CN105237598A - 一种名为茶山奈苷b的黄酮氧苷类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种名为茶山奈苷B(camellikaempferoside？B)的黄酮氧苷类化合物及其制备方法和应用。首先提供了一种茶山奈苷B的结构、然后提供了从茯砖茶中分离制备得到茶山奈苷B的方法；在制备所述化合物过程中，首先将茯砖茶经有机溶剂提取、减压浓缩制得膏状提取物，再经分离纯化得到茶山奈苷B。本发明还提供所述化合物抑制阿尔茨海默病中关键致病蛋白Aβ的产生和聚集及其介导的神经毒性、炎症和氧化应激反应的应用。本发明提供的具有多功能生物活性的黄酮氧苷类化合物，对医药领域及茯砖茶的农业开发具有重要的意义，也为有效开发利用茯砖茶提供了广阔的前景，并且本发明中的制备方法简单，成本较低。

Description

一种名为茶山奈苷B的黄酮氧苷类化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于化学技术领域，具体涉及一种名为茶山奈苷B的黄酮氧苷类化合物及其制备方法和应用。

背景技术

山茶属植物茶(Camelliasinensis)及其叶部加工产品如绿茶、红茶、黑茶等中均含有具有良好生物活性的黄酮和黄酮苷类化合物，它们是自然界中很重要的一类天然有机化合物。早在1991年Finger等就从茶鲜叶、红茶、绿茶中分别鉴定出20种黄酮醇及其糖苷，邹艳丽等也从普洱熟茶中分离得到三个黄酮类化合物。因此，说明茶产品中含有很多具有预防心血管疾病、抗菌、抗癌等功效的黄酮类活性生物成分，这些具有保健功效的天然成分备受人们关注，这也将成为医药研究领域的研究热点。

茯砖茶(Fuzhuanbricktea)是黑茶的一种，其制作已有一百多年的历史。该茶是以茶树的叶为原料，经过渥堆、压制、发花后制得。其中在渥堆发酵过程中形成了茯砖茶特有的“金花”，因此，在香气方面形成了其独特的“菌花香”。茯砖茶主要产于我国湖南和陕西两省，现广泛销往全国各地和东南亚地区。这种茶除了作为茶饮料使用外，还可用于降脂降压、降血糖、治疗菌痢等用途(见下方文献)。

[1]邢志华，佟启鹏，赵宇，闫锦.绿茶类黄酮生物活性研究进展.药学与临床，2013，4(7).

[2]侯冬岩,回瑞华,杨梅.绿茶及其饮料中总黄酮的分析.分析实验室，2003，22(6):86-88.

[3]邹艳丽，董宝生，张伏全.普洱熟茶化学成分研究.云南化工.2009，(2):10-13.

[4]傅东和,刘仲华,黄建安,龚雨顺,陈金华.高通量筛选研究茯砖茶降脂功效.茶叶科学，2006,26(3):209-214.

[5]侯凯东.茯砖茶市场与收藏前景广阔诱人.茶叶经济信息，2006,(7):12-15.

茯砖茶因其加工过程中有微生物参与而发生了复杂变化，这些变化也许会产生某些具有特殊药理作用的新化合物。目前对于茯砖茶生物活性的化学基础的报道还比较少，若能成功的从茯砖茶这一黑茶资源中研究开发出具有生物活性的黄酮糖苷类化合物成分，将对农业和医药等领域作出重要贡献。

发明内容

本发明的目的之一是提供了一种名为茶山奈苷B的黄酮氧苷类化合物，此名为茶山奈苷B(camellikaempferosideB)的黄酮氧苷类化合物具有如下结构：

本发明的目的之二是提供一种上述名为茶山奈苷B的黄酮氧苷类化合物的制备方法，其包括以下步骤：

1)、取茯砖茶，并将茯砖茶粉碎；

2)、将粉碎后的茯砖茶用70wt％的丙酮溶液浸泡72小时，或者将粉碎后的茯砖茶用70wt％的丙酮溶液浸泡后超声波振荡提取，并将提取液经过减压浓缩制得膏状提取物；

3)、将所述膏状提取物悬浮于水中得到水混悬液，再用石油醚、氯仿、正丁醇依次萃取，将最终得到的正丁醇萃取液减压浓缩至膏状；

4)、将所述膏状体用热水溶解得到溶解液，接着利用羟丙基凝胶柱层析即SephadexLH-20凝胶柱层析；将溶解液使用甲醇-水体积比0:100到100:0作为梯度洗脱，收集其中甲醇-水体积比20:80到40:60间的洗脱组分；将得到的洗脱组分使用MCI柱层析纯化，以甲醇-水体积比0:100到100:0作为梯度洗脱，分别收集相应体积比间的洗脱组分，将其中甲醇-水体积比70:30洗脱得到的组分再经过聚酰胺柱层析以丙酮-水体积比1:2洗脱，每20mL收集一个馏分，将其中的第9～17组馏分合并、蒸干，最后经过ODS反相硅胶柱层析即十八烷基键合硅胶柱层析，以甲醇-水体积比5:4洗脱，每20mL收集一个馏分，取其中第20～25馏分合并、蒸干，可得到茶山奈苷B。

本发明的目的之三是提供一种上述名为茶山奈苷B的黄酮氧苷类化合物在制备抗阿尔茨海默病药物方面的应用。

通过试验证实，本发明提供的名为茶山奈苷B的黄酮氧苷类化合物抑制β-淀粉样蛋白(Aβ)的产生和Aβ的聚集，从而进一步抑制Aβ引起的一系列细胞生物学反应，可以应用于制备抗阿茨海默病药物方面。

具体的，本发明中的所述名为茶山奈苷B的黄酮氧苷类化合物可以和药学上所通用的辅料制成口服、外用、注射等剂型，例如片剂、胶囊剂、颗粒剂、滴丸剂等口服药剂；栓剂、捈剂、洗剂、膏剂、透皮贴剂等外用药剂；注射液、混悬液、冻干粉末等注射药剂，参照制药领域的常规方法制备。

本发明的有益效果在于：

1)、本发明成功的从茯砖茶这一黑茶资源中研究开发出具有生物活性的黄酮糖苷类化合物成分，对农业和医药等领域具有重大的意义。

2)、本发明从茯砖茶中制备得到一个具有生物活性的黄酮氧苷类化合物茶山奈苷B，为有效开发利用茯砖茶提供了广阔的前景。

3)、本发明制备方法简单，采用常规的有机提纯步骤即可，有利于降低制备成本。

附图说明

图1为本发明茶山奈苷B(camellikaempferosideB)的化学结构式。

图2A、2B为本发明茶山奈苷B抑制Aβ产生的试验图。

图3A～3C为茶山奈苷B抑制Aβ聚集成纤维的对照试验图。

图4A～4D为茶山奈苷B促进异常Aβ寡聚体形成的对比试验图。

图5A～5C为茶山奈苷B抑制Aβ引起的HT22海马神经元细胞死亡的对比试验图。

图6A、6B为茶山奈苷B抑制Aβ引起原代小胶质细胞激活及炎症介质产生的对照试验图。

图7为茶山奈苷B抑制Aβ引起小胶质细胞氧化应激的对照试验图。

注：附图中的YCF-2为茶山奈苷B。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。

本发明中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

本发明中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

一、茶山奈苷B(camellikaempferosideB)

二、茶山奈苷B(camellikaempferosideB)的制备

(1)取3.6公斤茯砖茶，并将茯砖茶粉碎；

(2)每次用6升70wt％的丙酮水溶液浸提粉碎后的茯砖茶，每次浸泡72小时，共浸提3次。将所得丙酮水提取液浓缩至膏状，得浸膏800克；

(3)将上述所得浸膏悬浮于2L水中得到水混悬液，该水混悬液先用2L的石油醚依次萃取3次后得到的第一次剩余水混悬液即为萃取过石油醚的水混悬液，经减压浓缩得到石油醚部分浸膏50克；

将萃取过石油醚的水混悬液再用2L的氯仿依次萃取3次后得到的第二次剩余水混悬液即为萃取过氯仿的水混悬液，经减压浓缩得到氯仿部分浸膏460克；

将萃取过氯仿的水混悬液再用2L的正丁醇依次萃取3次，取正丁醇萃取液待用；

将所述正丁醇萃取液减压浓缩至膏状500克，然后用500mL热水溶解，再通过SephadexLH-20凝胶柱层析，使用甲醇水体积比0:100到100:0梯度洗脱，收集其中甲醇水体积比20:80到40:60间的洗脱组分，然后使用MCI柱层析分离纯化，以甲醇-水体积比0:100到100:0作为梯度洗脱，分别收集相应体积比间的洗脱组分，将其中甲醇-水体积比70:30洗脱得到的组分经过聚酰胺柱层析以丙酮-水体积比1:2洗脱，每20mL收集一个馏分，将编号9-17馏分合并、蒸干，然后再经ODS反相硅胶柱层析即十八烷基键合硅胶柱层析，以甲醇-水体积比5:4洗脱，每20mL收集一个馏分，取其中第20～25馏分合并、蒸干，可得到茶山奈苷B(8.6毫克)。

产物茶山奈苷B的特性如下：

1)、可溶于甲醇和DMSO，黄色松散粉末，

2)、UV(logε)：211(2.65)，268(2.40)，314(2.53)；

3)、IR(KBr)ν_max(cm^-1)：3380，2918，2850，1697，1649，1604，1506，1358，1246，1174，1133，1062，981，834，670，599，577，482，439；

4)、HRESI-MS：m/z885.2424([M-H]^-，C₄₂H₄₅O₂₁ ^-的理论计算值为885.2459)；核磁共振光谱数据见表1。

表1：茶山奈苷B的核磁共振光谱数据(¹HNMR在400MHz，¹³CNMR在100MHz条件下测试，δ单位为ppm，耦合常数J单位为Hz，溶剂为氘代DMSO)。

位置	δH(J in Hz)	δC
			2	–	156.54
3	–	133.19
			4	–	177.07
5	–	161.19
			6	6.178d(2.0)	98.89
7	–	164.50
			8	6.387d(2.0)	93.87
9	–	156.36
			10	–	103.97
1′	–	123.51

2′,6′	8.023d(9.0)	130.68
			3′,5′	7.160d(9.0)	115.82
4′	–	157.91
			5-OH	12.517s
Glc
			1	5.530d(8.0)	98.62
2	4.830dd(8.2,9.4)	73.88
			3	3.481b	73.91
4	3.345c	70.60
			5	3.371c	75.75
6	3.701a,3.250d	66.99
			Rha1
1	4.350br s	100.84
			2	3.412b	70.34
3	3.488b	70.39
			4	3.142m	71.75
5	3.272d	68.30
			6	0.982d(6.2)	17.94
Rha2
			1	5.540br s	98.12
2	3.881m	70.19
			3	3.674a	70.31
4	3.318c	71.75
			5	3.423b	70.04
6	1.135d(6.2)	17.71
			p-Cou
C＝O	–	165.81
			α	6.396d(16.0)	114.35
β	7.603d(16.0)	144.98
			1″	–	125.12
2″,6″	7.541d(8.6)	130.25
			3″,5″	6.799d(8.6)	115.86
4″	–	159.86

a，b，c，d信号重叠

所有波谱数据均通过¹H-¹HCOSY，HSQC和HMBC等二维核磁共振谱归属，证明了所得化合物的结构。

三、茶山奈苷B(camellikaempferosideB)抗阿茨海默病体外活性试验

根据阿茨海默病的发病原理，治疗该病的方法应该是减少Aβ的产生、抑制Aβ的聚集和加快Aβ的清除等。本发明从茯砖茶中分离纯化，并鉴定出一个全新结构的黄酮氧苷类化合物茶山奈苷B，可同时抑制Aβ产生和Aβ聚集。

茶山奈苷B按上述制备方法分离纯化获得。具体实验中的茶山奈苷B纯度为大于或等于95％；茶山奈苷B用水或DMSO溶解后于-20℃保存。

本发明所有的试验数据都是通过至少3次独立试验获得，以平均数加减标准差作为实验数据。数据的统计分析应用One-WayANOVA软件进行，多组比较分析用Duncan’stest。

1、茶山奈苷B体外抑制Aβ40和Aβ42产生

应用Aβ40和Aβ42试剂盒(Invotrigen，USA)，测定不同浓度茶山奈苷B对稳定转染APP基因的人胚肾细胞(7PA2，由美国哈佛大学医学院馈赠)分泌Aβ40和Aβ42的蛋白水平影响。

1)7PA2细胞培养至细胞密度约90％时，用无血清DME培养基稀释茶山奈苷B至不同浓度(0，5，10和20μM)，添加至细胞中，继续培养24小时。

2)收集7PA2细胞培养上清，3000rpm离心除去细胞碎片。

3)Aβ40和Aβ42试剂盒中加入100μL各细胞培养液，37摄氏度作用1小时。

4)甩去未结合上的多余样品，用0.05％TBST洗涤3次，每次30秒。

5)向各孔中分别加入100μL特异性结合HPR标记的Aβ40和Aβ42单克隆抗体，37摄氏度作用1小时。

6)洗涤同步骤4)。

7)加入100μLTMB显色，100μL1M硫酸终止反应。

8)应用多功能酶标仪450nm处测定光吸收值。

结果显示，加入不同浓度梯度的茶山奈苷B至7PA2细胞培养基上清中，作用24小时后，与对照相比，Aβ42(图2A)和Aβ40(图2B)水平都明显降低。

2、茶山奈苷B体外抑制Aβ42纤维形成

1)Aβ42(Americanpeptidecompany，USA)用六氟异丙醇(HFIP)充分溶解至1mg/ml，分装挥发干后用DMSO溶解，再用PBS缓冲液稀释至所需浓度。将茶山奈苷B用DMSO溶解成母液浓度为50mM，按指定浓度加入到终浓度到20μM的Aβ42溶液中，并以不加茶山奈苷B的溶液作对照。将所有样品于37℃孵育，指定时间点取样检测。

2)取190μL、5μM的硫磺素(ThT)加至黑色酶标板中，各取10μL样品，充分混匀后，在450nm激发波长和482nm发射波长条件下测定ThT的荧光强度。结果如图3A所示，与单独的Aβ42样品相比，加入4倍和8倍浓度的茶山奈苷B的荧光强度显著低于单独Aβ42样品。由于ThT和纤维结合，纤维越多，荧光强度越强，所以这一结果表明，茶山奈苷B抑制Aβ42聚集成纤维。

3)在已经孵育3天富含纤维的Aβ42样品中，添加4倍和8倍浓度的茶山奈苷B，继续孵育不同时间点，用ThT方法观测茶山奈苷B对Aβ42纤维的稳定性影响。结果如图3B显示，与Aβ42对照样品相比，添加茶山奈苷B后，不同时间点时，茶山奈苷B都明显减少ThT荧光强度。这一结果表明，茶山奈苷B促进Aβ42纤维的降解。

4)将1)中样品用透射电镜进行Aβ形态观察。取各样品10μL，滴加到200目的铜网上作用20分钟，吸干样品，再滴加10μL、2.5％的戊二醛固定5分钟，吸干后再滴加10μL双氧铀染色30秒，吸干液体后晾干。在电压80KV，放大倍数40K的透射电镜下观察样品。结果如图3C所示，320μM茶山奈苷B的Aβ42不能聚集成纤维，只形成了一些寡聚体。

3、茶山奈苷B体外促进异常Aβ42寡聚体形成

1)用特异性结合Aβ42毒性寡聚体的W20和OC抗体检测不同浓度的茶山奈苷B对Aβ42寡聚体形成的影响，将孵育好的Aβ42和Aβ42+茶山奈苷B样品，2μL每样点到醋酸纤维素膜上。5％牛奶室温封闭1小时，分别加W20和OC抗体继续作用1小时，洗涤后再加各自的二抗，孵育洗涤后加显色曝光。结果如图4A和4B所示，茶山奈苷B明显抑制W20和OC识别的毒性寡聚体形成。

2)以上样品直接包被ELISA板，分别用W20和A11抗体检测，结果如图4C所示，茶山奈苷B明显抑制W20和A11识别的毒性寡聚体形成。

3)以上样品加上样缓冲液煮样后，用Tricine-PAGE蛋白跑胶，转膜、封闭后，用识别Aβ单体的抗体4G8检测Aβ有无茶山奈苷B条件下的体外聚集状态。结果如图4D所示，茶山奈苷B体外促进异常Aβ42寡聚体形成。

结合以上结果，可得知茶山奈苷B通过促进异常寡聚体形成从而抑制Aβ纤维形成。

4、茶山奈苷B抑制Aβ引起的HT22海马神经元细胞死亡

1)用含10％血清的DMEM培养的HT22海马神经元细胞，每孔接种2000个细胞于96孔培养板中，每孔100μL体积。细胞于37度培养24小时后，每孔添加不同浓度的茶山奈苷B培养基继续培养48～72小时。每孔加2.5mg/ml的MTT溶液20μL，37度继续作用4小时后，弃去上清，每孔加150μL的DMSO充分溶解，多功能酶标仪检测570/630nm双波长处的光吸收值。结果如图5A所示，与对照介质相比，不同浓度的茶山奈苷B对HT22细胞活性均没有影响，表明茶山奈苷B对神经没有毒副作用。

2)在以上培养的96孔HT22细胞中分别添加培养基(Blank)、介质(Control)、Aβ42寡聚体、Aβ42+茶山奈苷B寡聚体。后续处理同上，结果显示(图5B)，Aβ42寡聚体与对照相比，HT22细胞活性明显降低，而Aβ42与茶山奈苷B共孵育后对HT22细胞活性几乎没什么影响。进一步表明，茶山奈苷B促进Aβ42形成没有毒性的寡聚体。

3)在以上培养条件下的12孔板中，让HT22细胞爬片后，分别添加介质(Control)、Aβ42寡聚体、Aβ42+茶山奈苷B寡聚体，继续培养24小时后，用TUNEL染色方法检测HT22细胞程序性死亡情况。结果如图5C所示，Aβ42寡聚体明显促进细胞凋亡，而Aβ42+茶山奈苷B组和对照相比，几乎抑制细胞凋亡。以上这些结果表明，茶山奈苷B作用于Aβ，对Aβ引起的海马神经元细胞死亡具有明显保护作用。

5、茶山奈苷B抑制Aβ引起的原代小胶质细胞激活及炎症介质产生

1)原代培养大鼠皮层混合胶质细胞：取刚出生1天内的大鼠皮层组织，胰酶消化20分钟，每间隔5分钟颠倒混匀数次以充分消化后加DMEM培养基终止反应。2000rpm机械震荡90秒，1000rpm离心，上清过40目筛网，去处神经元细胞碎片。细胞悬液按2000个细胞每孔铺到多聚赖氨酸处理好的盖玻片上。继续培养6天，培养期间换液一次。7天后分别添加介质(Control)、Aβ42寡聚体、Aβ42+茶山奈苷B寡聚体，继续培养24小时。

2)弃去上清，细胞用免疫细胞化学方法检测茶山奈苷B对Aβ42引起的小胶质细胞和星形胶质细胞激活作用的影响。经过PBS润洗，4％多聚甲醛固定，穿透，10％羊血清封闭后，分别用兔源Iba-1和鼠源GFAP抗体识别小胶质细胞和星形胶质细胞，再用FITC标记的羊抗兔和TRITC标记的羊抗鼠作用后，DAPI复染细胞核。甘油封片后，荧光显微镜观察细胞形态变化。实验结果表明，在没有刺激条件下，胶质细胞有细长的分叉，细胞体积较小，而Aβ42刺激后Iba-1阳性的胶质细胞和GFAP阳性的星形胶质细胞均表现出明显激活的形态，包括细胞分叉缩短，细胞体积变大；而添加茶山奈苷B的Aβ42的小胶质细胞却与对照差不多，明显抑制细胞激活，而对GFAP阳性的星形胶质细胞没有明显改变(图6A)。这一结果表明，茶山奈苷B抑制Aβ42引起的小胶质细胞激活。

3)过度激活的小胶质细胞会释放大量炎症介质，这些炎症介质又会促进神经元细胞的死亡。在DMEM培养的BV-2小胶质细胞中，分别添加介质(Control)、Aβ42寡聚体、Aβ42+茶山奈苷B寡聚体，继续培养24小时。收集上清，分别用IL-6、TNF-α、IL-1β和NO试剂盒(欣博盛，北京)检测Aβ42引起的神经炎症介质的释放。结果表明，茶山奈苷B明显抑制Aβ42引起的IL-6、TNF-α、IL-1β和NO的产生(图6B)。

6、茶山奈苷B抑制Aβ引起的小胶质细胞的氧化应激

DMEM培养基重悬的BV-2小胶质细胞，按2000个细胞每孔铺到12孔板的盖玻片中，继续培养24小时后，在培养的中分别添加介质(Control)、Aβ42寡聚体、Aβ42+茶山奈苷B寡聚体，继续培养24小时。收细胞，用DCF荧光探针标记细胞，检测荧光显微镜观察小胶质细胞的氧化应激状态。结果如图7所示，茶山奈苷B明显减少DCF标记的荧光强度。这一结果表明，茶山奈苷B抑制Aβ引起的小胶质细胞的氧化应激。

综上所述，研究表明茶山奈苷B在体外可以明显降低Aβ的产生，且可以抑制Aβ的聚集、细胞毒性、炎症因子释放、氧化应激等，是一个极具阿茨海默病治疗潜力的纯天然小分子化合物。

基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (3)

1.一种名为茶山奈苷B的黄酮氧苷类化合物，其特征在于具有如下所示结构：

2.一种如权利要求1所述名为茶山奈苷B的黄酮氧苷类化合物的制备方法，其特征在于具体包括以下步骤：

1)、取茯砖茶，并将茯砖茶粉碎；

2)、将粉碎后的茯砖茶用70wt％的丙酮溶液浸泡72小时，或者将粉碎后的茯砖茶用70wt％的丙酮溶液浸泡后超声波振荡提取，并将提取液经过减压浓缩制得膏状提取物；

3)、将所述膏状提取物悬浮于水中得到水混悬液，再用石油醚、氯仿、正丁醇依次萃取，将最终得到的正丁醇萃取液减压浓缩至膏状；

4)、将所述膏状体用热水溶解得到溶解液，接着利用羟丙基凝胶柱层析即SephadexLH-20凝胶柱层析；将溶解液使用甲醇-水体积比0:100到100:0作为梯度洗脱，收集其中甲醇-水体积比20:80到40:60间的洗脱组分；将得到的洗脱组分使用MCI柱层析纯化，以甲醇-水体积比0:100到100:0作为梯度洗脱，分别收集相应体积比间的洗脱组分，将其中甲醇-水体积比70:30洗脱得到的组分再经过聚酰胺柱层析以丙酮-水体积比1:2洗脱，每20mL收集一个馏分，将其中的第9～17组馏分合并、蒸干，最后经过ODS反相硅胶柱层析即十八烷基键合硅胶柱层析，以甲醇-水体积比5:4洗脱，每20mL收集一个馏分，取其中第20～25馏分合并、蒸干，可得到茶山奈苷B。

3.一种如权利要求1所述名为茶山奈苷B的黄酮氧苷类化合物的应用，其特征在于：应用于制备抗阿尔茨海默病药物方面。