CN114621094B - 具有胰岛保护的化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供具有胰岛保护的化合物及其制备方法和应用，所述化合物的结构式如下所示：
Figure DDA0002833807100000011
本发明还提供上述化合物的制备方法，所述化合物具有胰岛保护功能，可应用于制备胰岛保护保健品、药品。

Description

具有胰岛保护的化合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及植物药物技术领域，特别涉及具有胰岛保护的化合物及其制备方法和应用。
背景技术
据统计，到2025年，全球2型糖尿病患者将达到3亿人，糖尿病是一种慢性疾病，它的死亡率不高，但是发生率却一直上升，其并发症降低了人们的生活质量。而对糖尿病的治疗，目前主要靠药物促进胰岛素分泌来维持正常血糖，对胰岛细胞的保护方面还少有研究。研究表明，胰岛素抵抗之后，会导致高血糖，进而发展成为2型糖尿病，由于胰岛β细胞的功能障碍，导致了胰岛素抵抗。胰岛通常通过增加胰岛素分泌来维持正常血糖，增加胰岛素分泌主要从提高胰岛β细胞的数量和增强胰岛β细胞的功能着手。人体内普遍存在的游离脂肪棕榈酸可通过降低MIN-6细胞中的某种蛋白表达，从而使得细胞的增值减弱。而保护胰岛细胞，也可以从促进PA氧化着手，从而减少PA对β细胞的应激。MTT可用于细胞增值和活性的测定，其值可表示细胞数量的多少。
黎族是我国55个少数民族之一，聚集在祖国宝岛-海南。由于特殊的地理位置和生态环境，以及三千余年与疾病斗争的历史，形成了独具特色的黎医药文化。黎药是黎族人民使用的传统药物，以植物药为主，是祖国医药宝库中的一朵奇葩。黎药冰糖草(Scopariadulcis L.)为玄参科(Scrophulariaceae)野甘草属(Scoparia)植物，又名野甘草、土甘草，被海南黎族人民俗称为“术返龙”。因其枝叶嚼之有甜味，而得名“冰糖草”。黎药冰糖草味甘、性凉，具有清热利湿、消炎止疼的功效。海南为冰糖草的道地产区，其在海南各地均有分布，资源非常丰富。冰糖草原为黎族老医生所献的验方，现为黎族当地医院制剂，以全草入药，用于糖尿病、肺热咳嗽、肠炎等疾病的治疗，特别是抗糖尿病效果显著。冰糖草抗糖尿病的功效已被现代药理学研究所证实，如冰糖草水提物可通过增强抗氧化酶活性、促进胰岛素分泌发挥功效，而且其水提物不仅可降低动物血糖还能改善血脂水平。研究显示冰糖草通过改善胰岛功能发挥抗糖尿病的功效，其主要靶器官为胰岛。这是由于冰糖草含有可通过作用于胰岛起效的物质。
发明内容
鉴于此，本发明提出具有胰岛保护的化合物及其制备方法和应用。
本发明的技术方案是这样实现的：
具有胰岛保护的化合物1，其结构式如式(1)所示：
Figure BDA0002833807080000021
具有胰岛保护的化合物2，其结构式如式(2)所示：
Figure BDA0002833807080000022
本发明具有胰岛保护的化合物的制备方法，包括以下步骤：
S1、取冰糖草全株，干燥，使用乙醇水溶液回流提取，过滤得到冰糖草总提取液，减压浓缩至无醇味，得总提取液；取总提取液，加入水溶解后，加入石油醚萃取，去掉上层有机相，水层用二氯甲烷萃取后，回收下层有机相，减压加热浓缩后，得冰糖草二氯甲烷萃取浸膏；
S2、取冰糖草二氯甲烷萃取浸膏，经硅胶柱层析，使用不同比例的石油醚-丙酮为洗脱溶剂进行梯度洗脱，得到6个组分为Fr.A～Fr.F，即Fr.A、Fr.B、Fr.C、Fr.D、Fr.E、Fr.F；
再取组分Fr.C，经硅胶柱层析，使用不同比例的石油醚-二氯甲烷-丙酮为洗脱溶剂进行梯度洗脱，得到6个组分为Fr.Ca～Fr.Cf，即Fr.Ca、Fr.Cb、Fr.Cc、Fr.Cd、Fr.Ce、Fr.Cf；
再取组分Fr.Cd～Fr.Ce，通过Sephadex LH-20柱色谱分离，再采用高效液相色谱进行纯化，得到目标化合物，即得到化合物1和化合物2。
进一步的，步骤S2中，所述石油醚-丙酮的体积比依次为19：1，9：1，6：1，4：1，2：1，1：1。
进一步的，步骤S2中，所述石油醚-二氯甲烷-丙酮的体积比依次为50：1：1，30：1：1，20：1：1，15：1：1，10：1：1，5：1：1。
进一步的，步骤S2中，所示柱色谱分离的洗脱剂为甲醇。
进一步的，步骤S2中，所述高效液相色谱的洗脱剂为体积比60：40的甲醇和水。
进一步的，步骤S2中，所述高效液相色谱的流速为2mL/min。
本发明所述的化合物在胰岛细胞保护方面的应用。
本发明所述的化合物在制备胰岛保护保健品、药品方面的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供两个新的化合物，有效提高小鼠胰岛MIN-6细胞活力，具有明显的胰岛保护功效；本发明还提供目标化合物的制备方法，从天然植物冰糖草中提取，应用制备胰岛保护药物安全性更高；可更好地应用于制备胰岛保护保健品、药品。
附图说明
图1为本发明化合物1的氢谱图；
图2为本发明化合物1的碳谱图；
图3为本发明化合物2的氢谱图；
图4为本发明化合物2的碳谱图；
图5为本发明化合物1的化学结构式；
图6为本发明化合物1的1H-1HCOSY(粗线)HMBC(箭头)相关图；
图7为本发明化合物2的化学结构式；
图8为本发明化合物2的1H-1HCOSY(粗线)HMBC(箭头)相关图；
图9为实验各组HE染色图。其中，A对照组；B模型组；C二甲双组；D化合物2组。
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1目标化合物的制备
S1、两个二萜化合物的提取分离
冰糖草全株(10.0kg)阴干后，切小，将其置于多功能提取罐，用85％的乙醇水溶液室温下浸泡24h后回流提取3次，每次2小时，减压加热浓缩提取液至无醇味，合并提取液。取合并后总的提取液，加入水混悬后，用石油醚萃取4次得到脂溶性成分(90g)，继而母液用二氯甲烷萃取，回收下层有机相，减压加热浓缩后得冰糖草二氯甲烷萃取浸膏(180g)。
S2、对二氯甲烷萃取部位进行粗分
(1)溶解：称取180g二氯甲烷萃取浸膏于烧杯中，用二氯甲烷(约500mL)溶解。
(2)拌样：称取空白硅胶200g于烧杯中，与溶解好的样品充分混匀，将样品与硅胶的混合物捣碎至粉末状，阴干，备用。
(3)湿法装柱：称取空白硅胶1000g于烧杯中，加入石油醚(3000mL)不断搅拌均匀，硅胶经石油醚搅拌均匀后，边搅拌边倒入高为120cm，直径为8cm的柱内，用石油醚冲实柱子，保证硅胶柱子液面平整，无气泡。
(4)湿法上样：样品硅胶加入石油醚(约1000mL)不断搅拌均匀，样品硅胶经石油醚搅拌均匀后，边搅拌边倒入柱子内，保证液面平整，无气泡，样品硅胶的上面加入脱脂棉。
(5)洗脱：洗脱溶剂采用石油醚-丙酮系统(V石油醚/V丙酮＝19：1，9：1，6：1，4：1，2：1，1：1)进行梯度洗脱，每500mL回收一次洗脱溶剂，经旋转蒸发仪减压加热浓缩，回收样品。
(6)合并样品：样品点样于薄层色谱(TLC)GF254板、紫外暗箱仪检查、10％硫酸乙醇显色后合并相同组分，一共得到6个组分为Fr.A～Fr.F。
Fr.C(20g)部分经硅胶柱层析，石油醚-二氯甲烷-丙酮系统(V石油醚/V二氯甲烷/V丙酮＝50：1：1，30：1：1，20：1：1，15：1：1，10：1：1，5：1：1)进行梯度洗脱，一共得到6个组分即Fr.Ca～Fr.Cf。
组分Fr.Cd～Fr.Ce进一步通过Sephadex LH-20(MeOH)柱色谱分离，然后通过半制备型HPLC以甲醇-水(60：40，v/v，流速2.0mL/min)洗脱，得到化合物1(50mg)和2(15mg)。
实施例2化合物1-2的结构鉴定
(1)如图1-2所示，化合物1的1H-NMR(600MHz，CDCl3)中显示结构中存在3个甲基1.12(3H，s)，1.37(3H，s)，1.63(3H，s)，1个苯基酰基7.98(2H，d，J＝8.4Hz)，7.61(1H，t，J＝8.4Hz)，7.48(2H，d，J＝8.4Hz)，2个连氧碳氢5.30(1H，brs)，3.67(1H，brs)和多个亚甲基、次甲基。13C-NMR(150MHz，CDCl3)中给出27个碳信号，包括1个羰基信号(216.3)，1个羧基碳(184.3)，1个苯甲酰基(167.6，133.8，129.8，129.4，128.8)，2个连氧碳(77.7，70.9)，7个亚甲基(18.1，25.1，33.5，34.3，36.8，38.4，46.6)，2个次甲基(40.0，40.7)，4个季碳(38.4，47.9，52.3，52.9)，3个甲基(21.2，19.9，19.5)。根据氢谱和碳谱信息，可以得出化合物1为Scopadulane型二萜且其结构与Scopadulcic acid B相似，如图5所示。
通过仔细分析化合物1的1H-1HCOSY、HMBC谱，确定其比Scopadulcic acid B在7位多了1个羟基取代。HMBC谱中，H-6与70.9(C-7存在相关)以及1H-1HCOSY谱中H-6与H-7存在相关，证实了7位羟基取代，如图6所示。根据Scopadulane型二萜立体构型的分析方法，结合ROESY中的相关，特别是H-7与H-6存在相关，证明它们均为α朝向，进而确定了化合物1的相对构型。经检索，化合物1为新化合物，因此，化合物1被命名为Scopadulcic acid D。
(2)如图3-4所示，化合物2的氢谱和碳谱与化合物1极为相似，结构中仅发生了一处变化。化合物1中的羰基在化合物2中消失，而化合物2中多出一个羟基，如图7所示。推测化合物2同样为Scopadulane型二萜，而且结构中的化合物1中的羰基转化为了羟基，核磁共振碳谱数据证实了这一推测。
通过进一步分析化合物2的1H-1HCOSY、HMBC相关，证实羰基被氧化为羟基，如图8所示。在ROESY谱中，由于甲基经检索化合物2为新化合物。因此，化合物2命名为Scopadulcicacid E。
实施例3化合物1-2的应用
(1)化合物2的体内抗胰岛凋亡作用
随机将SD大鼠分为正常组、模型组、二甲双胍组(100mg·Kg-1)、化合物2组(50mg·Kg-1)，每组8只；对照组给予普通颗粒饲料喂养，其余各组均给予高脂高糖饲料喂养造模，第8周第3天禁食不禁水12h，腹腔注射STZ溶液(30mg·Kg-1)，造模各组尾静脉空腹血糖(FBG)≥11.1mmol/L视为造模成功，共19只造模成功。将造模成功的大鼠分为模型组6只，二甲双胍组6只，化合物2组6只。二甲双胍组(100mg·Kg-1)、化合物2组(50mg·Kg-1)连续给药8周，正常组和模型组灌胃给予等量生理盐水。最后一次给药后，禁食12h，于次日清晨乙醚麻醉，采集麻醉后大鼠腹主动脉血，离心，留取上清液，-20℃冰箱冻存。用生化分析仪检测血糖浓度，ELISA法检测胰岛素水平。
结果显示化合物2可显著降低动物血糖水平，增加胰岛素分泌，改善胰岛功能。HE染色结果显示，正常大鼠胰岛细胞完整，细胞间界限清楚；模型组大鼠胰岛萎缩，胰岛与周围界限不明显、坏死凋亡情况严重，形态不完整；二甲双胍(100mg·Kg-1)以及化合物2(200mg·Kg-1)组胰岛形态较完整，细胞间界限较清晰，尽管存在空泡等情况，但细胞凋亡较少，如图9所示。
(2)两个化合物抗胰岛细胞凋亡的功效
细胞培养及传代
将冻存于-80℃冰箱的MIN-6细胞取出置37℃水浴中使细胞融化后，1000转/分钟离心5分钟，移液管吸走离心管上层冻存液，将1640培养基(含10％FBS、1％双抗)加入离心管重悬细胞，转移至合适的培养瓶，相对湿度为95％，37℃，5％CO2的培养箱中培养，视细胞生长状况，每2-3天换一次细胞培养液，显微镜下观察细胞，待细胞密度为80％～90％时，把原细胞培养液换掉，用移液管吸取适量PBS液轻轻吹打细胞表面，吸走培养瓶中的PBS，加入0.25％胰酶(EDTA)消化细胞2分钟后用移液管吸掉胰酶，显微镜下观察，待MIN-6细胞形态变圆后，加入1640培养基终止消化，用电动移液枪轻轻将细胞吹散成单个细胞，按照密度为2×105个/mL，将吹散后的细胞接种于96孔板，每个孔加入100μL培养液，其中边缘一周的36孔不接种细胞而是用FBS液封，相对湿度为95％，温度为37℃，5％CO2置于培养箱中培养，当细胞密度达到80％～90％时开始实验。
PA对MIN-6细胞给药浓度的确定
将生长状态良好的MIN-6细胞，均匀接种到96孔板中，按5×105个/mL加入完全培养基100μL，96孔板置于培养箱中培养24h后，弃去原培养基，加入0.5％FBS的1640培养基，继续培养12h，将细胞进行分组为不同浓度PA(0，15.6125，31.25，62.5，125，250，500μg/mL)组。去掉原来的培养液，加入不同PA浓度各组培养基，继续培养24h后，根据碧云天生物技术有限公司的MTT试剂盒说明书测细胞活性，每一个实验组反复测6次，求平均值，以对照组均值为对照，实验独立重复3次。
实验分组及细胞活力测定
将生长状态良好的MIN-6细胞，均匀接种到96孔板中，按5×105个/mL加入完全培养基100μL，96孔板置于培养箱中培养24h后，弃去原培养基，加上0.5％FBS的1640培养基，继续培养12h，将各孔细胞分为以下几组：空白对照组(CK)、模型组(PA300μmol/L)，实验组1(化合物1-25μM+PA 300μmol/L)、实验组2(化合物1-50μM+PA300μmol/L)，弃去原培养基，各组中加入1640培养基，每孔各100μL，分别培养至24h，MTT法测细胞活力，每个实验组重复测6次取平均值，以体对照组均值为对照，实验独立重复3次。
MTT法测细胞活性具步骤如下：MIN-6细胞经以上条件干预处理后，去掉原培养液，每孔加50μL 1×MTT，在37℃孵育4小时，4小时后，吸出上清液，每孔加150μL DMSO，平板摇床上摇匀5分钟，摇匀后用酶标仪在490nm波长处检测每孔的吸光度。
细胞的活力＝(加药细胞OD/对照细胞OD)*100采用软件GraphPadPrism 8.0.2对数据进行统计学分析，以均值±标准差表示结果，采用单因素方差分析多组均数比较。
PA的干预对小鼠胰岛MIN-6细胞活力的影响
300μmol/L的PA处理后，MIN-6细胞增殖活力与正常对照组相比明显下降(P<0.001)，具有统计学意义，浓度为25μmol/L的化合物1、2分别加300μmol/L PA作用于MIN-6细胞24h后，与PA对照组相比，其MIN-6细胞的细胞活力有提高(P<0.01)，具有统计学意义。
表冰糖草中二萜类化合物对MIN-6细胞活力的影响(
Figure BDA0002833807080000081
n＝5)
Figure BDA0002833807080000091
注：与对照组比较**P<0.01
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.具有胰岛保护的化合物，其特征在于，其结构式如式（1）所示：
Figure 206600DEST_PATH_IMAGE001
（1）。
2.具有胰岛保护的化合物，其特征在于，其结构式如式（2）所示：
Figure 958656DEST_PATH_IMAGE002
（2）。
3.权利要求1或2所述的具有胰岛保护的化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、取冰糖草全株，干燥，使用乙醇水溶液回流提取，过滤得到冰糖草总提取液，减压浓缩至无醇味，得总提取液；取总提取液，加入水溶解后，加入石油醚萃取，去掉上层有机相，水层用二氯甲烷萃取后，回收下层有机相，减压加热浓缩后，得冰糖草二氯甲烷萃取浸膏；
S2、取冰糖草二氯甲烷萃取浸膏，经硅胶柱层析，使用不同比例的石油醚-丙酮为洗脱溶剂进行梯度洗脱，所述石油醚-丙酮的体积比依次为19：1，9：1，6：1，4：1，2：1，1：1，
得到6个组分为Fr.A、Fr.B、Fr.C、Fr.D、Fr.E、Fr.F；再取组分Fr.C，经硅胶柱层析，使用不同比例的石油醚-二氯甲烷-丙酮为洗脱溶剂进行梯度洗脱，所述石油醚-二氯甲烷-丙酮的体积比依次为50：1：1，30：1：1，20：1：1，15：1：1，10：1：1，5：1：1，得到6个组分为Fr.Ca、Fr.Cb、Fr.Cc、Fr.Cd、Fr.Ce、Fr.Cf；再取组分Fr.Cd~Fr.Ce，通过Sephadex LH-20柱色谱分离，再采用高效液相色谱进行纯化，得到目标化合物。
4.权利要求3所述的具有胰岛保护的化合物的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所示柱色谱分离的洗脱剂为甲醇。
5.权利要求3所述的具有胰岛保护的化合物的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述高效液相色谱的洗脱剂为体积比60：40的甲醇和水。
6.权利要求3所述的具有胰岛保护的化合物的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述高效液相色谱的流速为2mL/min。
7.权利要求1或2所述的化合物在胰岛细胞保护方面的应用。
8.权利要求1或2所述的化合物在制备胰岛保护保健品、药品方面的应用。
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