KR20210016362A - 결장암 예측 바이오마커로서의 l1td1 - Google Patents

Abstract

본 발명은 결장암의 예측 예후 마커로서 1을 함유하는 LINE-1형 트랜스포사제(transposase) 도메인(L1TD1)과 같은 바이오마커에 관한 것이다. 본 발명은 또한 결장암을 예후하는 방법 및 상기 방법에 사용하기 위한 키트에 관한 것이다.

Description

결장암 예측 바이오마커로서의 L1TD1

본 발명은 분자 진단 분야에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 결장암(colon cancer)을 예후하기 위한 수단 및 방법에 관한 것이다.

줄기 세포 유사 유전자 시그니처는 다양한 암에서 검출되었으며, 배아 줄기 세포 인자 OCT4 및 NANOG는 다양한 암 유형에서 향상된 종양 형성 및 불량한 예후와 관련이 있다.

1을 함유하는 LINE-1형 트랜스포사제(transposase) 도메인(L1TD1)은 미분화 배아 줄기 세포의 자가 재생에 필요한 RNA 결합 단백질이다. 최근에, L1TD1 단백질은 인간 배아 줄기 세포(hESC)에서 OCT4, NANOG, LIN28, 및 SOX2와 핵심 상호 작용 네트워크를 형성하는 것으로 나타났으며, L1TD1 결핍은 hESC에서 OCT4, NANOG, 및 LIN28의 하향 조절을 초래했다. 초기 보고서는 다른 암 유형에서 OCT4 및 NANOG의 불량한 예후와의 연관성을 증명했다.

배아 줄기 세포 외에, L1TD1의 발현은 뇌 및 결장에서 뿐만 아니라, 정상피종(seminoma), 배아 암종(embryonic carcinomas), 수모세포종(medulloblastoma), 및 결장 선암(colon adenocarcinoma)과 같은 다른 암에서도 이전에 보고되었다. L1TD1은 배아 암종 세포의 자가 재생에 필수적인 것으로 나타났으며, 정상피종 세포의 성장을 지지한다. 흥미롭게도, HPA(Human Protein Atlas)로부터의 면역 조직 화학 데이터는 L1TD1이 결장암 샘플의 하위 집합에서 높은 수준으로 발현되는 것을 시사한다. 더욱이, WO 제2013/033626호 및 US 제2010/0292094호는 대조군 수준에 비해 더높은 수준의 L1TD1이 결장암, 종양성 대장 세포(neoplastic large intestine cell) 또는 종양 상태의 발병 성향이 있는 세포를 가리킨다.

결장암은 2012년에 140만건의 새로운 사례로 전 세계에서 세 번째로 가장 흔하게 진단된 암이다. 대장암은 가장 잘 연구된 암 유형 중 하나이지만, 예측 진단 마커가 부족하다.

본 발명의 목적은 대상에서 결장암을 예후하기 위한 개선된 방법 및 수단을 제공하는 것이다.

이 목적은 독립항에 기술된 것을 특징으로 하는 방법, 용도 및 키트에 의해 달성된다. 본 발명의 일부 특정 실시형태는 종속항에 개시되어 있다.

따라서, 본 발명은 대상에서 결장암을 예후하는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 방법은 상기 대상으로부터 수득된 샘플을 L1TD1 및 ASRGL1 발현 수준에 대해 분석하는 단계, 분석된 L1TD1 및 ASRGL1 수준을 상응하는 대조군 수준과 비교하는 단계 및 상기 비교에 기초하여 상기 결장암을 예후하는 단계를 포함한다. 또한, 결장암 예후에 있어서 L1TD1 및 ASRGL1의 사용이 제공된다.

추가 측면에 있어서, 본 발명은 본 방법에 사용하기 위한 키트를 제공하며, 이 키트는 결장암이 결정될 대상으로부터 수득된 생물학적 샘플에서 L1TD1 및 ASRGL1의 발현 수준을 특이적으로 검출할 수 있는 하나 이상의 시험 제제를 포함한다.

본 발명의 추가 측면, 특정 실시형태, 목적, 세부사항 및 이점은 다음 도면, 상세한 설명 및 실시예에서 설명된다.

이하에서, 본 발명은 첨부된 도면을 참조하여 바람직한 실시형태에 의해 보다 상세히 설명될 것이다.

도 1A 내지 1C는 3개의 결장암 데이터 세트에 대한 무병 생존(disease-free survival)을 나타내는 카플란 마이어 곡선(Kaplan-Meier curves)을 도시한다. 이 곡선은 L1TD1 발현 수준(높음 또는 낮음)에 근거한 두 그룹의 결장암 환자에 대한 생존 데이터를 제시한다. 실선 곡선의 곡선은 L1TD1 발현이 높은 환자에 해당하며, 점선 곡선은 L1TD1 발현이 낮은 환자를 나타낸다. x축은 무병 생존 시간(년)을 나타내고, y축은 무병 생존 확률을 나타낸다. 위험도표(risk table)는 주어진 시점에서 위험에 처한 환자의 수를 보여준다.
도 2는 정상피종 및 줄기 세포 데이터 세트를 기반으로 결정된 L1TD1의 가장 유의적으로 공동 발현된 상호 작용 파트너 20개에 대한 스피어맨 순위 상관 계수(Spearman rank correlation)의 부호 있는 P값을 보여주는 히트맵을 나타내고; (A) 정상피종 및 줄기 세포 데이터 세트 및 (B) 결장암 데이터 세트에서의 공동 발현을 나타낸다. 상위 상호 작용 파트너는 L1TD1과 상기 상호 작용 파트너 간의 쌍별 상관 관계에 대해 계산된 스피어맨 순위 상관값의 내림차순을 기반으로 한 hESC 및 정상피종 데이터 세트에서 상호 작용 파트너의 순위를 우선 매김으로써 선택되었다. 다음에는 이들 데이터 세트에 대한 최대 순위가 각 상호 작용 파트너의 대표적인 통계로서 선택되었다. 목록은 이 최대 순위를 기준으로 정렬(오름차순)되었으며, 목록 상단부터 20개의 상호 작용 파트너가 선택되었다. 스피어맨 순위 상관의 부호 있는 P값은 1 - 스피어맨 상관의 P값 x 상관의 부호로서 정의되었다.
도 3A는 L1TD1에 대한 건강한 결장 세포의 면역 염색이 L1TD1의 조직화되고 조절된 발현을 나타내는 것을 증명한다.
도 3B는 높은 수준의 L1TD1 발현을 나타내는 대장 선암 샘플의 면역 염색을 보여준다.
도 4A 내지 4C는 3개의 결장암 데이터 세트에 대한 무병 생존을 보여주는 카플란-마이어 곡선이다. 이 곡선은 L1TD1 및 ASRGL1 발현 수준을 기준으로 한 3 그룹의 결장암 환자: L1TD1 또는 ASRGL1 발현이 없는 환자(실선), ASRGL1이 아닌 L1TD1만 발현하는 환자(파선) 및 L1TD1 및 ASRGL1을 발현하는 환자(점선)에 대한 생존 데이터를 나타낸다. x축은 무병 생존 시간(년)을 나타내고, y축은 무병 생존 확률을 나타낸다.
도 5A 내지 5C는 3개의 결장암 데이터 세트에 대한 무병 생존을 보여주는 카플란-마이어 곡선이다. 이 곡선은 L1TD1, ASRGL1 및 RETNLB 발현 수준을 기준으로 한 3 그룹의 결장암 환자: L1TD1, ASRGL1 또는 RETNLB 발현이 없는 환자(실선), ASRGL1 또는 RETNLB가 아닌 L1TD1만 발현하는 환자(파선) 및 L1TD1, ASRGL1 및 RETNLB를 발현하는 환자(점선)에 대한 생존 데이터를 나타낸다. x축은 무병 생존 시간(년)을 나타내고, y축은 무병 생존 확률을 나타낸다.
도 6A 내지 6C는 3개의 결장암 데이터 세트에 대한 무병 생존을 보여주는 카플란-마이어 곡선이다. 이 곡선은 L1TD1, ASRGL1, RETNLB 및 SPINK4 발현 수준을 기준으로 한 3 그룹의 결장암 환자: L1TD1, ASRGL1, RETNLB 또는 SPINK4 발현이 없는 환자(실선), ASRGL1, RETNLB 또는 SPINK4가 아닌 L1TD1만 발현하는 환자(파선) 및 L1TD1, ASRGL1, RETNLB 및 SPINK4를 발현하는 환자(점선)에 대한 생존 데이터를 나타낸다. x축은 무병 생존 시간(년)을 나타내고, y축은 무병 생존 확률을 나타낸다.

본 발명은 결장암에 대한 예후 예측 마커로서 L1TD1의 다른 측면에 관한 것이다. 따라서, 일부 측면에 있어서, 본 발명은 상기 마커의 상이한 용도, 및 결장암을 예후하는 상이한 시험관내(in vitro) 방법에 관한 것이다.

본 발명은 적어도 부분적으로 결장암을 앓고있는 대상으로부터 수득된 샘플에서 L1TD1의 증가된 발현이 양호한 예후를 나타낸다는 놀라운 발견에 기초한다.

본 발명의 과정 중에, 3개의 독립적인 유전자 발현 마이크로어레이 데이터 세트(N=1052)가 분석되었다. 연구자들은 L1TD1의 높은 발현이 불량한 예후와 관련이 있을 것이라는 가설 하에 결장암에서 L1TD1의 예후적인 중요성을 조사하기 시작했다. 이전 보고서는 수모세포종 및 정상피종을 포함한 다른 암 유형에서 OCT4 및 NANOG의 불량한 예후와의 연관성을 입증했다. 따라서, L1TD1의 높은 발현이 다수의 독립적인 결장암 데이터 세트에서 양성 예후와 관련이 있다는 것은 놀라운 일이었다.

본 발견은 L1TD1의 높은 발현이 불량한 예후와 관련이 있는 것으로 나타난 수모세포종에 대한 이전의 연구와 대조적이다[Santos et al., 2015, Stem Cells Dev., 24(22):2700-8]. 여느 이론에 제한되지 않고, 이 차이는 상위 20개 상호 작용 파트너, 예를 들어, OCT4, TRIM71, DPPA4, DNMT3B, LRPPRC, MRPS17, PARP1, RPF2, HSP90AA1, IGF2BP1, DNAJA2, NANOG, ALPL, EIF3B, NCL, LIN28A, NOLC1, CCT8, RRS1, 및 SFPQ(표 1) 중 하나 이상과 L1TD1의 공동 발현 부족으로 설명되며, 이는 질량분석법 및 공동 면역 침전법에 의해 초기 연구에서 확인되었다(Emani et al., 2015, Stem Cell Reports 4, 519-528).

표 1. L1TD1의 상위 20개 상호 작용 파트너

반면에, L1TD1의 유전자 발현은 결장암에서 일부 다른 유전자의 발현과 상관 관계가 있다는 것이 놀랍게도 밝혀졌다. 이들 유전자 중 상위 20개는 RETNLB, CLCA1, HEPACAM2, FOXA3, FCGBP, ST6GALNAC1, SPINK4, KIAA1324, KLF4, GMDS, SLITRK6, SERPINA1, LINC00261, ITLN1, MUC2, DEFA5, ASRGL1, SLC27A2, RNF186, 및 PCCA이다(표 2).

표 2. 상위 20개 공동 발현 유전자

따라서, 본 발명은 L1TD1의 발현 수준을 기준으로 하여 대상에서 결장암을 예후하는 방법을 제공한다. 이 방법은 상기 대상에서 얻은 샘플을 L1TD1 발현 수준에 대해 분석하는 단계, 분석된 L1TD1 수준을 대조군 수준과 비교하는 단계 및 상기 비교에 기초하여 상기 결장암을 예후하는 단계를 포함한다. 본 발명에 따르면, L1TD1의 발현 증가는 양호한 예후를 나타내는 반면, L1TD1의 감소 또는 정상 발현은 불량한 예후를 나타낸다.

일부 실시형태에 있어서, 상기 방법은 OCT4, TRIM71, DPPA4, DNMT3B, LRPPRC, MRPS17, PARP1, RPF2, HSP90AA1, IGF2BP1, DNAJA2, NANOG, ALPL, EIF3B, NCL, LIN28A, NOLC1, CCT8, RRS1, 및 SFPQ로 이루어진 군 중에서 선택된 L1TD1의 하나 이상의 상호 작용 파트너에 대해서도 상기 샘플을 분석하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 여기서 L1TD1과의 공동 발현의 결핍은 양호한 예후를 나타낸다.

일부 추가 실시형태에 있어서, L1TD1과의 공동 발현의 결핍이 양호한 예후, 특히 장기 무병 생존을 나타내는 바람직한 상호 작용 파트너는 OCT4, DNMT3B, NANOG, 및 LIN28A를 포함한다. 분석될 바람직한 바이오마커 조합은 L1TD1 및 OCT4; L1TD1, OCT4 및 DNMT3B; L1TD1, OCT4, NANOG 및 LIN28A; 또는 L1TD1, OCT4, DNMT3B, NANOG, 및 LIN28A로서, 여기서 L1TD1과 표시된 상호 작용 파트너 사이의 공동 발현의 결핍은 양호한 예후를 나타낸다.

대안적으로 또는 추가로, 본 방법은 RETNLB, CLCA1, HEPACAM2, FOXA3, FCGBP, ST6GALNAC1, SPINK4, KIAA1324, KLF4, GMDS, SLITRK6, SERPINA1, LINC00261, ITLN1, MUC2, DEFA5, ASRGL1, SLC27A2, RNF186, 및 PCCA로 이루어진 군 중에서 선택된 유전자에 의해 코드화된 하나 이상의 바이오마커에 대해서도 상기 샘플을 분석하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 여기서 L1TD1과의 공동 발현은 양호한 예후를 나타낸다. 본 발명에서 사용하기 위한 바람직한 바이오마커 조합의 비제한적인 예는 다음을 포함한다:

L1TD1 및 SPINK4;

L1TD1 및 RETNLB;

L1TD1 및 ASRGL1;

L1TD1 및 CLCA1;

L1TD1 및 FCGBP;

L1TD1, SPINK4 및 RETNLB;

L1TD1, SPINK4 및 ASRGL1;

L1TD1, SPINK4 및 CLCA1;

L1TD1, SPINK4 및 FCGBP;

L1TD1, RETNLB 및 ASRGL1;

L1TD1, RETNLB 및 CLCA1;

L1TD1, RETNLB 및 FCGBP;

L1TD1, ASRGL1 및 CLCA1;

L1TD1, ASRGL1 및 FCGBP;

L1TD1, CLCA1 및 FCGBP;

L1TD1, SPINK4, RETNLB 및 ASRGL1;

L1TD1, SPINK4, RETNLB 및 CLCA1;

L1TD1, SPINK4, RETNLB 및 FCGBP;

L1TD1, SPINK4, ASRGL1 및 CLCA1;

L1TD1, SPINK4, ASRGL1 및 FCGBP;

L1TD1, SPINK4, CLCA1 및 FCGBP;

L1TD1, RETNLB, ASRGL1 및 CLCA1;

L1TD1, RETNLB, ASRGL1 및 FCGBP;

L1TD1, RETNLB, CLCA1 및 FCGBP;

L1TD1, ASRGL1, CLCA1 및 FCGBP;

L1TD1, SPINK4, RETNLB, ASRGL1 및 CLCA1;

L1TD1, SPINK4, RETNLB, ASRGL1 및 FCGBP;

L1TD1, SPINK4, RETNLB, CLCA1 및 FCGBP;

L1TD1, SPINK4, ASRGL1, CLCA1 및 FCGBP;

L1TD1, RETNLB, ASRGL1, CLCA1 및 FCGBP; 및

L1TD1, SPINK4, RETNLB, ASRGL1, CLCA1 및 FCGBP.

일부 실시형태에 있어서, L1TD1과 공동 발현될 때 양호한 예후를 나타내는 특히 효능있는 바이오마커는 ASRGL1, RETNLB 및 SPINK4 조합을 포함한다. 따라서, 본 발명에서 사용하기 위한 바람직한 바이오마커 조합은 L1TD1과 ASRGL1, RETNLB 및 SPINK4 중 적어도 하나, 특히 L1TD1과 ASRGL1의 조합, L1TD1과 ASRGL1 및 RETNLB의 조합뿐만 아니라, L1TD1과 ASRGL1, RETNLB 및 SPINK4의 조합을 포함한다.

본 발명의 일부 실시형태에 있어서, 특히 L1TD1과 공동 발현될 때 양호한 예후를 나타내는 바이오마커는 RETNLB, FOXA3, SPINK4, DEFA5 및 RNF186으로 이루어진 군 중에서 선택된 유전자에 의해 코드화된 하나 이상의 바이오마커를 포함한다. 상기 언급한 것들 외에, 바람직한 바이오마커 조합의 비제한적인 예는 다음을 포함한다:

RETNLB;

FOXA3;

SPINK4;

DEFA5;

RNF186;

L1TD1 및 RETNLB;

L1TD1 및 FOXA3;

L1TD1 및 SPINK4;

L1TD1 및 DEFA5;

L1TD1 및 RNF186;

RETNLB 및 FOXA3;

RETNLB 및 SPINK4;

RETNLB 및 DEFA5;

RETNLB 및 RNF186;

FOXA3 및 SPINK4;

FOXA3 및 DEFA5;

FOXA3 및 RNF186;

SPINK4 및 DEFA5;

SPINK4 및 RNF186;

DEFA5 및 RNF186;

L1TD1, RETNLB 및 FOXA3;

L1TD1, RETNLB 및 SPINK4;

L1TD1, RETNLB 및 DEFA5;

L1TD1, RETNLB 및 RNF186;

L1TD1, FOXA3 및 SPINK4;

L1TD1, FOXA3 및 DEFA5;

L1TD1, FOXA3 및 RNF186;

L1TD1, SPINK4 및 DEFA5;

L1TD1, SPINK4 및 RNF186;

L1TD1, DEFA5 및 RNF186;

RETNLB, FOXA3 및 SPINK4;

RETNLB, FOXA3 및 DEFA5;

RETNLB, FOXA3 및 RNF186;

RETNLB, SPINK4 및 DEFA5;

RETNLB, SPINK4 및 RNF186;

RETNLB, DEFA5 및 RNF186;

FOXA3, SPINK4 및 DEFA5;

FOXA3, SPINK4 및 RNF186;

FOXA3, DEFA5 및 RNF186;

SPINK4, DEFA5 및 RNF186;

L1TD1, RETNLB, FOXA3 및 SPINK4;

L1TD1, RETNLB, FOXA3 및 DEFA5;

L1TD1, RETNLB, FOXA3 및 RNF186;

L1TD1, RETNLB, SPINK4 및 DEFA5;

L1TD1, RETNLB, SPINK4 및 RNF186;

L1TD1, RETNLB, DEFA5 및 RNF186;

L1TD1, FOXA3, SPINK4 및 DEFA5;

L1TD1, FOXA3, SPINK4 및 RNF186;

L1TD1, FOXA3, DEFA5 및 RNF186;

L1TD1, SPINK4, DEFA5 및 RNF186;

RETNLB, FOXA3, SPINK4 및 DEFA5;

RETNLB, FOXA3, SPINK4 및 RNF186;

RETNLB, FOXA3, DEFA5 및 RNF186;

RETNLB, SPINK4, DEFA5 및 RNF186;

FOXA3, SPINK4, DEFA5, 및 RNF186;

L1TD1, RETNLB, FOXA3, SPINK4 및 DEFA5;

L1TD1, RETNLB, FOXA3, SPINK4 및 RNF186;

L1TD1, RETNLB, FOXA3, DEFA5 및 RNF186;

L1TD1, RETNLB, SPINK4, DEFA5 및 RNF186;

L1TD1, FOXA3, SPINK4, DEFA5 및 RNF186;

RETNLB, FOXA3, SPINK4, DEFA5 및 RNF186; 및

L1TD1, RETNLB, FOXA3, SPINK4, DEFA5 및 RNF186.

본 발명은 또한 대상에서 결장암을 예후하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 L1TD1, RETNLB, CLCA1, HEPACAM2, FOXA3, FCGBP, ST6GALNAC1, SPINK4, KIAA1324, KLF4, GMDS, SLITRK6, SERPINA1, LINC00261, ITLN1, MUC2, DEFA5, ASRGL1, SLC27A2, RNF186, 및 PCCA로 이루어진 군 중에서 선택된 유전자에 의해 코드화된 하나 이상의 바이오마커의 발현 수준에 대해 상기 대상으로부터 수득된 샘플을 분석하는 단계, 상기 하나 이상의 바이오마커의 분석된 수준을 대조군 수준과 비교하는 단계, 및 상기 비교에 기초하여 상기 결장암을 예후하는 단계를 포함한다. 바람직하게는 상기 하나 이상의 바이오마커의 발현 증가는 양호한 예후를 나타낸다. 본 발명에서 사용하기 위한 바람직한 바이오마커 및 바이오마커 조합의 비제한적인 예는 상기 열거한 것들에 더하여, 다음을 포함한다:

SPINK4;

RETNLB;

ASRGL1;

CLCA1;

FCGBP;

SPINK4 및 RETNLB;

SPINK4 및 ASRGL1;

SPINK4 및 CLCA1;

SPINK4 및 FCGBP;

RETNLB 및 ASRGL1;

RETNLB 및 CLCA1;

RETNLB 및 FCGBP;

ASRGL1 및 CLCA1;

ASRGL1 및 FCGBP;

CLCA1 및 FCGBP;

SPINK4, RETNLB 및 ASRGL1;

SPINK4, RETNLB 및 CLCA1;

SPINK4, RETNLB 및 FCGBP;

SPINK4, ASRGL1 및 CLCA1;

SPINK4, ASRGL1 및 FCGBP;

SPINK4, CLCA1 및 FCGBP;

RETNLB, ASRGL1 및 CLCA1;

RETNLB, ASRGL1 및 FCGBP;

RETNLB, CLCA1 및 FCGBP;

ASRGL1, CLCA1 및 FCGBP;

SPINK4, RETNLB, ASRGL1 및 CLCA1;

SPINK4, RETNLB, ASRGL1 및 FCGBP;

SPINK4, RETNLB, CLCA1 및 FCGBP;

SPINK4, ASRGL1, CLCA1 및 FCGBP;

RETNLB, ASRGL1, CLCA1 및 FCGBP; 및

SPINK4, RETNLB, ASRGL1, CLCA1 및 FCGBP.

본원에 사용된 용어 "예후(prognosis)"는 질병의 가능한 과정 또는 임상 결과를 의미하는 반면, "예측하는(prognosticating)", "예후하는(prognosing)", "예후 결정(determining a prognosis)" 등의 표현은 결장암의 미래의 진행 예측을 말한다.

본원에 사용된 용어 "양호한 예후(good prognosis)" 및 양성 예후(positive prognosis)"는 예를 들면, 질병의 중간 결과 또는 불량한 예후를 가진 대상에서의 생존과 비교하여 전체 생존 연장, 무병 생존 연장, 무재발 생존 연장, 또는 무진행 생존 연장과 같은 통계적으로 유의하게 연장된 생존 가능성을 의미한다.

본원에 사용된 용어 "불량한 예후(poor prognosis)"는 양호한 예후를 가진 대상에서 보다 감소된 전체 생존, 무병 생존, 무재발 생존 또는 무진행 생존과 같은 통계적으로 유의하게 감소된 생존 가능성을 말한다.

본 발명에 따르면, 예후는 결장암이 예후되는 대상으로부터 수득된 생물학적 샘플에서 결장암의 예후와 관련된 L1TD1의 검출된 수준을 기준으로 이루어진다. 이는 또한 예후가 최종적으로 결정되지 않았지만 추가의 검사가 필요한 경우를 포함하고자 하는 것이다. 이러한 실시형태에 있어서, 상기 방법은 그 자체로 대상의 결장암의 예후를 결정하는 것은 아니지만 추가 검사가 필요하거나 유익할 것임을 나타낼 수 있다. 따라서, 본 방법은 예후의 최종 결정을 위해 하나 이상의 다른 방법과 조합될 수 있다. 이러한 다른 방법은 대장 내시경, 생검, 종양의 분자 특성화, 컴퓨터 단층 촬영 스캔, 자기 공명 영상 및 양성자 방출 단층 촬영, 및 암 배아 항원(Carcinoembryonic antigen, CEA) 수준 모니터링을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 당업자에게 잘 알려져 있는 것이다. 본 발명과 조합하여 사용될 수 있는 추가의 예측 마커에는 RAS(KRAS 및 NRAS) 돌연변이, BRAF 돌연변이, 종양의 분자 프로파일링, 종양의 염색체 안정성 검사(현미부수체 안정성(microsatellite stable, MSS) 및 현미부수체 불안정성(microsatellite instable, MSI))가 포함되나 이에 제한되지 않는다.

본원에 사용된 용어 "대상(subject)"은 인간과 같은 포유류 및 가축, 애완 동물, 및 스포츠 동물과 같은 가축을 가리킨다. 이러한 동물의 예로는 고양이 및 개와 같은 육식 동물 및 말과 같은 유제류를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본원에 사용된 용어 "대상" 및 "개별(individual)"는 상호 교환 가능하다.

본원에 사용된 용어 "샘플"은 생물학적 샘플, 전형적으로 임상 샘플을 가리키고, 예를 들어, 말초 혈액, 혈청, 혈장, 소변 및 타액을 포함하나 이에 제한되지 않는 혈액 및 다른 체액; 및 생검 표본, 특히 암세포를 포함하는 표본과 같은 고체 조직 샘플을 포함한다. 특정 실시형태에 있어서, 혈청 또는 혈장 샘플과 같은 혈액 샘플은 본 방법에서 사용되는 가장 바람직한 샘플 유형이다. 일반적으로 대상으로부터 분석할 샘플을 얻는 것은 본 예후 방법의 일부가 아니다.

용어 "샘플"은 또한 세포 집단과 같은 샘플의 특정 성분의 원심분리, 여과, 침전, 투석, 크로마토그래피, 시약 처리, 세척 또는 농축을 포함하나 이에 제한되지 않는, 입수 후 임의의 적절한 방식으로 조작 또는 처리된 샘플을 포함한다.

본원에 사용된 용어 "바이오마커(biomaker)" 및 "마커(maker)"는 상호 교환 가능하며, 불량한 예후를 갖는 결장암을 앓고있는 대상과 같은, 대조군 대상으로부터 채취한 비교 가능한 샘플과 비교하여, 양호한 예후를 갖는 결장암을 앓고있는 대상으로부터 취한 샘플에 차별적으로 존재하는 분자를 말한다. 따라서, 본 바이오마커는 결장암의 가능한 과정에 대한 정보를 제공하고 결장암의 양성 예후와 관련이 있다. 용어 "본 바이오마커"는 상기 언급된 임의의 개별 바이오마커, 바람직하게는 L1TD1, 또는 그의 임의의 바이오마커 조합을 말한다. 따라서, 이 용어는 L1TD1뿐만 아니라, L1TD1과 상기 언급한 상호 작용 파트너의 하나 이상 및/또는 L1TD1과 공동 발현되는 상기 언급한 하나 이상의 바이오마커의 임의의 조합을 포함한다.

여기서, "수준(level)"이라는 용어는 바이오마커에 적용될 때, "양(amount)" 및 "농도(concentration)"라는 용어와 혼용되어 사용되며, 바이오마커의 절대적 또는 상대적 양을 말할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "대조군(control)"은 알려진 결장암 이력이 있거나 병력이 없는 대조군 대상 또는 대조군 대상 풀(pool)로부터 얻은 비교 가능한 샘플을 말한다. 적절한 대조군 대상에는 명백하게 건강하여 결장암의 어떠한 징후도 보이지 않는 개인이 포함된다. 일부 실시형태에 있어서, 바람직한 대조군 대상은 불량한 예후를 갖는 결장암이 있는 개인 또는 개인 풀이다. 일부 추가 실시형태에 있어서, 양호한 예후를 갖는 결장암이 있는 대상 또는 대상 풀이 적절한 대조군 대상으로 사용될 수 있다. 때로는 단일 예후 방법에서 여러 유형(more than one type)의 대조군을 사용하는 것이 유익할 수 있다.

용어 "대조(control)"는 또한 상기 언급한 단일 대조군 대상 또는 대조군 대상 풀로부터 유래하는 미리 결정된 역치 또는 대조값을 말할 수 있으며, 이 값은 결장암의 예후를 나타낸다. 적절한 역치 또는 대조값을 결정하기 위한 통계적 방법은 당업자에게 쉽게 명백할 것이며, 통계적으로 검증된 역치 또는 대조값은 다양한 형태를 취할 수 있다. 예를 들어, 통계적으로 검증된 역치는 중앙값 또는 평균값과 같은 단일 컷오프(cut-off) 값일 수 있다. 대안적으로는 통계적으로 검증된 역치는 저 위험군, 중 위험군, 및 고 위험군과 같은 그룹으로 균등하게(또는 불균등하게) 나눌 수 있으며, 저 위험군은 공격성 결장암이 걸릴 가능성이 가장 적은 개인이고, 고위험군은 짧은 생존 시간으로 공격성 결장암에 걸릴 가능성이 가장 높은 개인이다. 또한 역치는 절대값 또는 상대값일 수 있다. 그러나 분석된 바이오마커의 수준에 절대값이 사용되는 경우, 임계값도 절대값을 기반으로 한다. 비교 가능한 상대값에도 동일하게 적용된다. 일부 실시형태에 있어서, 바이오마커 수준은 관련 대조군과 비교하기 전에 표준 방법을 사용하여 정규화된다.

일부 실시형태에 있어서, 동일한 연령, 인구 통계학적 특징, 및/또는 질병 상태 등의 대상은 비교 가능한 대조 샘플을 수득하거나 통계적으로 검증된 임계값을 결정하기 위한 적절한 대조군 대상으로서 사용될 수 있다.

환자 샘플에서 분석된 바이오마커의 수준은 대조값이 미리 결정된 값이거나 또는 예후 방법을 실행할 때 대조 샘플로부터 얻은 값인지에 관계없이 하나 이상의 단일 대조값 또는 대조값의 하나 이상의 범위와 비교할 수 있다. 환자 샘플과 대조군에서 바이오마커 수준 차의 유의성은 표준 통계 방법을 사용하여 평가할 수 있다. 본 발명의 일부 실시형태에 있어서, 분석된 바이오마커 수준과 음성 대조군 수준간의 통계적으로 유의한 증가는 환자가 통계적으로 검증된 음성 대조값에 필적하는 바이오마커 수준을 갖는 개체보다 양호한 예후를 가질 가능성이 더 높다는 것을 나타낸다. 이러한 경우, 증가된 바이오마커 수준은 결장암의 양호한 예후를 나타낸다. 반면에, 분석된 바이오마커 수준과 음성 대조군 수준간의 통계적으로 유의한 비 증가는 환자가 양호한 예후를 가질 가능성이 없는 것을 나타내거나 환자가 불량한 예후를 갖는 것을 나타낸다. 더욱이, 분석된 바이오마커 수준과 양성 대조군 수준 사이에 통계적으로 유의한 비증가는 환자가 양호한 예후를 가질 가능성이 있는 것을 나타낸다.

본원에 사용된 바와 같이, "결장암의 양호한 예후를 나타내는"과 같은 표현은 적어도 일부 실시형태에 있어서, 신뢰 수준을 최소 95%로 설정하는 일상적인 통계 방법을 사용하여 바이오마커가 불량한 결과를 갖는 대상에서보다 결장암의 양호한 결과를 갖는 대상에서 훨씬 더 자주, 또는 더 높은 수준으로 발견되도록 하는 결장암에 대한 예후인 바이오마커를 가리킨다. 바람직하게는, 양호한 예후를 나타내는 예측 바이오마커는 결장암 관련 생존이 연장된 대상의 적어도 80%에서 발견되고, 결장암 관련 생존이 감소된 대상의 10% 미만에서 발견된다. 더욱 바람직하게는, 양호한 예후를 나타내는 예측 바이오마커는 결장암 관련 생존이 연장된 대상에서 적어 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 그 이상에서 발견되고, 결장암 관련 생존이 감소된 대상의 10% 미만, 8% 미만, 5% 미만, 2.5% 미만, 또는 1% 미만에서 발견된다.

본원에서 사용되는 용어 "증가된 수준"은 관련 대조군과 비교하여 샘플에서 바이오마커 양의 증가를 말한다. 상기 증가는 당업계에 공지된 표준 방법에 따라 정성적으로 및/또는 정량적으로 결정될 수 있다. 용어 "증가된"은 임의의 수준으로의 증가를 포함하지만, 보다 구체적으로 관련 대조군과 비교하여 약 10% 내지 약 250%의 증가를 말한다. 일부 실시형태에 있어서, 바이오마커는 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 100%, 적어도 110%, 적어도 120%, 적어도 130%, 적어도 140%, 적어도 150%, 적어도 160%, 적어도 170%, 적어도 180%, 적어도 190%, 적어도 200%, 적어도 250% 또는 그 이상 증가된다. 일부 실시형태에 있어서, 용어 "증가된 수준"은 관련 대조군과 비교하여 바이오마커의 수준 또는 양에서 통계적으로 유의한 증가를 가리킨다.

본원에 사용되는 용어 "비증가(non-increased)" 또는 "정상(normal)"은 관련 대조군 샘플 또는 미리 결정된 임계값과 비교하여 본질적으로 동일하거나 본질적으로 변경되지 않는 검출 또는 분석된 바이오마커 수준을 말한다.

일부 실시형태에 있어서, 예후는 예를 들어, 예후의 임의의 변화를 검출하기 위해 대상으로부터 얻은 하나 이상의 연속 샘플을 분석하는 것에 기초할 수 있고, 결장암의 특정 치료 또는 치료의 조합에 대한 반응의 예측 또는 모니터링을 포함할 수 있다. 그러한 경우, 예후 방법은 다양한 시점에서 동일한 대상으로부터 얻은 적어도 2개의 샘플을 분석하고 비교하는 것을 포함한다. 연속 샘플의 수와 간격은 원하는대로 다양할 수 있다. 수득된 평가 결과간의 차이는 결장암 진행의 지표 또는 적용된 치료 또는 치료 조합의 효과 또는 비효과의 지표로서 제공된다.

일부 실시형태에 있어서, 결장암을 예후하는 본 방법은 예를 들어, 해부학적 부위, 조직학적 아형, T 단계(침습), N(지역 림프절 전이), M(원격 전이), 원주 가장자리(직장만), 중장 직장 손상(직장만), 신보조 치료에 대한 조직학적 반응(직장만), 혈관 침습, 림프 침습, 신경 침습, 등급, 종양 신진(Tumour budding), 천공(Perforation)에 기초한 종양에 대한 모니터링 또는 특성화를 포함할 수 있다. 또한, 이미징(컴퓨터 단층 촬영 스캔, 자기 공명 영상 및 양전자 방출 단층 촬영 스캔) 및 순환 종양 마커 분석 등에 의해 치료에 대한 반응 또는 진행을 모니터링하는 것이 기획된다.

개인의 결장암을 예후하는 본 방법은 개인의 결장암 위험 또는 진행을 결정, 예측 또는 모니터링하는 것뿐만 아니라, 결장암에 대한 새로운 치료제를 스크리닝하는 데에도 사용될 수 있다. L1TD1은 후보 약물 또는 중재 요법이 불량한 예후를 갖는 대상의 L1TD1 발현 수준을 양성 대조군을 향하거나 결장암의 양호한 예후를 갖는 개인을 향해 증가시킬 수 있는 지의 여부를 평가하는 데 사용될 수 있다. 더욱이, 비증가 L1TD1 발현 수준을 근거로 결장암의 불량한 예후를 갖는 것으로 확인된 개인은 결장암에 대한 새로운 치료 약물 또는 다른 중재 요법을 확인하기 위한 임상 시험의 표적으로 사용될 수 있다. 따라서, L1TD1은 또한 임상 시험을 위해 개인을 계층화하는 데 사용될 수도 있다.

일부 구현에 있어서, 결장암을 가진 대상에서 결장암을 예후하는 본 방법은 치료적 개입을 더 포함할 수 있다. 대상이 질병의 주어진 가능한 결과를 가지고 있는 것으로 확인되면, 화학요법과 같은 적절한 치료적 개입을 받을 수 있다. 이러한 구현에 있어서, 본 발명은 또한 이를 필요로 하는 대상에서 결장암 치료 방법으로서 제형화될 수도 있으며, 여기서 상기 방법은 상기 언급한 바와 같이 결장암을 예후하고, 상기 대상에게 하나 이상의 적절한 화학치료제를 투여하는 것을 포함한다.

본 바이오마커 중 어느 하나의 발현 수준은 다양한 기술에 의해 결정될 수 있다. 특히, 핵산 수준에서의 발현은 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여, 문제의 바이오마커를 나타내는 RNA, 바람직하게는 mRNA 또는 임의의 다른 RNA종의 양을 측정함으로써 결정될 수 있다. 적합한 방법의 비제한적인 예에는 디지털 PCR 및 실시간(RT) 정량 또는 반 정량 PCR이 포함된다. 이들 방법에 적합한 프라이머는 숙련된 자가 쉽게 설계할 수 있다.

본 바이오마커 중 어느 하나의 발현 수준을 핵산 수준으로 결정하기 위한 추가의 적합한 기술은 형광 활성화 세포 분류(FACS) 및 동일 반응계내(in situ) 하이브리드화(hybridization)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

문제의 바이오마커를 나타내는 RNA, 바람직하게는 mRNA 또는 임의의 다른 RNA종의 양을 측정하는 다른 비제한적인 방식은 전사체 접근법, 특히 DNA 마이크로어레이를 포함한다. 일반적으로, mRNA의 양을 결정해야할 때, 시험 및 대조 mRNA 샘플을 역전사하고 라벨링하여 cDNA 프로브를 생성한다. 다음에는 프로브를 고체 지지체 상에 고정된 상보적 핵산 어레이에 하이브리드화한다. 이 어레이는 어레이의 각 구성원의 순서 및 위치가 알려지도록 구성된다. 표지된 프로브와 특정 어레이 구성원과의 하이브리드화는 프로브가 유도된 샘플이 해당 유전자를 발현하는 것을 나타낸다. 상업적으로 이용 가능한 마이크로어레이 시스템의 비제한적인 예는 Affymetrix GeneChip™ 및 Illumina BeadChip을 포함한다.

또한, 벌크 RNA 시퀀싱, 단일 세포 RNA 시퀀싱 또는 cDNA 시퀀싱, 예를 들어, NGS(Next Generation Sequencing) 방법에 의해 본 바이오마커 중 어느 하나의 발현 수준을 결정하는 데에도 사용될 수 있다.

원하는 경우, 문제의 바이오마커를 나타내는 RNA, 바람직하게는 mRNA 또는 임의의 다른 RNA종의 양은 또한 노던 블롯 분석(Nothern blot analysis)과 같은 통상의 하이브리드화 기반 분석뿐 아니라, 질량 세포 측정법에 의해 결정되거나 측정될 수 있다.

문제의 바이오마커를 코드화하는 유전자의 활성 조절의 변화는 문제의 바이오마커의 유전자간 조절 부위 또는 유전자 영역에서 히스톤 변형 분석과 같은 후성 유전 분석을 통해, 예를 들어, 염색질 면역 침강에 이어, 시퀀싱 또는 정량적 PCR, 또는 DNA 메틸화 수준의 정량, 예를 들어, 중아황산염 시퀀싱 또는 포획 기반 방법에 의해 결정될 수 있다.

당업자에게 쉽게 명백한 바와 같이, 본 바이오마커 중 어느 하나의 발현 수준을 단백질 수준으로 결정하기 위해 다양한 기술이 사용될 수 있다. 적합한 방법의 비제한적인 예에는 상대 및 절대 정량 시약(iTRAQ) 및 라벨 없는 분석을 위한 동위 원소 태그뿐만 아니라, 선택된 반응 모니터링(SRM) 질량 분석과 같은 질량 분석 기반의 정량 단백질체학 기술 및 표적 단백질체학의 임의의 다른 기술이 포함된다. 또한, 단백질 마커의 수준 또는 양은 예를 들어, 면역분석(예: ELISA 또는 LUMINEX®), 웨스턴 블롯팅, 분광 광도계, 효소 분석, 자외선 분석, 운동 분석, 전기 화학 분석, 비색 분석, 탁도 분석, 원자 흡수 분석, 유세포 분석, 질량 세포 측정 또는 이들의 조합에 의해 결정될 수 있다. 추가의 적합한 분석 기술에는 액체크로마토그래피, 예를 들어, 고성능/압력 액체 크로마토그래피(HPLC), 가스 크로마토그래피, 핵 자기 공명 분광법, 관련 기술 및 이들의 조합, 예를 들어, 탠덤 액체 크로마토그래피-질량 분광법(LC-MS)이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.

본 개시 내용은 또한 대상에서 결장암을 예후하기 위한 시험관내 키트에 관한 것이다. 이 키트는 본 방법 또는 그의 실시형태의 임의의 구현에 사용될 수 있다. 최소한 키트는 하나 이상의 본 바이오마커, 바람직하게는 적어도 L1TD1을 검출하거나 그의 발현 수준을 결정할 수 있는 하나 이상의 시험 제제 또는 시약을 포함한다.

일부 실시형태에 있어서, 키트는 L1TD1에 특이적인 한 쌍의 프라이머 및/또는 프로브를 포함할 수 있다. 숙련된 자는 적용할 기술의 특정 요구 사항을 고려하여 적합한 프라이머 및/또는 프로브를 쉽게 설계할 수 있다. 키트는 시험 샘플에서 L1TD1을 나타내는, mRNA 또는 cDNA와 같은 뉴클레오타이드 분자와 프로브의 하이브리드화를 검출하기 위한 수단 및/또는 프라이머의 쌍을 사용하여 시험 샘플에서 L1TD1을 나타내는 뉴클레오타이드 분자를 증폭 하고/하거나 검출하기 위한 수단을 더 포함할 수 있다.

일부 실시형태에 있어서, 키트는 또한 상기 개시 내용에 따라 L1TD1 또는 L1TD1의 상호 작용 파트너와 공동 조절된 하나 이상의 유전자를 검출하기 위한 하나 이상의 시험 제제 또는 시약을 포함할 수 있다.

키트의 다른 선택적 구성요소에는 구획화된 담체 수단, 하나 이상의 버퍼(예, 차단 버퍼, 세정 버퍼, 기질 버퍼 등), 다른 시약, 양성 또는 음성 대조 샘플 등이 포함된다.

키트는 또한 본 개시의 임의의 방법을 수행하기 위한 컴퓨터 실행 가능 명령을 포함하는 컴퓨터 판독 가능 매체를 포함할 수 있다.

기술이 진보함에 따라 본 발명의 개념이 다양한 방식으로 구현될 수 있음은 당업자에게 자명할 것이다. 본 발명 및 그 실시형태는 후술하는 실시예에 제한되지 않고 청구범위 내에서 변경될 수 있다.

재료 및 방법

마이크로어레이 데이터 세트

미가공 마이크로어레이 데이터 세트는 유전자 발현 옴니버스(GEO)로부터 다운로드 되었다. 총 1052개의 임상 샘플을 포함하는 3개의 결장암 유전자 발현 마이크로어레이 데이터 세트를 분석했다. 비종양 기원(즉, 정상 조직) 또는 관련 생존 정보 누락으로 인해 124개 샘플이 상기 생존 분석에서 제외되었다(928개 샘플 남음). 사용된 데이터 세트의 요약은 표 3에 제시되었다. 추가로, 2개의 정상피종 및 1개의 줄기 세포 유전자 발현 마이크로어레이 데이터 세트를 분석하여 L1TD1 및 그의 상호 작용 파트너의 공동 발현을 평가하였다(표 1). 줄기 세포 데이터 세트 "hESC1"이 균질한 hESC 데이터 세트가 아니라 10개의 hESC, 49개의 유도 만능 줄기 세포, 5개의 암세포주, 및 6개의 비암성 체세포주로부터의 샘플로 구성되었다는 점은 주목할 만하다.

표 3-연구에 사용된 데이터 세트 요약

이 표에는 분석에 사용된 이들 개별 데이터 세트, 마이크로어레이 플랫폼, 및 샘플수를 나타내는 데 사용되는 별칭명과 함께 GEO 식별 번호가 열거되어 있다.

유전자 발현 분석

Affymetrix 프로브의 프로브 강도 측정을 함유하는 CEL 파일은 바이오컨덕터(Bioconductor) 패키지 "SCAN.UPC"의 UPC(Universal exPression Code) 정규화 방법과 바이오컨덕터 패키지 "affy"의 RMA(Robust Multiarray Average) 정규화 방법을 사용하여 정규화되었다. UPC 정규화 방법은 특정 샘플에서 특정 유전자가 발현되는 확률을 나타내는 0.0에서 1.0 사이의 점수를 제공한다. UPC 점수는 L1TD1 발현 상태를 기반으로 한 모든 데이터 세트의 샘플을 L1TD1 높음(UPC>=0.60) 및 L1TD1 낮음(UPC<0.60)으로 분류하는 데 사용되었다. 이 연구에 사용된 Affymetrix 플랫폼의 양쪽(HUG 133 plus 2.0 및 HG-U133A) 모두에 존재하기 때문에 L1TD1의 정량화를 위한 주 프로브로서 프로브 "219955_at"가 선택되었다. RMA는 정규화된 log2 강도값을 제공한다. RMA 정규화된 유전자 발현값을 사용하여 유전자간의 쌍별 상관 관계를 계산했다.

마이크로어레이 데이터의 생존 분석

무병 생존은 R 패키지 "survival"에서 구현된 카플란-마이어 방법으로 각 데이터 세트에서 분석되었고, R 패키지 "survminer"를 사용하여 생존 곡선을 플롯했다. 로그 순위 테스트는 2개의 L1TD1 그룹(높은 L1TD1 및 낮은 L1TD1)간의 생존율을 바교하는 데 사용되었다. 생존 시간 및 생존 상태에 대한 완전한 정보를 갖는 총 928개의 샘플이 분석에 포함되었다.

결과

결장암 환자의 하위 세트는 높은 수준으로 L1TD1을 발현한다

우리의 결과는 결장암 환자의 26.7%가 L1TD1이 높은 그룹에 속하며, 이는 HPA(Human Protein Atlas)로부터 이용 가능한 면역 조직 화학 데이터와 일치한다(표 4). 그러나 L1TD1이 높은 샘플의 비율은 정상피종(48.6% 및 50.0%) 및 hESC(88.6%)에 비해 결장암에서 더 낮았다(표 4).

표 4- L1TD1의 높은 발현을 갖는 샘플의 비율

이 표는 이 연구에 사용된 다른 데이터 세트에서 L1TD1 발현 상태를 기준으로 한 샘플의 분류를 보여준다. 결장암 데이터 세트의 경우, 완전한 생존 정보를 갖는 종양 샘플만 고려했다.

L1TD1의 높은 수준은 장기 무질병 생존과 관련이 있다

3개의 결장암 데이터 세트로부터의 관련 생존 정보를 갖는 928개 샘플에 대한 카플란-마이어 분석은 L1TD1이 높은 결장암 그룹이 L1TD1의 발현이 없거나 낮은 그룹에 비해 무병 생존이 더 길다는 것을 나타냈다(도 1A 내지 1C). 차이는 3개의 데이터 세트 모두에서 유의미했다(P<0.05).

L1TD1의 상호 작용은 결장암에서 공동 발현되지 않는다

결장암에서 L1TD1의 다른 예후 행동에서 L1TD1의 알려진 상호 작용 파트너[이전 간행물(Emani, N

rv

et.al., Stem Cell Reports, 2015)에서 질량분석법 및 공동 면역 침전법을 사용하여 L1TD1의 상호 작용 파트너 311개를 결정했음]의 잠재적 역할을 조사하기 위해, L1TD1과 그의 상호 작용 파트너의 발현 수준간에 스피어맨 순위 상관 행렬을 계산했다. 높은 양의 상관 관계(상관값>0.5 및 P<0.0001)가 정상피종 및 줄기 세포 데이터 세트에서 L1TD1과 상위 20개 상호 작용 파트너 중에서 관찰되었다(도 2A). 반대로, 3개의 결장암 데이터 세트는 모두 이들 유전자 및 L1TD1 중에서 상관 관계가 결핍되었다(도 2B).

결장암에서 L1TD1과 공동 발현된 유전자

결장암 환자에서 L1TD1과 공동 발현된 다른 유전자를 또한 확인했다. 각 결장암 데이터 세트에 대해, 스피어맨 순위 상관 관계 점수의 내림차순을 기준으로 유전자 순위를 매겼다(최고 유전자가 가장 작은 순위를 가짐). 각 유전자에 대해, 3개의 데이터 세트 중 최대 순위(최악 순위)를 그의 최종 순위로 취했다. 목록은 각 유전자의 최대 순위의 오름차순으로 정렬되었으며 상위 20개 유전자를 선택했다(표 5).

표 5- 결장암 데이터 세트에서 L1TD1과 양성 상관 관계가 있는 상위 20개 유전자

상관 관계의 통계적 유의성은 FDR(false discovery rate)값 범위에 해당하는 원을 사용하여 표시된다. 최상위 유전자는 L1TD1과 각 유전자간의 쌍별 상관 관계에 대한 스피어맨 순위 상관 점수(Spearman rank correlation scores)를 기반으로 한 각 결장암 데이터 세트에 대해 개별적으로 마이크로어레이 데이터 세트에서의 모든 유전자의 순위를 지정하여 선택되었다. 다음에, 결장암 데이터 세트에 대한 최대 순위는 각 유전자에 대한 대표적인 통계로 선택되었다. 목록은 최대 순위를 기준으로 정렬(오름차순)되었으며 목록 상단으로부터 20개의 유전자가 선택되었다.

하기 표 6은 개별적으로 시험했을 때, 결장암 환자에서 생존에 미치는 영향을 보여주는 P값과 함께, 결장암에서 L1TD1과 공동 발현되는 상위 20개 유전자를 나열한다. 5개의 유전자, 즉 SPINK4, RETNLB, ASRGL1, CLCA1 및 FCGBP는 3개의 데이터 세트 중 2개에서 통계적으로 유의적이었다.

상위 20개 공동 발현 유전자(표 2에 나열됨) 중 어느 것도 3개의 데이터 세트 모두에서 결장암에 대한 독립적인 예후 마커로서 L1TD1을 능가하지 못하지만, 5개의 유전자가 3개의 결장암 데이터 세트 중 적어도 2개에서 생존에 통계적으로 유의적인(P<0.05) 영향을 미쳤다: SPINK4, RETNLB, ASRGL1, CLCA1, FCGBP. 샘플을 계층화하기 위해 이 추가 정보를 부가하면, L1TD1 + ASRGL1, L1TD1 + ASRGL1 + RETNLB, 및 L1TD1 + ASRGL1 + RETNLB + SPINK4를 포함한 L1TD1 및 공동 발현 유전자의 조합이, L1TD1 단독보다 훨씬 더 양호하게 생존을 예측하는 것이 확인되었다(도 4A 내지 6C).

3개의 데이터 세트에서 이들 조합의 기능은 그 조합의 우선 순위를 지정하기 위해 가중치 순위를 사용하여 서로 비교하였다. 처음에는, 3개의 데이터 세트에서 L1TD1 단독보다 더 나은 성과를 내는 각 데이터 세트 조합에 대해 더 낮은 랭크(즉, 1= 최고)를 받았다. 3개의 데이터 세트로부터의 순위를 사용하여, 조합의 기능을 요약하기 위해 가중치 순위(가중치=데이터 세트의 샘플 수/연구의 총 샘플 수(928))를 계산했다. 이들 결과를 바탕으로, 마커 조합 L1TD1 + ASRGL1 + RETNLB가 최고의 성과를 보였고, 이어서 마커 조합 L1TD1 + ASRGL1, 그리고 마커 조합 L1TD1 + ASRGL1 + RETNLB + SPINK4 순이었다.

논의

이 연구에 있어서, L1TD1의 강력한 증거가 결장암에 대한 양성 예후 마커라는 것을 발견했다(도 1A 내지 1C). 1052명의 결장암 환자로 구성된 3개의 유전자 발현 데이터 세트로부터 928개 샘플의 생존 분석을 통해 이를 입증했다. 그러나 ASRGL1; ASRGL1 및 RETNLB; 또는 ASRGL1, RETNLB 및 SPINK4의 증가된 발현과 조합하여 L1TD1의 발현 증가는 장기간 무병 생존의 보다 강력한 지표였다.

LTD1의 발현은 이전에 배아 줄기 세포, 뇌 및 결장에 매우 특이적인 것으로 보고되었다(도 3A). 이들 외에도, L1TD1은 또한 정상피종, 배아 암종, 수모세포종, 및 결장 선암에서 발현되는 것으로 보고되었다(도 3B). 결장암 세포에서 L1TD1의 높은 수준으로의 발현은 결장암에서 L1TD1의 높은 발현이 예후와 관련이 있을 수 있다는 가설을 이끌어냈다. 이전 보고서는 수모세포종 및 정상피종을 포함한 다른 암 유형에서 OCT4 및 NANOG의 불량한 예후와의 연관성을 입증했다. 흥미롭게도, 우리의 결과는 이전 연구와 대조적으로 결장암에서 L1TD1의 높은 발현이 더 양호한 예후와 연결되어 있음을 시사한다.

다른 암에서 L1TD1의 독특한 역할을 조사하기 위한 시도로서, 현재 알려진 상호 작용 파트너와 L1TD1의 공동 발현을 조사했다. hESC 및 정상피종과 달리, L1TD1은 결장암에서 상호 작용 파트너와 공동 발현되지 않는다는 것을 발견했다(도 2). 이는 대조적인 예후 결과에서 L1TD1의 상호 작용 파트너가 잠재적으로 참여할 수 있음을 나타낸다. 이는 높은 L1TD1 발현과 불량한 임상 결과의 연관성 및 L1TD1과 그의 상호 작용 파트너, OCT4 사이의 유의적인 공동 발현을 보여주는, 수모세포종에 대한 최근 연구에 의해 더 지지되었다. 더불어, 이들 발견은 L1TD1과 그의 상호 작용 파트너의 공동 발현이 공격적이고 해로운 표현형을 나타내는 데 필요할 수 있음을 시사한다. 배아 줄기 새포 인자가 상호 작용 파트너와의 강한 공동 발현의 존재 또는 부재를 고려하여 암에서 대조적인 결과를 초래하는 것으로 밝혀진 것은 이번이 처음이다.

3개의 임상 결장암 데이터 세트의 유전자 발현 데이터에 대한 분석 결과, 결장암에서 양호한 예후에 대한 마커로서, L1TD1를 지지하는, 특히 ASRGL1, RETNLB 및 SPINK4 중에서 선택된 추가의 바이오마커와의 조합으로 유망한 증거가 나왔다.

Claims (10)

1. 대상에서 결장암을 예후하는 방법으로서, 이 방법은
   1을 함유하는 LINE-1형 트랜스포사제(transposase) 도메인(L1TD1) 및 이소아스파르틸 펩티다제/L-아스파라기나제(ASRGL1) 발현 수준에 대해 상기 대상에서 수득된 샘플을 분석하는 단계,
   L1TD1 및 ASRGL1의 분석된 수준을 각각의 대조군 수준과 비교하는 단계,
   상기 비교에 기초하여 상기 결장암을 예후하는 단계를 포함하며, 여기서 L1TD1 및 ASRGL1의 증가된 발현이 양호한 예후를 나타내는 방법.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 방법은 레지스틴 유사 베타(RETNLB) 수준에 대해 상기 샘플을 분석하는 단계를 더 포함하고, 여기서 L1TD1 및 ASRGL1의 공동 발현이 양호한 예후를 나타내는 방법.
   
3. 제2항에 있어서,
   상기 방법은 세린 프로테아제 억제제 카잘(Kazal)형 4(SPINK4)의 수준에 대해 상기 샘플을 분석하는 단계를 더 포함하고, 여기서 L1TD1, ASRGL1 및 RETNLB의 공동 발현이 양호한 예후를 나타내는 방법.
   
4. 제3항에 있어서,
   CLCA1, HEPACAM2, FOXA3, FCGBP, ST6GALNAC1, KIAA1324, KLF4, GMDS, SLI-TRK6, SERPINA1, LINC00261, ITLN1, MUC2, DEFA5, SLC27A2, RNF186 및 PCCA로 이루어진 군 중에서 선택된 유전자에 의해 코드화된 하나 이상의 바이오마커에 대해서도 상기 샘플을 분석하는 단계를 더 포함하고, 여기서 L1TD1, ASRGL1, RETNLB 및 SPINK4의 공동 발현이 양호한 예후를 나타내는 방법.
   
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
   OCT4, TRIM71, DPPA4, DNMT3B, LRPPRC, MRPS17, PARP1, RPF2, HSP90AA1, IGF2BP1, DNAJA2, NANOG, ALPL, EIF3B, NCL, LIN28A, NOLC1, CCT8, RRS1, 및 SFPQ로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 바이오마커에 대해서 상기 샘플을 분석하는 단계를 더 포함하고, 여기서 L1TD1과의 공동 발현 결핍이 양호한 예후를 나타내는 방법.
   
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 샘플이 말초 혈액 샘플, 혈청 샘플, 혈장 샘플, 소변 샘플, 타액 샘플 및 조직 샘플로 이루어진 군 중에서 선택되는 방법.
   
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
   결장암에 대한 개인의 위험 또는 진행을 결정, 예측 또는 모니터링하고, 임상 시험을 위해 개인을 계층화하고, 결장암에 대한 새로운 치료제를 스크리닝하기 위한 방법.
   
8. 결장암을 예후하기 위한 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 정의된 바이오마커 조합의 사용.
   
9. 제1항에 따른 방법에 사용하기 위한 키트로서, 상기 키트는 결장암이 예후되는 대상으로부터 수득된 생물학적 샘플에서 L1TD1 및 ASRGL1의 발현 수준을 특이적으로 검출할 수 있는 하나 이상의 시험 제제를 포함하는 키트.
   
10. 제9항에 있어서,
    상기 키트는 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 하나 이상의 바이오마커 및/또는 표 1 및 표 2에 열거된 유전자 중에서 선택된 유전자의 발현 수준을 특이적으로 검출할 수 있는 하나 이상의 시험 제제를 더 포함하는 키트.
    
    

Images