CN110551834A - 一种羊源尸毒梭菌的检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于PCR检测试剂盒领域,尤其涉及一种羊源尸毒梭菌的检测试剂盒。本发明的试剂盒关键在于具有如SEQ ID NO.1‑2、SEQ ID NO.3‑4和/或SEQ ID NO.5‑6所述的引物对;前述引物互不干扰,可使试剂盒完成高灵敏度和特异性的检测。本发明的试剂盒弥补了羊源尸毒梭菌检测试剂的空白,具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于PCR检测试剂盒领域,尤其涉及一种羊源尸毒梭菌的检测试剂盒。
背景技术
尸毒梭菌(Clostridium cadaveris)(又称尸体梭菌)是在腐烂的尸体中发现的最常见的细菌之一,但在活人身上极其罕见。该菌广泛分布于土壤、海底沉积物和人的粪便中,该菌为厌氧的革兰氏阳性杆菌,周生鞭毛运动,孢子卵圆、端生。尸毒梭菌为芽孢杆菌科梭菌属群IV成员,群IV还包括缓腐梭菌、腐败梭菌、海梭菌、破伤风梭菌及腐化梭菌。
尸毒梭菌是一种致病菌,可以从创伤感染、脓肿及血液样品等临床样品中检出。人们有必要对尸毒梭菌采取预防和监测措施,其中,检测试剂盒就是其中一种方便快捷的工具。
目前关于尸毒梭菌的报道很少。1991年,田军川等从变质兔肉罐头中检出尸毒梭菌产毒株,这是国内鲜有的报道。基于有限报道,人们尚未开发出相应的检测试剂盒。
尸毒梭菌在入侵宿主后由于需要在宿主的免疫系统中存活下来,会进行适应性的进化,导致不同种类的宿主生物中尸毒梭菌的基因组存在一定的区别,以至于根据genbank等已有基因组数据库进行常规的PCR引物设计,不一定能检测分离自各种不同动物的尸毒梭菌。目前尚未见羊源(以羊为宿主)尸毒梭菌的报道,因此更没有检测羊源尸毒梭菌的PCR引物或试剂盒。
发明内容
本发明的目的是提供一种高灵敏度、高特异性的羊源尸毒梭菌的检测试剂盒。
本发明的技术方案包括:
一种羊源尸毒梭菌的PCR检测试剂盒,它包括序列如SEQ ID NO.1-2、SEQ IDNO.3-4和/或SEQ ID NO.5-6所述的引物对。
如前述的试剂盒,它包括如SEQ ID NO.1-2、SEQ ID NO.3-4和SEQ ID NO.5-6所述的引物对。
如前述的试剂盒,它还包括PCR用预混液。
进一步的,所述PCR用预混液是1.1×T3 Super PCR Mix。
一种羊源尸毒梭菌的PCR检测方法,它是使用前述的试剂盒对样品DNA进行检测。
如前所述的检测方法,其PCR反应条件是:98℃预变性2min;98℃变性10s,59℃退火15s,72℃延伸30s,共35个循环;72℃再延伸2min。
序列如SEQ ID NO.1-2、SEQ ID NO.3-4和/或SEQ ID NO.5-6所述的引物对在制备羊源尸毒梭菌的PCR检测试剂中的用途。
发明人从腹泻羊羔体内分离得到一株羊源尸毒梭菌LJH-1,并设计得到一种三重PCR检测试剂盒,填补了市面缺乏羊源尸毒梭菌检测试剂盒的空白。
本发明的三重PCR检测试剂盒,其引物间不会相互干扰,能够达到很高的灵敏度,可检测浓度低至7.720×10-2ng的羊源尸毒梭菌DNA。
本发明的三重PCR检测试剂盒还具有很高的特异性,其对蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)、类志贺邻单胞菌(Plesimonas shigelloides)、乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、霍氏肠杆菌(Enterobacterhormaechei)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、大肠杆菌(Escherichia coli)、柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的检测结果均为阴性。
显然,根据本发明的上述内容,按照本领域的普通技术知识和惯用手段,在不脱离本发明上述基本技术思想前提下,还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式,对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1分离菌形态观察(A)及革兰氏染色镜检(B,1 000×)结果。
图2菌株LJH-1 16S rDNA扩增结果;M,DL2000 DNA Marker;1,LJH-1。
图3菌株LJH-1 16S rDNA基因系统发育树。
图4菌株LJH-1 16S rDNA基因同源性分析结果。
图5特异性引物扩增;M,DL2000 DNA Marker;1,使用引物对A扩增;2,使用引物对B扩增;3,使用引物对C扩增;4,引物对A、B、C的三重PCR。
图6三重PCR的特异性检测;M,DL2000 DNA Marker;1,Clostridium cadaveris;2,Bacillus cereus;3,Plesimonas shigelloides;4,Pediococcus acidilactici;5,Micrococcus luteus;6,Enterobacter hormaechei;7,Enterobacter cloacae;8,Escherichia coli;9,Citrobacter amalonaticus;10,Bacillus subtilis。
图7三重PCR的灵敏度检测;M,DL2000 DNA Marker;1-7依次为DNA模板浓度(ng/μL):77.200,7.720,7.720×10-1,7.720×10-2,7.720×10-3,7.720×10-4,7.720×10-5。
具体实施方式
实施例1本发明的试剂盒
1.试剂盒的组成
本试剂盒是三重PCR检测试剂盒,由如下部分组成:
三重PCR引物,PCR预混液(1.1×T3 Super PCR Mix)。
引物序列如表1所示。
表1三重PCR引物信息
2.试剂盒的使用方法
将1.1×T3 Super PCR Mix 18μL,尸毒梭菌DNA模板1μL,三对引物上、下游引物各1μL混合,PCR后采用琼脂糖凝胶电泳检测即可。
PCR条件为:98℃预变性2min;98℃变性10s,59℃退火15s,72℃延伸30s,共35个循环;72℃再延伸2min。
以下将用实验例的形式对本发明试剂盒的有益效果做进一步介绍。
实验例1羊源尸毒梭菌的常规鉴定以及本发明试剂盒的特异性敏、感性试验
1.方法
1.1菌株
对照菌株蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、类志贺邻单胞菌(Plesimonasshigelloides)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、藤黄微球菌(Micrococcusluteus)、霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、大肠杆菌(Escherichia coli)、柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)均由西南民族大学动物分子遗传与育种重点实验室提供。
1.2病料
四川省某羊场内发生腹泻的瘫痪羔羊,用无菌棉签采取肛门拭子,放入装有新鲜LB肉汤的采样管中,于干冰中保存。带回实验室后,于37℃,150r/min的摇床中培养20h,用于细菌分离鉴定。
1.3主要试剂和仪器
Mueller-Hinton琼脂、LB肉汤购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司;1.1×T3 Super PCR MIX、4S Red Plus Nucleic Acid Stain、细菌基因组DNA提取试剂盒均购自天根生化科技(北京)有限公司;DL2000 Marker购自宝生物工程(大连)有限公司;电泳仪、凝胶成像系统均购自Bio-RAD USA公司;PCR仪购自Eppendorf Germany公司;岛津紫外可见分光光度计(BioSpec-nano)购自日本岛津仪器公司。
1.4细菌的分离纯化
在超净台中,将培养20h的样品混匀后于LB固体琼脂培养上无菌操作划线,37℃恒温培养20h,挑取颜色、形状相近的单菌落经过LB肉汤纯化后保种备用。革兰氏染色、镜检。
1.5生化试验
取37℃培养20h的菌液,用细菌生化鉴定管按照李绍戊等[5]方法进行操作,结果参照《伯杰氏细菌鉴定手册》[3]进行判定。
1.6细菌DNA提取将保种后的菌株和对照菌株接种于LB肉汤培养基中活化,37℃恒温培养20h,12000r/min离心5min收集菌体。参照细菌基因组DNA试剂盒说明书提取细菌总DNA,其浓度及质量于紫外分光光度计检测合格后(D260nm/D280nm=1.8-2.0),记录数值,-20℃保存备用。
1.7 16S rDNA基因序列的扩增及系统进化发育树的构建
采用16S rDNA基因的引物进行PCR扩增,PCR反应体系为25μL:1.1×T3 Super PCRMIX 22μL,细菌DNA模板1μL,上、下游引物各1μL。正向引物16S-F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’;反向引物16S-R:5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’。PCR扩增条件:98℃预变性2min;98℃变性10s,55℃退火10s,72℃延伸30s,共35个循环;72℃再延伸2min。取5μL的PCR扩增产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测,于凝胶成像系统下观察PCR扩增结果。扩增产物交由生工生物工程(上海)股份有限公司纯化及序列测定,测序拼接结果提交至GenBank数据库,将测序所得的16S rDNA拼接序列与NCBI数据库中的序列进行BLAST比对,采用MegAlign软件进行16S rDNA基因同源性分析,采用Mega 6.0软件对同源性相近的序列构建进化树,参考菌株信息见表2。
表2参考菌株信息
1.8使用本发明试剂盒检测
使用实施例1的试剂盒对羊源尸毒梭菌的DNA进行检测。
1)引物间特异性测试
使用A、B、C三对引物分别对羊源尸毒梭菌进行扩增。
2)物种间特异性测试
对照菌株蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、类志贺邻单胞菌(Plesimonasshigelloides)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、藤黄微球菌(Micrococcusluteus)、霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)、阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)、大肠杆菌(Escherichia coli)、柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的DNA分别为模板,使用实施例1的试剂盒进行PCR检测。
3)灵敏度测试
将测定细菌基因组DNA浓度后的尸毒梭菌样品依次按照10倍、102倍、103倍、104倍、105倍进行稀释,使用实施例1的试剂盒进行检测。
2.结果
2.1病原菌的分离鉴定
在LB固体琼脂培养基上培养20h后发现,分离菌株形成圆形、较大的菌落,白色、半透明,单个或成双排列,表面有光泽,见图1(A)。革兰氏染色后1000倍镜检,可见菌体呈紫色或者黑紫色的短杆状,芽孢呈椭圆形,表明该菌为革兰氏阳性菌,见图1(B)。该菌株命名为LJH-1。
2.2生化试验
分离菌生化特性符合梭菌属成员的特征,详细结果见表3。综合形态学观察和生理生化特性分析,发现分离菌株与《常见细菌系统鉴定手册》[9]中尸毒梭菌描述基本一致,初步鉴定为尸毒梭菌。
表3生理生化结果
注:“+”代表阳性,“-”代表阴性。
2.3 16S rDNA基因序列的扩增及系统进化发育树的构建
16S rDNA基因扩增发现,分离菌株经过16S rDNA基因序列测定,获得长度为约1023bp的序列片段,见图2。将序列提交至NCBI获得GenBank登录号为MK968718。由菌株LJH-1的16S rDNA基因系统进化树可知,菌株LJH-1与尸毒梭菌C4菌株(登录号为MF145697.1)亲缘关系最近,见图3。由菌株LJH-1的16S rDNA基因同源序列分析可知,菌株LJH-1与尸毒梭菌C4、JCM1392、E027菌株同源性分别为99.6%、99.6%、99.5%,菌株LJH-1与尸毒梭菌C4、JCM1392菌株同源性最高,见图4。结合分离菌形态学和生理生化特性,综合判定菌株LJH-1为尸毒梭菌。
2.4三重PCR特异性和灵敏性检测结果
图5为引物特异性试验结果,仅1号泳道的尸毒梭菌三重PCR扩增结果出现三条清晰条带,片段大小分别为492bp、355bp和255bp,其他菌株均未出现目的条带。图6为引物灵敏性试验结果,1-4号泳道均能出现清晰的目的条带,尸毒梭菌DNA模板稀释前的浓度测定结果为77.200ng/μL,4号泳道所对应的DNA模板浓度为7.720×10-2ng/μL。
由于加样量是1μL,本发明的试剂盒的最低检测限是7.72×10-2ng。
综上,本发明的试剂盒可以特异、灵敏地检测羊源尸毒梭菌,具有良好的应用前景。
SEQUENCE LISTING
<110> 西南民族大学
<120> 一种羊源尸毒梭菌的检测试剂盒
<130> GYKH1426-2019P017637CC
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
gaaaggagca gtggacgaca t 21
<210> 2
<211> 21
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<400> 2
ttctatggca ctccttctcc c 21
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
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<400> 3
cgcggctgat taccaacaa 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
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tcgggcagcg tttcttctt 19
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<211> 23
<212> DNA
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ctgagttctg tatctgcggg agt 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 6
tacgggttat acctgcaagt tca 23
Claims (7)
1.一种羊源尸毒梭菌的PCR检测试剂盒,其特征在于,它包括序列如SEQ ID NO.1—2、SEQ ID NO.3-4和/或SEQ ID NO.5—6所述的引物对。
2.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,它包括如SEQ ID NO.1—2、SEQ ID NO.3-4和SEQ ID NO.5—6所述的引物对。
3.如权利要求1或2所述的试剂盒,其特征在于,它还包括PCR用预混液。
4.如权利要求1或2所述的试剂盒,其特征在于,所述PCR用预混液是1.1×T3 SuperPCR Mix。
5.一种羊源尸毒梭菌的PCR检测方法,其特征在于,它是使用如权利要求1-4任一所述的试剂盒对样品DNA进行检测。
6.如权利要求5所述的检测方法,其特征在于,其PCR反应条件是:98℃预变性2min;98℃变性10s,59℃退火15s,72℃延伸30s,共35个循环;72℃再延伸2min。
7.序列如SEQ ID NO.1-2、SEQ ID NO.3-4和/或SEQ ID NO.5-6所述的引物对在制备羊源尸毒梭菌的PCR检测试剂中的用途。
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GB2549799A (en) * | 2016-04-29 | 2017-11-01 | Nat Univ Ireland Galway | A multiplex assay for the sensitive and specific detection and differentiation of Clostridium difficile |
-
2019
- 2019-09-26 CN CN201910922370.3A patent/CN110551834A/zh active Pending
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