CN110256394B - 具有抗癌活性的化合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种具有抗癌活性的化合物，具有以下结构通式I：

R基团为CH₃或H，其中，所述化合物从草龙中提取。本发明并提供了所述化合物的制备方法，包括以下步骤：1)采用溶剂提取法提取药材草龙，获得草龙提取物；2)使用石油醚、乙酸乙酯萃取，分别获得第一浓缩物和第二浓缩物；3)分别以大孔树脂吸附所述石油醚萃取物与乙酸乙酯萃取物，获得第一流份和第二流份；4)分别以硅胶色谱柱吸附第一流份和第二流份，获得第三流份和第四流份；5)采用制备型高效液相色谱法分别对第三流份和第四流份进行纯化，获得R基团为CH₃的化合物和R基团为H的化合物。本发明具有化合物具有抗肿瘤活性。

Description

具有抗癌活性的化合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及医药领域。更具体地说，本发明涉及一种具有抗癌活性的化合物及其制备方法。

背景技术

壮药草龙(壮名：Gvahgya呱夹)是柳叶菜科线叶丁香蓼Ludwigia hyssopifolia(G.Don)Exell的干燥全草，《广西壮族自治区壮药质量标准》记载其具有清热毒，通水道，消肿痛之功效，用于治疗阿意眯(痢疾)，传染性肝炎，笨浮(水肿)等疾病。然而，目前国内外对草龙化学成分和药理作用研究较少，阻碍了草龙药用价值的开发利用。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种具有抗癌活性的化合物，其能够用于防治癌症。

本发明还有一个目的是通过所述化合物的制备方法，制备出纯度较高的化合物，使其能用于制备各种形式的药剂以及满足各种给药方式。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种具有抗癌活性的化合物，具有以下结构通式：

R基团为CH₃或H，其中，所述化合物从草龙中提取。

优选的是，所述化合物用于喉癌、肝癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、神经母细胞瘤、鼻咽癌、前列腺癌或膀胱癌的防治。

优选的是，所述化合物用于喉癌的防治。

优选的是，所述化合物用于增加Caspase-3蛋白表达。

优选的是，所述化合物通过增加Caspase-3蛋白表达来诱导癌细胞凋亡。

一种具有抗癌活性的化合物的提取方法，包括以下步骤：

1)采用溶剂提取法提取药材草龙，获得草龙提取物；

2)往所述草龙提取物加水混悬，使用石油醚萃取，获得石油醚萃取物与水分离物；往所述水分离物中添加乙酸乙酯萃取，获得乙酸乙酯萃取物；

3)分别以大孔树脂吸附所述石油醚萃取物与乙酸乙酯萃取物，以醇-水混合溶液为洗脱剂进行梯度洗脱，获得第一流份和第二流份；

4)分别以硅胶色谱柱吸附第一流份和第二流份，以二氯甲烷-甲醇混合溶剂为洗脱剂进行梯度洗脱，获得第三流份和第四流份；

5)采用制备型高效液相色谱法分别对第三流份和第四流份进行纯化，获得R基团为CH₃的化合物和R基团为H的化合物。

优选的是，所述第一流份和第二流份的洗脱方法为：使用乙醇：水的体积比为10：90～20：80的开始洗脱，逐渐增加乙醇的比例至乙醇：水的体积比为95：5。

优选的是，所述第三流份和第四流份的洗脱方法为：以二氯甲烷：甲醇的体积比为100：1～50：1开始洗脱，逐渐增加甲醇的比例，至二氯甲烷：甲醇的体积比为8：1～5：1。

优选的是，步骤1)中，采用80％～95％的乙醇溶液以料液比1：8～10浸渍处理草龙2～4天，获得草龙提取物。

优选的是，所述溶剂提取法为浸渍法、渗漉法、加热回流法、微波振荡法或煎煮法中的任意一种。

本发明至少包括以下有益效果：本发明提取的化合物纯度高，适于制备较多的药剂以及能满足较多的给药方式；本发明提取的化合物具有抗肿瘤活性，其通过影响Caspase-3蛋白表达来诱导所述癌细胞凋亡，该组合物能够增加Caspase-3的活化水平，从而通过酶促级联反应的方式放大凋亡信号，最终导致癌细胞的凋亡。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明的荧光倒置显微镜观察细胞形态图；

图2为本发明的流式细胞仪观察结果图；

图3为本发明的荧光显微镜的观察结果图；

图4为本发明细胞内Caspase-3表达结果图；

图5为本发明细胞抑制率结果图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

本发明首次从草龙中提取了两种化合物，分别为ozoroalide(化合物A)和de-O-methyllasiodiplodin(化合物B)，化合物A的结构式为：

化合物B的结构为：

试验一化合物A和化合物B对Hep-2细胞形态的影响

取对数生长期的Hep-2细胞，接种入6孔板培养24h后，吸弃培养液，加入不同浓度的化合物A(样品浓度分别为5，15，25μg/mL)和B(样品浓度分别为3，4，5μg/mL)，加入空白液组(DMEM)作为阴性对照组，继续培养24h，显微镜明场观察细胞形态后，吸弃培养液，每孔加入固定液(甲醇：冰醋酸＝3:1)，固定后吸弃，加入PBS清洗一遍，吸除液体，风干。加入Hoechst 33258染色液覆盖所有细胞30分钟。采用荧光倒置显微镜观察细胞形态。结果如图1，两个空白组的Hep-2细胞呈现良好的贴壁性，总数多、界限清楚、细胞分布均匀、细胞核形态正常、呈圆形或不规则椭圆形、核质分布均匀，细胞呈现均匀荧光。而Hep-2细胞经化合物A和B处理后，随剂量的增加出现不同程度的凋亡，凋亡细胞特征逐步明显。低剂量组细胞形态不统一，贴壁细胞数量减少，开始出现凋亡小体；中剂量组贴壁细胞数量进一步减少，出现少量的凋亡小体，细胞核可见致密的颗粒性荧光；高剂量组贴壁细胞数量明显减少，细胞核固缩，有较多的凋亡小体出现。

试验二、化合物A和化合物B对Hep-2细胞凋亡的影响

对数生长期的Hep-2接种入6孔板培养24h后，使细胞贴壁，加入不同浓度的样品液于6孔板，再培养24h。之后用PBS洗涤细胞两次，300g离心6分钟，然后加入400μL 1×结合缓冲液并混悬细胞，避光条件下在室温用5μL Annexin V-FITC培养15分钟，5μL PI培养5分钟。采用流式细胞仪(Guava easyCyte,Darmstadt,Germany)和荧光显微镜(LeicaMicrosystems,Wetzlar,Germany)观察细胞凋亡。

结果见图2和图3，经化合物A和B处理后的喉癌细胞Hep-2，经过FITC-PI双染后，于流式细胞仪下检测。不同的细胞群被分区，其中早期凋亡的细胞位于右下限，晚期凋亡细胞位于右上限。总凋亡率即右边象限的比例总和。结果表示化合物A和B诱导Hep-2细胞凋亡。荧光倒置显微镜可以观察到给药组的早期凋亡(绿色)和晚期凋亡(红色)的细胞数量明显高于对照组。

试验三、化合物A和化合物B对Hep-2细胞内蛋白表达的影响

取对数生长期的贴壁细胞，加入一定浓度的样品作用24h后，收集细胞液，PBS洗涤，加入细胞裂解液裂解，超声粉碎，沸水浴10min，采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。制备浓缩胶和分离胶，采用12.5％SDS-PAGE凝胶电泳分离总蛋白，按照免疫印迹方法将胶内蛋白转移至PVDF膜上，用5％脱脂奶粉溶液封闭2小时后，加入一抗anti-cleaved-Caspase-3冰上孵育过夜，TBST洗涤三次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1h30min，TBST洗涤3次，后按照ECL的方法依次加入发光底物、曝光、显影及定影，采用ImageLab软件分析条带。

结果见图4，Hep-2细胞内的蛋白表达水平发生明显变化，随着化合物A和B给药浓度的增加，Caspase-3表达水平上升。这一结果表明，化合物A和B是通过影响细胞凋亡相关蛋白表达，发挥抗喉癌的作用。

综上，本发明所提供的化合物A和化合物B均具有抗癌活性，其作用机理为：通过影响Caspase-3蛋白表达，增加Caspase-3的活化水平，从而通过酶促级联反应的方式放大凋亡信号，最终导致癌细胞的凋亡。

实施例1

一种具有抗癌活性的化合物的提取方法，其包括以下步骤：

1)采用溶剂提取法提取药材草龙，获得草龙提取物；

2)往所述草龙提取物加水混悬，使用石油醚萃取，获得石油醚萃取物与水分离物；往所述水分离物中添加乙酸乙酯萃取，获得乙酸乙酯萃取物；

3)分别以大孔树脂吸附所述石油醚萃取物与乙酸乙酯萃取物，以醇-水混合溶液为洗脱剂进行梯度洗脱，获得第一流份和第二流份；

4)分别以硅胶色谱柱吸附第一流份和第二流份，以二氯甲烷-甲醇混合溶剂为洗脱剂进行梯度洗脱，获得第三流份和第四流份；

5)采用制备型高效液相色谱法分别对第三流份和第四流份进行纯化，对其进行结构鉴定，第三流份为化合物A和第四流份为化合物B。

实施例2

一种具有抗癌活性的化合物的提取方法，其包括以下步骤：

1)采用80％的乙醇溶液以料液比1：8浸渍处理草龙2天，过滤，获得草龙提取物；

2)往所述草龙提取物加水混悬，使用石油醚萃取，获得石油醚萃取物与水分离物；往所述水分离物中添加乙酸乙酯萃取，获得乙酸乙酯萃取物；

3)分别以大孔树脂吸附所述石油醚萃取物与乙酸乙酯萃取物，使用体积比为1：9的乙醇：水开始洗脱，逐渐增加乙醇的比例至乙醇：水的体积比为95：5，收集含第一流份和第二流份的馏分，得到第一流份和第二流份；

4)分别以硅胶色谱柱吸附第一流份和第二流份，以体积比为100：1的二氯甲烷：甲醇开始洗脱，逐渐增加甲醇的比例，至二氯甲烷：甲醇的体积比为8：1，获得第三流份和第四流份；

5)采用制备型高效液相色谱法分别对第三流份和第四流份进行纯化，经结构鉴定，第三化合物为化合物A，第四化合物为化合物B。

<对比试验>草龙的两种活性成分对喉癌细胞Hep-2和TU212与正常肾细胞HEK293细胞活力的影响

用MTT法检测化合物A和B对Hep-2、TU212和HEK293细胞株的细胞毒性。将细胞接种在96孔板中培养24小时，然后暴露于不同浓度的化合物A和化合物B中。在药物处理12、24和48小时后，向每个孔中添加100μL MTT(5mg/mL)，培养30分钟后，弃掉孔中的液体，并向每个孔中添加150μL DMSO，使用分光光度计(Thermo Fisher Scientific Oy,Vantaa,Finland)在562nm处测量OD值。

细胞的生长抑制率＝[1-(实验组A值-空白组A值)/(对照组A值-空白组A值)]×100％。

用GraphPad Prism 6.0计算了抑制率和IC50值，结果如图5和表1所示。

表1 Cytotoxic activity of compounds A and B against Hep-2(IC50,ug/mL，mean±SD)

结果见图5、表1，化合物A和B在5-25μg/mL和3-5μg/mL的浓度范围内，对喉癌细胞Hep-2和TU212均显示较好的活力抑制，也显示出明显的量效、时效关系，但对正常肾细胞HEK293影响不大。化合物A和B对Hep-2 12h的IC50值分别为14.98和3.83μg/mL，24h的IC50分别为10.82和3.50μg/mL，48h的IC50分别为9.40和3.17μg/mL。综上，化合物A和B在体外抗癌活性研究中，显示出良好的效果。由此可见，化合物A和B极具开发成为抗癌药物的潜力。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (2)

1.一种具有抗癌活性的化合物的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)采用溶剂提取法提取药材草龙，获得草龙提取物；其中，采用80％～95％的乙醇溶液以料液比1：8～10浸渍处理草龙2～4天，获得草龙提取物；

2)往所述草龙提取物加水混悬，使用石油醚萃取，获得石油醚萃取物与水分离物；往所述水分离物中添加乙酸乙酯萃取，获得乙酸乙酯萃取物，获得第二浓缩物；

3)分别以大孔树脂吸附所述石油醚萃取物与乙酸乙酯萃取物，以醇-水混合溶液为洗脱剂进行梯度洗脱，获得第一流份和第二流份；其中，所述第一流份和第二流份的洗脱方法为：使用乙醇：水的体积比为10：90～20：80的开始洗脱，逐渐增加乙醇的比例至乙醇：水的体积比为95：5；

4)分别以硅胶色谱柱吸附第一流份和第二流份，以二氯甲烷-甲醇混合溶剂为洗脱剂进行梯度洗脱，获得第三流份和第四流份；其中，所述第三流份和第四流份的洗脱方法为：以二氯甲烷：甲醇的体积比为100：1～50：1开始洗脱，逐渐增加甲醇的比例，至二氯甲烷：甲醇的体积比为8：1～5：1

5)采用制备型高效液相色谱法分别对第三流份和第四流份进行纯化，获得R基团为CH₃的化合物和R基团为H的化合物；

所述化合物具有以下结构通式：

R基团为CH₃或H。

2.根据权利要求1所述的具有抗癌活性的化合物的提取方法，其特征在于，所述溶剂提取法为浸渍法、渗漉法、加热回流法、微波振荡法或煎煮法中的任意一种。

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