CN110551834A - 一种羊源尸毒梭菌的检测试剂盒 - Google Patents

一种羊源尸毒梭菌的检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属于PCR检测试剂盒领域，尤其涉及一种羊源尸毒梭菌的检测试剂盒。本发明的试剂盒关键在于具有如SEQ ID NO.1‑2、SEQ ID NO.3‑4和/或SEQ ID NO.5‑6所述的引物对；前述引物互不干扰，可使试剂盒完成高灵敏度和特异性的检测。本发明的试剂盒弥补了羊源尸毒梭菌检测试剂的空白，具有良好的应用前景。

Description

一种羊源尸毒梭菌的检测试剂盒
技术领域
本发明属于PCR检测试剂盒领域，尤其涉及一种羊源尸毒梭菌的检测试剂盒。
背景技术
尸毒梭菌(Clostridium cadaveris)(又称尸体梭菌)是在腐烂的尸体中发现的最常见的细菌之一，但在活人身上极其罕见。该菌广泛分布于土壤、海底沉积物和人的粪便中，该菌为厌氧的革兰氏阳性杆菌，周生鞭毛运动，孢子卵圆、端生。尸毒梭菌为芽孢杆菌科梭菌属群IV成员，群IV还包括缓腐梭菌、腐败梭菌、海梭菌、破伤风梭菌及腐化梭菌。
尸毒梭菌是一种致病菌，可以从创伤感染、脓肿及血液样品等临床样品中检出。人们有必要对尸毒梭菌采取预防和监测措施，其中，检测试剂盒就是其中一种方便快捷的工具。
目前关于尸毒梭菌的报道很少。1991年，田军川等从变质兔肉罐头中检出尸毒梭菌产毒株，这是国内鲜有的报道。基于有限报道，人们尚未开发出相应的检测试剂盒。
尸毒梭菌在入侵宿主后由于需要在宿主的免疫系统中存活下来，会进行适应性的进化，导致不同种类的宿主生物中尸毒梭菌的基因组存在一定的区别，以至于根据genbank等已有基因组数据库进行常规的PCR引物设计，不一定能检测分离自各种不同动物的尸毒梭菌。目前尚未见羊源(以羊为宿主)尸毒梭菌的报道，因此更没有检测羊源尸毒梭菌的PCR引物或试剂盒。
发明内容
本发明的目的是提供一种高灵敏度、高特异性的羊源尸毒梭菌的检测试剂盒。
本发明的技术方案包括：
一种羊源尸毒梭菌的PCR检测试剂盒，它包括序列如SEQ ID NO.1-2、SEQ IDNO.3-4和/或SEQ ID NO.5-6所述的引物对。
如前述的试剂盒，它包括如SEQ ID NO.1-2、SEQ ID NO.3-4和SEQ ID NO.5-6所述的引物对。
如前述的试剂盒，它还包括PCR用预混液。
进一步的，所述PCR用预混液是1.1×T3 Super PCR Mix。
一种羊源尸毒梭菌的PCR检测方法，它是使用前述的试剂盒对样品DNA进行检测。
如前所述的检测方法，其PCR反应条件是：98℃预变性2min；98℃变性10s，59℃退火15s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃再延伸2min。
序列如SEQ ID NO.1-2、SEQ ID NO.3-4和/或SEQ ID NO.5-6所述的引物对在制备羊源尸毒梭菌的PCR检测试剂中的用途。
发明人从腹泻羊羔体内分离得到一株羊源尸毒梭菌LJH-1，并设计得到一种三重PCR检测试剂盒，填补了市面缺乏羊源尸毒梭菌检测试剂盒的空白。
本发明的三重PCR检测试剂盒，其引物间不会相互干扰，能够达到很高的灵敏度，可检测浓度低至7.720×10-2ng的羊源尸毒梭菌DNA。
本发明的三重PCR检测试剂盒还具有很高的特异性，其对蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)、类志贺邻单胞菌(Plesimonas shigelloides)、乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、霍氏肠杆菌(Enterobacterhormaechei)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、大肠杆菌(Escherichia coli)、柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的检测结果均为阴性。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1分离菌形态观察(A)及革兰氏染色镜检(B，1 000×)结果。
图2菌株LJH-1 16S rDNA扩增结果；M，DL2000 DNA Marker；1，LJH-1。
图3菌株LJH-1 16S rDNA基因系统发育树。
图4菌株LJH-1 16S rDNA基因同源性分析结果。
图5特异性引物扩增；M，DL2000 DNA Marker；1，使用引物对A扩增；2，使用引物对B扩增；3，使用引物对C扩增；4，引物对A、B、C的三重PCR。
图6三重PCR的特异性检测；M，DL2000 DNA Marker；1，Clostridium cadaveris；2，Bacillus cereus；3，Plesimonas shigelloides；4，Pediococcus acidilactici；5，Micrococcus luteus；6，Enterobacter hormaechei；7，Enterobacter cloacae；8，Escherichia coli；9，Citrobacter amalonaticus；10，Bacillus subtilis。
图7三重PCR的灵敏度检测；M，DL2000 DNA Marker；1-7依次为DNA模板浓度(ng/μL)：77.200，7.720，7.720×10-1，7.720×10-2，7.720×10-3，7.720×10-4，7.720×10-5。
具体实施方式
实施例1本发明的试剂盒
1.试剂盒的组成
本试剂盒是三重PCR检测试剂盒，由如下部分组成：
三重PCR引物，PCR预混液(1.1×T3 Super PCR Mix)。
引物序列如表1所示。
表1三重PCR引物信息
2.试剂盒的使用方法
将1.1×T3 Super PCR Mix 18μL，尸毒梭菌DNA模板1μL，三对引物上、下游引物各1μL混合，PCR后采用琼脂糖凝胶电泳检测即可。
PCR条件为：98℃预变性2min；98℃变性10s，59℃退火15s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃再延伸2min。
以下将用实验例的形式对本发明试剂盒的有益效果做进一步介绍。
实验例1羊源尸毒梭菌的常规鉴定以及本发明试剂盒的特异性敏、感性试验
1.方法
1.1菌株
对照菌株蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、类志贺邻单胞菌(Plesimonasshigelloides)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、藤黄微球菌(Micrococcusluteus)、霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、大肠杆菌(Escherichia coli)、柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)均由西南民族大学动物分子遗传与育种重点实验室提供。
1.2病料
四川省某羊场内发生腹泻的瘫痪羔羊，用无菌棉签采取肛门拭子，放入装有新鲜LB肉汤的采样管中，于干冰中保存。带回实验室后，于37℃，150r/min的摇床中培养20h，用于细菌分离鉴定。
1.3主要试剂和仪器
Mueller-Hinton琼脂、LB肉汤购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；1.1×T3 Super PCR MIX、4S Red Plus Nucleic Acid Stain、细菌基因组DNA提取试剂盒均购自天根生化科技(北京)有限公司；DL2000 Marker购自宝生物工程(大连)有限公司；电泳仪、凝胶成像系统均购自Bio-RAD USA公司；PCR仪购自Eppendorf Germany公司；岛津紫外可见分光光度计(BioSpec-nano)购自日本岛津仪器公司。
1.4细菌的分离纯化
在超净台中，将培养20h的样品混匀后于LB固体琼脂培养上无菌操作划线，37℃恒温培养20h，挑取颜色、形状相近的单菌落经过LB肉汤纯化后保种备用。革兰氏染色、镜检。
1.5生化试验
取37℃培养20h的菌液，用细菌生化鉴定管按照李绍戊等[5]方法进行操作，结果参照《伯杰氏细菌鉴定手册》[3]进行判定。
1.6细菌DNA提取将保种后的菌株和对照菌株接种于LB肉汤培养基中活化，37℃恒温培养20h，12000r/min离心5min收集菌体。参照细菌基因组DNA试剂盒说明书提取细菌总DNA，其浓度及质量于紫外分光光度计检测合格后(D260nm/D280nm＝1.8-2.0)，记录数值，-20℃保存备用。
1.7 16S rDNA基因序列的扩增及系统进化发育树的构建
采用16S rDNA基因的引物进行PCR扩增，PCR反应体系为25μL：1.1×T3 Super PCRMIX 22μL，细菌DNA模板1μL，上、下游引物各1μL。正向引物16S-F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；反向引物16S-R：5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’。PCR扩增条件：98℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃再延伸2min。取5μL的PCR扩增产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，于凝胶成像系统下观察PCR扩增结果。扩增产物交由生工生物工程(上海)股份有限公司纯化及序列测定，测序拼接结果提交至GenBank数据库，将测序所得的16S rDNA拼接序列与NCBI数据库中的序列进行BLAST比对，采用MegAlign软件进行16S rDNA基因同源性分析，采用Mega 6.0软件对同源性相近的序列构建进化树，参考菌株信息见表2。
表2参考菌株信息
1.8使用本发明试剂盒检测
使用实施例1的试剂盒对羊源尸毒梭菌的DNA进行检测。
1)引物间特异性测试
使用A、B、C三对引物分别对羊源尸毒梭菌进行扩增。
2)物种间特异性测试
对照菌株蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、类志贺邻单胞菌(Plesimonasshigelloides)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、藤黄微球菌(Micrococcusluteus)、霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)、阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)、大肠杆菌(Escherichia coli)、柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的DNA分别为模板，使用实施例1的试剂盒进行PCR检测。
3)灵敏度测试
将测定细菌基因组DNA浓度后的尸毒梭菌样品依次按照10倍、102倍、103倍、104倍、105倍进行稀释，使用实施例1的试剂盒进行检测。
2.结果
2.1病原菌的分离鉴定
在LB固体琼脂培养基上培养20h后发现，分离菌株形成圆形、较大的菌落，白色、半透明，单个或成双排列，表面有光泽，见图1(A)。革兰氏染色后1000倍镜检，可见菌体呈紫色或者黑紫色的短杆状，芽孢呈椭圆形，表明该菌为革兰氏阳性菌，见图1(B)。该菌株命名为LJH-1。
2.2生化试验
分离菌生化特性符合梭菌属成员的特征，详细结果见表3。综合形态学观察和生理生化特性分析，发现分离菌株与《常见细菌系统鉴定手册》[9]中尸毒梭菌描述基本一致，初步鉴定为尸毒梭菌。
表3生理生化结果
注：“+”代表阳性，“-”代表阴性。
2.3 16S rDNA基因序列的扩增及系统进化发育树的构建
16S rDNA基因扩增发现，分离菌株经过16S rDNA基因序列测定，获得长度为约1023bp的序列片段，见图2。将序列提交至NCBI获得GenBank登录号为MK968718。由菌株LJH-1的16S rDNA基因系统进化树可知，菌株LJH-1与尸毒梭菌C4菌株(登录号为MF145697.1)亲缘关系最近，见图3。由菌株LJH-1的16S rDNA基因同源序列分析可知，菌株LJH-1与尸毒梭菌C4、JCM1392、E027菌株同源性分别为99.6％、99.6％、99.5％，菌株LJH-1与尸毒梭菌C4、JCM1392菌株同源性最高，见图4。结合分离菌形态学和生理生化特性，综合判定菌株LJH-1为尸毒梭菌。
2.4三重PCR特异性和灵敏性检测结果
图5为引物特异性试验结果，仅1号泳道的尸毒梭菌三重PCR扩增结果出现三条清晰条带，片段大小分别为492bp、355bp和255bp，其他菌株均未出现目的条带。图6为引物灵敏性试验结果，1-4号泳道均能出现清晰的目的条带，尸毒梭菌DNA模板稀释前的浓度测定结果为77.200ng/μL，4号泳道所对应的DNA模板浓度为7.720×10-2ng/μL。
由于加样量是1μL，本发明的试剂盒的最低检测限是7.72×10-2ng。
综上，本发明的试剂盒可以特异、灵敏地检测羊源尸毒梭菌，具有良好的应用前景。
SEQUENCE LISTING
<110> 西南民族大学
<120> 一种羊源尸毒梭菌的检测试剂盒
<130> GYKH1426-2019P017637CC
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
gaaaggagca gtggacgaca t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
ttctatggca ctccttctcc c 21
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 3
cgcggctgat taccaacaa 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 4
tcgggcagcg tttcttctt 19
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 5
ctgagttctg tatctgcggg agt 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 6
tacgggttat acctgcaagt tca 23

Claims (7)

1.一种羊源尸毒梭菌的PCR检测试剂盒，其特征在于，它包括序列如SEQ ID NO.1—2、SEQ ID NO.3-4和/或SEQ ID NO.5—6所述的引物对。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，它包括如SEQ ID NO.1—2、SEQ ID NO.3-4和SEQ ID NO.5—6所述的引物对。
3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，它还包括PCR用预混液。
4.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR用预混液是1.1×T3 SuperPCR Mix。
5.一种羊源尸毒梭菌的PCR检测方法，其特征在于，它是使用如权利要求1-4任一所述的试剂盒对样品DNA进行检测。
6.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于，其PCR反应条件是：98℃预变性2min；98℃变性10s，59℃退火15s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃再延伸2min。
7.序列如SEQ ID NO.1-2、SEQ ID NO.3-4和/或SEQ ID NO.5-6所述的引物对在制备羊源尸毒梭菌的PCR检测试剂中的用途。
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