CN102491965B

CN102491965B - 制备染料木素的方法

Info

Publication number: CN102491965B
Application number: CN 201110365357
Authority: CN
Inventors: 徐学民; 袁崇均; 陈帅; 罗森; 王笳; 杨红; 吴燕
Original assignee: Sichuan Academy of Chinese Medicine Sciences SACMS
Current assignee: Sichuan Academy of Chinese Medicine Sciences SACMS
Priority date: 2011-11-17
Filing date: 2011-11-17
Publication date: 2013-09-25
Anticipated expiration: 2031-11-17
Also published as: CN102491965A

Abstract

本发明涉及制备染料木素的方法，属于化学药品技术领域。本发明所要解决的技术问题是提供一种制备染料木素的方法，该方法提高了染料木素的收率。本发明制备染料木素的方法包括如下步骤：取槐角总黄酮、醇溶液和盐酸，混匀，使混匀后的溶液中的槐角总黄酮浓度为8～14wt％，醇浓度为32～48wt％，盐酸浓度7～7.5wt％，加热回流2～5h，然后中和至pH值为5.8～6.2，静置15～30h，析出棕黄色沉淀，过滤，洗涤，干燥，得到染料木素粗品；其中，所述的醇溶液为甲醇溶液、乙醇溶液中至少一种。

Description

制备染料木素的方法

技术领域

本发明涉及制备染料木素的方法，属于化学药品技术领域。

背景技术

染料木素又称金雀异黄素，分子式：C₁₅H₁₀O₅，分子量270.23；

其结构式如(I)所示：

染料木素为淡黄色结晶性粉末，属于异黄酮类，熔点297～298℃，溶于常用的有机溶剂，几乎不溶于水，溶于稀碱溶液中呈黄色。UVλ_max：263nm(MeOH)；IR(KBr)3411(OH)，822、811、1615、1570、1520、1503(苯环)，1652(羰基)；¹H NMR(DMSO)δ：12.97(1H，s，C₅-OH)，10.92(1H，s，C₇-OH)，9.62(1H，s，C_4′-OH)，8.33(1H，s，C₂-H)，7.38(2H，d，J＝8.5Hz，C_2′-H，C_6′-H)，6.83(2H，d，J＝8.5Hz，C_3′-H，C_5′-H)，6.39(1H，d，J＝2.0Hz，C₈-H)，6.21(1H，d，J＝2.0Hz，C₆-H)。

染料木素的药学作用有：

①防止骨质疏松症：染料木素增加骨密度，能够与雌激素受体结合，发挥微弱的雌激素效应，具有使骨密度增加、胫骨长度增加、骨细胞形成超过消溶、防止骨质流失等药理作用。

②抗肿瘤：染料木素对人体鼻咽癌(KB)细胞有细胞毒活性，ED₅₀为7.4μg/ml。可以增加吉西他滨的抗胰腺癌肿瘤活性。

③降血脂：染料木素有降低血清中胆固醇和三甘油酸酯的作用，还具有抗脂质过氧化的作用，可提高LDL受体活性，抑制脂合成，促进脂分解。

④雌激素作用和抗雌激素作用：小鼠实验表明，子宫增重25mg需要染料木素8mg，与雌酮比较，作用强度很小，其相对强度仅为1∶6900。低浓度的染料木素可与雌激素竞争雌激素受体，从而干扰雌激素功能。

⑤抗氧化：染料木素具有多羟基酚的结构，有一定的抗氧化活性，体内外实验显示它可以消除多种活性氧，还能提高体内抗氧化酶活性，有SOD样作用。

⑥体外抗肝纤维化：染料木素能显著抑制或阻断纤维化细胞因子PDGF及TGF-β₁对肝星状细胞的作用，具有体外抗肝纤维化作用。

目前，国内外已批准多种主含染料木素的异黄酮产品作为食品用于人群。美国国家肿瘤研究中心于1996年已将染料木素列入肿瘤化学预防药物临床发展计划，主要目标使乳腺癌和前列腺癌。1998年美国SFDA同时批准两种主含染料木素(150mg/粒)胶囊的食品用于人群。另外还可用于女性养颜保健和预防血液疾病。

目前，染料木素主要从大豆、三叶草、葛根、槐花、槐角、染料木(金雀花)和广豆根等植物中提取得到。由于槐角中的染料木素相对含量较高，因此，近年来，研究人员较为重视从槐角中提取染料木素的工艺研究。如：申请号为02123450.7，发明名称为“染料木素的制备工艺及其药物组合物与应用”的中国专利申请公开了一种从植物中提取纯化槐属苷，将纯化的槐属苷进行酸水解，并纯化得到染料木素，其结晶产品平均收率为0.636％，染料木素纯度为98％。又如：申请号为02123457.4，发明名称为“染料木素的提取方法”的中国专利申请公开了一种从槐角中提取染料木素的方法，其制备的粗品收率为原料的2.1％，结晶成品收率为原料的1.0％，纯度为99％。再如：申请号为200910167978.6，发明名称为“染料木素的提取方法”的中国专利申请公开了一种采用超声波从槐角中提取染料木素的方法，其结晶染料木素的收率为原料的1.57％。从上述专利申请可以看出，随着时间的发展，科技的进步，染料木素的收率有较大提高，但是最高收率仅达到1.57％。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种制备染料木素的方法，该方法提高了染料木素的收率。

本发明制备染料木素的方法包括如下步骤：取槐角总黄酮、醇溶液和盐酸，混匀，使混匀后的溶液中的槐角总黄酮浓度为8～14wt％，醇浓度为32～48wt％，盐酸浓度7～7.5wt％，加热回流2～5h，然后中和至pH值为5.8～6.2，静置至基本无棕黄色沉淀析出，过滤，洗涤，干燥，得到染料木素粗品；其中，所述的醇溶液为甲醇溶液、乙醇溶液中至少一种。

通过多次试验研究，本发明的发明人发现，水解时，混匀后的溶液中的槐角总黄酮浓度为10wt％，醇浓度为40wt％，盐酸浓度7.3wt％，加热回流后，中和至pH值为6.0，染料木素的收率最高。因此，综合考虑各种因素，本发明方法优选为：混匀后的溶液中的槐角总黄酮浓度为9～11wt％，醇浓度为38～42wt％，盐酸浓度7.1～7.4wt％。本发明方法最优选为：混匀后的溶液中的槐角总黄酮浓度为10wt％，醇浓度为40wt％，盐酸浓度7.3wt％，加热回流后，中和至pH值为6.0。

其中，考虑到甲醇的毒性，上述的醇溶液优选为乙醇溶液。

其中，本发明方法所制备的染料木素粗品还可以经过重结晶，得到精制染料木素。染料木素粗品的重结晶方法可以采用常规方法，为了提高产品收率，优选采用如下方法：取染料木素粗品，加入染料木素粗品1.5～2.5倍重量的浓度≥95wt％的乙醇溶液，混匀，溶解，然后倾入染料木素粗品1.5～2.5倍重量的沸水中，趁热过滤，静置15～30h，过滤，所得晶体重复上述步骤再次重结晶，干燥，得到精制染料木素。

其中，本发明方法水解所用的槐角总黄酮可以采用市售产品，也可以自行制备，优选采用如下方法制备槐角总黄酮：取槐角，粉碎(一般粉碎过20目筛即可)，用10～14倍量(W/V，即药材的重量与乙醇溶液的体积对应，1g药材加入10～14ml的乙醇溶液)的浓度为65～75wt％的乙醇或甲醇溶液提取(乙醇浓度过高，苷提取不完全；乙醇浓度过低，游离的染料木素提取不完全)，过滤，滤液浓缩，上大孔树脂柱，用水冲洗流出液近无色，然后用浓度为60～80wt％的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，浓缩，得到槐角总黄酮浸膏；其中，所述的大孔树脂柱为WLD、D101、HPD300或AB-8型树脂。

其中，考虑到甲醇的毒性，优选为乙醇溶液进行提取。提取方法可以采用常规的方法提取，如直接加热浸提、回流提取等。优选加热回流提取。为了提高槐角总黄酮的收率，优选用12倍量的浓度为70wt％的乙醇溶液加热回流提取槐角2～4次。

其中，WLD、D101、HPD300或AB-8型树脂对槐角总黄酮的吸附效果均较好，尤其以D101型树脂对槐角总黄酮的吸附效果为最佳。

其中，上样时，吸附流速为1.0～2.5BV/h时，吸附效果较佳，吸附流速为2.0BV/h时，吸附效果最佳。

其中，洗脱时，采用浓度为65～75wt％的乙醇溶液洗脱效果较好。

综上，本发明在制备槐角总黄酮时，优选如下工艺条件：滤液浓缩至浓度为4～6g/L，然后上D101型大孔树脂柱，上样时，吸附流速为1.0～2.5BV/h，洗脱时，用1.8～2.5倍柱体积的浓度为65～75wt％的乙醇溶液洗脱。最优选如下工艺条件：滤液浓缩至浓度为5g/L，然后上D101型大孔树脂柱，上样时，吸附流速为2.0BV/h，洗脱时，用2倍柱体积的浓度为70wt％的乙醇溶液洗脱。

本发明方法提高了染料木素的收率，染料木素粗品收率能够达到药材重量的6％以上，重结晶后，染料木素的纯度可以达到99％以上，精制后的染料木素收率可以达到药材重量的2.4％以上，相比现有工艺，染料木素的收率明显提高，本发明为染料木素的制备提供了一种新的方法，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为大孔树脂吸附槐角总黄酮梯度洗脱曲线图。

具体实施方式

本发明制备染料木素的方法包括如下步骤：取槐角总黄酮、醇溶液和盐酸，混匀，使混匀后的溶液中的槐角总黄酮浓度为8～14wt％，醇浓度为32～48wt％，盐酸浓度7～7.5wt％，加热回流2～5h，然后中和至pH值为5.8～6.2，静置至基本无棕黄色沉淀析出(一般情况下，静置≥15h即可使大部分沉淀析出，综合考虑生产效率和收率，一般情况下，静置15～30h即可，优选静置24h)，过滤，洗涤，干燥，得到染料木素粗品；其中，所述的醇溶液为甲醇溶液、乙醇溶液中至少一种。

其中，考虑到甲醇的毒性，上述的醇溶液优选为乙醇溶液。

下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步的描述，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。

试验例1槐角总黄酮制备工艺的研究

1.1上柱液的制备干燥的槐角药材粉碎过20目筛，用12倍量70％乙醇加热回流提取3次，提取液减压回收乙醇至无醇味，加适量纯化水，得槐角样品液。

1.2大孔吸附树脂的预处理树脂用95％乙醇浸泡24小时充分溶胀后，用95％乙醇淋洗至流出液与水混匀(1∶5)不呈白色浑浊为止，依次用纯化水、2％NaOH溶液、纯化水、5％HCl溶液浸泡冲洗，最后用纯化水洗至中性，备用。

1.3树脂的筛选由于树脂极性不同，对槐角总黄酮吸附作用强弱不同，解吸难易也不同。选择合适的树脂不仅需要吸附量大，还要求解吸率高，以保证有效成分最大限度回收。通过7种树脂对槐角总黄酮的静态吸附量和解吸率的考察选择合适的树脂。按下式计算树脂的吸附量和解吸率；吸附量Q＝(C₀-C₁)V₁/W。其中Q为吸附量(mg.g^-1)，C₀为初始浓度(g.L^-1)，V₁为药液体积(mL)，W为树脂重量(g)；解吸率D＝C₂V₂/(C₀-C₁)V₁×100％，其中D为解吸率(％)，C₂为解吸液浓度(g.L^-1)，V₂为解吸液体积(mL)。

1.3.1静态吸附准确称取经预处理的湿树脂(吸干表面水分)各2.0g于具塞瓶中，精密加入已和浓度的样品溶液20mL置电动振荡器上振荡24h，充分吸附后，滤取，取一定量滤液按分光光度法测定吸收度，代入标准曲线计算溶液中总黄酮浓度。各种树脂对槐角总黄酮的吸附量见表1

表17种树脂对槐角总黄酮的吸附量比较(20℃)

树脂类型	槐角总黄酮的吸附量(mg.g^-1)
		WLD	60.75
D101	67.78
		HPD100	50.3
HPD300	59.1
		HPD500	55.59
AB-8	58.21
		S-8	75.06

1.3.2静态解吸取已饱和吸附的各种树脂分别置于具塞瓶中，加入50mL70％乙醇溶液进行振荡12h，使树脂充分解吸。滤取一定量滤液按分光光度法测定吸收度，代入标准曲线计算滤液中总黄酮浓度，并根据吸附量计算解吸率(％)，结果见表2

表2槐角总黄酮的解吸率(％)

树脂类型	解吸率(％)
		WLD	95.47
D101	97.58
		HPD100	85.3
HPD300	94.7
		HPD500	90.66
AB-8	96.28
		S-8	81.46

从表1可以看出：WLD、D101、HPD300、AB-8、S-8树脂对槐角总黄酮吸附量大；从表2可以看出：WLD、D101、HPD300、HPD500、AB-8五种树脂在80％乙醇条件下能将约90％以上的吸附于树脂上的槐角总黄酮解吸下来，解吸比较完全。因此，WLD、D101、HPD300、AB-8这四种树脂的吸附、解析效果较好，以D101树脂最佳。

1.4D101树脂纯化分离槐角总黄酮的工艺参数研究

1.4.1上样浓度的确定取处理好的D101树脂各100g分别装于4.0cm×50cm的玻璃柱内，分别加不同浓度的槐角样品液于柱顶，以1mL·min^-1的流速进行动态吸附，收集流出液，于260nm处测定吸收度。当流出液浓度达到上样浓度的10％时，停止上样，记录上柱体积，换算成相当于原生药的上样量，结果见表3，可知槐角样品液上样质量浓度以5.0g·L^-1为最佳。

表3上样浓度对吸附的影响

上样浓度/g.L^-1	上柱体积/mL	相当于原生药的上样量/g
			7.0	1100	69
6.0	1300	74
			5.0	1600	80
4.0	2000	77
			3.0	2500	73

1.4.2吸附流速的确定将质量浓度为5.0g.L^-1的槐角样品液通过D101树脂柱，分别以0.5，1.0，1.5，2.0，2.5BV·h^-1的流速进行动态吸附，收集洗脱液，于260nm处测定吸收度。当流出液质量浓度达到上样浓度的10％时，停止上样，记录上柱体积，换算成相当于原生药的上样量，结果见表4，可知当吸附流速为2.0BV·h^-1时，吸附效果最好。

表4吸附流速对吸附的影响

吸附流速/BV·h^-1

体积/mL

相当于原生药的上样量/g

1.0	1300	78
			1.5	1400	77
2.0	1500	78
			2.5	1600	74
3.0	1700	70

1.4.3乙醇洗脱浓度的确定按上述所确定的吸附条件，取槐角样品液通过D101树脂柱进行动态吸附。先用纯化水洗脱，再分别用10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％乙醇洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，减压干燥，称重，于260nm处测定干膏总黄酮含量，大孔树脂吸附槐角总黄酮梯度洗脱曲线如图1所示。由图1可知，当用60～80％浓度的乙醇洗脱时，大部分异黄酮被洗脱，洗脱效率较高。

1.5大孔树脂工艺重复验证实验称取干燥的槐角药材500g粉碎过20目筛，用12倍量70％乙醇加热回流提取3次，提取液减压浓缩至无醇味，加药材量的20倍水(10L)搅拌溶解，过滤。滤液上已处理好的D101树脂柱(8cm×50cm，树脂用量1kg，药材∶树脂为1∶2)，控制流速为2BV·h^-1，水洗至洗脱液近无色(糖反应为阴性)，再用2倍柱体积的70％乙醇洗脱，收集洗脱液，60℃减压干燥，得棕黄色疏松粉末，称重，于260nm处测总黄酮含量。结果槐角总黄酮得量为39.5g(收率7.9％)，总黄酮含量为67.3％。本工艺使提取液的得膏量从精制前得35％降低到7.9％，槐角总黄酮含量从18％上升为67％，精制度达到3倍多，同时槐角总黄酮得保留率为93％左右。

试验例2槐角总黄酮水解工艺研究

1.1槐角总黄酮的组成

槐角总黄酮(本发明方法所制备)主要成分为染料木素、染料木苷、槐角双苷、槐角苷，他们的苷元均为染料木素，经测定槐角苷含量达15％以上，总黄酮达60％以上。

1.2槐角总黄酮水解条件选择

1.2.1水解方式的选择

水解方式有酸水解、碱水解以及加压水解等。由于异黄酮类化合物含有多个酚羟基，在碱性条件下不稳定，易造成氧化，故不考虑碱水解。加压水解可缩短反应时间，但要一定的条件，如高压釜，也具有一定的危险性，加之槐角苷酸水解很容易，故不考虑加压水解。

结论：水解方式选择酸水解。

1.2.2酸水解种类的选择

酸种类计有盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、醋酸等，各种文献及资料均表明可不考虑后面三种酸。硫酸作为酸水解，其不挥发性是优点，如不会污染各种金属管道，但其有腐蚀性，与异黄酮类化合物可形成佯盐，乃至磺化、酯化，故不考虑硫酸。

结论：酸种类选择为盐酸。

1.2.3盐酸浓度的选择

在水解液中，盐酸浓度在一定范围内越高，水解时间就越短，盐酸浓度越低，水解时间就会延长。盐酸浓度的选择可用如此实验来进行。

称取槐角总黄酮三份各10g，分别加80ml 50％乙醇，再分别加浓盐酸10ml、20ml、30ml，照制法项下有关内容进行酸水解，用硅胶GF₂₅₄薄层跟踪水解反应，待薄层检查无槐角苷存在时，即可认为水解完全，记录水解反应完成时间。结果，水解反应完成时间分别为240分钟、140分钟、120分钟。

结论：盐酸浓度选择为7.3％为最佳。

1.2.4水解溶媒种类的选择

考虑到甲醇的毒性，不适合工业化大生产，故优选用乙醇。

结论：水解溶媒种类选择为乙醇较佳。

1.2.5乙醇浓度的选择

槐角总黄酮水解首先要溶解，故应选择70％乙醇作为水解溶媒，但乙醇对染料木素也有一定的溶解度，造成水解母液含染料木素而影响收率；而乙醇浓度过低，就可能延长水解反应时间。用以下试验来选择乙醇浓度。

取槐角总黄酮10g，各三份，分别加80ml 40％乙醇、50％乙醇、60％乙醇，再分别加浓盐酸20ml，照制法项下水解2.0小时，趁热过滤，放置过夜，析出深棕色沉淀。过滤，60℃减压干燥，称重。实验情况见表5。

表5水解反应乙醇浓度的选择结果

从表5可以看出，溶液中的乙醇浓度为40％时，槐角总黄酮水解产物得量最大。

1.2.6乙醇用量的选择(溶液中的乙醇浓度为40％)

槐角总黄酮水解，若溶媒用量太少，则相同时间内水解量就低，若溶媒用量太多，则由于槐角总黄酮水解产物在溶剂中有一定溶解度，故造成槐角总黄酮水解产物得率低。用以下试验来进行乙醇用量的选择。

称取槐角总黄酮三份各10g，分别加50％乙醇60ml、80ml、100ml，搅拌均匀，再分别加浓盐酸15ml、20ml、25ml，照制法项下水解2.0小时，趁热过滤，滤液静置过夜，析出深棕色沉淀，过滤，沉淀水洗至流出液近中性，沉淀60℃减压干燥，称重。具体试验结果见表6。

表650％乙醇用量的选择(料液比)

结论：料液比选择为1∶10，即溶液中的槐角总黄酮浓度为10wt％，水解效果最佳。

1.2.7水解温度的选择

一般情况下，温度越高，水解反应越快，温度越低，水解反就越慢，甚至停止。用以下试验进行水解温度的选择。

称取槐角总黄酮三份各10g，分别加80ml 50％乙醇、20ml浓盐酸，再分别于100℃(回流)，80℃、60℃反应2小时。结果，通过硅胶F₂₅₄薄层检查，前者已水解完全，并析出深棕色沉淀，而后两者，未完全水解，特别是后者，反应液仍然为棕黄色，证明反应相当缓慢。

备注：水解完全后，溶液的颜色为黑色，并呈透明状。

结论：水解温度为100℃，即加热回流的效果较好。

1.2.8水解反应时间的选择

反应时间短，水解不完全，反应时间长，则耗时耗能，成分也有可能破坏。但反应时间是变数，小量与大量实验时间差别很大，如实验室小试水解2小时已完全，而投料量1kg的中试水平，则反应时间为3～5小时。故反应时间应以水解反应完全为准，用硅胶F₂₅₄薄层层析跟踪反应是否完全。

结论：水解反应时间为2～5小时。

实施例1采用本发明方法制备染料木素

1、槐角总黄酮的提取分离

称取干燥的槐角药材100kg，粉碎过10目筛，用12倍量70％乙醇加热回流提取3次，提取液减压浓缩，得浸膏(比重1.2，50℃测定)。浸膏加药材量的20倍水搅拌溶解，过滤。滤液上已处理好的D₁₀₁大孔树脂柱(0.6m×2.5m，树脂用量200kg，药材树脂用量比为1∶2)，流速为300～600L·h^-1。然后用树脂量2倍的常水洗至流出液近无色(α-萘酚反应为阴性)，再用2倍柱体积的70％乙醇洗脱，收集洗脱液，60℃减压回收，得浸膏(比重1.3，50℃测定)。浸膏60℃减压干燥，得槐角总黄酮8kg，为棕黄色疏松粉末，收率为药材量的8％。

2、槐角总黄酮的水解

取上述方法生产的槐角总黄酮5kg，加50％乙醇40L，盐酸(36.5％)10L于100L搪瓷反应釜中，加热回流5小时。取出，用10％NaOH溶液中和至PH6，放置过夜，析出棕黄色沉淀，过滤，沉淀用水洗涤至流出液近中性，60℃减压干燥，得棕黄色干燥疏松粉末状物质4kg，即槐角总黄酮水解产物(经HPLC面积归一化法测定，染料木素含量为86％)，收率为药材量的6％。

3、染料木素的重结晶

取槐角总黄酮水解产物1kg，加95％乙醇2000ml溶解，倾入2000ml沸水中，趁热过滤，滤液冰箱放置过夜，析出黄色沉淀，过滤，沉淀用乙醇适量溶解，放置过夜，析出淡黄色针状结晶，过滤，60℃减压干燥，得淡黄色结晶性粉末400g，即染料木素(经HPLC面积归一化法测定，染料木素含量＞99％，保留时间与染料木素对照品一致)，收率为药材量的2.4％。

Claims

1.制备染料木素的方法，其特征在于包括如下步骤：取槐角总黄酮、醇溶液和盐酸，混匀，使混匀后的溶液中的槐角总黄酮浓度为10wt%，醇浓度为40wt%，盐酸浓度7.3wt%，加热回流2～5h，然后中和至pH值为6.0，静置至基本无棕黄色沉淀析出，过滤，洗涤，干燥，得到染料木素粗品；其中，所述的醇溶液为甲醇溶液、乙醇溶液中至少一种；

取染料木素粗品，加入染料木素粗品1.5～2.5倍重量的浓度≥95wt%的乙醇溶液，混匀，溶解，然后倾入染料木素粗品1.5～2.5倍重量的沸水中，趁热过滤，静置15～30h，过滤，所得晶体重复上述步骤再次重结晶，干燥，得到精制染料木素；

其中，所述的槐角总黄酮采用下述方法制备得到：取槐角，粉碎，用10～14倍量W/V的浓度为65～75wt%的乙醇或甲醇溶液提取，过滤，滤液浓缩，上大孔树脂柱，用水冲洗流出液近无色，然后用浓度为60～80wt%的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，浓缩，得到槐角总黄酮浸膏；其中，所述的大孔树脂柱为WLD、D101、HPD300或AB-8型树脂。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的醇溶液为乙醇溶液。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：槐角用12倍量的浓度为70wt%的乙醇溶液加热回流提取2～4次。

4.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于：滤液浓缩至浓度为4～6g/L，然后上D101型大孔树脂柱，上样时，吸附流速为1.0～2.5BV/h，洗脱时，用1.8～2.5倍柱体积的浓度为65～75wt%的乙醇溶液洗脱。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：滤液浓缩至浓度为5g/L，然后上D101型大孔树脂柱，上样时，吸附流速为2.0BV/h，洗脱时，用2倍柱体积的浓度为70wt%的乙醇溶液洗脱。