CN105203672B - 一种优质草莓的品质保障及品种鉴定方法 - Google Patents

Abstract

一种优质草莓的品质保障及品种鉴定方法，属于生物技术领域。通过LC‑MS和GC‑MS测定不同品种草莓的酚类及风味物质，建立化学指纹图谱数据库；通过ORAC方法测定各品种草莓的总抗氧化活性；应用RFLP、RAPD、SSR方法，结合花色苷和多酚合成途径中的关键酶基因，分析草莓种质遗传多样性；建立不同草莓品种的化学指纹图谱和生物活性信息的谱效关系，分析草莓遗传基础与功能品质性状之间的关系。通过化学指纹图谱、有效性评价、遗传多样性分析，结合谱效关系的研究选定优质草莓品种，并进行真实性鉴定，建立科学可靠、统一规范的草莓品质评价体系，为草莓的质量控制提供技术支撑和科学依据。

Description

一种优质草莓的品质保障及品种鉴定方法

技术领域

本发明涉及一种优质草莓的品质保障及品种鉴定方法，属于生物技术领域。

背景技术

草莓(Fragaria ananassa Duch)以其独特的风味及营养保健价值风靡世界，是世界七大保健水果之一。中国近年来草莓生产发展迅速，目前已成为世界草莓第一生产大国，全国种植面积达9.12万公顷，产量达233万吨，居世界首位。江苏省是我国草莓重要生产省份，草莓种植面积约为0.83万公顷，产量达到20.6万吨。

草莓是超级水果。草莓富含酚酸、多酚、花青素、黄酮类物质等活性功能成分，具有较强的抗氧化、清除自由基能力，可滋补胃肠道、营养皮肤，对防治动脉硬化、冠心病也有较好的疗效。我国已经引进和培育出上百个草莓品种，如丰香、红颜、章姬、硕丰、硕露、硕香、女峰、美香莎、幸香、宁丰、宁玉、港丰、甜查理、达思罗、森嘎拉、巨星一号、巨早、莓宝、香绯等。品种的基因型是草莓品质的主要决定因子。DNA多态性生物的不同个体或不同种群在DNA结构上存在着差异的多种多样的手段，如RFLP限制性内切酶酶切片段长度多态性分析、串联重复序列分析、RAPD随机扩增多态性DNA分析等等，是研究草莓种质遗传多样性及其分子进化亲缘关系的有效方法。花色苷和多酚合成途径中的关键酶，包括PAL(phenylalanineammonia-lyase)，CHS(chalcone synthase)，F3H(flavanone 3-hydroxylase)，DFR(dihydroflavonol 4-reductase)，ANS(anthocyanidin synthase)，在草莓成熟的过程中均有表达，其表达水平与花青素、原花色苷、黄酮含量相关。研究不同品种草莓次级代谢产物合成途径中关键酶的系统发育关系，既可以在一定程度描述品种的分子进化亲缘关系，也可以将次级代谢产物含量、活性与其遗传信息联系起来。

不同品种草莓的热敏性风味物质、营养成分与生物活性物质各不相同，使得不同品种草莓的色泽、口感、品质产生差异。检测人员通常采用传统农业生产中普遍使用的形态学鉴定法和感官评价来确定品种的真实性，但是该方法具有一定的主观性，且容易受到成熟度、生产生态环境和贮藏等条件的影响。

发明内容

技术问题 本发明的目的是要提供一种优质草莓的品质保障及品种鉴定方法，解决现有检测人员通常采用传统农业生产中普遍使用的形态学鉴定法和感官评价来确定品种的真实性的问题。

技术方案 本发明目的是这样实现的：优质草莓的品质保障及品种鉴定方法，包括品种鉴定方法和品质保障方法；

1、品种鉴定方法：通过化学指纹图谱和DNA指纹图谱对照鉴定品种；

具体步骤如下：

1)化学成分检测：

通过液相色谱-质谱联用(LC-MS)测定不同品种草莓的酚类活性成分的种类和含量，所述的草莓的酚类活性成分包括：多酚、黄酮、花色苷类物质，此类酚类物质与草莓的抗氧化活性正线性相关；

采用顶空固相萃取技术收集草莓的挥发性风味物质，选用气质联用质谱仪(GC-MS)鉴定不同品种草莓的风味物质，包括：酯类、酮类、醇类、醛类、呋喃、萜烯、有机酸；

建立化学成分的指纹图谱数据库：通过化学成分检测得到草莓酚类物质和挥发性风味物质化学指纹图谱数据库，不同品种的草莓指纹图谱不同，此为品种鉴定的基础；

2)DNA分析：

首先提取草莓DNA，然后应用限制性片段长度多态性方法、随机扩增多态性DNA标记方法和简单序列重复方法，得到DNA指纹图谱，分析草莓种质遗传多样性及其分子进化亲缘关系；针对不同草莓品种花色苷和多酚合成途径中的关键酶基因，包括：苯丙氨酸解氨酶、查尔酮合酶、黄烷酮3-羟基化酶、二氢黄酮醇还原酶、花青素合成酶，分别用相应引物PCR扩增，经聚丙烯酰胺凝胶电泳得到DNA序列，通过DNA序列进化树分析其系统发育关系；

所述的限制性片段长度多态性方法：不同草莓品种DNA限制性酶位点上的遗传差异引起相关限制性酶切割产生不同数目及长度的限制性片断，经琼脂糖凝胶电泳分离后通过EB染色以检测DNA片段的多态性，其英文缩写为RFLP，英文名称为restriction fragmentlength polymorphism；

所述的随机扩增多态性DNA标记方法：使用一系列具有10个左右碱基的单链随机引物，对草莓基因组的DNA全部进行PCR扩增，引物结合位点DNA序列的改变以及两扩增位点之间DNA碱基的缺失、插入或置换均可导致扩增片段数目和长度的差异，经琼脂糖凝胶电泳分离后通过EB染色以检测DNA片段的多态性，其英文缩写为：RAPD，英文名称为randomamplified polymorphic DNA；

所述的简单序列重复方法：也叫微卫星序列重复方法，是一类由1-5个核苷酸为重复单位组成的长达几十个核苷酸的重复序列，长度较短，广泛分布在染色体上，由于不同草莓重复单位的次数的不同或重复程度的不完全相同，造成了SSR长度的高度变异性，用微卫星区域特定顺序设计成对引物，通过PCR技术，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，显示SSR位点在不同草莓个体间的多态性，其英文缩写为SSR，英文名称为simple sequence repeat；

RFLP、RAPD、SSR为现有的常用来分析遗传多样性和分子进化亲缘关系的方法；

所述的苯丙氨酸解氨酶英文缩写为PAL，英文名称为phenylalanine ammonia-lyase；所述的查尔酮合酶英文缩写为CHS，英文名称为chalcone synthase；所述的黄烷酮3-羟基化酶英文缩写为F3H，英文名称为flavanone 3-hydroxylase；所述的二氢黄酮醇还原酶英文缩写为DFR，英文名称为dihydroflavonol 4-reductase；所述的花青素合成酶英文缩写为ANS，英文名称为anthocyanidin synthase；

2、品质保障方法：通过活性功能评价选择抗氧化活性强的为优质品种；

具体步骤如下：

1)活性功能评价：以抗氧化生物活性为指标，通过氧自由基吸收能力方法测定各品种草莓的总抗氧化活性，建立科学的高通量的快速生物活性评价体系；

所述的氧自由基吸收能力方法：又称为抗氧化能力，是根据自由基破坏荧光探针，使荧光强度产生变化原理，以维生素E水溶性类似物Trolox为定量标准，使用荧光微孔板分析仪进行分析，荧光强度的变化大小反映自由基破坏的程度，在抗氧化剂存在时，它可以抑制由自由基引起的荧光变化，抑制程度反映了它对自由基的抗氧化能力，其英文缩写为ORAC，英文名称为oxygen radical absorbance capacity；

2)谱效关系：建立不同草莓品种的化学指纹图谱和生物活性信息的谱效关系，结合现阶段市场的导向，分析草莓遗传基础与功能品质性状之间的关系，建立草莓品质保障评价体系，进行优质草莓品种鉴定；

根据上述建立的化学成分指纹图谱数据库，把不同品种草莓酚类物质和挥发性风味物质的化合物种类和含量数据用Excel2007软件处理，建立品种与化合物之间的三维棱锥图；此外酚类物质总含量与上述ORAC法测定的草莓总抗氧化能力数据制成散点图，进行线性关系分析，得到不同草莓品种的化学指纹图谱和生物活性信息的谱效关系；

根据上述RFLP、RAPD、SSR方法测定得到的不同草莓品种限制性酶切DNA片段、随机扩增DNA片段和简单重复序列DNA片段图谱用NSTY Spc2.1聚类分析和Quantity one软件分析得到相似系数分析图；PCR扩增得到的不同草莓品种PAL、CHS、F3H、DFR、ANS的DNA序列，应用PAUP*4.0 b10软件通过最大简约法和邻位相连法进行分子系统发育分析得到进化树，用Ward系统聚类法分析不同草莓品种的总酚含量和总抗氧化活性与基因直接的相关性；不同的草莓品种对应不同的DNA图谱和化学成分，结合花青素、原花色苷、黄酮含量和草莓抗氧化活性的相关性分析，含量高的抗氧化活性强，通过化学指纹图谱和DNA指纹图谱鉴定得到的优质品种其品质得到保障。

所述的最大简约法英文缩写为MP，英文名称为Maximum-parsimony；所述的邻位相连法英文缩写为NJ，英文名称为Neighbor-joining。

有益效果由于采用了上述方案，选用LC-MS和GC-MS测定各品种草莓酚类活性成分和挥发性风味物质，建立化学指纹图谱，简便快捷；ORAC方法测定抗氧化能力，可以有效反映各品种草莓的总抗氧化活性；RFLP、RAPD、SSR可以快速有效分析草莓种质遗传多样性及其分子进化亲缘关系。花色苷和多酚合成途径中的关键酶(PAL、CHS、F3H、DFR、ANS)，表达水平与花青素、原花色苷、黄酮含量相关，可以将次级代谢产物含量、活性与其遗传信息联系起来。品种的基因型是草莓品质的主要决定因子，而化学成分决定草莓的生物活性与风味，此方法对优质草莓品种进行真实性鉴定，建立统一规范的草莓品质评价体系，从而保障优质草莓的品质。

通过化学指纹图谱(成分分析)、有效性评价(活性检测)、遗传多样性分析(DNA指纹图谱)，结合谱效关系的研究可以选定优质草莓品种，并进行真实性鉴定，有助于建立科学可靠、统一规范的草莓品质评价体系，为草莓的质量控制提供技术支撑和科学依据。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明：

徐州馨香草莓专业合作联社，提供50份江苏主要草莓品种的样本。利用LC-MS和GC-MS测定各品种草莓酚类活性成分和挥发性风味物质，建立化学指纹图谱。通过ORAC测定各品种草莓的总抗氧化活性。提取DNA，设计相应的引物，测定RFLP、RAPD、SSR和PAL、CHS、F3H、DFR、ANS基因，建立DNA指纹图谱。分析不同草莓品种的化学指纹图谱和生物活性信息的谱效关系，以及草莓遗传基础与功能品质性状之间的关系，建立草莓品质保障评价体系，进行优质草莓品种鉴定。

优质草莓的品质保障及品种鉴定方法，包括品种鉴定方法和品质保障方法；

1、品种鉴定方法：通过化学指纹图谱和DNA指纹图谱对照鉴定品种；

具体步骤如下：

1)化学成分检测：

通过液相色谱-质谱联用(LC-MS)测定不同品种草莓的酚类活性成分的种类和含量，所述的草莓的酚类活性成分包括：多酚、黄酮、花色苷类物质，此类酚类物质与草莓的抗氧化活性正线性相关；

采用顶空固相萃取技术收集草莓的挥发性风味物质，选用气质联用质谱仪(GC-MS)鉴定不同品种草莓的风味物质，包括：酯类、酮类、醇类、醛类、呋喃、萜烯、有机酸；

建立化学成分的指纹图谱数据库：通过化学成分检测得到草莓酚类物质和挥发性风味物质化学指纹图谱数据库，不同品种的草莓指纹图谱不同，此为品种鉴定的基础；

2)DNA分析：

首先提取草莓DNA，然后应用限制性片段长度多态性方法、随机扩增多态性DNA标记方法和简单序列重复方法，得到DNA指纹图谱，分析草莓种质遗传多样性及其分子进化亲缘关系；针对不同草莓品种花色苷和多酚合成途径中的关键酶基因，包括：苯丙氨酸解氨酶、查尔酮合酶、黄烷酮3-羟基化酶、二氢黄酮醇还原酶、花青素合成酶，分别用相应引物PCR扩增，经聚丙烯酰胺凝胶电泳得到DNA序列，通过DNA序列进化树分析其系统发育关系；

2、品质保障方法：通过活性功能评价选择抗氧化活性强的为优质品种；

具体步骤如下：

1)活性功能评价：以抗氧化生物活性为指标，通过氧自由基吸收能力方法测定各品种草莓的总抗氧化活性，建立科学的高通量的快速生物活性评价体系；

2)谱效关系：建立不同草莓品种的化学指纹图谱和生物活性信息的谱效关系，结合现阶段市场的导向，分析草莓遗传基础与功能品质性状之间的关系，建立草莓品质保障评价体系，进行优质草莓品种鉴定；

根据上述建立的化学成分指纹图谱数据库，把不同品种草莓酚类物质和挥发性风味物质的化合物种类和含量数据用Excel2007软件处理，建立品种与化合物之间的三维棱锥图；此外酚类物质总含量与上述ORAC法测定的草莓总抗氧化能力数据制成散点图，进行线性关系分析，得到不同草莓品种的化学指纹图谱和生物活性信息的谱效关系；

根据上述RFLP、RAPD、SSR方法测定得到的不同草莓品种限制性酶切DNA片段、随机扩增DNA片段和简单重复序列DNA片段图谱用NSTY Spc2.1聚类分析和Quantity one软件分析得到相似系数分析图；PCR扩增得到的不同草莓品种PAL、CHS、F3H、DFR、ANS的DNA序列，应用PAUP*4.0 b10软件通过最大简约法和邻位相连法进行分子系统发育分析得到进化树，用Ward系统聚类法分析不同草莓品种的总酚含量和总抗氧化活性与基因直接的相关性；不同的草莓品种对应不同的DNA图谱和化学成分，结合花青素、原花色苷、黄酮含量和草莓抗氧化活性的相关性分析，含量高的抗氧化活性强，通过化学指纹图谱和DNA指纹图谱鉴定得到的优质品种其品质得到保障。

Claims (1)

1.一种优质草莓的品质保障及品种鉴定方法，包括品种鉴定方法和品质保障方法：

1)品种鉴定方法：通过化学指纹图谱和DNA指纹图谱对照鉴定品种；

具体步骤如下：

1.1)化学成分检测：

通过液相色谱-质谱联用(LC-MS)测定不同品种草莓的酚类活性成分的种类和含量，所述的草莓的酚类活性成分包括：多酚、黄酮、花色苷类物质，此类酚类物质与草莓的抗氧化活性正线性相关；

采用顶空固相萃取技术收集草莓的挥发性风味物质，选用气质联用质谱仪(GC-MS)鉴定不同品种草莓的风味物质，包括：酯类、酮类、醇类、醛类、呋喃、萜烯、有机酸；

建立化学成分的指纹图谱数据库：通过化学成分检测得到草莓酚类物质和挥发性风味物质化学指纹图谱数据库，不同品种的草莓指纹图谱不同，此为品种鉴定的基础；

1.2)DNA分析：

首先提取草莓DNA，然后应用限制性片段长度多态性方法、随机扩增多态性DNA标记方法和简单序列重复方法，得到DNA指纹图谱，分析草莓种质遗传多样性及其分子进化亲缘关系；针对不同草莓品种花色苷和多酚合成途径中的关键酶基因，包括：苯丙氨酸解氨酶、查尔酮合酶、黄烷酮3-羟基化酶、二氢黄酮醇还原酶、花青素合成酶，分别用相应引物PCR扩增，经聚丙烯酰胺凝胶电泳得到DNA序列，通过DNA序列进化树分析其系统发育关系；

所述的限制性片段长度多态性方法：不同草莓品种DNA限制性酶位点上的遗传差异引起相关限制性酶切割产生不同数目及长度的限制性片断，经琼脂糖凝胶电泳分离后通过EB染色以检测DNA片段的多态性，其英文缩写为RFLP，英文名称为restriction fragmentlength polymorphism；

所述的随机扩增多态性DNA标记方法：使用一系列具有10个左右碱基的单链随机引物，对草莓基因组的DNA全部进行PCR扩增，引物结合位点DNA序列的改变以及两扩增位点之间DNA碱基的缺失、插入或置换均可导致扩增片段数目和长度的差异，经琼脂糖凝胶电泳分离后通过EB染色以检测DNA片段的多态性，其英文缩写为：RAPD，英文名称为randomamplified polymorphic DNA；

所述的简单序列重复方法：也叫微卫星序列重复方法，是一类由1-5个核苷酸为重复单位组成的长达几十个核苷酸的重复序列，长度较短，广泛分布在染色体上，由于不同草莓重复单位的次数的不同或重复程度的不完全相同，造成了SSR长度的高度变异性，用微卫星区域特定顺序设计成对引物，通过PCR技术，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，显示SSR位点在不同草莓个体间的多态性，其英文缩写为SSR，英文名称为simple sequence repeat；

RFLP、RAPD、SSR为现有的常用来分析遗传多样性和分子进化亲缘关系的方法；

2)品质保障方法：通过活性功能评价选择抗氧化活性强的为优质品种；

具体步骤如下：

2.1)活性功能评价：以抗氧化生物活性为指标，通过氧自由基吸收能力方法测定各品种草莓的总抗氧化活性，建立科学的高通量的快速生物活性评价体系；

所述的氧自由基吸收能力方法：又称为抗氧化能力，是根据自由基破坏荧光探针，使荧光强度产生变化原理，以维生素E水溶性类似物Trolox为定量标准，使用荧光微孔板分析仪进行分析，荧光强度的变化大小反映自由基破坏的程度，在抗氧化剂存在时，它可以抑制由自由基引起的荧光变化，抑制程度反映了它对自由基的抗氧化能力，其英文缩写为ORAC，英文名称为oxygen radical absorbance capacity；

2.2)谱效关系：建立不同草莓品种的化学指纹图谱和生物活性信息的谱效关系，结合现阶段市场的导向，分析草莓遗传基础与功能品质性状之间的关系，建立草莓品质保障评价体系，进行优质草莓品种鉴定；

根据上述建立的化学成分指纹图谱数据库，把不同品种草莓酚类物质和挥发性风味物质的化合物种类和含量数据用Excel2007软件处理，建立品种与化合物之间的三维棱锥图；此外酚类物质总含量与上述ORAC法测定的草莓总抗氧化能力数据制成散点图，进行线性关系分析，得到不同草莓品种的化学指纹图谱和生物活性信息的谱效关系；

根据上述RFLP、RAPD、SSR方法测定得到的不同草莓品种限制性酶切DNA片段、随机扩增DNA片段和简单重复序列DNA片段图谱用NSTY Spc2.1聚类分析和Quantity one软件分析得到相似系数分析图；PCR扩增得到的不同草莓品种PAL、CHS、F3H、DFR、ANS的DNA序列，应用PAUP*4.0 b10软件通过最大简约法和邻位相连法进行分子系统发育分析得到进化树，用Ward系统聚类法分析不同草莓品种的总酚含量和总抗氧化活性与基因直接的相关性；不同的草莓品种对应不同的DNA图谱和化学成分，结合花青素、原花色苷、黄酮含量和草莓抗氧化活性的相关性分析，含量高的抗氧化活性强，通过化学指纹图谱和DNA指纹图谱鉴定得到的优质品种其品质得到保障。