CN114869876A - 低聚茋类化合物在制备抗炎产品中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了低聚茋类化合物在制备抗炎产品中的用途，通过对从马蔺种子中提取到的3种低聚茋类化合物进行活性研究，验证了所述化合物能够有效抑制细胞炎症因子的释放，具有优异的抗炎活性，在抗炎药物、抗炎保健品和抗炎化妆品等多个领域均具有良好的应用前景。

Description

低聚茋类化合物在制备抗炎产品中的用途
技术领域
本发明涉及低聚茋类化合物的用途领域，特别是涉及低聚茋类化合物在制备抗炎产品中的用途。
背景技术
马蔺(Iris lactea Pall.var.Chinensis(Fisch.)Koidz)，别名马莲、马兰、兰花草等，是被子植物门(Angiospermae)鸢尾科(Iridaceae)鸢尾属(Iris)的多年生草本宿根植物。目前为止，已经从马蔺的种子中分离得到多种化学成分，包括黄酮类、苯醌类、低聚茋类等。现代药理学对马蔺中的主要活性成分进行了研究，发现马蔺具有多种药理活性，如放射增敏作用、抗辐射作用、增强免疫力、抗生育、抗着床作用等。
到目前为止，已经从马蔺中分离得到多种化学成分，包括黄酮类、类黄酮类、苯醌类、茋类、甾醇和挥发油等。茋类，是二苯乙烯类化合物或者其寡聚体。但从马蔺中分离得到的茋类化合物微乎其微，数量极少。目前关于茋类化合物相关成分的活性研究较少。因此，现亟需对马蔺中提取到的化学成分及药理作用进行更加深入、细微的研究与活性机制探讨。
发明内容
本发明提供从马蔺中提取得到低聚茋类化合物在制备抗炎产品中的用途，该化合物具有优异的抗炎活性。
本发明提供低聚茋类化合物在制备抗炎产品中的用途，所述低聚茋类化合物为具有以下结构式的化合物中的至少一种：
Figure BDA0003687954180000021
化合物1为本发明中的VitisinA-13b-O-glucoside,化合物2为VitisinD，化合物3为Hopeaphenol。
进一步地，所述抗炎产品为抑制细胞炎症因子NO含量的产品。
NO为重要的细胞炎症因子，NO参与多种生理病理过程，过量NO会促进炎症性疾病的发生与发展，并且还能诱导其他炎症因子。
进一步地，所述抗炎产品为细胞炎症因子IL-6拮抗剂、IL-1β拮抗剂、TNFα拮抗剂中的至少一种。
所述IL-6拮抗剂、IL-1β拮抗剂、TNFα拮抗剂为降低细胞炎症因子IL-6、IL-1β、TNFα的基因表达水平的产品。
IL-6：人类IL-6基因位于第7号染色体上；IL-6分子量在21～30KD之间。主要由单核巨噬细胞、Th2细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞产生。能够刺激活化B细胞增殖，分泌抗体；刺激T细胞增殖及CTL活化；刺激肝细胞合成急性期蛋白，参与炎症反应；促进血细胞发育。
IL-1β：在局部低浓度时协同刺激APC和T细胞活化，促进B细胞增殖和分泌抗体，进行免疫调节。大量产生时有内分泌效应：诱导肝脏急性期蛋白合成，引起发热和恶病质。
TNFα：是一种能够直接杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无明显毒性的细胞因子，是迄今为止所发现的直接杀伤肿瘤作用最强的生物活性因子之一，然而其毒副作用也非常严重。
进一步地，所述抗炎产品为COX-2拮抗剂。
哺乳动物的环加氧酶(COX)至少存在两种形式：COX-1和COX-2。COX-1是一种构成型蛋白，普遍存在于各个器官细胞中；COX-2是一种诱导型蛋白，正常生理状态下处于低表达，当细胞受到相应刺激时表达量增加，参与炎症反应的发展。所述COX-2拮抗剂为抑制COX-2蛋白表达水平的产品。
所述产品包括但不限于药物、保健品、化妆品、食品。
在本发明的一个实施例中，所述低聚茋类化合物是从马蔺中分离得到。
本发明还提供一种前述用途中的低聚茋类化合物在制备治疗由LPS诱导细胞所致炎症的药物中的用途。
本发明还提供一种抗炎组合物，包括有效量的低聚茋类化合物和/或药学上可接受的辅料或辅助性成分；所述低聚茋类化合物为具有以下结构式的化合物中的至少一种：
Figure BDA0003687954180000031
本发明还提供一种抗炎组合物的制备方法，取有效量的前述低聚茋类化合物，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分，制备成剂型。
进一步地，所述剂型包括但不限于片剂、胶囊剂、散剂、软胶囊剂、滴丸、蜜丸、丸剂、颗粒剂、蜜炼膏剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液体制剂、注射制剂或外用制剂等。
本发明的有益效果是：
本发明对从马蔺种子中提取低聚茋类化合物进行了活性研究，采用网络药理学及分子对接结合细胞实验的方法初步预测、验证了低聚茋类化合物抗炎的作用机制及潜在靶点，抗炎活性实验结果表明，本发明所述化合物能够有效减少细胞炎症因子NO、IL-6β、COX-2的释放，具有较好的抗炎作用，在抗炎药物、抗炎保健品和抗炎化妆品等多个领域均具有良好的应用前景；同时为从马蔺种子中提取的低聚茋类化合物提供了新的用途。
附图说明
图1为低聚茋类化合物抗炎的靶点图，(a)低聚茋类化合物抗炎的潜在靶点Venn图，其中A代表炎症，B代表化合物；(b)炎症-化合物-潜在靶点网络图；
图2为PPI网络图；
图3为网络分析核心靶点；
图4为GO分析；
图5为KEGG分析；
图6为化合物与COX-2蛋白的分子对接；
图7为低聚茋类化合物细胞活力的影响；
图8为低聚茋类化合物对炎症因子的影响；
图9为低聚茋类化合物对COX-2蛋白表达的影响。
其中，图8、图9中，“#”表示模型组和正常组相比，“*”表示药物组与模型组相比。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，本实施例所用的原料和设备均为本技术领域常规市购的原料和设备。
本发明中的数据均为平均值。
受试样品：包括3个低聚茋类化合物：化合物1为本发明中的VitisinA-13b-O-glucoside,化合物2为VitisinD，化合物3为Hopeaphenol，均是从马蔺种子中分离纯化制得，其化学结构式如下：
Figure BDA0003687954180000051
实施例1
1.方法
1.1.网络药理学
1.1.1低聚茋类化合物潜在靶点获取
PubChem数据库或Chemdraw中获得化合物的SDF文件，将SDF文件导入PharmMapper(http://lilab.ecust.cn/pharmmapper/)网站，这是一个免费提供的网络工具，用于使用药效团作图方法识别潜在靶点。从而进行化合物靶点预测，获取低聚茋类化合物的潜在靶点
1.1.2炎症相关靶点收集
使用DrugBank(https://www.drugbank.ca/)、GeneCards(https://www.genecards.org/)和TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)的数据库构建通过使用包括“inflammation”和“inflammatory”在内的关键字自动搜索与炎症相关的基因靶标。
1.1.3药物与疾病共同靶点筛选及互作网络构建
使用维恩图(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)在线网站对炎症靶点和化合物靶点取交集，获取药物与疾病的共同靶点，绘制Veen图，交集基因即代表低聚茋类化合物治疗炎症的潜在作用靶点。利用STRING 11.0数据库构建共同靶点的蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络，下载TSV文件，导入Cytoscape 3.6.0以构建和可视化复合靶标网络。
1.1.4核心靶点筛选
利用Cytoscape软件中的“Cytohubba”插件分析PPI网络中各个靶点的Degree值，按照Degree值的大小排序，筛选出核心靶点(Degree值越大，说明网络中该靶点的重要性越强，筛选Degree前10的靶点)。
1.1.5功能富集分析
采用Metascape数据库(https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)进行GO包括生物过程(BP)、细胞组分(CC)和分子功能(MF)和KEGG通路的富集分析。
1.1.6分子对接
分子对接用于分析所有分离的化合物与COX-2之间的相互作用。分析是在YinfoCloud Platform(https://cloud.yinfotek.com/)和AutodockVina程序中进行的。低聚茋类化合物1、2、3的3D结构是在MMFF94力场中以能量最小化的方式构建的。COX-2(PDB ID:4M11)的晶体结构获自RCSB蛋白质数据库(https://www.rcsb.org/)。晶体配体被分离并用于定义结合袋。AutoDockVina程序用于在内部聚类后执行半灵活对接，最多输出9个姿势。
1.2抗炎活性评价
1.2.1RAW264.7细胞的培养
(1)RAW264.7细胞的培养与传代
RAW264.7细胞的培养：RAW264.7细胞在含有10％的胎牛血清(FBS)和1％的青霉素-链霉素(双抗)的DMEM高糖培养基中培养。细胞培养箱环境为温度为37℃，湿度95％，CO2浓度为5％。RAW264.7细胞的传代：正常培养情况下，RAW264.7细胞每隔1～2天传代一次。在显微镜下观察细胞生长至90％左右密度即可传代。RAW264.7细胞有部分悬浮细胞，此部分细胞需要离心收集。首先用无菌细胞刮顺同一方向将贴壁细胞从培养皿底部刮下，用巴氏管或5mL移液管轻轻吹打，显微镜下观察细胞呈单个细胞状态。将细胞悬液收集至15mL离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，再加入5mL新的DMEM培养基，吹打均匀。取新的10cm培养皿，加入8mL DMEM培养基，1mL FBS，1mL细胞悬液，十字晃动培养皿混匀，放入细胞培养箱培养。
(2)RAW264.7细胞冻存与复苏
RAW264.7细胞的冻存：预先按DMEM:FBS:DMSO＝5:4:1配制好细胞冻存液，置于4℃冰箱预冷。选用培养至1～3代的RAW264.7细胞进行冻存，首先按照传代的方法将消化下来的细胞收集至15mL离心管中，随后在离心力1000g，4℃下离心5min。弃掉上清液，根据细胞数量加入合适的提前预冷的细胞冻存液(每皿冻存2管，每管1.2mL)，用5mL移液枪轻轻吹打混匀。取无菌冻存管，标注细胞名称、冻存时间和操作者姓名，每管加入1.2mL细胞悬液。在冻存管盖处缠绕封口膜以免染菌，外层缠预先写好细胞名称、时间和操作者姓名的医用胶带以免封口膜在低温情况下失去粘性掉落。程序性冻存流程如下：4℃预冷15min→-20℃，2h→-80℃过夜→液氮。或将冻存管放入梯度冻存盒，直接放入-80℃冰箱过夜，再放入液氮保存。
RAW264.7细胞的复苏：提前将水浴锅中的水预热至37℃，从-80℃冰箱或者液氮中取出细胞，迅速放入水浴锅中，轻轻晃动加速融化。取15mL离心管，加入2mL培养基，用移液枪轻轻吹打2～3次融化后的细胞冻存液，取出1mL加入离心管中，于1000rpm，25℃离心5min。倒掉上清液，加入1mL培养基轻轻吹打5～6次至单细胞悬液。取培养皿，加入8mLDMEM、1mL FBS、1mL细胞悬液，十字晃动培养皿8～10次，放入细胞培养箱中孵育。24h后换液，之后每隔一天传代一次。
(3)RAW264.7细胞的计数
取血球计数板，用擦镜纸擦拭干净，盖上专用的盖玻片。将消化后的细胞用PBS稀释至合适浓度并混匀，用200μL移液枪吸取细胞悬液，沿着盖玻片的边缘加入，使细胞悬液缓缓渗入，直至计数板中央的计数室被填满。静置10min，待细胞全部沉降到计数室中时开始计数。计数时，分别取上面和下面的左上、左下、右上和右下四个4×4方格进行计数。计算公式如下：
Figure BDA0003687954180000071
式中，
A/B：上/下4个大格子细胞数总和；
血球计数板和使用完毕后，喷洒75％乙醇，用无尘纸擦净，于干燥处保存。
1.2.2MTT法测定细胞活力
将RAW264.7细胞以1×105个/mL的密度接种于96孔板中，在细胞培养箱中孵育12h后，换成含有脂多糖或化合物的DMEM培养基(含2％FBS)继续培养24h。培养至特定时间后，将原来的培养液弃掉，每孔加入100μL含2％FBS的DMEM培养基。随后每孔加入10μL MTT溶液，置于细胞培养箱中孵育4h。最后弃去培养基，加入100μL DMSO，在37℃微孔板震荡前上震荡溶解10min，测定波长450nm处的吸光度值。细胞活力计算公式如下：
Figure BDA0003687954180000081
其中ODS为样品组，ODblank为空白组，ODcontrol为对照组。
1.2.3低聚茋类化合物对RAW264.7细胞分泌NO的影响
将RAW264.7细胞以1×105个/mL的密度接种于96孔板中，在细胞培养箱中孵育12h后，换成含有脂多糖或化合物的DMEM培养基(含2％FBS)继续培养24h。培养至特定时间后，吸取上层培养基至新的96孔培养板，按试剂盒说明书测定NO浓度。
1.2.4低聚茋类化合物对炎症因子表达的影响
将RAW264.7细胞以1×105个/mL的密度接种于96孔板中，在细胞培养箱中孵育12h后，换成含有脂多糖或化合物的DMEM培养基(含2％FBS)继续培养24h。培养至特定时间后，吸取上层培养基至新的96孔培养板，按试剂盒说明书测定培养基上清中IL-6的水平。
1.2.5Western blot分析
RAW264.7细胞以1×105个/mL的密度接种于6孔板中，于细胞培养箱中孵育24h后，换成含有脂多糖或化合物的DMEM培养基(含2％FBS)。培养至特定时间后，进行蛋白提取。具体操作方法如下：
(1)RAW264.7细胞蛋白的提取：将RIPA裂解液(强)与PMSF按100:1的比例进行混合，配制成细胞裂解液，于4℃存储。将6孔板中的细胞用PBS缓冲液洗2次，将PBS吸净。每孔加入70μL细胞裂解液，晃动6孔板混匀，放置于冰上裂解2min，然后用细胞刮顺同一方向将蛋白质刮下来，收集到1.5mL离心管中。将离心管置于冰上继续裂解15～20min，期间轻弹离心管数次混匀。裂解完成后在12000r/min，4℃下离心15min，取上清液于新的EP管中。
(2)BCA法测细胞蛋白浓度：蛋白浓度的测定采用BCA法，具体操作按照试剂盒说明书进行。Western blot实验中采用等体积上样，因此将所有蛋白样品用PBS稀释至同一浓度。
(3)蛋白变性：取稀释好的蛋白样品，加入5×蛋白上样缓冲液并混匀，在金属浴中100℃变性15min。变性好的蛋白冷却后，于-80℃储存备用。加样前，将蛋白样品离心至充分融化后再使用。
(4)SDS-PAGE电泳：首先配制分离胶。根据蛋白分子量大小先配下层胶即分离胶(表1)。
表1 SDS-聚丙烯酰胺凝胶的分离范围
Figure BDA0003687954180000091
灌入约4.5mL分离胶后，再灌入异丙醇，使分离胶液面压平及去除气泡。等待30min后，分离胶凝固(可参照未灌入制胶板的分离胶)。将上层异丙醇倒掉并用吸水纸吸去残留的异丙醇，灌入配置好的浓缩胶，插入合适的梳子。等待40～60min，浓缩胶凝固(可参照未灌入制胶板的浓缩胶)，将两块制备好的电泳胶夹在电泳槽上，需要水平夹好，灌入电泳液检漏，否则漏液或电极不平衡或漏液导致条带偏斜或移动缓慢。此时水平拔出梳子，尽量使上样孔保持垂直状态。提前将蛋白样品离心至充分融化，上样20～30μg，根据需求在两端及/或中间加入蛋白质预染Marker。上样完成后，补足电泳液开始电泳，先用恒压80V，使样品在浓缩胶中浓缩30min左右，待样品电泳行至分离胶后换成恒压120V继续分离50～90min，上样缓冲液的蓝色条带电泳行至距最下端5～10mm时停止电泳。
(5)转膜：本实验采用湿转方法进行转膜，首先将PVDF膜剪至合适大小，剪去一个角作为记号以便区分正反面，用甲醇活化1min后。将活化后的PVDF膜、2张转膜海绵、4张转膜滤纸泡在预冷的转膜缓冲液中。将转膜夹黑色一面置于下方，依次放上转膜海绵和2张转膜滤纸。取出电泳槽中的玻璃板，将玻璃板用切胶刀撬动后，按蛋白质预染Marker标识切下目标蛋白所在的电泳胶，放在黑色转膜夹的滤纸上，注意电泳胶与滤纸间不要有气泡，再将PVDF膜放在电泳胶上，同样注意避免膜与胶之间的气泡。最后在上面放上2层转膜滤纸和海绵。放置好后把夹子放入转膜仪中，黑色夹子对着槽的黑面，转膜仪中要放置冰袋避免过热使蛋白质降解，恒流250mA，通电后将转膜仪置于冰水混合物中。根据分子量大小将转膜时间设为30～90min。
(6)封闭：封闭液为5％的脱脂牛奶。转膜结束后打开转膜夹，检查蛋白质预染Marker是否全部转至PVDF膜上，如果电泳胶上仍有Marker，则蛋白质可能转膜不全，下一次实验室需要加大电流或增加转膜时间。如果Marker已经转至膜背面，则需要降低电流或减少转膜时间。转膜结束后将PVDF膜放入抗体孵育盒，加脱脂牛奶至没过PVDF膜，室温摇床慢摇1.5～2h或者4℃过夜。
(7)孵育一抗：用TBST冲洗掉封闭液，4℃摇床孵育一抗过夜。
(8)孵育二抗：用TBST室温洗膜3次，每次8min，之后室温摇床孵育二抗1h。孵育完毕之后，用TBST室温洗膜3次，每次8min。
(9)显影：显影采用ECL化学发法，将ECL发光液滴加在PVDF膜上，用凝胶成像系统进行拍照。
(10)结果分析：目的蛋白和内参蛋白的灰度值用Image J软件进行定量，目的蛋白与内参蛋白的灰度值之比即为蛋白相对表达量。
2.实验结果
2.1网络药理学分析
去除重复靶点后，通过DrugBank、GeneCards和TTD数据库，共整合识别出1365个炎症相关靶点。通过使用PharmMapper筛选和去除重复，获得了3个化合物的436个可能的目标。图1a显示了化合物和炎症靶点的维恩图，因此两者的共同部分被认为化合物潜在的抗炎靶点。化合物靶点和炎症相关靶点之间有138个重叠靶点。潜在靶点通过Cytoscape3.6.0软件构建了可视化的网络图(图1b)。
通过低聚茋类化合物治疗炎症的潜在靶点构建PPI网络(图2)，通过Degree值表明，抗炎靶点中度数值较高的10个靶点分别ALB、AKT1、SRC、PPARG、MMP9、IL2、HSP90AA1、ESR1、EGFR和CASP3，其在网络中发挥着主要作用(图3)。
GO分析结果表明，BP主要富集于激素反应过程、防御反应调节、细菌反应、对脂多糖的反应等。CC主要富集于质膜、膜微区、磷脂酰肌醇3-激酶复合物、阳离子通道复合体等。MF主要富集于激酶结合、一氧化氮合成调节、核受体结合等(图4)。
KEGG途径分析表明低聚茋类化合物主要富集在癌症通路、脂质和动脉硬化、NF-kB信号通路、Wnt信号通路、内分泌抵抗等信号通路(图5)。
为了研究抗炎活性的可能机制，进行了分子对接以研究化合物与COX-2蛋白之间的相互作用。
图6结果表明，化合物1、2、3与COX-2蛋白具有很强的亲和力。化合物1、2、3与COX-2结合的估计结合自由能分别为-10.9、-11.3、-8.2kal/mol。对于化合物1和COX-2之间的相互作用，在残基Gly135、Gln327、Lys317和Asn34处形成氢键，而在残基His133、Tyr134、Glu326和Tyr136处发生疏水相互作用。对于化合物2和COX-2之间的相互作用，在残基Asp239和Arg311处形成氢键，在残基Lys243、Lys557、Val554、Phe247、Thr561和His242处发生疏水相互作用，在残基Phe247处发生π-π堆积。对于化合物3和COX-2之间的相互作用，在残基Asp158和Tyr136处形成氢键，而在残基Pro154、Ala156、Asp157、Asp325和Glu326处发生疏水相互作用。
2.2抗炎活性评价
MTT法初步用于测定分离化合物在RAW 264.7细胞中的细胞毒性。如图7所示，与对照组相比，化合物1、2、3(1～100μM)对RAW 264.7细胞活力没有细胞毒性作用(P<0.01)。因此，化合物1、2、3的最佳处理浓度为10μM。
NO是一种有效的促炎介质，在炎症反应中具有双重调节功能。NO在正常生理条件下发挥抗炎作用，然而，已发现NO的过量产生与各种炎症性疾病有关。因此，我们研究了这3种化合物是否影响细菌脂多糖(LPS)刺激的RAW 264.7细胞中NO的产生。如图8所示，与模型组相比，化合物1、2、3显着抑制了LPS刺激的RAW 264.7细胞中NO的产生(P<0.01)。此外，还评估了化合物1、2、3对促炎细胞因子IL-6水平的影响。结果表明，与模型组相比，化合物2、3抑制了细胞上清液中IL-6的释放(P<0.01)(图8b)
COX-2在炎症、疼痛反应或组织损伤中被各种因子(如IL-1β、IL-6、TNFα和生长因子)诱导表达。通过western blot实验发现，与模型组相比，化合物1、2、3对LPS刺激的RAW264.7细胞中COX-2表达的抑制作用最强(P<0.01)(图9)。
综上实验结果发现马蔺子中的低聚茋类化合物具有较好的抗炎活性，其中化合物3(Hopeaphenol)抗炎活性最显著。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.低聚茋类化合物在制备抗炎产品中的用途，所述低聚茋类化合物为具有以下结构式的化合物中的至少一种：
Figure FDA0003687954170000011
2.据权利要求1所述用途，其特征在于，所述抗炎产品为抑制细胞炎症介质NO含量的产品。
3.根据权利要求1所述用途，其特征在于，所述抗炎产品为细胞炎症因子IL-6拮抗剂、IL-1β拮抗剂、TNFα拮抗剂中的至少一种。
4.根据权利要求1所述用途，其特征在于，所述抗炎产品为COX-2拮抗剂。
5.根据权利要求1～4任一项所述用途，其特征在于，所述产品包括药物、保健品、化妆品、食品。
6.根据权利要求1所述用途，其特征在于，所述低聚茋类化合物是从马蔺中分离得到。
7.权利要求1～6任一项所述用途中的低聚茋类化合物在制备治疗由LPS诱导细胞所致炎症的药物中的用途。
8.一种抗炎组合物，其特征在于，包括有效量的低聚茋类化合物和/或药学上可接受的辅料或辅助性成分；所述低聚茋类化合物为具有以下结构式的化合物中的至少一种：
Figure FDA0003687954170000021
9.权利要求8所述抗炎组合物的制备方法，其特征在于，取有效量的权利要求1～6任一项所述低聚茋类化合物，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分，制备成剂型。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述剂型包括片剂、胶囊剂、散剂、软胶囊剂、滴丸、蜜丸、丸剂、颗粒剂、蜜炼膏剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液体制剂、注射制剂或外用制剂。
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