CN111876511A - 一种结核分枝杆菌复合群的lamp快速检测试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测结核分枝杆菌复合群(MTBC)的LAMP检测试剂盒和检测方法，属于微生物分子检测领域。本发明由于设计了高度特异性的引物(如SEQ ID NO.1～4所示)，相比现有技术，本发明的方法兼具了简便、快速、高灵敏度的优点。本发明在结核分枝杆菌复合群检测中具有良好的应用前景。

Description

一种结核分枝杆菌复合群的LAMP快速检测试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及微生物分子检测领域。

背景技术

结核分枝杆菌复合群(mycobacterium tubercu1osis，MTBC)是肺内及肺外结核共同的病原菌，包括人结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌。目前,有超过三分之一的世界人口感染结核。根据2016年WHO全球结核调查报告显示，2015年全球有1040万新发结核病人，中国的新发病例仅次于印度。研究结果显示中国潜伏期结核比例在13％～20％。中国仍是全球22个结核高负担国家之一。现阶段结核病控制、预防与治疗最好的手段就是通过早期快速准确的诊断和完善治疗体系。因此，开发可用于结核病致病菌早期实时、快速诊断技术，或许是帮助我们有效防治结核病的根本方法。

目前大多数发展中国家，对结核病的诊断主要是通过观察临床标本中(如痰液)是否存在结核分枝杆菌，如细菌涂片镜检和培养等，该法需要的设备简易，操作容易掌握，但存在着检测周期长、灵敏度低和特异性低等问题，这样很难及时诊断结核病，不利于结核病的诊断与控制。

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，是一种新型的核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4-6种特异引物，在链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)的作用下，60～65℃恒温扩增，15-60分钟左右即可实现核酸有效扩增，具有操作简单、特异性强、产物易检测等特点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简便、快捷准确地检测结核分枝杆菌复合群的LAMP检测试剂盒及方法。

本发明的技术方案包括：

一种LAMP引物，序列如SEQ ID NO.1～4所示。

一种结核分枝杆菌复合群的LAMP检测试剂盒，它包括：序列如SEQ ID NO.1～4的引物。

如前述的试剂盒，它还包括：

商业化的LAMP Mix；LAMP酶、镁离子、dNTP以及LAMP用缓冲液。

如前述的试剂盒，所述商业化的LAMP Mix与引物被混在同一个分散系中。

一种非疾病诊断目的的结核分枝杆菌复合群检测方法，它是使用如权利要求2～4任一所述试剂盒进行LAMP检测的方法。

如前述的检测方法，所述检测的待检样本为：死亡人体来源的样本、死亡动物体来源的样本或环境来源样本。

如前述的检测方法，它包括如下LAMP程序：60～65℃，15～60min。

如前述的检测方法，反应温度是65℃恒温。

如前述的检测方法，反应时间为50min。

本发明具有如下有益效果：

1)特异性强

本发明的试剂盒和方法可以特异性检测出样品中的结核分枝杆菌复合群，所检测的阴性对照细菌和水对照均无阳性结果出来。

2)灵敏度高

本发明的试剂盒和方法的最低检测限约为1.0×10^-3ng/μL。

3)简单快速

本发明使用“一步法”LAMP，理论上的LAMP扩增时间为50min，这大大缩减了检测时间。

4)结果呈现方式多样

该LAMP反应产物可以通过凝胶电泳、荧光、沉淀等多种技术达到结果的可视化。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1：LAMP引物可行性验证结果

图2：LAMP引物扩增产物电泳结果

图3：LAMP外引物浓度优化结果

图4：LAMP内引物浓度优化结果。1-5分别为2.8pmol/μL、2.4pmol/μL、2.0pmol/μL、1.6pmol/μL、1.2pmol/μL，6为阴性对照。

图5：LAMP特异性结果。其中B～L分别为人结核分枝杆菌、牛结核分枝杆菌、非洲结核分枝杆菌、田鼠结核分枝杆菌、堪培拉结核分枝杆菌、变形杆菌、巴氏杆菌、诺卡氏菌、副鸡嗜血菌、沙门氏菌、肺炎链球菌，M：阴性对照

图6：LAMP引物灵敏度结果，其中1-7为DNA梯度：1.0×10⁰ng/μL、1.0×10^-1ng/μL、1.0×10^-2ng/μL、1.0×10^-3ng/μL、1.0×10^-4ng/μL、1.0×10^-5ng/μL、1.0×10^-6ng/μL，8为阴性对照。

图7：对比例1的LAMP引物灵敏度结果，其中1-7为DNA梯度：1.0×10⁰ng/μL、1.0×10^-1ng/μL、1.0×10^-2ng/μL、1.0×10^-3ng/μL、1.0×10^-4ng/μL、1.0×10^-5ng/μL、1.0×10^{- 6}ng/μL，8为阴性对照。

具体实施方式

实施例1本发明试剂盒对应的LAMP检测方法及其有效性测试

1材料与方法

1.1 DNA模板

人结核分枝杆菌、牛结核分支杆菌，非洲结核分枝杆菌、田鼠结核分枝杆，堪培拉结核分枝杆，变形杆菌、巴氏氏菌、诺卡氏菌、副鸡嗜血杆菌、沙门氏菌、肺炎链球菌的DNA。

1.2主要仪器和试剂

荧光定量PCR仪，Bio-rad公司凝胶成像系统，Simplinano超微量紫外分光光度计，Sigma低温微量超速离心机，LAMP酶(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)，2×Buffer(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)，DNA Marker100bp ladder购自康为世纪生物科技有限公司。

1.3引物设计与合成

根据结核分枝杆菌复合群gyrB基因保守序列设计LAMP引物，由北京擎科有限公司合成，引物序列如表1所示。

表1基于靶基因设计的LAMP引物

gyrB-F3/gyrB-B3为外引物，gyrB-FIP/gyrB-BIP为内引物。

1.4结核分枝杆菌复合群LAMP反应体系、程序

LAMP扩增体系如表2所示。

表2扩增体系

LAMP扩增反应于65℃恒温，50min。

1.5目的基因的扩增、克隆和测序

取扩增的结核分枝杆菌复合群LAMP扩增产物进行凝胶电泳实验，验证引物的可行性。

1.6结核分枝杆菌复合群LAMP引物特异性

将人结核分枝杆菌、牛结核分枝杆菌、非洲结核分枝杆菌、田鼠结核分枝杆菌、堪培拉结核分枝杆菌、变形杆菌、巴氏杆菌、诺卡氏菌、副鸡嗜血菌、沙门氏菌、肺炎链球菌的DNA分别按照1.4节的反应体系和程序进行LAMP扩增，水为阴性对照。

1.7结核分枝杆菌复合群LAMP引物灵敏性

为评价该引物对标准菌株结核分枝杆菌复合群DNA和临床样本中结核分枝杆菌复合群DNA的检测灵敏性，将提取的DNA测定浓度后进行10倍倍比稀释成7个浓度梯度：1.0×10⁰ng/μL、1.0×10^-1ng/μL、1.0×10^-2ng/μL、1.0×10^-3ng/μL、1.0×10^-4ng/μL、1.0×10^-5ng/μL、1.0×10^-6ng/μL；取各梯度DNA2μL分别进行LAMP扩增，水为阴性对照。

2.结果

2.1 LAMP引物可行性验证

设计的引物均有阳性扩增曲线出现(图1)，随后对扩增产物进行凝胶电泳实验，结果显示出现LAMP特有的梯形条带(图2)。

2.2 LAMP引物浓度优化结果

结果显示当引物外引物F3/B3终浓度为0.1pmol/μL，内引物FIP/BIP终浓度为2.0pmol/μL时，扩增效率最佳(图3、图4)。

2.3 LAMP的特异性试验

结果如图显示，设计的LAMP引物在结核分支杆菌复合群中均检出阳性，其他阴性对照菌和水对照均未出现(图5)。

2.4 LAMP的灵敏性试验

LAMP方法能检测临床样本中结核分枝杆菌复合群DNA的下限浓度为1.0×10^-3ng/μL(图6)。

对比例1与另一套LAMP引物的灵敏性比较

由于16S rRNA拷贝数多，相比DNA单一拷贝具有更大的丰度，基于16S rRNA设计LAMP检测引物被认为能提高LMAP检测灵敏度。申请公布号为CN107099601A的专利申请公开了一套以16S rRNA作为检测靶点设计的RT-LAMP检测引物(检测“对比引物”)，其序列如下：

正向外引物F3：5’-TCCTGGCTCAGGACGAAC-3’(SEQ ID NO：5)；

反向外引物B3：5’-CGCTTTCCACCACAAGACAT-3’(SEQ ID NO：6)；

正向内引物FIP：

5’-TCGCCACTCGAGTATCTCCGAAGCGGCGTGCTTAACACAT-3’(SEQ ID NO：7)；

反向内引物BIP：

5’-AGTAACACGTGGGTGATCTGCCATCCCGTGGTCCTATCCG-3’(SEQ ID NO：8)。

前述专利申请声称其引物的最低检测限为1拷贝。

本对比例用实施例1的LAMP反应条件测试对比引物的灵敏度。

1.方法

将提取的DNA测定浓度后进行10倍倍比稀释成7个浓度梯度：1.0×10⁰ng/μL、1.0×10^-1ng/μL、1.0×10^-2ng/μL、1.0×10^-3ng/μL、1.0×10^-4ng/μL、1.0×10^-5ng/μL、1.0×10^{- 6}ng/μL；取各梯度DNA 2μL分别进行LAMP扩增，水为阴性对照。

扩增条件、试剂同实施例1。

2.结果

如图7所示。数字1～8分别代表1.0×10⁰ng/μL、1.0×10^-1ng/μL、1.0×10^-2ng/μL、1.0×10^-3ng/μL、1.0×10^-4ng/μL、1.0×10^-5ng/μL、1.0×10^-6ng/μL等7个浓度的DNA样本以及阴性对照。

可见，其最低检测限仅1.0×10^-2ng/μL，高于本发明的引物组合；且在样本浓度同为1.0×10⁰ng/μL时，本发明的引物组合的Ct值较低，为25；而对比引物的Ct值为30。

本对比例的结果表明，本发明的引物相比基于16s RNA设计得到的引物的检测灵敏度更高。

综上，本发明的检测试剂盒和方法简单快速，具有良好的特异性和灵敏度，应用前景良好。

SEQUENCE LISTING

<110> 西藏自治区人民政府驻成都办事处医院（四川大学华西医院西藏成办分院）

<120> 一种结核分枝杆菌复合群的LAMP快速检测试剂盒及方法

<130> GYKH1069-2020P0111365CC

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 1

agatggcgtt cctcaacaag 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 2

gctgctatga atcgcgttct 20

<210> 3

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 3

accacttcgt cgacgacctc ggggctgacc atcaacctg 39

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 4

tccactgcac cgcacaaagt gtttcacgaa gtccaccagg 40

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 5

tcctggctca ggacgaac 18

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 6

cgctttccac cacaagacat 20

<210> 7

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 7

tcgccactcg agtatctccg aagcggcgtg cttaacacat 40

<210> 8

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 8

agtaacacgt gggtgatctg ccatcccgtg gtcctatccg 40

Claims (9)

1.一种LAMP引物，其特征在于，序列如SEQ ID NO.1～4所示。

2.一种结核分枝杆菌复合群的LAMP检测试剂盒，其特征在于，它包括：序列如SEQ IDNO.1～4的引物。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，它还包括：

商业化的LAMP Mix；LAMP酶、镁离子、dNTP以及LAMP用缓冲液。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述商业化的LAMP Mix与引物被混在同一个分散系中。

5.一种非疾病诊断目的的结核分枝杆菌复合群检测方法，其特征在于，它是使用如权利要求2～4任一所述试剂盒进行LAMP检测的方法。

6.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于：所述检测的待检样本为：死亡人体来源的样本、死亡动物体来源的样本或环境来源样本。

7.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于，它包括如下LAMP程序：60～65℃，15～60min。

8.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，反应温度是65℃恒温。

9.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，反应时间为50min。

Images