CN113957168B - 一种用于鉴定赤芍的基原植物的试剂盒及鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本申请提供了一种用于鉴定赤芍的基原植物的试剂盒及鉴定方法，所述试剂盒包括第一引物组合物和第二引物组合物中的至少一种，所述第一引物组合物包括如SEQ ID NO:1所示的正向引物和如SEQ ID NO:2所示的反向引物；所述第二引物组合物包括如SEQ ID NO:3所示的正向引物和如SEQ ID NO:4所示的反向引物。采用本申请提供的用于鉴定赤芍的基原植物的试剂盒，所述试剂盒中的引物组合物可以特异性扩增赤芍的特定序列，通过与基原植物的特征序列进行比对，从而实现赤芍的基原植物的准确鉴定。
Description
本申请要求于2021年9月2日提交中国专利局、申请号为202111026347.X发明名称为“一种用于鉴定赤芍的基原植物的试剂盒及鉴定方法”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
本申请涉及赤芍的基原植物的鉴定技术领域，特别是涉及一种用于鉴定赤芍的基原植物的试剂盒及鉴定方法。
背景技术
赤芍作为临床最常见的多基原植物类中药材，具有清热凉血、消淤止痛的功效。据《中国药典》(2020版)规定，赤芍的基原植物为毛茛科(Ranunculaceae)植物芍药或川赤芍的干燥根。然而，尽管芍药和川赤芍都为赤芍的基原植物，但已有研究报道，赤芍的基原植物为芍药或川赤芍时，二者的成分含量具有较大差异，含量不同其药效也会有差异。因此，赤芍基原植物的鉴定对其临床用药的安全性及有效性具有重要意义。
发明内容
本申请的目的在于提供一种用于鉴定赤芍的基原植物的试剂盒，通过对赤芍特定序列的特异性扩增，以实现赤芍的基原植物的准确鉴定。
本申请第一方面提供了一种用于鉴定赤芍的基原植物的试剂盒，其包括第一引物组合物和第二引物组合物中的至少一种，所述第一引物组合物包括如SEQ ID NO:1所示的正向引物和如SEQ ID NO:2所示的反向引物；所述第二引物组合物包括如SEQ ID NO:3所示的正向引物和如SEQ ID NO:4所示的反向引物。
本申请第二方面提供了本申请第一方面提供的试剂盒在鉴定赤芍的基原植物中的用途。
本申请第三方面提供了一种采用本申请第一方面提供的试剂盒鉴定赤芍的基原植物的方法，包括以下步骤：
1)提取待测样品的总DNA；
2)采用所述试剂盒中的引物组合物，以待测样品的总DNA为模板进行PCR扩增；
3)对扩增产物进行测序，分析测序结果，获得扩增产物的基因序列；
4)将步骤3)获得的基因序列与芍药和川赤芍的特征序列进行比对，鉴定所述待测样品的基原植物为芍药或川赤芍；其中，芍药的特征序列如SEQ ID NO:5所示，川赤芍的特征序列如SEQ ID NO:6所示。
本申请提供的用于鉴定赤芍的基原植物的试剂盒，所述试剂盒中的引物组合物可以特异性扩增赤芍的特定序列，通过与基原植物的特征序列进行比对，从而实现赤芍的基原植物的准确鉴定。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的实施例。
图1显示了各待测样品总DNA的PCR扩增结果的琼脂糖凝胶电泳图。
图2显示了分别用两对引物组合物得到的各待测样品总DNA的PCR扩增结果的序列相对丰度热图，其中A图对应第一引物组合物，B图对应第二引物组合物。
图3显示了各待测样品中芍药和川赤芍的含量与reads数的相关性。
图4显示了各中成药样品总DNA的PCR扩增结果的琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员基于本申请所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
本申请第一方面提供了一种用于鉴定赤芍的基原植物的试剂盒，其包括第一引物组合物和第二引物组合物中的至少一种，所述第一引物组合物包括如SEQ ID NO:1所示的正向引物和如SEQ ID NO:2所示的反向引物；所述第二引物组合物包括如SEQ ID NO:3所示的正向引物和如SEQ ID NO:4所示的反向引物。
在本申请第一方面的一些实施方式中，所述试剂盒中还包括PCR缓冲液、ddH2O、DNA聚合酶、dNTPs，及操作说明书。
本申请第二方面提供了本申请第一方面提供的试剂盒在鉴定赤芍的基原植物中的用途。
发明人在研究中发现，本申请的试剂盒中的引物组合物，能够用于同时扩增赤芍的基原植物芍药或川赤芍的不同的DNA片段，所述DNA片段分别为如SEQ ID NO:5所示的芍药的特征序列或如SEQ ID NO:6所示的川赤芍的特征序列的不同片段，因此，通过将扩增所得的不同的DNA片段与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示的特征序列进行比对，即可鉴定赤芍的基原植物为芍药或川赤芍。
本申请中，赤芍的基原植物为芍药或川赤芍的干燥根，若赤芍以根或其切片入药，采用本申请的方法能够准确鉴定该赤芍的基原植物为芍药或川赤芍；若赤芍为粉末状态或制成成药后，采用本申请的方法能够准确鉴定该赤芍的基原植物为芍药、川赤芍或芍药与川赤芍的混合物。
其中，芍药的特征序列为：5’-AAATATAATCAAAGGCTCCGTGCGCGCCAAAAGGCGGAAAACTCCTATTTTGGAACCGTTTCAAGCAAACGCACACTCCCCTCTTTTTTTGGATAGAATAGACAAAGTCTTTTTTTTTTCTTTTGATATCTTCGGTCTGGCGAAATTCATTTTTAGAAATTGGATGGGGAAAAACACAGAATTCAAAATT-3’(SEQ ID NO:5)；
川赤芍的特征序列为：5’-AAATATAATCAAAGGCGCCGTGCGCGCCAAAAGGCGGAAAACTCCTATTTTGGAACCGTTTCAAGCAAACGCACACTCCCCTCTTTTTTTGGACAGAATAGACAAAGTCTTTTTTTTTTCTTTTGATATCTTCGGTCTGGCGAAATTCATTTTTCGAAATTGGATGGGAAAAAACACAGAATTCAAAATT-3’(SEQID NO:6)。
本申请第三方面提供了一种采用本申请第一方面提供的试剂盒鉴定赤芍的基原植物的方法，包括以下步骤：
1)提取待测样品的总DNA；
2)采用所述试剂盒中的引物组合物，以待测样品的总DNA为模板进行PCR扩增；
3)对扩增产物进行测序，分析测序结果，获得扩增产物的基因序列；
4)将步骤3)获得的基因序列与芍药和川赤芍的特征序列进行比对，鉴定所述待测样品的基原植物为芍药或川赤芍；其中，芍药的特征序列如SEQ ID NO:5所示，川赤芍的特征序列如SEQ ID NO:6所示。
本申请中，对待测样品总DNA的提取方法不做限定，只要能够实现本申请的目的即可，例如可以采用市售的植物DNA提取试剂盒即可，如TIANGEN公司的植物DNA提取试剂盒。
对待测样品的总DNA进行PCR扩增可采用常规的PCR扩增体系，例如25μL扩增体系或50μL扩增体系等，本申请在此不做限定。
在本申请第三方面的一些实施方式中，PCR扩增体系中包括：
0.1-0.3μmol/L正向引物；0.1-0.3μmol/L反向引物；2-10ng/μL模板DNA；50-150μmol/LdNTPs；0.02-0.03U/μL DNA聚合酶。
dNTPs以及DNA聚合酶均为PCR体系的常规通用试剂，均可市售获得。DNA聚合酶可以选择PCR扩增用的常规DNA聚合酶，本申请在此不做限定，例如Gflex DNA聚合酶。
当然，所述PCR扩增体系中还包括PCR缓冲液和ddH2O，所述PCR缓冲液根据所用的DNA聚合酶的种类确定，可市售获得。通常PCR缓冲液与DNA聚合酶需要配合使用，市售DNA聚合酶均配有与之配合使用的PCR缓冲液，此为本领域常规操作，本申请在此不做限定。
本领域中，PCR缓冲液通常为浓缩的PCR缓冲液，例如可以是2×PCR缓冲液、10×PCR缓冲液等，本申请对此不做限定，示例性的，对于50μL扩增体系而言，如果采用2×PCR缓冲液，其用量通常为25μL，如果采用10×PCR缓冲液，其用量通常为5μL；此为PCR扩增的常规用法，本申请在此不做限定。PCR扩增体系中，除缓冲液、引物、模板、dNTP及DNA聚合酶，剩余体积以双蒸水(ddH2O)或DEPC无酶水补足，此为本领域常规操作，本申请在此不做限定。
在本申请第三方面的一些实施方式中，步骤2)中，PCR扩增的条件包括：
预变性：97-98℃，50-70s；变性：97-98℃，8-12s；退火：54-56℃，13-17s；延伸：67-69℃，25-35s；25-35个循环；完成循环后继续67-69℃延伸4-6分钟。
其中，“25-35个循环”是指变性、退火、延伸三个过程的循环，此为本领域常规操作，本申请在此不做赘述。
本申请中所述的“测序”包括一代测序和下一代测序技术，是本领域公知的测序方法，测序的工作一般由专业的商业公司来完成。
本申请中，对测序的结果进行分析为本领域的常规操作，本申请在此不做限定，只要能够实现本申请的目的即可，例如，可以采用bbduck软件去除测序结果中的引物序列，然后采用DADA2软件进行分析，获得扩增产物的基因序列。
以下结合具体实施例对本申请进行详细说明。
1、仪器
表1实验主要仪器
2、试剂
表2主要实验试剂
3、材料
从国家药品标准物质管理平台购买了芍药和川赤芍的标准品，芍药和川赤芍的标准品粉末进行人工混样，得到7个混合样品，混合比例见表3。
表3
下述实施例中所用实验材料和方法，如无特别说明，均为常规材料和方法。
实施例1赤芍的基原植物的鉴定
1、待测样品总DNA提取
分别取表3中各混合样品(即待测样品)，采用植物DNA提取试剂盒进行总DNA提取，提取步骤按操作说明书进行。利用NanoDropTM分光光度计(Thermo Scientific，美国)检测总DNA的浓度，并用DEPC无酶水稀释各待测样品总DNA的浓度至25-125ng/μL。
2、PCR扩增及测序
分别使用表4的两对引物组合物对各待测样品总DNA进行PCR扩增，每个待测样品总DNA的PCR扩增均重复3次。
表4
扩增体系：
扩增条件：
预变性：98℃，60s；变性：98℃，10s；退火：55℃，15s；延伸：68℃，30s；30个循环；完成循环后继续68℃延伸5分钟。
配置1.5％琼脂糖凝胶，PCR反应结束后，取5μL的PCR产物加1μL Loading buffer进行琼脂糖凝胶电泳，确定是否扩增出目标条带，参数设置为110V，30min；同步设置空管和负管作为阴性对照，空管：除待测样品总DNA提取时不加药材，其余与待测样品步骤相同；负管：PCR扩增中以DEPC无酶水代替待测样品总DNA，其余与待测样品步骤相同；电泳结果如图1所示，图中M表示Marker(DNA分子标准和标记物)；图中1-21为7个待测样品采用第一引物组合物重复扩增3次的结果，其中相邻的3个样品为同一个待测样品的重复结果，例如1-3为待测样品1的重复结果，依次类推；图中22-42为7个待测样品采用第二引物组合物分别重复扩增3次的结果，其中22-24为待测样品1的重复结果，依次类推；图中的“空”代表空管，“负”代表“负管”；1-42的电泳结果均显示扩增出了目标条带，且空管和负管作为阴性对照，均无条带显示，结果表明两对引物组合物在各待测样品中均能扩增成功，且空管和负管均无污染。
PCR扩增产物使用Illumina Hiseq PE150平台测序。
3、待测样品鉴定
采用bbduck软件去除上述测序结果中的引物序列，采用DADA2软件进行数据处理和分析，以表3中样品编号为1号的待测样品为例，采用第一引物组合物进行扩增的结果，经处理得到待测样品reads数的结果，从中分析得到6个ASV(扩增子序列变体)，并获取每个ASV代表序列，与芍药和川赤芍的特征序列进行比对，得到鉴定结果如表5所示，其中ASV2、ASV3和ASV6被鉴定为芍药，ASV1、ASV4和ASV5被鉴定为川赤芍；在用第二引物组合物扩增得到的待测样品reads数的结果中分析得到5个ASV，并获取每个ASV代表序列，与芍药和川赤芍的特征序列进行比对，得到鉴定结果，其中ASV1被鉴定为芍药，其余四个ASV被鉴定为川赤芍；相应的其他各待测样品的鉴定结果见表5，其中“一致性”是指ASV的代表序列与芍药或川赤芍的特征序列的一致程度。
表5
对各待测样品的reads数进行分析，得到各待测样品总DNA的PCR扩增结果的序列相对丰度热图如图2的A图和B图所示，A图对应第一引物组合物，B图对应第二引物组合物，图中成分含量为各成分的质量百分比，reads数比例为各基原植物的reads数占总reads数的百分比，单位为％，从图2可以看出，各待测样品中均检出了芍药和川赤芍，说明本申请的方法能够用于芍药和川赤芍的鉴定。
进一步地，发明人对图2中芍药和川赤芍在各待测样品中的成分含量(即生物量比例)和reads数进行了相关性分析，结果如图3所示，结果显示芍药和川赤芍在7个待测样品中占有的reads数比例与人工混合样品时不同成分的成分含量比例呈显著相关，当采用第一引物组合物时，芍药的生物量比例Y与reads数比例X的线性关系为Y＝0.966X(R2＝0.9932)，川赤芍的生物量比例Y与reads数比例X的线性关系为Y＝0.9936X(R2＝0.9925)；当采用第二引物组合物时，芍药的生物量比例Y与reads数比例X的线性关系为Y＝0.9284X(R2＝0.9796)，川赤芍的生物量比例Y与reads数比例X的线性关系为Y＝1.0973X(R2＝0.9888)；表明第一引物组合物和第二引物组合物均可以较好的对芍药和川赤芍进行定量分析。
实施例2中成药中赤芍的基原植物的鉴定
材料：中成药脑血栓片(含赤芍)的样品信息见表6。
表6
分别取表6中各中成药样品，采用植物DNA提取试剂盒进行总DNA提取，提取步骤按操作说明书进行。利用NanoDropTM分光光度计(Thermo Scientific，美国)检测总DNA的浓度，并用DEPC无酶水稀释各中成药样品总DNA的浓度至25-125ng/μL。
分别以各中成药样品总DNA作为扩增模板，采用第一引物组合物进行扩增，扩增所用酶、扩增体系、扩增条件均同实施例1，PCR反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，同步设置空管和负管作为阴性对照，步骤均同实施例1，电泳结果如图4所示，图中M表示Marker(DNA分子标准和标记物)；图中Zcy1-7分别为表6中编号为Zcy1-7的中成药样品采用第一引物组合物扩增的结果，图中的“空”代表空管，“负”代表“负管”；从图中可以看出，各中成药样品的电泳结果均显示扩增出了目标条带，且空管和负管均无条带显示，说明空管和负管无污染，以上结果表明第一引物组合物在各中成药样品中均能够扩增成功。
PCR扩增产物使用Illumina Hiseq PE150平台测序。采用bbduck软件去除测序结果中的引物序列，采用DADA2软件进行数据处理和分析，得到各中成药样品reads数，并各自分析得到9个ASV，获取每个ASV代表序列，与芍药和川赤芍的特征序列进行比对，得到鉴定结果，所有ASV均被鉴定为芍药，各中成药样品的鉴定结果见表7，其中“一致性”是指ASV的代表序列与芍药或川赤芍的特征序列的一致程度。
表7
本说明书中的各个实施例均采用相关的方式描述，各个实施例之间相同相似的部分互相参见即可，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处。尤其，对于系统实施例而言，由于其基本相似于方法实施例，所以描述的比较简单，相关之处参见方法实施例的部分说明即可。
以上所述仅为本申请的较佳实施例，并非用于限定本申请的保护范围。凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本申请的保护范围内。
序列表
<110> 天津中医药大学
<120> 一种用于鉴定赤芍的基原植物的试剂盒及鉴定方法
<130> PP211498
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cctctacata atccga 16
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caatcagatt ttcgtcg 17
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcgttatctt tcttcc 16
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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<210> 5
<211> 190
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aaatataatc aaaggctccg tgcgcgccaa aaggcggaaa actcctattt tggaaccgtt 60
tcaagcaaac gcacactccc ctcttttttt ggatagaata gacaaagtct tttttttttc 120
ttttgatatc ttcggtctgg cgaaattcat ttttagaaat tggatgggga aaaacacaga 180
attcaaaatt 190
<210> 6
<211> 190
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
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attcaaaatt 190
Claims (7)
1.一种用于鉴定赤芍的基原植物的试剂盒，其包括第一引物组合物，所述第一引物组合物包括如SEQ ID NO:1所示的正向引物和如SEQ ID NO:2所示的反向引物。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括PCR缓冲液、ddH2O、DNA聚合酶、dNTPs，及操作说明书。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的试剂盒在鉴定赤芍的基原植物中的用途。
4.一种采用权利要求1-2中任一项所述的试剂盒鉴定赤芍的基原植物的方法，包括以下步骤：
1)提取待测样品的总DNA；
2)采用所述试剂盒中的引物组合物，以待测样品的总DNA为模板进行PCR扩增；
3)对扩增产物进行测序，分析测序结果，获得扩增产物的基因序列；
4)将步骤3)获得的基因序列与芍药和川赤芍的特征序列进行比对，鉴定所述待测样品的基原植物为芍药或川赤芍；其中，芍药的特征序列如SEQ ID NO:5所示，川赤芍的特征序列如SEQ ID NO:6所示。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，PCR扩增体系中包括：
0.1-0.3μmol/L正向引物；0.1-0.3μmol/L反向引物；2-10ng/μL模板DNA；50-150μmol/LdNTPs；0.02-0.03U/μL DNA聚合酶。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2)中，PCR扩增的条件包括：
预变性：97-98℃，50-70s；变性：97-98℃，8-12s；退火：54-56℃，13-17s；延伸：67-69℃，25-35s；25-35个循环；完成循环后继续67-69℃延伸4-6分钟。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤3)中，所述分析测序结果包括采用bbduck软件去除引物序列，采用DADA2软件分析，获得扩增产物的基因序列。
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-
2021
- 2021-11-02 CN CN202111288802.3A patent/CN113957168B/zh active Active
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Non-Patent Citations (1)
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|---|
| The genetic diversity of Paeonia anomala (Paeoniaceae), as indicated by nuclear ITS and plastid ycf1 molecular markers;Galina Degtjareva;BIO Web of Conferences;第38卷;第1-4页 * |
Also Published As
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