchas indicaciones, la probabilidad, posibilidad, riesgo absoluto o relativo, tiempo o velocidad de conversión de uno a otro estado de la enfermedad oí hacer pronósticos de futuras mediciones de biomarcador'es de enfermedad metastásica. Esto puede ser para un período u horizonte de tiempo específico o para el riesgo durante el tiempo de vida restante o simplemente proporcionarse como un índice relativo a otra población de referencia. ¡ Aunque aquí se describen varias fórmulas preferidas, los expertos en la técnica conocen ' otros modelos y tipos de fórmulas además de las que se mencionan en la presente y en las definiciones anteriores. Él tipo de modelo real o fórmula utilizada puede seleccionarse a partir del campo de modelos potenciales que tienen como base las características de desempeño y de exactitud diagnóstica de sus resultados en una población experimental. Los aspectos específicos de la fórmula en sí, normalmente se pueden derivar de los resultados de la DETERMINANTE PC en la población experimental correspondiente. Entre otros usos, esta fórmula: puede destinarse a mapear el espacio característico derivado de una o más DETERMINANTES PC introducidas a un grupo de clases de individuos (por ejemplo, útiles para pronosticar la clase de membresía de un individuo como normal, en riesgo de tener un evento metastásico, enfermo de cáncer) , para deducir una estimación de una función de probabilidad de riesgo mediante el uso de un enfoque Bayesianb (por ejemplo, el riesgo de cáncer o de un evento metastásico) o para estimar las probabilidades condicionales de la clase y luego usar la regla de Bayes para producir la función de probabilidad de clase como en el caso anterior.
Las fórmulas preferidas incluyen la extensa clase de algoritmos de clasificación y en particular, el uso de análisis discriminante. El objetivo del análisis discriminante es pronosticar la membresía (class membership) a partir de un conjunto de particularidades previamente identificadas. En el caso del análisis discriminante linear (LDA - linear discriminant analysis) , la combinación lineal de particularidades se identifica la maximizar la separación entre grupos por algunos criterios. Las particularidades para LDA se pueden identificar por medio de un enfoque que tenga como base Eigengene con diferentes valores umbral (ELDA) o un algoritmo escalonado con base en análisis multifactorial de la varianza (MA OVA - multivariate analysis of variance) . Los algoritmos de avance, retrospectivos y escalonados se pueden generar de manera que reduzcan al mínimo la probabilidad de no separación con base en estadística Hotelling-Lawley .
El análisis discriminante lineal con base Eigengene (ELDA - Eigengene-based Linear Discriminant Analysis) es una técnica de selección de particularidades desarrollada por Shen et al. (2006). La fórmula selecciona particularidades (por ejemplo, biomarcadores) en una estructura multifactorial utilizando análisis ' Eigen modificado para identificar particularidades asociadas con los eigenvectores más importantes. El término "importante" se define como aquellos eigenvectores que explican la máxima varianza en las diferencias entre muestras que se están sometiendo a clasificación con relación a un valor umbral . ¡ Una máquina vectorial de soporte (SVM - support vector machine) es una fórmula de clasificación que intenta encontrar un hiperplano que separe dos clases. Este hiperplano contiene vectores de soporte, puntos de datos que son exactamente la distancia marginal fuera del hiperplano. En el probable evento de que no exista el hiperplano de separación en las dimensiones actuales1 de los datos, la dimensionalidad se expande mucho al proyectar los datos a dimensiones más grandes tomando funciones no lineales de las variables originales (Venables y Ripley, 2002) . Aun cuando no se requieren, el filtrado de particularidades para SV con frecuencia mejora el pronóstico. Las particularidades (por ejemplo, biomarcadores) se pueden identificar para una máquina vectorial de soporte, utilizando una prueba Kruskal-jWallis (K ) no paramétrica para seleccionar las mejores características univariables . También se pueden usar el bosque aleatorio (RF, Breiman, 2001) o el árbol de particiones recursivas (RPART, Breiman et al., 1984), por separado o en combinación para identificar' las combinaciones de biomarcadores más importantes. Tanto la KW como el RF requieren que varias particularidades se seleccionen del total . RPART genera un solo árbol de clasificación utilizando un subconjunto de biomarcadores disponibles.
Se puede usar otra fórmula para un procesamiento previo de los resultados de mediciones de las DETERMINANTES PC individuales y obtener formas de información más valiosas, antes de su presentación en la fórmula de pronóstico. Sobre todo, la normalización de resultados de biomarcadores que utiliza transformaciones matemáticas comunes como funciones logísticas o logarítmicas, como la normal u otras posiciones de distribución, con referencia a valores medios de una población, etc., son muy conocidos para los expertos en la técnica. De interés particular son los conjuntos de normalizaciones que tienen como base parámetros clínicos como edad, género, raza o sexo, ¡en los que se usan las específicas únicamente en individuos de una clase o de manera continua combinando un parámetro clínico como un dato de entrada. En otros casos, los biomarcadores de analitos se pueden combinar en variables calculadas que después se presentan en una fórmula.
Además de los valores de parámetros individuales de un individuo que potencialmente se normalizan, una fórmula pronóstico general para todos los individuos o cualquier clase conocida de individuos, puede en sí calibrarse de nuevo o ajustarse de otro modo con base en el ajuste para la prevalencia esperada en una población y en los valores medios de parámetros de los biomarcadores, según la técnica descrita en D'Agostino et al., (2001) JAMA 286:180-187 u otras técnicas de normalización y recalibración. Estos datos estadísticos de ajuste epidemiológico se pueden capturar, confirmar, mejorar y actualizar de manera continua a través de un registro de datos anteriores presentados al modelo, que pueden ser susceptibles de leerse en medios automatizados o de otro modo o en ocasiones a través de la consulta retrospectiva de muestras almacenadas o referencia a estudios históricos de estos parámetros y estadística. Otros ejemplos que pueden ser objeto de recalibración de la fórmula o de otros ajustes, incluyen la estadística utilizada en estudios realizados por Pepe, M.S. et al., 2004, sobre las limitaciones de las razones de momios; Cook, N.R., 2007 con relación a las curvas ROC. Por último, el resultado numérico de una fórmula de clasificación, se puede transformar después del procesamiento a través ¡de su referencia a una población clínica real y a resultados de estudio y criterios de valoración observados a fin de calibrar respecto al riesgo absoluto y proporcionar intervalos de confianza para resultados numéricos variables del clasificador o fórmula de riesgo. Un ejemplo de esto es la presentación de riesgo absoluto e intervalos de confianza para ese riesgo, derivados utilizando un estudio clínico real, elegidos con referencia al resultado; de la fórmula de puntuación de recurrencia en el producto Oncotype Dx de Genomic Health Inc. (Redwood City, CA) .
Otra modificación consiste en hacer ajustes para subpoblaciones más pequeñas del estudio con base en el resultado del clasificador o fórmula de riesgo y definir y seleccionar por sus parámetros clínicos, como edad o sexo.
Combinación con parámetros clínicos y factores de riesgo de laboratorio tradicionales Cualquiera de los parámetros clínicos anteriormente mencionados se pueden usar para llevar a la práctica la invención, como una entrada de datos de una DETERMINANTE PC a una fórmula o como criterio de preseleccion que define una población pertinente que se evaluará mediante un panel y una fórmula de las DETERMINANTES PC particular. Como se señala en lo anterior, los parámetros clínicos también pueden ser: útiles en la normalización y procesamiento previo de biomarcadores o en la selección de las DETERMINANTES PC, la construcción del panel, la selección del tipo de fórmula y la derivación y el resultado de la fórmula posterior al procesamiento. Se puede adoptar un enfoque similar con los factores de riesgo de laboratorio tradicionales, ya sea como entrada de datos a una fórmula o como criterio de preseleccion. : Medición de las DETERMINANTES PC La medición real de niveles o cantidades de las DETERMINANTES PC se puede determinar en cuanto a proteínas o ácidos nucleicos, por cualquiera de los métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, a nivel de ácido nucleico, para determinar la expresión génica, se puede usar análisis de hibridación Northern y Southern, así como ensayos de protección de ribonucleasa utilizando sondas que reconozcan específicamente una o más de estas secuencias. Como alternativa, las cantidades de las DETERMINANTES ¦ PC se pueden medir mediante ensayos PCR con base en transcripción inversa (RT-PCR - reverse transcription-based PCR) , por ejemplo, utilizando cebadores específicos para secuencias de genes expresadas en diferencialmente o por amplificación de ARN de cadena ramificada y métodos de detección de Panomics, Inc. Las cantidades de las DETERMINANTES PC también se pueden determinar a nivel de proteína, por ejemplo, por medición de los niveles de péptidos codificados por los productos génicos descritos aquí o la localización o actividades subcelulares de los mismos mediante el uso de plataformas tecnológicas, como por ejemplo, AQUA® (HistoRx, New Heaven, CT) o la Patente de los Estados Unidos Núm. 7,219,016. Estos métodos son muy conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, i inmunoensayos con base en anticuerpos frente a proteínas codificadas por los genes, aptámeros o impresos moleculares. Se puede usar cualquier material biológico para la detección y/o cuantificación de la proteína o de su actividad. Como alternativa, se puede seleccionar un método adecuado para determinar la actividad de proteínas codificadas por los genes marcadores según la actividad de cada proteína analizada.
Las DETERMINANTES PC sean proteínas, polipéptidos , mutaciones y polimorfismos de los mismos, se pueden detectar de cualquier manera que sea adecuada, pero, por lo general, se detectan al poner en contacto una muestra proveniente del individuo con un anticuerpo jque se une a la DETERMINANTE PC sea proteína, polipéptido, mutación o polimorfismo y luego detectar la presencia o ausencia de un producto de reacción. El anticuerpo puede ser monoclonal, policlonal, quimérico o un fragmento de éstos, como se comentó con detalle en lo anterior; la etapa que consiste en detectar el producto de reacción se puede llevar a cabo mediante algún inmunoensayo que sea adecuado. La muestra del individuo es normalmente un fluido biológico tal como se describió en lo anterior y puede ser la misma muestra de fluido biológico utilizada para aplicar el método descrito en lo anterior.
Los inmunoensayos realizados según la presente invención pueden ser ensayos homogéneos o ensayos heterogéneos. En un ensayo homogéneo la reacción inmunológica comprende, por lo general, el anticuerpo específico (por ejemplo, anticuerpo anti-proteína DETERMINANTE PC) , un analito marcado y la muestra de interés. La señal que surge de la etiqueta o marca se modifica, directa o indirectamente, durante la unión del anticuerpo con el analito marcado. Tanto la reacción inmunológica como la detección del grado de la misma se pueden llevar a cabo en una solución homogénea. Se : ueden emplear etiquetas inmunoquímicas que incluyen radicales libres, radioisótopos, colorantes fluorescentes, enzimas, bacteriófagos o coenzimas. j En un enfoque de ensayo heterogéneo', los reactivos son, por lo general, la muestra, el anticuerpo y los medios para producir una señal detectable . Se | pueden usar muestras como las que se describen en lo anterior. El I anticuerpo se puede inmovilizar en un soporte, c mo un i glóbulo (por ejemplo, glóbulos de proteína A y proteína G agarosa) , placa o portaobjetos y ponerlo en contacto! con la muestra de la que se sospecha que contiene el antígeno en fase líquida. Luego, el soporte se separa de la fase líquida y la fase de soporte o la fase líquida se examinan con respecto a la presencia de una señal detectable empleando medios para producir esa señal. La señal está relacionada con la presencia del analito en la muestra.
Los medios para producir una señal detectable incluyen el uso de etiquetas radioactivas, etiquetas fluorescentes o etiquetas enzimáticas. Por ejemplo, si el antígeno a detectar contiene un segundo sitio de unión, un anticuerpo que se una a ese sitio se puede con ugar a un: grupo detectable y añadirse a la solución de reacción en fase i líquida antes de la etapa de separación. La presencia del grupo detectable en el soporte sólido indica la presencia del antígeno en la muestra de prueba. Ejemplos de inmunoensayos adecuados son oligonucleótidos , ¡ inmunotransferencia, métodos de inmunofluorescencia, inmunoprecipitación, métodos de quimiluminiscencia, electroquimiluminiscencia (ECL - electrochemiluminescen.ee) o inmunoensayos ligados a enzimas. ¡ Los expertos en la técnica estarán familiarizados con varios formatos de inmunoensayos específicos y I variaciones de los mismos que pueden ser útiles para; llevar a cabo los métodos expuestos en la presente. Véase, en I general, E. Maggio, Enzyme-Immunoassay, (1980) (CRCj Press, Inc., Boca Ratón Fia.) véase también Patente ele los Estados Unidos Núm. 4,727,022 de Skold et al. titulada "Methods for Modulating Ligand-Receptor Interactic|ns and their Application", Patente de los Estados Unido^s Núm. 4,659,678 de Forrest et al. titulada "Immunoassay of Antigens", Patente de los Estados Unidos Núm. 4,376Í110 de David et al. titulada "Immunometric Assays Using Monoclonal i Antibodies", Patente de los Estados Unidos Núm. 4,275,149 de Litman et al., titulada "Macromolecular Environment Control in Specific Receptor Assays", Patente de los Estados Unidos Núm. 4,233,402 de Maggio et al., titulada "Reagents and Method Employing Channeling" y Patente de los Estados Unidos Núm. 4,230,767 de Boguslaski et al., titulada "Heterogenous Specific Binding Assay Employing a Coenzyme as a Label" .
Los anticuerpos se pueden conjugar a un soporte sólido adecuado para una prueba de diagnóstico (por ejemplo, glóbulos como proteína A o proteína G agarosa, microesferas , placas, portaobjetos o pocilios constituidos por materiales como látex por poliestireno) según las técnicas conocidas, por ejemplo, unión pasiva. De igual forma, los anticuerpos descritos aquí se pueden conjugar con etiquetas o grupos detectables como las radioetiquetas (por ejemplo, 35S, 125I, 131I) , etiquetas enzimáticas (por ejemplo, peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina) y etiquetas fluorescentes (por ejemplo, fluoresceína, ;Alexa, proteína fluorescente verde, rodamina) según las técnicas conocidas.
Los anticuerpos también pueden ser útiles para detectar modificaciones posteriores a la traducción, de las DETERMINANTES PC sean proteínas, polipéptidos , mutaciones y polimorfismos, como fosforilación de tir'osina, fosforilación de treonina, fosforilación de serina, glucosilación (por ejemplo, O-GlcNAc) . Estos anticuerpos detectan de manera específica los aminoácidos fosforilados en una proteína o proteínas de interés y se pueden usar en los ensayos de inmunotransferencia, inmunofluorescencia y ELISA descritos aquí. Estos anticuerpos son muy conocidos para los expertos en la técnica y se encuentran disponibles a nivel comercial. Las modificaciones posteriores a la traducción también se pueden determinar por medio de iones metaestables en espectrometría de masas de ionización y desorción por láser asistida por matriz reflectora y de tiempo de vuelo (MALDI-TOF - reflector matrix-assisted láser desorption ionization- time of flight , mass spectrometry) (Wirth, U. efc al. (2002) Proteomics 2 (10) : 1445-51) .
Para las DETERMINANTES PC sean proteínas, polipéptidos , mutaciones y polimorfismos, que se sabe tienen actividad enzimática, las actividades se 1 pueden determinar in vitro por medio de los análisis enzimáticos conocidos en la técnica. Estos análisis incluyen, entre otros, análisis de fosfatasa, reductasa, entre muchos otros. La modulación de la cinética de las actividades enzimáticas se puede determinar por medición de la constante de velocidad KM por medio de los algoritmos conocidos, como la gráfica de Hill, la ecuación de Michaelis-Menten, gráficas de regresión lineal como el análisis Lineweaver-Birk y la gráfica de Scatchard.
Al utilizar la información de la secuencia proporcionada por las entradas de la base de datos para las secuencias DETERMINANTES PC, la expresión de las sec encias DETERMINANTES PC (si estuvieran presentes) se puede detectar y medir utilizando las técnicas conocidas para las personas con experiencia ordinaria en la técnica. Por ejemplo, las secuencias dentro de las entradas de la base de datos de secuencias correspondientes a las secuencias de las DETERMINANTES PC o dentro de las secuencias descritas aquí, se pueden usar para construir sondas para detectar secuencias de ARN DETERMINANTE PC, por ejemplo, con análisis de hibridación en transferencia Northern o métodos con secuencias de ácido nucleico específico que se amplifican de manera específica y de preferencia cuantitativamente. Como otro ejemplo, las secuencias se pueden usar para construir cebadores para amplificar de manera específica las secuencias DETERMINANTES PC, por ejemplo, en métodos de detección que tienen como base la amplificación, como la reacción en cadena de polimerása con transcripción inversa (RT-PCR - reverse- transaription based polymerase chain reaction) . Cuando las alteraciones en la expresión genética están asociadas con la amplificación, deleción, polimorfismos y mutaciones génicas,; las comparaciones de secuencias en poblaciones de prueba y de referencia se pueden hacer comparando cantidades relativas de las secuencias del ADN analizado en las poblaciones de prueba y de referencia.
La expresión de los genes descritos aquí se puede medir a nivel de ARN con los métodos conocidos : en la técnica. Por ejemplo, se puede utilizar el análisis de hibridación Northern que utiliza sondas que reconocen de manera específica una o más de estas secuencias', para determinar la expresión génica. Como alternativa, la expresión se puede medir mediante ensayos PCR de transcripción inversa (RT-PCR) , por ejemplo, utilizando cebadores específicos para las secuencias expresadas diferencialmente . El ARN también se puede cuantificar, por ejemplo, por medio de otros métodos de amplificación dirigida (por ejemplo, TMA, SDA, NASBA) o métodos de amplificación de señal (por ejemplo, bADN) , y lo similar.
Como alternativa, se pueden medir los metabolitos de proteínas y ácidos nucleicos DETERMINANTES PC;. El término "metabolito" incluye cualquier producto químico o bioquímico de un proceso metabólico, por ejemplo, cualquier compuesto producido por el procesamiento, escisión o consumo de una molécula biológica (por ejemplo, una proteína, ácido nucleico, carbohidrato o lípido) . i Los metabolitos se pueden detectar de muchas maneras conocidas para el experto en la técnica, que incluyen espectroscopia I de índice de refracción (RI - refractive índex) , espectroscopia ultravioleta (UV) , análisis de fluorescencia, análisis radioquímico, espectroscopia de infrarrojo (IR cercano), espectroscopia de resonancia magnética nuclear (NMR - nuclear magnetic reson'ance) , análisis de dispersión luminosa (LS - light scattering) , espectrometría de masas, espectrometría de masas con pirólisis, nefelometría, espectroscopia Raman dispersiva, cromatografía de gases combinada con espectrometría de masas, cromatografía de líquidos combinada con espectrometría de masas, espectrometría de masas de ionización y desorción por láser asistida por matriz y de i tiempo de vuelo (MALDI-TOF) , espectroscopia de nebulización iónica combinada con espectrometría de ¡ masas, electroforesis capilar, detección por NMR e IR. (Véase, WO 04/056456 y WO 04/088309) , las cuales, en su totalidad, se i consideran parte de la presente, como referencia)J . Al respecto, otros analitos DETERMINANTES PC se pueden medir con los métodos de detección mencionados en lo anterior u otros métodos conocidos para el técnico experimentado. Por ejemplo, los iones de calcio circulante (Ca2+) se \ pueden detectar en una muestra por medio de colorantes fluorescentes como la serie Fluo, Fura-2A, Rhod-2,! entre otros. Del mismo modo, se pueden detectar; otros metabolitos DETERMINANTES PC por medio de reactivos que están específicamente diseñados o adaptados para detectar esos metabolitos.
Estuches La invención también incluye un reactivo de detección de las DETERMINANTE PC, por ejemplo, > ácidos nucleicos que identifican de manera específica uno o más ácidos nucleicos DETERMINANTES PC por sus secuencias de ácido nucleico homologas, como las secuencias de oligonucleótidos , complementarias a una porción ele los ácidos nucleicos DETERMINANTES PC o anticuerpos para proteínas codificadas por los ácidos nucleicos DETERMINANTES PC, empacados juntos en forma de un estuche.
Los oligonucleótidos pueden ser fragmentos de los genes DETERMINANTES PC. Por ejemplo, los oligonucleótidos pueden ser de 200, 150, 100, 50, 25, 10 o menos nucleótidos de longitud. El estuche puede contener en recipientes separados un ácido nucleico o anticuerpo (ya sea unido a una matriz sólida o empacado por separado con reáctivos para unirse a la matriz) , formulaciones de control (positivo y/o negativo) y/o una etiqueta detectable como fluoresceína, proteína fluorescente verde, rodamina, colorantes de cianina, colorantes Alexa, luciferasa, radioetiquetas, entre otras. El estuche puede incluir instrucciones (por ejemplo, escritas, en cinta, VCR, CD- ROM, etc.) para llevar a cabo el ensayo. El ensayo puede estar, por ejemplo, en forma de una hibridación Northern o un ensayo ELISA Sandwich, como es sabido en la técnica.
Por ejemplo, los reactivos de detección de la DETERMINANTE PC se pueden inmovilizar en una matriz sólida, como una tira porosa, para formar al menos un punto o sitio de detección de la DETERMINANTE PC. La región de medición o detección de la tira porosa puede incluir una pluralidad de puntos o sitios que contienen un ácido nucleico,. Una tira de prueba también puede contener puntos para controles positivos y/o negativos. Como alternativa, los puntos de control pueden estar ubicados en una tira separada; de la tira de prueba. Como opción, los diferentes puntos o sitios de detección pueden contener diferentes cantidades de ácidos nucleicos inmovilizados, por ejemplo!, una cantidad más elevada en el primer punto de detección y una cantidad menor en los siguientes puntos. Al adicionar la muestra de prueba, el número de puntos que manifiestan una señal detectable ofrece una indicación cuantitativa ' de la cantidad de las DETERMINANTES PC presentes en la muestra.
Los puntos de detección se pueden configurar de cualquier forma que sea adecuadamente detectable y por lo general , están en forma de barra o de un punto que abarca el ancho total de una tira de prueba.
Como alternativa, el estuche contiene una matriz de sustrato de ácido nucleico que comprende una , o más secuencias de ácido nucleico. Los ácidos nucleicos del conjunto identifican de manera específica una ? más secuencias de ácido nucleico representadas por las DETERMINANTES PC 1-372. El varias modalidades la expresión de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 40, 50, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 275 o más de las secuencias representadas por las DETERMINANTES PC 1-372, se pueden identificar por la unión a la matriz. La matriz de sustrato puede estar, por ejemplo, en un sustrato sólido, por ejemplo, un " chip" tal como se describe en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5,744,305. Como alternativa, la matriz de sustrato puede ser una matriz en solución, por ejemplo, xMAP (Luminex, Austin, TX) , Cyvera (Illumiria, San Diego, CA) , CellCard (Vitra Bioscience, Mountain View, CA) y Quantum Dots ' Mosaic (Invitrogen, Carlsbad, CA) . ¡ i Los proveedores de anticuerpos adecuados para la detección de DETERMINANTES PC incluyen fuentes comerciales como, por ejemplo, Abazyme, Abnova, Affinity Biologicals, AntibodyShop, Biogénesis, Biosense Laboratories, Calbiochem, Cell Sciences, Chemicon International, Chemokine, Clontech, Cytolab, DAKO, Diagnostic BioSystems, eBioscience, Endocrine Technologies, Enzo Biochem, Eurogentec, Fusión Antibodies, Génesis Biotech, GlobóZymes, Haematologic Technologies, Immunodetect , Immunodiagnostik, Immunometries , Immunostar, Immunovision, Bipgenex, Invitrogen, Jackson ImmunoResearch Laboratory, KMI Diagnostics, Koma Biotech, LabFrontier, Life Science Institute, Lee Laboratories, Lifescreen, Maine Biotechnology Services, Mediclone, MicroPharm ; Ltd., ModiQuest, Molecular Innovations, Molecular Probes, Neoclone, Neuromics, New England Biolabs, Novocastra, Novus Biologicals, Oncogene Research Products, Orbigen, Oxford Biotechnology, Panvera, PerkinElmer Life Sciences, Pharmingen, Phoenix Pharmaceuticals , Pierce Chemical Company, Polymun Scientific, Polysciences , Inc., Promega Corporation, Proteogenix, Protos Immunoresearch, QED Biosciences, Inc., R&D Systems, Repligen, Research Diagnostics, Roboscreen, Santa Cruz Biotechnology, Seikagaku America, Serological Corporation, Serotec, SigmaAldrich, StemCell Technologies, Synaptic Systems GMBH, Technopharm, Terra Nova Biotechnology, TiterMax, Trillium Diagnostics, Upstate Biotechnology, US Biological, 'Vector Laboratories, Wako Puré Chemical Industries y Zeptometrix. Sin embargo, el técnico experimentado puede preparar de manera sistemática anticuerpos, sondas de ácidos nucleicos, por ejemplo, oligonucleótidos , aptámeros , ARNsi, oligonucleótidos antisentido, contra cualquiera de las DETERMINANTES PC de la Tabla 1.
Métodos para tratar o prevenir cáncer La invención proporciona un método para tratar, prevenir o aliviar un síntoma de cáncer en un individuo, al disminuir la expresión o actividad de las DETERMINANTES PC 1-245 o al aumentar la expresión o actividad de las DETERMINANTES PC 246-272. Los compuestos terapéuticos se administran de manera profiláctica o terapéutica a un individuo que padece cáncer o está en riesgo ¡ (o es susceptible de) de desarrollarlo. Estos individuos se identifican mediante el uso de los métodos clínicos estándar o al detectar un nivel alterado de expresión o actividad de DETERMINANTES PC (por ejemplo; las DETERMINANTES PC 1-372) . Los agentes terapéuticos ihcluyen inhibidores de la regulación del ciclo celular, proliferación celular y actividad de la proteína cinasa.
El método terapéutico incluye aumentar la I expresión o función o ambos, de uno o más productos génicos de genes cuya expresión está disminuida ("genes subexpresados") en una célula cancerosa con relación a las células normales en el mismo tipo de te ido del cual se derivan las células cancerosas. En estos métodos, el individuo se trata con una cantidad eficaz de un compuesto, el cual aumenta la cantidad de uno o más de los! genes subexpresados en el individuo. La administración puede ser sistémica o local. El compuesto terapéutico incluye un producto polipeptídico de un gen subexpresado i o un fragmento biológicamente activo del mismo, un : ácido nucleico que codifica un gen subexpresado y que! tiene elementos de control de expresión que permiten la expresión en las células cancerosas; por ejemplo, un agente que aumente el nivel de expresión de este gen endógeno; a las células cancerosas (es decir, que regula por aumento la expresión del gen o genes subexpresados) . \ La administración de estos compuestos contrarresta los efectos del gen o genes anormalmente subexpresados en las células del individuo y mejora la condición clínica del individuo.
El método también incluye disminuir la expresión o función o ambos, de uno o más productos génicos dé genes cuya expresión está anormalmente aumentada ,( "genes sobreexpresados" ) en células cancerosas con relación a las células normales. La expresión se inhibe por cualquiera de las diversas formas que se conocen en la técnica i Por ejemplo, la expresión se inhibe administrándole al i individuo un ácido nucleico que inhibe o antagoniza la expresión del gen o genes sobreexpresados, por ejemplo, un oligonucleótido antisentido que altera la expresión del gen o genes sobreexpresados. ; Como alternativa, la función de uno !o más i productos génicos de los genes sobreexpresados se inhibe al administrar un compuesto que se une o de otro modo ; inhibe la función de los productos génicos . Por ejemplo, el compuesto es un anticuerpo que se une al producto o productos del gen sobreexpresado . ' Estos métodos de modulación se realizan ex: vivo o in vitro (por ejemplo, cultivando la célula con el agente) o como alternativa in vivo (por ejemplo, administrando el agente al individuo) . El método implica administrar una proteína o combinación de proteínas o una molécula de ácido nucleico o combinación de moléculas ácido nucleico, como terapia para contrarrestar la expresión o actividad átipica de los genes expresados en forma diferencial.
Las enfermedades o trastornos que se caracterizan por incremento en niveles o actividad de los genes (con relación a un individuo que no padece de la enfermedad o trastorno) , se pueden tratar con principios terapéuticos que antagonizan (es decir, reducen o inhiben) la actividad ! del gen o genes sobreexpresados . Los principios terapéuticos que antagonizan la actividad se administran de manera terapéutica o profiláctica (por ejemplo, las vacunas) .
Los principios terapéuticos que se pueden utilizar incluyen, por ejemplo, (i) un polipéptido o análogos, derivados, fragmentos u homólogos del mismo de la secuencia o secuencias sobreexpresadas o subexpresadas ; (ii) anticuerpos de la secuencia o secuencias sobreexpresadas o subexpresadas ; (iii) ácidos nucleicos de la secuencia o secuencias sobreexpresadas o subexprésadas ; (iv) ácidos nucleicos antisentido o ácidos nucleicos que son "disfuncionales" (es decir, debido a una inserción heteróloga dentro de las secuencias codificantes de secuencias codificantes de uno o más secuencias sobreexpresadas o subexpresadas) o (v) moduladores (es decir, inhibidores, agonistas y antagonistas que alteran la interacción entre un polipéptido sobre/subexpresadp y su socio de unión. La molécula antisentido disfunciónal se utiliza para "inactivar o desactivar" (knockout) la función endógena de un polipéptido por recombinación homologa (véase, por ejemplo, Capecchi, Science 244: 1288-1292 1989) .
Las enfermedades y trastornos que se caracterizan por niveles o actividad biológica disminuidos (con relación a un individuo que no padece la enfermedad o trastorno) , se pueden tratar con principios terapéuticos que aumentan la actividad (es decir, son agonistas frente ellos) , Los principios terapéuticos que regulan por aumento la actividad se pueden administrar de manera terapéutica o profiláctica. Los principios terapéuticos que se ¡ pueden utilizar incluyen, entre otros, un polipéptido (o análogos, derivados, fragmentos u homólogos de los mismos)¡ o un agonista que aumente la biodisponibilidad . ; Generación de animales transgénicos Los animales transgénicos de la invención ¡ tienen uno o los dos alelos endógenos de los genes Pten y Smad4 en forma no funcional. La inactivación se puede lograr por modificación del gen endógeno, por lo general, una deleción, sustitución o adición a una región codificante del gen. La modificación puede impedir la síntesis de un producto génico o puede dar como resultado un producto génico que carece de actividad funcional. ¡ Las modificaciones típicas son la introducción de un segmento exógeno, por ejemplo, un marcador de selección, dentro de un exón y ocasiona la alteración o la deleción del exón.
La inactivación de genes endógenos en ratones se puede lograr por recombinación homologa entre ün gen endógeno en una célula germinal (ES - ste cell) embrionaria de ratón y un constructo dirigido. Normalmente, el constructo dirigido contiene un marcador de selección positivo flanqueado por segmentos del gen seleccionado como objetivo o diana. Por lo general, los segmentos son de la misma especie que el gen diana (por ejemplo, ratón) . Sin embargo, los segmentos se ; pueden obtener de otras especies, por ejemplo, de humanos, siempre que tengan suficiente identidad de secuencia con el gen diana para que se de con éste la recombinación homologa. Normalmente, el constructo también contiene un marcador de selección negativo ubicado fuera de uno o de los dos segmentos designados para la recombinación homologa con el gen endógeno (véase, Patente de los Estados Unidos Núm. 6,204,061). Como opción, el constructo también contiene un par de sitios de recombinación específicos para el sitio, como frt, posición dentro o en los extremos de los segmentos designados para la recombinación homologa con el gen endógeno. El constructo se introduce en las células ES, normalmente por electroporacion y se recombina en forma homologa con el gen endógeno introduciendo el marcador de selección positiva y partes de los segmentos flanqueantes (y los sitios frt, si hubiera) en el gen endógeno;. Las células ES que se han recombinado en la forma deseada, se pueden seleccionar por selección positiva y negativa. La selección positiva selecciona células que hayan tenido la recombinación homologa deseada y la selección negativa selecciona células que hayan tenido recombinación negativa. Estas células se obtienen a partir de preimplantación de embriones cultivados in vitro. Bradley et al., Nature 309, 255-258 (1984) (la cual, en su totalidad y para cualquier fin, se considera parte de la presente, como referencia) .
Las células ES transformadas se combinan con blastocitos de animal no humano. Las células ES colonizan el embrión y en algunos embriones forman o contribuyen a la línea germinal del animal quimérico resultante. Véase, Jaenisch, Science, 240, 1468-1474 (1988) (la cual, en su totalidad y para cualquier fin, se considera parte de la presente;, como referencia) . Los animales quiméricos se pueden cruzar con animales no transgénicos para generar animales transgénicos heterocigóticos . Los animales heterocigóticos se pueden cruzar entre sí para generar animales homocigóticos . Los animales heterocigóticos y homocigóticos se pueden cruzar con un animal transgénico que exprese la flp recombinasa. La expresión de la recombinasa da como resultado la escisión de la porción de ADN entre los sitios frt introducidos, si hubiera.
La inactivación funcional también se puede : lograr para otras especies, que sean adecuadas como ratas, conejo y otros roedores, ovinos como ovejas, caprinos como cabras, porcinos como cerdos y bovinos como vacunos y búfalos .
Para animales diferentes de los ratones, se prefiere la tecnología de transferencia nuclear para generar; genes funcionalmente inactivados. Véase Lai et al., Sciences 295, 1089-92 (2002) . Se pueden emplear varios tipos de células como donantes para núcleos que se transfieran a los ovocitos, incluidas las células ES y los fibrocitos fetales. Los núcleos donantes se obtienen a partir de células cultivadas in vitro en las que se ha introducido un constructo y han tenido recombinación homologa con un gen endógeno, como se describe en lo anterior (véase O 98/37183 y WO 98/39416, las cuales, en su totalidad y para cualquier fin, se consideran parte de la presente, como referencia) . Los núcleos donantes se introducen en los ovocitos por medio de fusión inducida eléctrica o químicamente (véase cualquiera de los documentos WO 97/07669, WO 98/30683 y WO 98/39416) o por microinyección ¡ (véase WO 99/37143), las cuales, en su totalidad y para cualquier fin, se consideran parte de la presente, como referencia. Los ovocitos trasplantados se cultivan después en embriones que luego se implantan en los oviductos de animales hembra pseudopreñadas , lo cual da lugar a la progenie transgénica (véase cualquiera de los documentos WO 97/07669, WO 98/30683 y WO 98/39416) . Los animales transgénicos que tienen transgenes heterocigóticos se pueden cruzar entre sí para generar animales transgénicos que tengan transgenes homocigóticos .
Algunos animales transgénicos de la invención tienen la inactivación de uno o los dos alelos de los genes Pten y Smad4 y un segundo transgén que confiere un fenotipo adicional relacionado con cáncer de próstata, su patiología o procesos bioquímicos subyacentes . Esta alteración se puede lograr por la escisión mediada por recombinasa de los genes Pten y Smad con el sitio LoxP incorporado (es ¡decir, la cepa actual) o por ejemplo, activación (knóck- in) mutacional y la extinción mediada por ARNi de estos genes I en un configuración de linea germinal o en trans ucción somática de epitelio de próstata in si tu o en cultivo celular seguido por la reintroducción de estas células primarias en la cápsula renal u ortotópicamente . También son obvias otras estrategias de manipulación genética, entre las que se incluyen la formación de quimeras que utiliza clones ES dirigidos que evitan la transmisión de la línea germinal. > i EJEMPLOS ; Ejemplo 1: Método general ; Alelos condicionales Pten y ¡ Smad, genotipificación y análisis de expresión. i Los alelos inactivados (knockout) condicionales PtenloxP y Smad4loxP están descritos en alguna otra fuente. La deleción específica en el epitelio de próstata se efectuó por medio de PB-Cre425. La estrategia de genotipificación PCR para (i) Pten utiliza los cebadores 1 i (51 -CTTCGGAGCATGTCTGGCAATGC-3 ' ; SEQ ID NO: 1), 2 (5'- I CTGCACGAGACTAGTGAGACGTGC-3 ' ; SEQ ID NO: 2) y 3 (5'- AAGGAAGAGGGTGGGGATAC- 3 ' ; SEQ ID NO: 3) y (Ü) Smad4 utiliza los cebadores 1 (5 ' -GGGAACAGAGCACAGGCCTCTGTGACAG- 3 ' ; | SEQ ID NO: 4) y 2 (5 ' -TTCACTGTGTAGCCCCGCCTGTCCTGGA- 31 ; SEQ j ID NO: 5) . Para detectar el alelo Smad4 eliminado, se usaron los cebadores 2 y 3 (51 -TGCTCTGAGCTCACAATTCTCCT-31 ,- SEQ \ ID NO: 6} .
Para el análisis de transferencia Western, tejidos y células se lisaron con amortiguador RIPA (20 mM, Tris pH 7.5, NaCl 150 mM, Nonidet P-40 1%, desoxicolato de sodio 0.5%, EDTA 1 mM, SDS 0.1%) que contiene inhibidores completos de mini proteasa (Roche) e inhibidor de fosfatasa. Las bandas de transferencia Western se obtuvieron utilizando 20-50 pg de proteína lisada y se incubaron con los anticuerpos contra Smad4 , p53 ,(1C12) , pSmad 2/3, pSmadl/5/8, (Cell Signaling Technology), p21Cipl (M19) y PTEN (A2B1) (Santa Cruz Biotechnology) .
Análisis de tejido Los tejidos normales y tumorales se fijaron con formalina amortiguada neutra al 10% (Sigma) durante la noche, se lavaron una vez con PBS IX, se transfirieron en etanol 70% y se almacenaron a 4°C. Los tejidos se procesaron por deshidratación de etanol y se incorporaron en parafina de Histosery Inc. (Gaithersburg, MD) según los protocolos estándar. Se prepararon secciones (5 pm1) para la detección de anticuerpos y la Ticino con hematoxi'lina y eosina (H&E) . Para los estudios inmunohistoquímicos , las secciones incorporadas en parafina y fijas en formalina se incubaron durante la noche con anticuerpos policlonales de conejo anti-Pten o anti-p53 y luego se incubaron con anticuerpo secundario de cabra anti-IgG (H+L) de i conejo (Vector) y se visualizaron incubando las secciones con DAB (Vector) y se contratiñeron con hematoxilina y éosina. Para los estudios por inmunofluorescencia, se sembraron células tumorales de próstata en portaobjetos de 8 pocilios Lab-Técnica a 5000 células/pocilio, se fijaron con metanol a -20°C durante 10 minutos, se tiñeron con anticuerpos anti-CK8 y CK18 (CM5, Vector Laboratories) y visualmente se procesaron por medio de Image J (vi.38). La significancia estadística se determinó por la prueba t de Student 1 Para evaluar la senescencia en tejido prostático de diversos genotipos, se tiñeron secciones de 6 m congeladas para SA-ß-Gal según lo que hay descrito. j Establecimiento de líneas celulares primarias e inducibles por tet. ¡ ¡ El tejido de cáncer prostático se diséctó a partir de ratón Ptenloxp/loxp; Smad4loxp/loxp; PB-Cre4+, se molió y se digirió con colagenasa tipo I al 0.5% (Invitrogen) según se describió previamente. Después de filtrar a través de malla de 40 µp?, los fragmentos retenidos se depositaron en cajas de cultivo recubiertas con colágeno tipo I (BD Pharmingen) . Se recolectaron las células con morfología epitelial típica y células aisladas se sembraron en cada pocilio de una placa de 96 pocilios.: Se establecieron tres líneas celulares independientes (3132-1, -2 y -3) y se conservaron en DMEM más suero fetal de bovino al 10% (FBS; Omega Scientific) , 25 g/mL de extracto de pituitaria de bovino, 5 pg/mL de insulina bovina y 6 ng/mL de factor de crecimiento epidérmico humano recombinante (Sigma-Aldrich) . Para establecer las líneas celulares inducibles por Smad4 , las líneas celulares de tumo de próstata carentes de Pten/Smad4 de ratón se transdujeron con vector pTRE-Tight (Clontech) que contenía la \ región codificante Smad4 y se establecieron las líneas celulares tet-on estables de conformidad con el protocolo del fabricante. La inducción de Smad4 se logró con 1 g/mL de doxiciclina (dox) y se verificó por análisis de transferencia Western. 1 Ensayos en cultivo celular Para los ensayos de viabilidad celular, células epiteliales de próstata se depositaron en placas de 96 pocilios a 5000 células/pocilio en 100 µ? de un medio que contiene 5% de suero fetal de bovino (FBS - fetal bovine serum) tratado con carbón vegetal. Después de 2 d'ías de incubación, el medio se reemplazó. La viabilidad de las células se midió el día 4 utilizando el estuche CelÍTiter-Glo Luminescent Cell Viability Kit (Promega, Madisoh, WI) conforme al protocolo del fabricante.
Análisis transcriptó ico, genómico e in sílico Para los análisis transcriptómicos , se aislaron tumores primarios localizados de próstata de ratón Ptenpc_ " y Ptenpc"/_ Smad130" " de tamaño y etapa comparables y se extrajo el A total, se marcaron y se hibridairon en Affymetrix GeneChip®Mouse Genome 430 2.0 Arrays por el de Dana-Farber Cáncer Institute Microarray Core Facility según el protocolo del fabricante. Los datos crudos del' ratón MOE430 Affymetrix (archivos CEL) se procesaron en forma preliminar por medio de análisis robusto de micromátrices (RMA - robust m lti-array análisis) del paquete affy de Bioconductor . Los datos de intensidad normalizada y corregida se analizaron por análisis de significancia de micromátrices (SAM - significance analysis of microarrays) para identificar genes expresados de manera diferencial. Mediante el uso de un valor de corte duplicado, generamos una lista de genes supervisados que distingue muestras Ptenpc~ _ Smad4pc_/" contra Ptenpc_ ~ . La intersección de la lista de genes murinos con la lista de genes humanos produjo un conjunto ortólogo Pten/Smad4 de 284 genes (200 regulados por aumento y 84 regulados por disminución) Para los análisis de promotores in silico, las matrices de frecuencia posicionales (PFM - positional frequency matrices) para sitios de unión conservados en vertebrados se extrajeron a partir de TRA SFAC Professional . Las matrices de peso posicionales i(PWM -positional weight matrices) se construyeron a partir de PFM mediante el módulo TFBS. El módulo TFBS también se usó para explorar los sitios de unión dentro de las secuencias promotoras 3-kb, que se descargaron de Ensembl a través de Biomart. Los sitios de unión del factor de transcripción observados en el gen elegido como objetivo o diana se compararon con aquellas en un conjunto de genes de fondo (genoma de ratón) seleccionados al azar. Se calcularon la puntuación z y el valor p (Estadística: distribuciones de CPAN) para determinar si un sitio de unión dado gestaba representado en exceso en conjunto de genes diana.
Para determinar si Pten/Smad4 murinos ! están dirigidos para alteraciones en el número de copias ¡ en el cáncer de próstata humano, usamos genes residentes en regiones comunes mínimas (MCRs - mínimum common regions) de perfiles ACGH de cáncer de próstata humano metastático, GSE8026 que se procesaron por segmentación binaria circular tal como se describió previamente. Los genes ortólogos comunes que manifestaron expresión diferencial significante entre los tumores de próstata de ratones Pter2pc"/_ y Ptenpc"/" S/nad4pc"/" así como alteración en el número de copia en tumores de próstata humanos metastáticos , se seleccionaron para posterior análisis computacional de muestras registradas clínicamente.
El Programa Ingenuity Pathway Analysis i (http://www.ingenuity.com/index.html) se utilizó para analizar las funciones celulares y vías que estuvieron reguladas significativamente en los modelos PCA Ptenpc_ " y PterPc- Smad 9 -'- .
Análisis de resultados clínicos Implementamos un enfoque de "comparación de módulos de expresión de especies cruzadas) (Figura 7A) por medio de la lista de 66 genes diana de Smad que surgieron del distintivo transcriptoma Pten/Smad4 murino ' o su intersección con el conjunto de datos ACGH 27 de próstata humana metastásica. Los perfiles de expresión de cáncer de próstata y cáncer de mama se utilizaron para evaluar el valor pronóstico de estos conjuntos de genes.' La correlación del ordenamiento de Spearman se utilizó para identificar dos grupos principales de muestras de cáncer de próstata localizado clínicamente con base en la expresión del AR m de 66 genes y 17 genes. Para demostrar significancia estadística, seleccionamos 10 grupos de conjuntos al azar de 17 genes a partir de los estudios de perfiles de cáncer de próstata de Glinsky y cáncer de mama de Chang (refs . ) .
Análisis estadístico Las curvas de supervivencia libre de invasión y acumulativa se obtuvieron por análisis de Kaplan-Meier tal como se describió en lo anterior. Los análisis estadísticos se hicieron por medio del software GraphPad Prism 4 (GraphPadSoftware , San Diego, CA) . La incidencia de tumor se gráfico utilizando el análisis de Kaplan-Meier. La significancia estadística se determinó utilizando la prueba de orden logarítmico (log-rank test) .
Ejemplo 2: Tumores de próstata carentes de Pten exhiben notable activación de la vía TGFp-Smad4 La deleción específica en próstata del supresor tumoral Pten dio como resultado neoplasia intraepitelial de próstata (PIN -' prostate intraepithelial neoplasia) y después de una larga latencia, las lesiones ocasionales pueden progresar a adenocarcinoma, aunque , con características invasivas y metastásicas mínimas. I Para definir puntos de comprobación activados en PIN deficiente en Pten, que pudieran inhibir la progresión a adenocarcinoma invasivo y metastásico, realizamos una búsqueda imparcial mediante análisis del sistema con base en el conocimiento, de genes diferencialmente expresados en PIN de alto grado en próstata anterior que surcfen en tumores PtenloxF/loxP Pb-Cre4 comparados con epitelio de próstata anterior de ratones Pb-Cre4 a las 15 semanas de edad. Este análisis del sistema reveló esteatosis hepática, BMP y TGF como las primeras tres redes enriquecidas por arriba de las observadas con listas de genes generadas al azar (Figura 1A) .
La supe familia de ligandos TGF que comprende TGF , proteínas morfogenéticas de hueso (BMPs) y familias de activitas, se unen a un receptor tipo II que recluta y fosforila un receptor tipo I. El receptor tipo I a su vez fosforila los SMAD regulados por el receptor (R-SMAD) . En la activación de Smad2/3 por T? y Smadl/5/8 ocasionada por los BMP, estos R-Smad activados por el receptor se unen a un mediador común Smad4 para formar complejos de proteína funcionales que migran al núcleo para regular diversos objetivos o diana génicos importantes para el cáncer. El enriquecimiento de las redes de señalización BMP y TGF en la lista de genes diferencialmente expresados impulsaron la validación molecular directa de su mediador común Smad4. Para este fin, los ensayos de transferencia Western e IHC documentan una notable regulación por aumento de la expresión de Smad4 , Smad2/3 activada por fósforo: y el blanco sensible a Smad, ID1, en la enfermedad Pten"/_ PIN con relación al tejido de próstata tipo silvestre ('Figura IB y 1C) . En comparación, el pSmadl/5/8 constitutivamente expresado aumentó sólo en forma marginal en los tumores Pten-/- con relación al tejido de próstata tipo silvestre (Figura IB) . En otras palabras, estos tumores de próstata Pten-/- presentaron notable activación del sistema de señalización BMP/TGFp-Smad4 , lo que sugiere posible participación de Smad4 en el bloqueo de la progresión del cáncer de próstata. Esta hipótesis es congruente :con la observación de que la expresión de Smad4 en PCA humano está significativamente regulada por disminución durante la progresión de la enfermedad primaria a metastásica (Figura ID a Figura 1F) .
Ejemplo 3: Smad4 inhibe la progresión de tumores de próstata deficiente en Pten Para orientar genéticamente este bloqueo hipotético de la progresión dependiente de Smad4 y su consecuente inactivación en enfermedad avanzada, utilizamos el agente de deleción específico de próstata, Pb-Cre4 para i eliminar de manera específica el Pten y/o el Smad4 4n el epitelio de próstata. Los ratones PtenloxP/loxP Pb-Cre4 y Smad4loxP/loxP Pb-Cre4 (en lo sucesivo ?????e~ y S/nad4pc"/") mostraron recombinación robusta mediada por Cre sólo¡ en la próstata, específicamente en la próstata anterior, la próstata ventral y los lóbulos de próstata sacrolaterales (no se muestran datos) como se reportó previamente 18 De conformidad con los estudios previos de Pten 18·20( los ratones Ptenpc_ " desarrollaron consistentemente PIN de alto grado en los tres lóbulos muy pronto, a las 9 semanas de edad, en contraste, las crías PB-Cre4 (en adelante, T) y Smad 0' ' presentaron histología prostética normal (Figura 2A) . En forma notable, a los 2 años de edad (Figura 9A y 9B) , la deficiencia de Smad4 no tuvo un impacto perceptible en la histología de próstata la cual permaneció sin tumor (n = 15; no se muestran datos) .
El modelo Pten^'^' muestra un fenotipo neoplásico de progresión lenta con características invasivas que surgen después de 17 a 24 semanas de edad; la mayoría de los ratones están vivos al año de edad (Figura 2B) . En fuerte contraste, los ratones Pten90'^ Sm dé0'^ desarrollaron PCA invasivo muy agresivo a las 9 semanas de edad (Figura 2A,d) que condujeron a la muerte a las 32 semanas de edad en todos los casos (Figura 2B,2C) . Estos i grandes tumores de próstata producen obstrucción i de la salida de la vejiga e hidronefrosis y distensión del¡ riñon debido a la obstrucción del flujo de salida con la consecuente insuficiencia renal con causa probable de mortalidad (Figuras 10A-10C) .
Para comenzar a entender la base biológica del tumor para el fenotipo de progresión Ptenpc"/_ Sm d4vc'/' , evaluaos el impacto del estado del Swad4 en los niveles de proliferación, apoptosis y senescencia en los tumores de próstata en desarrollo. Observamos proliferación notablemente incrementada en los tumores Ptenpc_/~ Smád4pc"/", en particular junto con los frentes de tumor invasivo; mientras que los tumores Ptenpc~/~ mostraron una actividad proliferativa más modesta (Figura 3A,C). También, consistente con estos distintos perfiles proliferátivos , observamos una notable disminución en la actividad de SA-B-Gal en los tumores Ptenpc"/" ¦Smad4pc~/~, con relación; a los tumores PterP'^ (Figura 3B,E), consistente con la desactivación del punto de comprobación de senescencia inducida por oncogén (OIS - oncogrene induced senescence) . Por último, los tumores Pten90'/' Sn7ad4pc~/~ y Ptenpc_/" no mostraron diferencias en la muerte celular apoptósica según se determinó por ensayos TUNEL (Figura 3A,D) .
Ejemplo 4: Pérdida de Smadé da lugar a un fenotipo invasivo totalmente penetrante y metastático.
Una particularidad obligada del PCA letal en humanos es la progresión a enfermedad invasiva y metastásica, que impulsa estudios histopatológicos detallados de criterios de valoración y seriales de los tumores Ptenpc~ _ Smad4pc_ " . Los tumores Ptenpc" " Sí?iád4pc~/~ , mostraron penetración a través de la membrana basal tan precoz que se observó a las 9 semanas de edad (n = 7 examinados); mientras que durante el mismo periodo,; todos los neoplasmas Pter¡pc~ ~ (n = 7 examinados) fueron confinados por la membrana basal (no se muestran datos) . De1 forma notable, en estudios de criterios de valoración terminales, los 25 ratones Ptenpc_ " S-rjad4pc" " portadores de tumor, mostraron diseminación metastásica a los ganglios linfáticos de drenado y 2 de estos ratones también tuvieron metástasis al pulmón (Figura 4A, 4B, a, b) . El origen epitelial prostático de la enfermedad metastásica documentada fue confirmado por tinción positiva para citoqueratina (CK) 8 y receptor de andrógeno (AR - androg-en receptor) (Figura 4C,e,f) . Cabe señalar que ninguno de los 25 ratones Ptenpc" _ Smad 90^' mostraron metástasis ósea que puede relacionarse con el rápido deceso debido 1 a la obstrucción urinaria y/o la necesidad de eventos genéticos más allá de la pérdida de Smad4 que den lugar a esta particularidad clave en el PCA humano (Figuras 10Á-10C) . Por el contrario, ninguno de los 25 ratones Pterf0'^ portadores de tumor, desarrollaron lesiones metastásicas hasta 1 año de edad (Figura 4A) , aunque se documentó 1 metástasis a ganglio linfático lumbar y 1 metástasis al pulmón en 8 ratones con más de 1.5 años de , edad, observación congruente con los reportes previos. Según lo que sabemos, este es el primer modelo de adenocarciríoma de próstata metastático totalmente penetrante que en forma similar al PCA humano, retiene los marcadores prostéticos de CK y AR.
Ejemplo 5: Identificación de DETERMINANTES PC y su utilidad como pronóstico en cáncer de próstata humano Los fenotipos de progresión sorprendentemente diferente de los modelos de PCA PteiFc~ , ~ y Ptenpc_ " Smad 0''' y la función sobresaliente del Smad4 como factor de transcripción específico de la secuencia proporcionó una estructura ideal para el análisis transcriptómico comparativo y descubrir cómo podría funcionar el Smad4 para inhibir la progresión maligna, específicamente en el cáncer de próstata. En este punto, obtuvimos tumores de próstata primarios del lóbulo anterior de dimensiones comparables a partir de los dos modelos, aproximadamente a las 15 semanas de edad, a través de los estudios histológicos se documentó la falta de enfermedad metastásica en estos ratones (no se muestran datos) . Las muestras de tumor se procesaron para histología, inmunohistoquímica y extracción de ARN para el perfil de expresión génica. El análisis comparativo inicial con los tres tumores de cada genotipo identificó 284 DETERMINANTES PC diferencialmente expresadas (Tabla IA) . El análisis posterior con un grupo expandido de cinco tumores de cada genotipo identificó un grupo expandido de 372 DETERMINANTES PC diferencialmente expresadas (Tabla IB) . Sin sorpresa, la clasificación no supervisada con facilidad separó los tumores PteiPc~ ,~ ; y PterPc~ ,~ Sjmad4pc"/" (no se muestran datos) . Considerando la diferencia fenotípica entre estos dos modelos, fue gratificante que, con base lo conocido, el análisis del sistema de los 284 genes diferencialmente expresados (200 regulados por aumento y 84 regulados por disminución) definió con claridad el movimiento celular como la categoría funcional más significante, seguida de cáncer, muerte celular y crecimiento y proliferación celular, enriquecidos en estos tumores primarios Ptei '1' Smad 90'1' (Figuras 11A-11B) '.
Después, buscamos confirmar que las DETERMINANTES PC descubiertas a través de la comparación de los perfiles de expresión de tumor de próstata murino fueran importantes para el cáncer humano. En este punto, utilizamos un conjunto de datos de expresión génica de PCA humano, de Glinsky y colaboradores1, constituido por 79 muestras localizadas por vía clínica registradas con tiempo de recurrencia de PSA (denominada recurrencia bioquímica) . La clasificación no supervisada, por agrupación jerárquica, utilizando las 284 DETERMINANTES PC enlistadas en la Tabla 1A estratificó las muestras de pacientes clínicos en subgrupos con resultados clínicos significativos: para recurrencia (Figura 5, p<0.0001) .
Ejemplo 6: El análisis integrador define un conjunto de genes de Smad4 pronosticados en tumores primarios con capacidad de evolución a metastáticos .
Después, exploramos los promotores de las 284 DETERMINANTES PC respecto a los elementos de unión con Smad evolutivamente conservados, identificando 66 dianas u objetivos transcripcionales de Smad4 directos pronosticados (Figura 7A; véase Tabla 2 para la lista completa)' . El análisis, en función de lo que se conoce, del sistema de estos 66 objetivos transcripcionales de Smad4 (45 regulados por aumento y 21 regulados por disminución) determinó con precisión el movimiento celular nuevamente como la categoría funcional más significativa (p = 2.46 x 10"12) , seguida del cáncer (p = 3.77 x 10~10) , crecimiento y proliferación celular (p = 4.14 x 10"8) y muerte celular (p = 5.75 x 10"7) enriquecidos en estos tumores primarios metastáticos Pterf0^' Smad4pc~ ~ (Figura 7B) . De manera sorprendente, 28 de los 66 genes están registrados funcionalmente como genes del movimiento celular. Esta lista de 66 genes se intersectó con perfiles de matrices CGH de PCA metastásico humano19, considerando que los eventos clave impulsores de progresión dependiente de Smad4 se dirigirían en sí mismos a alteraciones genómicas en enfermedades avanzadas, es decir, los genes regulados por aumento a la pérdida Smad4 se dirigirían de por sí a amplificación, mientras que los genes regulados por disminución se eliminarían. Estas especies cruzadas dieron 17 genes (Figura 8A) de las cuales tienen conexiones conocidas con el movimiento celular (FSCNl, ID3 , KRT6A, SPP1 y ZBTB16) . De forma interesante, los análisis oncogenómicos comparativos en melanoma han identificado recientemente el FSCNl como un DETERMINANTE PC clave en la metástasis y el pronóstico (no se muestran datos) , aumentando la posibilidad de que nuestro distintivo . génico es importante para los procesos de invasión y metastásico y los resultados clínicos entre los múltiples tipos de 'tumor.
Ejemplo 7: Objetivos o dianas transcripcionales de Smad4 triangulados con especies cruzadas que están relacionados con resultados clínicos Para acumular evidencia de la importancia que para el humano tienen estos genes diana u objetivos de Smad4 pronosticados y evolutivamente conservados y el posterior acreditamiento de este nuevo modelo de PCA metastásico, evaluamos la capacidad de estos 17 genes triangulados con especies cruzadas para estratificar la recurrencia de PCA en PCA humano con relación a la lista de 66 genes sólo murinos . Para este fin, utilizamos un conjunto de datos de expresión de genes de PCA humano de Glinsky y colaboradores15, constituido por 79 muestras localizadas por vía clínica registradas con tiempo de recurrencia de PSA (denominada recurrencia bioquímica) . La clasificación no supervisada, por agrupación jerárquica, utilizando la lista de 17 genes estos tumores de los pacientes se asignaron a una de dos ramas principales (Figura 7C) . Aunque el tamaño de la muestra es demasiado pequeño para la significancia estadística, 4 de 5 muestras metastásicas en esta cohorte se agruparon en el grupo de alto riesgo definido por estos 17 genes (Figura 7B),. Por otra parte, el análisis Kaplan-Meier de estas dos subclases estratificadas por esta lista de 17 genes mostró diferencias significantes en la relación entre tiempo y recurrencia (P = 0.0086) (Figura 7D) , mientras que las listas seleccionadas al azar (n= 10) de conjuntos de 17 genes a partir del estudio de perfiles de Glinsky15 no sirvieron para generar una separación estadísticamente significativa (P = 0.8610, 0.6086, 0.1827, 0.8338, 0.6391, 0.7918, 0.1814, 0.9851, 0.3946, 0.9201). En comparación, el conjunto de 66 genes no tuvo capacidad para estratificar pacientes en subclases de resultados diferenciales (p = 0.0626), ratificando que el filtro de especies cruzadas ha eliminado con eficacia los elementos de ruido de la, lista de 66 genes (Figuras 12A-12B) .
Después, para evaluar si la lista de 17 genes es específica para próstata, realizamos un análisis similar con el resultado de los datos de expresión registrados de 295 cáncer de mama primarios28. Como se muestra en la Figura 8E, el agrupamiento no supervisado con los 17 genes subclasificó estas muestras de tumores de mama en dos grupos con diferencia significativa en la supervivencia global (p<0.0001) y supervivencia libre de metástasis (p = 0.0005; Figura 8F) . Las listas de 17 genes seleccionados al azar (n = 10) de nuevo falló para lograr una separación significativa de las curvas de Kaplan-Meier (información o figura en el suplemento) . Mientras que el conjunto de 66 genes fue un elemento incierto en este trabajo, supervivencia global (p = 0.0263) y supervivencia libre de metástasis (p = 0.0886) . : Considerados en conjunto, estos análisis que demuestran la potencia de estos genes diana de Smad4 evolutivamente conservados, para clasificar adenocarcinomas humanos de próstata y mama en subclases de buenos y escasos resultados, junto con la frecuente y significativa regulación por disminución del Smad4 durante la progresión (datos Oncomine, con diagramas de caja {boxplots) ) en varios tipos de tumores humanos, sirven para validar al ratón PterPc~f~ Smad4p ~/~ como modelo muy importante de próstata metastásica impulsado por eventos distintivos presentes en PCA humano y respaldan nuestro enfoque analítico integrador de especies cruzadas.
Ejemplo 8: El análisis in silico revela genes de movimiento celular que son expresados diferencialmente en tumores Pten/Smad4 metastásicos comparados con tumores Pten inactivos .
Los fenotipos de progresión sorprendentemente diferente de los modelos PCA Ptenpc_/~ y Ptenpc~/_ Smad^''' y la capacidad del panel de 284 genes para estratificar poblaciones de pacientes con PCA humano subrayan que las DETERMINANTES PC impulsan funcionalmente la progresión metastásica. Para recoger la visión temprana de los tipos de actividades biológicas conferidas por estos ¡genes, realizamos un análisis de trayectoria conocida mediante el programa Ingenuity Pathway Analysis (IPA) (Ingenuity Systems Inc., Redwood City, CA) (Figuras 6A-6B) . Mientras la categoría de movimiento celular calificó con el #18 en los tumores Ptenpc_/~; p53pc_/~ invasivos pero no metastásicos (Figura 6B) , los genes de movimiento celular calificaron con #1 para tumores Ptenpc" " ; Smad4pc" " propensos a metástasis (Figura 6A) .
Ejemplo 9: Las DETERMINANTES PC exhiben progresión correlacionada con la expresión en cáncer de próstata humano Está muy establecido que la inestabilidad genómica induce tumorigénesis , que genera tumores primarios formados por subpoblaciones heterogéneas de células con perfiles genéticos comunes y distintos. Por lo tanto, es razonable que si una DETERMINANTE PC que expresa una subpoblación dentro de un tumor primario está dotad ; de una ventaja proliferativa y que finalmente se disemina, la expresión de la DETERMINANTE PC aumentaría debido a la representación enriquecida en las lesiones metastásicas derivadas más homogéneas. Para evaluar esta expresión asociada con la progresión, las 372 DETERMINANTES; PC se examinaron en el gran compendio de datos de perfiles de expresión de cáncer de próstata en el sistema Oncomirie. Se encontró que SETENTA Y CUATRO (74) DETERMINANTES PC muestran expresión relacionada con la progresión en el cáncer de próstata humano (Tabla 4) , además ponen de relieve la importancia de las DETERMINANTES PC para el cáncer humano. 1 Ejemplo 10: Las especies cruzadas y las DETERMINANTES PC trianguladas con plataforma cruzada son pronóstico ; en el cáncer de próstata humano.
El distintivo de metástasis formado por 372 DETERMINANTES PC diferencialmente expresadas en tumores de ratón propensos a metastásis frente los inactivos se hizo interactuar con un gran compendio de genes que residen en alteraciones de número de copia (CNAs - copy number aberrations) en un conjunto de datos de cáncer de próstata metastásico humano19. Utilizamos genes residentes en regiones comunes mínimas (MCRs - mínimum common regions) de perfiles ACGH de cáncer de próstata metastásico humano, GSE8026 19 que se procesaron por segmentación binaria circular tal como se describió previamente24. Los genes ortólogos comunes que muestran expresión diferencial significante entre tumores de próstata de ratones Ptenpc" ' y Ptenpc'//' Smad4pc"/" así como alteración en el número de copia en tumores de próstata humanos metastáticos , se seleccionaron para posterior análisis computacional .' Este análisis identificó 56 DETERMINANTES PC (Tabla 7 que se expresan diferencialmente a nivel de ARN en tumores de ratón propensos a metástasis y a nivel de ADN en cáncer de próstata humano metastásico (Figura 6A) .
El conjunto de 56 genes (Tabla 7) se evaluó posteriormente respecto a la utilidad pronostica 1 en un conjunto de datos de expresión de genes de cáncer de próstata. Las muestras del paciente se categorizaron en dos grupos principales (grupo de bajo riesgo y grupo de alto riesgo) definidos por el distintivo de 56 genes. El análisis de Kaplan-Meier del nivel de PSA de recurrencia bioquímica (BCR) (>0.2 ng/mL) con base en los grupos definidos por el grupo de 56 genes. Para la cohorte de "alto riesgo" (Figura 21B) se encontró una supervivencia libre de recurrencia de PSA BCR (P = 0.0018) estadísticamente significativa en comparación con la cohorte de "bajo riesgo".
Ejemplo 11: Cribados genéticos para identificar DETERMINANTES PC que participan funcionalmente en la invasión.
Los cribados genéticos son útiles : para identificar el subconjunto de DETERMINANTES PC que funcionalmente inducen metástasis (Figuras 22A-22C)'. La sobreexpresión heteróloga de ciertas DETERMINANTES PC (en particular las DETERMINANTES PC 1 a 245) aumenta la actividad invasiva de las células humanas. Del mismo modo, la regulación por disminución de ciertas DETERMINANTES PC (en particular, las DETERMINANTES PC 246 a 372) da como resultado una invasión incrementada.
Ejemplo 12: Las DETERMINANTES PC impulsan directamente la invasión in vitro Clones de ADNc que representan DETERMINANTES PC reguladas por aumento y reguladas por disminución, se expresaron en un sistema pMSCV retroviral . La! línea celular PC3 de cáncer de próstata humano se transdujo individualmente con sobrenadantes retrovirales y se analizó por triplicado para detectar invasión, utilizando cámaras de invasión Matrigel de 24 pocilios. El grado de invasión de cada gen se comparó con controles GFP (Tabla 5) . Se ilustra un ensayo de invasión representativo en cámara de Boyden con células PC3 que sobreexpresan SPPl y/o control GFP por triplicado (Figura 23A) . La expresión forzada de SPPl confirmó su capacidad para aumentar en forma significativa la actividad invasiva de las células PC3 de PCA mediante el ensayo de invasión. El nivel diferencial de invasión fue estadísticamente significativo (P <0.05) (Figura 23B) . Ciertas DETERMINANTES PC que promueven la invasión está registradas como genes de movimiento celular mientras que otras no (Tabla 5, Figura 23C) . Como hecho interesante, encontramos que hubo 12 aciertos a partir de estos 28 genes de movimiento celular en las células PC3 (43% de aciertos) ; mientras que sólo hubo 6 aciertos de 38 genes que estuvieron en otras categorías funcionales (16% de aciertos) . De este modo, estos resultados de validación funcional confirman la veracidad del registro in silico de que los genes son genes que permiten el movimiento celular. Estos datos funcionales que documentan la actividad promotora de invasión de los presuntos genes diana de Smad4-Pten, contra el antecedente del fenotipo t moral PteiPc'/' Sinad4pc" " progresivo in vivo y el perfil molecular de motilidad celular in silico, indican que este bloque de invasión es un importante mecanismo de inhibición de la progresión por medio del sistema de señalización TGFp/BMP-Smad4 y se puede utilizar para priorizar la posterior validación clínica.
Ejemplo 13: Paneles pequeños de DETERMINANTES PC son pronósticos en cáncer de próstata humano.
En ciertas modalidades, ofrece ventajas la medición de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350 o todas las 372 DETERMINANTES PC para proporcionar información pronostica relativa! a la propensión de un tumor individual para metastatizarse . En otras modalidades, tiene ventajas generar paneles pequeños de DETERMINANTES PC para proporcionar esta información pronostica. Las Figuras 5, 8A-8F, 12A-12B y 21 identifican paneles formados por > 16 DETERMINANTES PC que estratifican PCA humano las consecuencias del cáncer de mama o de PCA humanos. Exploramos después la utilidad de los paneles de DETERMINANTES PC más pequeños (Figuras 24A-24B) .! La expresión desregulada de Pten y Smad4 junto con la ciclina DI relacionada (proliferación/senescencia) y SPP1 (sistema de motilidad) demostró después, en un conjunto de datos de expresión génica de cáncer de próstata, que» está correlacionada con la progresión del cáncer de próstata humano (Figura 24A) . Las muestras del paciente se clasificaron en dos grupos principales por K-media (grupos de alto riesgo y bajo riesgo) definidos por el distintivo PTEN, SMAD4, ciclina DI y SPPl. Los pacientes del grupo de alto riesgo mostraron un nivel de PSA de recurrencia bioquímica (BCR) estadísticamente significativo (> 0.2 i ng/ml) determinado por análisis Kaplan-Meier . La significativa correlación de los distintivos PTEN, j SMAD4 , ciclina Di y SPPl en la progresión del PCA se validó en un conjunto de datos del estudio Physicians' Healthj Study (PHS) con estadística c. El distintivo PTEN, ! SMAD4 , ciclina DI y SPPl mostró potencia similar en la puntuación Gleason en cuanto al pronóstico de resultados letales. La adición de los genes PTEN, SMAD4, ciclina DI y SPPl a la evaluación Gleason mejoró de manera significativa el pronóstico de resultados letales con respecto al modelo Gleason solo, en PHS (Figura 24B) . Por otra parte, el conjunto de los 4 genes PTEN, SMAD4 , ciclina DI y SPPl calificó como el más enriquecido entre los 244 distintivos bidireccionales curados en la base de datos Molecular Signature Databases del Broad Institute (MSigDB, versión 2.5), indicando la robusta significancia de este distintivo de 4 genes en el pronóstico de resultados letales (Figura 24C) .
Ejemplo 14: Las DETERMINANTES PC son pronóstico en cáncer de mama Aun cunado se descubrieron en el contexto del cáncer de próstata, es probable que las DETERMINANTES PC regulen procesos metastáticos centrales importantes en varios tipos de cáncer. Para explorar esta posibilidad, evaluamos las 56 DETERMINANTES PC filtradas por especies cruzadas/plataforma cruzada (Tabla 7) , respecto : a su utilidad pronostica en un conjunto de datos de adenocarcinoma de mama. Las muestras del paciente se clasificaron en dos grupos principales (grupo dé bajo riesgo y grupo de alto riesgo) definidos por el distintivo de 56 genes. El análisis Kaplan-Meier se llevó a cabo para determinar la probabilidad de supervivencia (p = 0.00358) (Figura 25A) y la supervivencia libre de metástasis (p = 00492) (Figura 25B) con base en los grupos definidos por el agrupamiento de 56 genes. Además, examinamos las 74 DETERMINANTES PC que presentan expresión correlacionada con la progresión en el cáncer de próstata (Tabla 1 4) e identificamos 20 DETERMINANTES PC que también mostraron expresión correlacionada con la progresión en el cáncer de mama. Las 20 DETERMINANTES PC que presentan expresión correlacionada con la progresión tanto en cáncer de próstata como en cáncer de mama (Tabla 6) se evaluaron respecto a su utilidad pronostica en un conjunto de datos de adenocarcinoma de mama. Las muestras de pacientes se clasificaron en dos grupos principales (grupo de bajo riesgo y grupo de alto riesgo) definidos por los 20 distintivos de genes correlacionados con progresión. Se realizó análisis de Kaplan-Meier para determinar la probabilidad de supervivencia (p = 2.93e"11) (Figura 26A) y la supervivencia libre de metástasis (p = 4.62e"10) (Figura 26B) con base en los grupos definidos por las 20 DETERMINANTES PC.
Tabla 2 ; Presuntos genes diana de Smad4 Nombre Descripción ARG1 Argl: arginasa 1, hígado ! ABHD12 Abhdl2 : contiene el dominio 12 de abhidrolasa ALDH1A1 AldhlAl: familia aldehido deshidrogenasa 1, subfamilia Al CC D2 Ccnd2 : ciclina D2 CD44 Cd44: antígeno CD44 , C0L12A1 Coll2al: procolágeno, tipo XII, alfa 1 COL18A1 Coll8al: procolágeno, tipo XVIII, alfa 1 COL1A1 Collal: procolágeno, tipo I, alfa 1 COL1A2 Colla2 : procolágeno, tipo I, alfa 2 COL3A1 Col3al : procolágeno, tipo III, alfa 1 COL4A1 Col4al: procolágeno, tipo IV, alfa 1 COL4A2 Col4a2 : procolágeno, tipo IV, alfa 2 COL5A1 Col5al: procolágeno, tipo V, alfa 1 C0L5A2 Col5a2 : procolágeno, tipo V, alfa 2 CP Cp: ceruloplasmina CRLF1 Crlf1 : factor análogo al receptor de citosina 1 CTSE Ctsz: catepsina E DEGS2 Degs2 : homólogo de esperraatocito degenerativo 2 (Drosófila) , lípido desaturasa FBLN2 Fbln2: fibulina 2 ¡ FBN1 Fbnl: fibrilina 1 FN1 Fnl : fibronectina 1 FSCN1 Fscnl : homólogo de fascina 1, proteína de formación de haces (bundling) de actina (Strongylocentrotus putpuratus) FSTL1 Fstll : análogo 1 de folistatina GJA1 Gjal: proteína alfa 1 del canal de membrana de unión de brecha GPX2 Gpx2 : glutatión peroxidasa 2 GSN Gsn: gelsolina ID1 Idl: inhibidor de unión a ADN 1 ID3 Idl: inhibidor de unión a ADN 3 IGJ Igj : cadena de unión a inmunoglobulina INHBB Inhbb: inhibina beta-B K T14 Krtl4 : queratina 14 RT17 Krtl7: queratina 17 K T6A Krt6a: queratina 6A LGALS1 Lgalsl: lectina, de unión a galactosa, soluble 1 LHFP Lhfp: socio de la fusión de HMGIC en lipomas LOX Lox: lisil oxidasa METTL7A Mettl7a: similar a metiltransferasa 7 MID1 Midi : midlina 1 , MSN Msn: moesina NCOA4 Ncoa4 : coactivador de receptor nuclear 4 1 OSMR Osmr: receptor de oncostatina M PLLP Pllp: proteolípido de membrana plasmática PLOD2 Plod2 : lisina procolágeno, 2-oxoglutarato 5 dioxigenasa 2 POSTN Postn: periostina, factor específico de osteoblastos ' PSCA Psca: antígeno de célula germinal de próstata SCNN1A Scnnla: canal de sodio, sin voltaje- abierto, tipo I, alfa SERPINH1 Serpinhl : inhibidor de serina (o cisteína) peptidasa, clade H, miembro 1 SFRP1 Sfrpl: proteína 1 de secuencia relacionada con frizzled segregada SLPI Slpi: inhibidor de peptidasa de leucocito secretor SPARC Sparc: glucoproteína rica en cisteína ácida secretada SPONl Sponl : espondina 1, ( f-espondina) proteína de matriz extracelular SPP1 Sppl : fosfoproteína secretada 1 ! STAT5A Stat5a: transductor de señal y activador de transcripción 5A ! STEAP4 Steap4 : familia STEAP miembro 4 ' TESC Tese: tescalcina TFF3 Tff3: factor trefoil 3, intestinal TGFBI Tgfbi: factor de crecimiento transformante, beta inducido HBS2 Thbs2 : tromboespondina 2 TIMP1 Timpl: inhibidor tisular de metaloproteinasa 1 TM4SF1 Tm4sfl: superfamilia transmembrana 4 miembro 1 TMEM45B Tmem45b: proteína transmembrana 45b TNC Tnc: tenascina C TTR Ttr: transtiretina UPK1A Upkla: uroplaquina 1A UPK1B Upklb: uroplaquina IB ! ZBTB16 Zbtbl6 : contiene dedo de zinc y dominio BTB 16 Tabla 3: Esta representa los 17 genes diana de SMAD4 Nombre Descripción ALDH1A1 AldhlAl : familia aldehido deshidrogenasa 1, subfamilia Al i CP Cp: ceruloplasmina FBN1 Fbnl: fibrilina 1 FSCN1 Fscnl : homólogo de fascina 1, proteína de formación de haces (bundling) de actina (Strongylocentrotus putpuratus) GPX2 Gpx2 : glutatión peroxidasa 2 ID3 Idl : inhibidor de unión a ADN 3 1 KRT14 Krtl4 : queratina 14 KRT17 Krtl7: queratina 17 RT6A Krt6a: queratina 6A LHFP Lhfp: socio de la fusión de H GIC en lipomas OSMR Osmr: receptor de oncostatina PL0D2 Plod2 : lisina procolágeno, 2 -oxoglutarato 5 dioxigenasa 2 PSCA Psca: antígeno de célula germinal de próstata SPP1 Sppl : fosfoproteína secretada 1 ; TM4SF1 Tm4sfl: superfamilia transmembrana 4 miembro 1 UPK1B Upklb: uroplaguina IB ZBTB16 Zbtbl6: contiene dedo de zinc y dominio BTB 16 Tabla 4 DETERMINANTES PC que muestran patrones de expresión correlacionada con progresión en cáncer de próstata en la base de datos Oncomine Nombre Descripción ; Genes regulados por aumento ADAM8 Adam8 : dominio 8 de desintegrina y metalopeptidasa AK1 Akl : adenilato cinasa 1 ANGPTL4 Angptl4: análogo de angiopoyetina 4 B4GALT5 : B4galt5: UDP-Gal :betaGLcNAc beta 1,4- galactosiltransferasa, polipéptido 5 BIRC5 Birc5: repetición 5 IAP baculoviral BST1 Antígeno de célula estrómica de médula espinal CC D1 Ccndl : ciclina DI CDC2 Cdc2a: homólogo A del ciclo 2 de división celular (S. pombe) CDCA8 Cdca8 : ciclo de división celular asociado 8 CENPA Cenpa: proteína centrómera A C0L18A1 Coll8al: procolágeno, tipo XVIII, alfa 1 COL1A1 Collal procolágeno, tipo I, alfa 1 ¡ C0L3A1 Col3al procolágeno, tipo III, alfa 1 COL5A2 Col5a2 procolágeno, tipo V, alfa 2 ETS1 Etsl: dominio 1,5' del oncogen de la leucemia aviar E26 FSCN1 Fscnl : homólogo de fascina 1, proteína de formación de haces (Jundling) de actina (Strongylocentrotus putpuratus) ; HMGB2 Caja del grupo de alta movilidad 2 ITGB2 Itgb2 : integrina beta 2 , KIAA0101 2810417H13RÍk: gen RIKEN cDNA 2810417H13 KLK7 Peptidasa relacionada con la calicreína 7 LAMBI Lambí- 1: laminina Bl subunidad 1 LRIG1 Repeticiones ricas en leucina y dominios análogos a inmunoglobulina 1 ¡ MCM5 Mcm5 : deficiente en mantenimiento de minicromosomas 5, ciclo de división celular 45 (S. cerivisiae) MKI67 Antígeno identificado por anticuerpo monoclonal Ki-67 NCF4 Ncf4 : factor citosólico de neutrófilos 4 0LFML2B 01fml2b: similar a olfactomedina 2B PDPN Pdpn: podoplanina PL0D2 Plod2 : lisina procolágeno, 2 -oxoglutarato 5 dioxigenasa 2 SLC16A1 SlclSal: familia portadora de soluto 16, (transportadores de ácido monocarboxílico) , miembro 1 SPI1 Sfpil: integración proviral SFFV 1 SPP1 Sppl : fosfoproteína secretada 1 STEAP3 Steap3 : familia STEAP miembro 4 THBS2 Thbs2 : tromboespondina 2 TNFRSF12A Tnfrsfl2a: superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral, miembro 12a T0P2A Top2a: topoisomerasa (ADN) II alfa UBEC2C Ube2c: enzima E2C de conjugación con ubiguitina VCA versican Genes regulados por disminución ALDH1A1 AlshlAl: familia aldehido deshidrogenasa, subfamilia Al ATRN Atrn: atractina BEX4 Expresado en cerebro, unido a X, 4 CYB5B Cyb5b: citocromo b5 tipo B ' FMOD Fibromodulina GSN Gsn: gelsolina GSTM5 Glutatión S-transferasa mu 5 ¡ GSTOl Gstol : glutatión S-transferasa omega 1 ID1 Idl : inhibidor de unión a ADN 1 ¡ ID2 Id2 : inhibidor de unión a ADN 2 ' IQGAP2 Iggap2 : motivo IQ que contiene proteína 2 activadora de ATPasa i KRT15 Krtl5: queratina 15 ; LASS4 Homólogo LAG1, ceramida sintasa 4 METTL7A Mettl7a: similar a metiltransferasa 7A MIDI Midi: midline 1 MSMB Microseminoproteína , beta- NC0A4 Ncoa4: coactivador de receptor nuclear 4 ! 0NECUT2 Homeosecuencia one cut 2 PEX1 Factor de biogénesis peroxisómico PINK1 Pinkl: pseudocinasa 1 inducida por PTEN PTEN Fosfatasa y homólogo de tensina ' PTGS1 Ptgsl: prostaglandina-endoperóxido sintasa 1 RAB27B Rab27b: RAB27b, miembro RAS de la familia de oncogenes SATB1 Homeosecuencia SATB 1 : SC N1A Scnnla: canal de sodio, sin voltaje-cerrada, tipo I, alfa SLC25A26 familia de portadores de soluto 25, miembro 26 SMAD4 Familia SMAD, miembro 4 SPINT1 Inhibidor de serina peptidasa, tipo Kunitz 1 STAT5A Stat5a: transductor de señal y activador de transcripción 5A ! SUOX Sulfito oxidasa 1 TBX3 Tbx3 : caja-T 3 TFF3 Tff3 : factor 3 de trébol, intestinal TGM4 Transglutaminasa 4 (próstata) TMEM45B Tmem45b: proteina transmembrana 45b TRIM2 Trim2 : proteína 2 del motivo tripartita ¡ UPK1A Upkla: uroplaquina 1A Tabla 5 DETERMINANTES PC que influyen funcionalmente en la invasión in vitro Nombre Descripción Resultado Registro (número de veces de cambio) GSN Gsn: gelsolina 0.1 Movimiento celular ID4 Id : inhibidor de unión a ADN 0.1 otro 4 ID1 Id4 : inhibidor de unión a ADN 0.2 Movimiento j celular 1 ZBTB16 Zbtbl6 : contiene dedo de zinc 0.2 Movimiento celular y dominio BTB 16 PINK1 Pinkl: pseudocinasa 1 0.4 Otro inducida por PTEN TTR Ttr: transtiretina 0.4 Otro UGT2B15 Ugt2b35: familia UDP 0.4 Otro glucuronosiltransferasa 2, polipéptido B35 CTSE Ctse: catepsina E 0.5 Movimiento celular MIDI Midi : midline 1 0.5 Otro CD53 Cd53 : antígeno CD53 1.8 Movimiento celular SLPI Slpi: inhibidor de peptidasa 2.2 Movimiento 'celular de leucocito secretor CD44VE Cd44ve: isoforma del antígeno 2.4 Movimiento celular CD44 contiene ocho de los diez exones CD44 variables (v3-vl0) LOX Lox: lisil oxidasa 2.6 Movimiento Celular TM4SF1 Tm4sfl: superfamilia 2.64 Otro transmembrana 4 miembro 1 FSC 1 Fscnl : homólogo de fascina 1 , 3.1 Movimiento celular proteína de formación de haces {bundling) de actina (Strongylocentrotus LGALSl Lgalsl: lectina, de unión a 3.3 Movimiento celular galactosa, soluble 1 SPP1 Sppl: fosfoproteína secretada 3.3 Movimiento celular 1 KRT6A Krt6a: queratina 6A 6.5 Movimiento celular ABHD12 Abhdl2 : contiene dominio de Sin aciertos Otro abhidrolasa 12 i ADAM19 Adaml9 : desintegrina y Sin aciertos Otro dominio de metalopeptidasa 19 (meltrin beta) ALDH1A1 AldhlAl: familia aldehido Sin aciertos Otro deshidrogenasa 1, subfamilia Al ARGl Argl : arginasa 1 , hígado Sin aciertos Otro BIRC5 Birc5 : repetición 5 IAP Sin aciertos Otro baculoviral C4orfl8 1110032E23Rik: gen RIKEN ADNc Sin aciertos Otro 1110032E23 CCND2 Ccnd2: ciclina D2 Sin aciertos Otro CDCA8 Cdca8 : ciclo de división Sin aciertos Otro celular asociado 8 COL3A1 Col3al: procolágeno, tipo Sin aciertos Otro III, alfa 1 DDAH1 Ddahl : dimetilarginina Sin aciertos Otro dimetilaminohidrolasa 1 FKBP10 FkbplO : proteína 10 de unión Sin aciertos Otro a FK506 FSTLl Fstll : análogo 1 de Sin aciertos Movimiento celular folistatina GJA1 Gjal: proteína alfa 1 del Sin aciertos Movimiento celular canal de membrana de unión de brecha ID3 Id3 : inhibidor de unión a ADN Sin aciertos Movimiento celular 3 IGF1 Igfl: factor de crecimiento 1 Sin aciertos Movimiento celular similar a insulina IL4R Il4ra: receptor de Sin aciertos Movimiento celular interleucina 4, alfa I HBB Inhbb: inhibiría beta-B Sin aciertos Otro ITGAX Itgax: integrina alfa X Sin aciertos Movimiento celular ITGB2 Itgb2 : integrina beta 2 Sin aciertos Movimiento celular JUB Jub: ajuba Sin aciertos Movimiento celular KRT14 Krtl4 : queratina 14 Sin aciertos Otro KRT17 Krtl7 : queratina 17 Sin aciertos Otro LGALS7 Lgals7 : lectina, de unión a Sin aciertos Otro galactosa, soluble 7 LHFP Lhfp: socio de la fusión de Sin aciertos Otro HMGIC en lipomas LOXL2 Loxl2 : similar a lisil Sin aciertos Otro oxidasa 2 ETTL7A Mettl7a: similar a Sin aciertos otro metiltransferasa 7A MSN Msn: moesina Sin aciertos Movimiento ;celular NCOA4 Ncoa4 : coactivador de Sin aciertos Movimiento celular receptor nuclear 4 OLFML2B 01fml2b: similar a Sin aciertos Otro olfactomedina 2B OSMR Osmr : receptor de Sin aciertos Otro oncostatina M PLLP Pllp: proteolípido de Sin aciertos Otro membrana plasmática PLOD2 Plod2 : lisina procolágeno, Sin aciertos Otro 2-oxoglutarato 5 dioxigenasa 2 PSCA Psca: prostaglandina- Sin aciertos Otro ¡ endoperóxido sintasa 1 PTGS1 Ptgsl: prostaglandina- Sin aciertos Otro endoperóxido sintasa 1 PXDN Pxd : homólogo de Sin aciertos Otro peroxidasina (Drosófila) SERPI H1 Serpinhl : inhibidor de Sin aciertos Otro serina (o cisteína) peptidasa, clade H, miembro 1 SH3PXD2B Sh3pxd2b: dominios 2B de SH3 Sin aciertos Otro y PX SPARC Sparc: glucoproteína rica en Sin aciertos Movimiento celular cisteína acida secretada SLPI Slpi: inhibidor de peptidasa Sin aciertos Movimiento celular de leucocito secretor SPON1 Sponl: espondina 1, (f- Sin aciertos Otro espondina) proteína de matriz extracelular SPRR2G Sprr2a: proteína 2A pequeña Sin aciertos Otro rica en prolina STAT5A Stat5a: transductor de señal Sin aciertos Movimiento celular y activador de transcripción 5A TESC Tese : tescalcina Sin aciertos Otro TFF3 Tff3: factor 3 de trébol, Sin aciertos Movimiento celular intestinal TGFBI Tgfbi : factor de crecimiento Sin aciertos Movimiento celular transformante, beta inducido TIMP1 Timpl : inhibidor tisular de Sin aciertos Movimiento celular metaloproteinasa 1 T E 45B Tmem45b: proteína Sin aciertos Otro transmembrana 5b UPK1B Upklb: uroplaguina IB Sin aciertos Otro Tabla 6 DETERMINANTES PC que muestran expresión correlacionada con progresión en cáncer de próstata y cáncer de mama humanos Nombre Descripción ADAM8 Adam8 : dominio 8 de desintegrina y metalopeptidasa ANGPTL4 Angptl4 : análogo de angiopoyetina 4 BIRC5 Birc5 repetición 5 IAP baculoviral CCND1 Ccndl ciclina DI CDC2 Cdc2a homólogo A del ciclo 2 de división celular (S. pombe CDCA8 Cdca8 : ciclo de división celular asociado 8 CENPA Cenpa : proteina centrómera A KIAA0101 2810417H13Rik: gen RIKEN ADNc 2810417H13 MCM5 Mcm5 : deficiente en mantenimiento de minicromosomas 5, ciclo de división celular 45 (S. cerivisiae) PLOD2 Plod2 : lisina procolágeno, 2 -oxoglutarato 5 dioxigenasa 2 SLC16A1 Slcl6al: familia portadora de soluto 16, (transportadores de ácido monocarboxílico) , miembro, 1 SPP1 Sppl: fosfoproteína secretada 1 TOP2A Top2a: topoisomerasa (ADN) II alfa UBE2C Ube2c: enzima E2C de conjugación con ubiquitina KI67 Antígeno identificado por el anticuerpo monoclonal Ki-67 SMAD4 Familia S AD, miembro 4 TFF3 Tff3: factor trefoil 3, intestinal PTEN Fosfatas y homólogo de tensina FMOD Fibromodulina SUOX Sulfito oxidasa Tabla 7 56 DETERMINANTES PC con alteraciones en el ; número de copia de ADN en un conjunto de datos CGH de PCA metastásico humano Nom re Descripción Genes regulados por aumento ADA 19 Adaml9: dominio 19 de desintegrina y metalopeptidasa (beta meltrin) ANTXR2 Antxr2 : receptor 2 de la toxina del ántrax C1QB Clqb: componente 1 del complemento, subcomponente b, beta polipéptido CD200 Cd200: antígeno Cd200 CD248 Cd248: antígeno CD248, endosialina C0L8A1 Col8al: procolágeno, tipo XVIII, alfa 1 CP C : ceruloplasmina ! FBN1 Fbnl: fibrilina 1 FKBP10 FkbplO: proteína 10 de unión a FK506 FRZB Frzb: proteína relacionada con frizzled FSCN1 Fscnl : homólogo de fascina 1, proteína de formación de haces (bundling) de actina (Strongylocehtrotus putpuratus) GCNT2 Glucosaminil (N-acetil) transferasa 2, enzima de ramificación I (grupo sanguíneo I) GPX2 Gpx2 : glutatión peroxidasa 2 HPR Hp : haptoglobina 1 JAG1 Jagl : dentado 1 KLHL6 Similar a kelch 6 (Drosófila) : KRT14 Krtl4 : queratina 14 KRT17 Krtl7: queratina 17 ¡ KRT5 Krt5: queratina 5 KRT6A Krt6a: queratina 6A LGMN Lgmn: legumaína ' LHFP Lhfp: socio de la fusión de HMGIC en lipomas MKI67 Antígeno identificado por el anticuerpo monoclonal ;Ki-67 MSRB3 Msrb3 : metionina sulfóxido reductasa B3 NID1 Nidl : nidogen 1 REFERENCIAS LISTA DE REFERENCIAS 1. Jemal, A. et al. Cáncer statistics, 20?8. CA Cáncer J. Clin. 58, 71-96 (2008) . 2. Walsh,P.C, DeWeese,T.L. & Eisenberger, M . A .
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Claims (57)

200 REIVINDICACIONES :
1. Un método con un nivel predeterminado de previsibilidad para evaluar riesgo de recurrencia de ; cáncer o desarrollo de cáncer metastásico en un individuo, que comprende : a. medir el nivel de dos o más DETERMINANTES PC seleccionadas a partir del grupo formado por 1 a 372 DETERMINANTES PC en una muestra proveniente del individuo, y b. medir una alteración clínicamente significativa en el nivel de las dos o más DETERMINANTES PC en la muestra, en donde la alteración indica un incremento en el riesgo de recurrencia de cáncer o de desarrollo de cáncer metastásico en el individuo.
2. El método según la reivindicación 1, en donde las dos o más DETERMINANTES PC se seleccionan a partir de: a) Tabla 2 b) Tabla 3 · 1 c) Tabla 4 d) Tabla 5 e) Tabla 6 f) Tabla 7 ; y ; g) dos o más Tablas seleccionadas a partir de las Tablas 2 a 7.
3. El método según la reivindicación ?, en donde las DETERMINANTES PC incluyen Pten, Smad , ciclina DI y SPP1. i
4. El método según la reivindicación 1, que también consiste en medir al menos uno de los parámetros estándar asociados con el cáncer.
5. El método según la reivindicación 4, en donde el cáncer es cáncer de próstata y el parámetro estándar es la puntuación de Gleason.
6. El método según la reivindicación 1, en donde el nivel de una DETERMINANTE PC se mide por técnicas electroforéticas , inmunoquímicas o por adquisición de imágenes no invasivas.
7. El método según la reivindicación ;6, en donde la detección inmunoquímica es por radioinmunoanálisis , análisis por inmunofluorescencia; o por i ensayos de inmunoabsorción ligado a enzima. ¡
8. El método según la reivindicación 1, en donde el individuo tiene un tumor primario, un ; tumor recurrente o cáncer de próstata metastásico.
9. El método según la reivindicación jl, en donde la muestra es una biopsia del tumor, sangre o células tumorales circulantes en un fluido biológico. :
10. El método según la reivindicación 1, en donde la biopsia es una biopsia con aguja gruesa, una biopsia de tejido por escisión o una biopsia de tejido por incisión.
11. El método según la reivindicación 1, en donde se mide el nivel de expresión de cuatro o más DETERMINANTES PC.
12. Un método con un nivel predeterminado de previsibilidad para evaluar el riesgo de recurrencia de cáncer o de desarrollo de cáncer metastásico en un individuo, que consiste en: a. medir el nivel de dos o más DETERMINANTES PC seleccionadas a partir del grupo formado por 1 a 372 DETERMINANTES PC en una muestra proveniente del individuo, y ; b. comparar el nivel de las dos o más DETERMINANTES PC con un valor de referencia.
13. El método según la reivindicación 12, en donde el valor de referencia es un valor índice.
14. Un método con un nivel predeterminado de previsibilidad para evaluar la progresión de un tumor en un individuo, que consiste en: a. detectar el nivel de dos o más DETERMINANTES PC seleccionadas a partir del grupo formado por 1 a 372 DETERMINANTES PC en una primera muestra proveniente del individuo en un primer periodo de tiempo; j b. detectar el nivel de las dos o más DETERMINANTES PC en una segunda muestra proveniente del individuo en un segundo periodo de tiempo; c . comparar el nivel de las dos o más DETERMINANTES PC detectadas en el paso (a) con el nivel detectado en el paso (b) o con un valor de referencia.
15. El método según la reivindicación 14, en donde la primera muestra se extrae del individuo antes de someterse a tratamiento para el tumor.
16. El método según la reivindicación 14, en donde la segunda muestra se extrae del individuo después de someterse a tratamiento para el tumor.
17. Un método con un nivel predeterminádo de previsibilidad para monitorear la eficacia del tratamiento para un cáncer recurrente o metastásico: a. detectar el nivel de dos o más DETERMINANTES PC seleccionadas a partir del grupo formado por 1 a 372 DETERMINANTES PC en una primera muestra proveniente del individuo en un primer periodo de tiempo; ; b. detectar el nivel de dos o más DETERMINANTES PC en una segunda muestra proveniente del individuo; en un segundo periodo de tiempo; c. comparar el nivel de las dos p más DETERMINANTES PC detectadas en el paso (a) con el, nivel i detectado en el paso (b) o con un valor de referencia, en donde la eficacia del tratamiento se monitorea por un cambio en el nivel de dos o más DETERMINANTES PC en el individuo.
18. El método según la reivindicación 17, en donde el individuo ha sido tratado previamente contra el cáncer.
19. El método según la reivindicación 17, en donde la primera muestra se extrae del individuo antes de someterse a tratamiento contra el cáncer.
20. El método según la reivindicación 17, en donde la segunda muestra se extrae del individuo después de someterse a tratamiento contra el cáncer.
21. El método según la reivindicación 17, en donde la segunda muestra se extrae del individuo después de la recurrencia del cáncer.
22. El método según la reivindicación 17, en donde la segunda muestra se extrae del individuo antes de la recurrencia del cáncer. ;
23. Un método con un predeterminado nivel de previsibilidad para seleccionar un régimen de tratamiento para un individuo diagnosticado con un tumor, que consiste en : i a. detectar el nivel de dos o más DETERMINANTES PC seleccionadas a partir del grupo formado por 1 a 372 DETERMINANTES PC en una primera muestra preveniente del individuo en un primer periodo de tiempo; b. opcionalmente , detectar el nivel de dos o más DETERMINANTES PC en una segunda muestra preveniente del individuo en un segundo periodo de tiempo; c. comparar el nivel de las dos b más DETERMINANTES PC detectadas en el paso (a) con un valor de referencia o como opción, con la cantidad detectada en el paso (b) .
24. El método según la reivindicación 23, en donde el individuo se tratado previamente para combatir el tumor. ;
25. El método según la reivindicación 23, en donde la primera muestra se toma del individuo antes de someterse a tratamiento para combatir el tumor.
26. El método según la reivindicación 23, en donde la segunda muestra se toma del individuo después de someterse a tratamiento para combatir el tumor.
27. Un perfil de expresión de referencia de cáncer de próstata metastásico, que consiste de un patrón de niveles de marcadores de dos o más marcadores seleccionados a partir del grupo formado por 1 :a 372 DETERMINANTES PC. ',
28. Un estuche que comprende una pluralidad de reactivos de detección de DETERMINANTES PC que detectan las correspondientes DETERMINANTES PC seleccionadas a partir del grupo formado por 1 a 372 DETERMINANTES PC, suficientes para generar el perfil según la reivindicación 27.
29. El estuche según la reivindicación 28, en donde el reactivo de detección comprende uno ;o más anticuerpos o fragmentos de los mismos.
30. El estuche según la reivindicación 28, en donde el reactivo de detección comprende uno o más oligonucleótidos .
31. El estuche según la reivindicación 28, en donde el reactivo de detección comprende uno o más aptámeros . ,
32. Un medio susceptible de leerse en una máquina que contiene uno o más perfiles de expresión de referencia de cáncer de próstata metastásico según la reivindicación 27 y opcionalmente , resultados de :prueba adicionales e información del individuo.
33. Un panel de DETERMINANTES PC que comprende una o más DETERMINANTES PC que son indicativas de una vía fisiológica o bioquímica asociada con metástasis. '
34. El panel según la reivindicación 33, en donde la vía fisiológica o bioquímica comprende •migración celular, angiogénesis , degradación de la imatriz extracelular , colonización o anoikis.
35. Un panel de DETERMINANTES PC que comprende una o más DETERMINANTES PC que son indicativas de la progresión de un tumor.
36. Un método para identificar un compuesto que modula la actividad o expresión de una DETERMINANTE PC, que consiste en: · (a) proporcionar una célula que exprese la DETERMINANTE PC; ; (b) poner en contacto la célula con una composición que comprende un compuesto candidato; y (c) determinar si la sustancia altera la expresión de actividad de la DETERMINANTE PC; por lo cual, si la alteración observada en presencia del compuesto no se observa cuando la célula se pone en contacto con una composición carente del compuesto, el compuesto identificado modula la actividad o expresión de una DETERMINANTE PC.
37. El método según la reivindicación 36, en donde la célula se pone en contacto in vivo, ex vivo o in vi tro.
38. Un método para tratar un cáncer en un individuo, que consiste en administrarle al individuo un compuesto que modula la actividad o expresión de una DETERMINANTE PC. i
39. Un método para tratar o prevenir cáncer de próstata en un individuo, que consiste en administrarle al individuo un agente que modula la actividad o expresión de una DETERMINANTE PC.
40. Un ratón transgénico con genes doblemente inactivados cuyo genoma contiene una alteración homocigótica de los genes endógenos Pten y Smad4 , en donde el ratón transgénico exhibe una mayor susceptibilidad a la formación de tumores de próstata en comparación con un ratón tipo silvestre.
41. Una célula del ratón transgénico según la reivindicación 40.
42. La célula según la reivindicación 41, en donde la célula es una célula epitelial.
43. La célula según la reivindicación 41, en donde la célula epitelial es una célula de próstata, una célula de mama, una célula de colon o una célula de pulmón.
44. Un método de cribado para seleccionar agentes terapéuticos que inhiben la progresión del cáncer de próstata que consiste en: administrar un agente terapéutico candidato al ratón transgénico según la reivindicación 40 y evaluar el efecto del agente terapéutico sobre la progresión del cáncer de próstata en el ratón. '
45. Un método para identificar un biomarcador, que consiste en comparar el perfil genómico o proteómico de expresión génica en una primera muestra obtenida a partir del ratón transgénico según la reivindicación 40 en ausencia de un compuesto de prueba con el perfil de una 209 muestra obtenida a partir del ratón transgénico según la reivindicación 40 en presencia de un compuesto de prueba.
46. El método según la reivindicación 45, en donde la muestra es una muestra de célula, una muestra de sangre o una célula tumoral circulante.
47. Un método para identificar el ¡perfil genómico o proteómico de expresión génica en una primera muestra obtenida a partir del ratón transgénico según la reivindicación 40 en un primer periodo de tiempo con el perfil del de una muestra obtenida a partir del; ratón transgénico según la reivindicación 40 en un segundo periodo de tiempo.
48. El método según la reivindicación 47, en donde la muestra es una muestra de célula, una muestra de sangre o una célula tumoral circulante.
49. Un estuche que comprende reactivos para la detección o cuantificación de Pten, Smad4 , cicliná DI y SPP1 e instrucciones de uso del estuche.
50. Un mamífero no humano transgénico cuyo tejido prostático comprende una célula cuyo genoma contiene una alteración homocigótica de los genes endógenos Pten y Smad4 , en donde el mamífero muestra una mayor susceptibilidad al desarrollo de cáncer de próstata en comparación con un mamífero de control sin esa alteración en alguno de los genes Pten o Smad4 y muestra una mayor susceptibilidad al desarrollo de cáncer de próstata metastásico más que al indolente, en comparación con un mamífero de control con alteración homocigótica sólo en el gen Pten pero no en el gen Smad4. :
51. Un método para tratar cáncer, que comprende los siguientes pasos: a) proporcionar un individuo cuyas células cancerosas tengan una alteración clínicamente significativa en el nivel de dos o más de las 1 a 372 DETERMINANTES PC, en donde la alteración indica un aumento en el riesgo de recurrencia de cáncer o de desarrollo de cáncer metastásico en el individuo; y ', b) tratar al individuo con una terapia complementaria además de la terapia estándar.
52. El método según la reivindicación 51, en donde la terapia estándar es cirugía, radiación o ablación andrógena .
53. Un método para tratar cáncer de próstata en un individuo que lo necesite, que consiste en los siguientes pasos: a) obtener información sobre los niveles de expresión de PTEN, SMAD4 , CICLINA DI y SPP1 en una muestra de tejido de cáncer de próstata, en un individuo; y b) administrar un inhibidor SPP1 o un inhibidor CD44 a un individuo que se identifica con riesgo de recurrencia de cáncer de próstata o desarrollo de . cáncer metastásico con base en los niveles de expresión.
54. El método según la reivindicación 53, en donde el inhibidor es un anticuerpo anti-SPPl, un ARNsi SPP1, un anticuerpo de CD44 o ARNsi CD44.
55. Un método para determinar si un individuo con cáncer podría beneficiarse de un régimen de tratamiento : a) detectar el nivel de dos o más de las 1 a 372 DETERMINANTES PC y b) comparar el nivel de dos o más DETERMINANTES PC detectadas en el paso (a) con un valor de referencia.
56. Un método para seleccionar un paciente con un tumor que necesita de un tratamiento complementario, que consiste en: evaluar el riesgo de metástasis en el paciente por medición de do o más de las 1 a 372 DETERMINANTES PC, en donde la alteración clínicamente significativa de las dos o más DETERMINANTES en una muestra de tumor proveniente del paciente, indica que el paciente necesita el tratamiento complementario.
57. Un método para fundamentar una decisión de tratamiento en un paciente con tumor, que consiste en: obtener información sobre dos o más de las 1 a 372 DETERMINANTES PC en una muestra de tumor proveniente del paciente, y seleccionar un régimen de tratamiento que evite o reduzca la metástasis del tumor en el paciente si las dos o más DETERMINANTES están alteradas de una manera clínicamente significativa.
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