CN111676313B - 一种引物组合物及其应用 - Google Patents

一种引物组合物及其应用 Download PDF

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Abstract

本申请提供了一种引物组合物及其应用，所述引物组合物包括正向引物和反向引物，其中，所述正向引物的序列如SEQ ID NO:1所示，所述反向引物的序列如SEQ ID NO:2所示。采用本申请提供的引物组合物，可以用于特异性扩增决明及其混伪品的特征序列，从而实现决明及其混伪品的准确鉴定。

Description

一种引物组合物及其应用
技术领域
本发明涉及决明及其混伪品的鉴定技术领域，特别是涉及一种引物组合物及其在鉴定决明及其混伪品中的应用。
背景技术
决明是一种常见的植物药，决明子为豆科植物决明Cassia obtusifolia L.或小决明Cassia tora L.的干燥成熟种子，田菁Sesbania cannabina与望江南Cassiaoccidentalis的种子为决明子常见混伪品。混伪品的存在在一定程度上影响了临床用药的安全性，但现有鉴定混伪品的方法，如来源鉴定、性状鉴定、显微鉴定等，会受到主观因素的影响，无法完全满足目前中药鉴定的需求。因此，亟需一种更加客观准确的鉴定方法。
发明内容
本申请的目的在于提供一种引物组合物，以通过对决明及其混伪品特征序列的特异性扩增，实现决明及其混伪品的准确鉴定。
本申请第一方面提供了一种引物组合物，包括正向引物和反向引物，其中，所述正向引物的序列如SEQ ID NO:1所示，所述反向引物的序列如SEQ ID NO:2所示。
本申请第二方面提供了本申请第一方面所提供的引物组合物在鉴定决明及其混伪品中的用途；所述混伪品包括望江南或田菁中的至少一种。
本申请第三方面提供了一种采用本申请第一方面提供的引物组合物鉴定决明及其混伪品的方法，包括以下步骤：
1)提取待测样品的总DNA；
2)采用所述引物组合物，以待测样品的总DNA为模板进行PCR扩增；
3)对扩增产物进行二代测序，分析测序结果，获得扩增产物的基因序列；
4)将步骤3)获得的基因序列与决明及其混伪品的特征序列进行比对，鉴定决明及其混伪品；其中，决明的特征序列如SEQ ID No.3所示，望江南的特征序列如SEQ ID No.4所示，田菁的特征序列如SEQ ID No.5所示。
本申请第四方面提供了一种用于鉴定决明及其混伪品的试剂盒，包括本申请第一方面所提供的引物组合物。
本申请提供的引物组合物，可以用于特异性扩增决明及其混伪品的特征序列，从而实现决明及其混伪品的准确鉴定。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1显示了各样品扩增结果的序列相对丰度热图。
图2A显示了在3个待测样品中望江南的含量与counts数的相关性；
图2B显示了在3个待测样品中决明的含量与counts数的相关性。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本申请第一方面提供了一种引物组合物，包括正向引物和反向引物，其中，所述正向引物为5’-GTGAATACGAATCTATCT-3’(SEQ ID NO:1)；所述反向引物为5’-GGATTTTCCTTGATATCT-3’(SEQ ID NO:2)。
本申请第二方面提供了本申请第一方面所提供的引物组合物在鉴定决明及其混伪品中的用途；所述混伪品包括望江南或田菁中的至少一种。
发明人在研究中发现，本申请的引物组合物，能够同时用于扩增决明、望江南以及田菁的具有不同碱基序列的DNA片段，因此，如果决明药材中混有望江南和/或田菁，对药材的总DNA进行PCR扩增的产物中就会出现望江南和/或田菁的DNA片段；以决明、望江南和田菁的具有不同碱基序列的DNA片段作为各自的特征序列，通过鉴定扩增结果中是否存在决明、望江南及田菁的特征序列，即可确定决明药材中是否含有望江南和/或田菁。
其中，决明的特征序列为：5’-TTCTTTTTCTCCGTAACAAATCTTCTTATTTACGATTAACATCTTCTAGAGTCCTTTTTGAGCGAATTTATTTCTATGCAAAAATAGAACATTTTGTAGAAGTCTTTGATAAAGATTTTCGGTCCACCCTATGGTTCTTCAAGGACCCTTTCATTCATTATGTT-3’(SEQ ID No.3)；
望江南的特征序列为：5’-TTCTTTTTCTCCGTAACAAATCTTCTTATTTACGATTAACATCTTCTGGAATCCTTTTTGAGCGAATCAATTTCTATGCAAAAATAGAACATTTTGTAGAAGTCTTTGATAAAGATTTTCCGTCCACTCTATGGTTCTTCAAGGACCCTTTCATTCATTATGCT-3’(SEQ ID No.4)；
田菁的特征序列为：5’-TCCTTTTTCTACGTAACAAATCTTCTCATTTACGATTAAAATCTTTTAGTGTTTTTTTTGAACGAAGTTTTTTCTATGCAAAACGAGAGAATCTTGTAGAATTCTTTGCTAAAGATTTTTCGTCTATCTTAACATTCTTCAAGGATCCTTTCATTCATTATGTT-3’(SEQ ID No.5)。
本申请第三方面提供了一种采用本申请第一方面提供的引物组合物鉴定决明及其混伪品的方法，包括以下步骤：
1)提取待测样品的总DNA；
2)采用所述引物组合物，以待测样品的总DNA为模板进行PCR扩增；
3)对扩增产物进行二代测序，分析测序结果，获得扩增产物的基因序列；
4)将步骤3)获得的基因序列与决明及其混伪品的特征序列进行比对，鉴定决明及其混伪品；其中，决明的特征序列如SEQ ID No.3所示，望江南的特征序列如SEQ ID No.4所示，田菁的特征序列如SEQ ID No.5所示。
本申请中，对待测样品总DNA的提取方法不做限定，只要能够实现本发明的目的即可，例如可以采用市售的植物基因组提取试剂盒即可，如TIANGEN公司的植物基因组提取试剂盒。
对待测样品的总DNA进行PCR扩增可采用常规的PCR扩增体系，例如25μL扩增体系或50μL扩增体系等，本申请在此不做限定。
在本申请第三方面的一些实施方式中，PCR扩增体系中包括：
0.1-0.3μmol/L正向引物；0.1-0.3μmol/L反向引物；2-10ng/μL模板DNA；50-150μmol/L dNTPs；0.02-0.03U/μL DNA聚合酶。
dNTPs以及DNA聚合酶均为PCR体系的常规通用试剂，均可市售获得。DNA聚合酶可以选择PCR扩增用的常规DNA聚合酶，本申请在此不做限定，例如Gflex DNA聚合酶。
当然，所述PCR扩增体系中还包括PCR缓冲液和ddH2O，所述PCR缓冲液根据所用的DNA聚合酶的种类确定，可市售获得。通常PCR缓冲液与DNA聚合酶需要配合使用，市售DNA聚合酶均配有与之配合使用的PCR缓冲液，此为本领域常规操作，本申请在此不做限定。
本领域中，PCR缓冲液通常为浓缩的PCR缓冲液，例如可以是2×PCR缓冲液、10×PCR缓冲液等，本申请对此不做限定，示例性的，对于25μL扩增体系而言，如果采用2×PCR缓冲液，其用量通常为12.5μL，如果采用10×PCR缓冲液，其用量通常为2.5μL；此为PCR扩增的常规用法，本申请在此不做限定。PCR扩增体系中，除缓冲液、引物、模板、dNTP及DNA聚合酶，剩余体积以双蒸水(ddH2O)或DEPC水补足，此为本领域常规操作，本申请在此不做限定。
在本申请第三方面的一些实施方式中，步骤2)中，PCR扩增的条件包括：
预变性：97-98℃，50-70s；变性：97-98℃，8-12s；退火：54-56℃，13-17s；延伸：67-69℃，25-35s；25-35个循环；完成循环后继续67-69℃延伸4-6分钟。
其中，“25-35个循环”是指变性、退火、延伸三个过程的循环，此为本领域常规操作，本申请在此不做赘述。
本申请中所述的“二代测序”也称为第二代测序技术，是本领域公知的测序方法，二代测序的工作一般由专业的商业公司来完成。
本申请中，对二代测序的结果进行分析为本领域的常规操作，本申请在此不做限定，只要能够实现本发明的目的即可，例如，可以采用DADA2软件对二代测序结果进行分析，获得扩增产物的基因序列。
本申请第四方面提供了一种用于鉴定决明及其混伪品的试剂盒，包括本申请第一方面所提供的引物组合物。
在本申请第四方面的一些实施方式中，所述试剂盒中还包括PCR缓冲液、ddH2O、DNA聚合酶、dNTPs，及操作说明书。
在本申请第四方面的一些实施方式中，所述混伪品包括望江南或田菁中的至少一种。
以下结合具体实施例对本申请进行详细说明。
1、仪器
表1实验主要仪器
Figure BDA0002583073020000051
2、试剂
表2主要实验试剂
Figure BDA0002583073020000052
Figure BDA0002583073020000061
制备例待测样品制备
决明、望江南、田菁的种子购自安国中药材市场，并经过天津中医药大学中医药研究院田晓轩教授鉴定。
分别将决明、望江南、田菁干燥种子打粉，按表3中的含量混样。得到3个含不同物种比例的混合样品。
表3
Figure BDA0002583073020000062
实施例
1、待测样品总DNA提取
分别取制备例1的3份混合样品，采用TIANGEN的植物基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取，以下以样品1为例进行说明，样品2、3总DNA提取方法相同，具体操作如下：
①将混合样品迅速转移到预先装有700μl 65℃预热缓冲液GP1的离心管(实验前在预热的GP1中加入巯基乙醇，使其终浓度为0.1％)，迅速颠倒混匀后，将离心管放在65℃水浴20min，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次；
②加入700μl氯仿，充分混匀，12000rpm(Revolution(s)per minute，每分钟转速)离心5min；
③小心地将上一步所得上层水相转入一个新的离心管中，加入700μl缓冲液GP2，充分混匀；
④将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12000rpm离心30s，弃掉废液；
⑤向吸附柱CB3加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CP3放入收集管中；
⑥向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CP3放入收集管中；
⑦重复步骤6；
⑧将吸附柱CP3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于温室放置数分钟，以彻底晾干吸附柱中残余的漂洗液；
⑨将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部分悬空滴加50-200μl洗脱液TE，室温放置2-5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管。利用NanoDrop2000来检测提取DNA的浓度，其中，样品1浓度为31.4ng/μL，样品2的浓度为33.3ng/μL，样品3的浓度为35.2ng/μL。
2、PCR扩增及测序
扩增体系：
12.5μL 2×Gflex buffer；
0.5μL 正向引物；
0.5μL 反向引物；
2μL 总DNA；
0.5μL Tks Gflex DNA聚合酶；
9μL ddH2O。
扩增条件：
预变性：98℃，60s；变性：98℃，10s；退火：55℃，15s；延伸：68℃，30s；30个循环；完成循环后继续68℃延伸5分钟。
配置1.5％琼脂糖凝胶，PCR反应结束后，取5μL的PCR产物加1μL Loading buffer进行琼脂糖凝胶电泳，确定是否扩增出目标条带，参数设置为110V，35min。
PCR产物使用Illumina X Ten PE150平台测序。
3、数据处理
采用DADA2软件对测序结果进行数据分析，获得各样品中扩增产物的基因序列及各序列的count数，扩增产物的基因序列与各成分特征序列比对，确定各待测样品组成。
4、结果分析
各样品扩增结果的序列相对丰度热图如图1所示。可以看出，3各样品中均检出决明、望江南和田菁，说明本申请的方法能够用于决明及其混伪品的鉴定。
图中数字代表以制备例1的成分含量计算各成分质量百分比，以及各序列的count数百分比。进一步地，发明人对望江南和决明在各样品中生物量和count数进行了相关性分析，结果如图2A和图2B所示。结果显示每个物种在3个样品中占有的count数比例与人工混合样品时不同成分的成分含量比例呈显著相关(望江南R2＝0.9973；决明R2＝0.9998)，表明该引物可以较好的对决明和望江南进行定量分析。
本说明书中的各个实施例均采用相关的方式描述，各个实施例之间相同相似的部分互相参见即可，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处。尤其，对于系统实施例而言，由于其基本相似于方法实施例，所以描述的比较简单，相关之处参见方法实施例的部分说明即可。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 天津中医药大学
<120> 一种引物组合物及其应用
<130> PP205740
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtgaatacga atctatct 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggattttcct tgatatct 18
<210> 3
<211> 164
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttctttttct ccgtaacaaa tcttcttatt tacgattaac atcttctaga gtcctttttg 60
agcgaattta tttctatgca aaaatagaac attttgtaga agtctttgat aaagattttc 120
ggtccaccct atggttcttc aaggaccctt tcattcatta tgtt 164
<210> 4
<211> 164
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttctttttct ccgtaacaaa tcttcttatt tacgattaac atcttctgga atcctttttg 60
agcgaatcaa tttctatgca aaaatagaac attttgtaga agtctttgat aaagattttc 120
cgtccactct atggttcttc aaggaccctt tcattcatta tgct 164
<210> 5
<211> 164
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcctttttct acgtaacaaa tcttctcatt tacgattaaa atcttttagt gttttttttg 60
aacgaagttt tttctatgca aaacgagaga atcttgtaga attctttgct aaagattttt 120
cgtctatctt aacattcttc aaggatcctt tcattcatta tgtt 164

Claims (9)

1.一种引物组合物，包括正向引物和反向引物，其中，所述正向引物的序列如SEQ IDNO:1所示，所述反向引物的序列如SEQ ID NO:2所示。
2.权利要求1所述的引物组合物在鉴定决明及其混伪品中的用途；所述混伪品包括望江南或田菁中的至少一种。
3.一种采用权利要求1的引物组合物鉴定决明及其混伪品的方法，包括以下步骤：
1)提取待测样品的总DNA；
2)采用所述引物组合物，以待测样品的总DNA为模板进行PCR扩增；
3)对扩增产物进行二代测序，分析测序结果，获得扩增产物的基因序列；
4)将步骤3)获得的基因序列与决明及其混伪品的特征序列进行比对，鉴定决明及其混伪品；其中，决明的特征序列如SEQ ID No.3所示，望江南的特征序列如SEQ ID No.4所示，田菁的特征序列如SEQ ID No.5所示。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，PCR扩增体系中包括：
0.1-0.3μmol/L正向引物；0.1-0.3μmol/L反向引物；2-10ng/μL模板DNA；50-150μmol/LdNTPs；0.02-0.03U/μL DNA聚合酶。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2)中，PCR扩增的条件包括：
预变性：97-98℃，50-70s；变性：97-98℃，8-12s；退火：54-56℃，13-17s；延伸：67-69℃，25-35s；25-35个循环；完成循环后继续67-69℃延伸4-6分钟。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤3)中，所述分析测序结果采用DADA2软件。
7.一种用于鉴定决明及其混伪品的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括权利要求1所述的引物组合物。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括PCR缓冲液、ddH2O、DNA聚合酶、dNTPs，及操作说明书。
9.根据权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于，所述混伪品包括望江南或田菁中的至少一种。
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