CN103536922B - 酰基辅酶a:胆固醇酰基转移酶‑2抑制剂在抑制肝癌生长中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶‑2抑制剂在抑制肝癌生长中的应用。具体地，抑制酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶‑2（即ACAT2）的活性可分别在细胞水平和动物水平有效抑制人肝癌细胞和移植瘤的生长，这种抑制效应是通过阻断ACAT2介导的胆固醇代谢物的分泌外排，而使细胞内胆固醇代谢物累积产生的。胆固醇代谢物的累积具有促进肝癌细胞凋亡、抑制肝癌生长的效应；胆固醇代谢物的外排则能解除这种抑制效应。

Description

酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-2抑制剂在抑制肝癌生长中的 应用

技术领域

本发明属于生物医学和制药领域，具体地，本发明涉及酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-2抑制剂在抑制肝癌生长中的应用。

背景技术

肝脏是体内胆固醇代谢中心，在维持体内胆固醇代谢平衡中发挥了至关重要的作用。肝脏可通过从头合成的方式产生大量的胆固醇；肝外组织必须通过胆固醇逆转运（RCT,Reverse Cholesterol Transportation）途径将有害的过量胆固醇代谢物及胆固醇转运到肝脏代谢，降解成为胆汁酸、组装脂蛋白等。肝脏还能将酯化的中性胆固醇酯组装为脂蛋白，并分泌到血液中，为肝外组织的生命活动提供足量的胆固醇。

细胞内胆固醇的水平对细胞的生长、增殖、分化等生命活动均非常重要；胆固醇的缺乏会引起细胞周期依赖性蛋白激酶1的活性受到抑制，从而导致细胞特异性地停留在G2期。临床研究表明，肝癌发生过程肝脏原有的胆固醇合成、降解及脂蛋白组装分泌的功能都受到了损伤，但肝脏又必须不断接收并代谢肝外组织来源过量的有害胆固醇代谢物及胆固醇；同时肝癌的发生与血清总胆固醇水平呈现明显的负相关，肝癌组织中的胆固醇水平也高于癌旁组织。

人体内通过RCT途径运送到肝脏进一步代谢的胆固醇代谢物，包括体内不断产生的27-羟胆固醇（27OH）、24-羟胆固醇（24OH）等。胆固醇代谢物在体内的生理浓度非常低，一般是胆固醇浓度的1/1000或者更低。过量的胆固醇代谢物比过量的胆固醇毒性要大得多，正常肝细胞主要通过酯化、硫酸化和降解三个途径代谢全身组织细胞来源的过量胆固醇代谢物。

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是一种高发病率和高死亡率的恶性肿瘤，是世界第六大癌症。肝癌在亚洲和非洲法发病率高，每年的发病率约为30/100000；而在欧洲和美国，肝癌的发病率则较低，约为2/100000以下。

我国肝癌患者占世界肝癌总患者的50%以上，死亡率高达20.4/100000，占恶性肿瘤致死总数的18.8%。由于肝癌早期难以诊断，因此往往当肝癌被诊断出来的时候，大多数病人已经发展到了肝癌晚期，且经常伴随肝内或肝外的转移，这些因素是造成肝癌高死亡率的主要原因。此外，肝癌复发率很高，这可能与肝癌细胞容易发生微小转移有关。

基于长期的流行病学调查，虽然已经比较明确：慢性肝炎感染、超量酒精摄入以及食物来源的黄曲霉素等因素都有可能导致肝癌，但是肝癌发生发展的具体分子机制依然并不清楚，对肝癌的干预也并不成功。因此，本领域迫切需要进行肝癌抑制的机理研究。

发明内容

本发明的目的就是提供酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-2抑制剂在抑制肝癌生长中的应用。

在本发明的第一方面，提供了一种酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-2基因、或酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-2的抑制剂的用途，所述用途选自下组的一种或多种：

(a)用于制备治疗肝癌的药物组合物；

(b)用于制备治疗肝癌扩散转移的药物组合物；

(c)用于制备抑制肝癌体外增殖生长的药物组合物；

(d)用于制备抑制肝癌细胞体外增殖生长的药物组合物；

(e)用于制备抑制肝癌细胞成癌的药物组合物；

(f)用于制备促进肝癌细胞凋亡的药物组合物。

在另一优选例中，所述的肝癌细胞是人或非人哺乳动物的肝癌细胞。

在另一优选例中，所述的非人哺乳动物包括灵长目动物、啮齿动物（如小鼠、大鼠）等。

在本发明的第二方面，提供了一种酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-2基因、或酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-2的抑制剂的用途，所述用途选自下组的一种或多种：

(a)用于制备治疗癌症的药物组合物；

(b)用于制备治疗癌症扩散转移的药物组合物；

(c)用于制备抑制癌症的体外增殖生长的药物组合物；

(d)用于制备抑制癌症细胞体外增殖生长的药物组合物；

(e)用于制备抑制癌症细胞成癌的药物组合物；

(f)用于制备促进癌症细胞凋亡的药物组合物。

在另一优选例中，所述的癌症包括肝癌、肺癌、肠癌、胃癌、脑癌（瘤）、骨癌；更佳地为肝癌。

在另一优选例中，所述的酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-2的抑制剂选自下组：Pyripyropene A、或具有相同效应的Pyripyropene A衍生物与类似物、或同样具有抑制酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-2效应的化合物等。

在本发明的第三方面，提供了一种体外非治疗性的抑制肝癌细胞生长的方法，所述方法包括步骤(I)：在添加酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-2的抑制剂的条件下，培养肝癌细胞，从而抑制肝癌细胞的生长；或

所述方法包括步骤(I')：降低酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-2基因的表达或降低酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-2的蛋白量或活性。

在另一优选例中，将肝癌细胞与含酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-2的抑制剂的溶液进行接触或混合，然后进行培养。

在另一优选例中，与野生型相比，酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-2基因的表达降低10%，较佳地降低20%，更佳地降低30%，更佳地降低40%，更佳地降低50%，更佳地降低60%，更佳地降低70%，更佳地降低80%，更佳地降低90%，最佳地，酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-2编码基因完全不表达。

在另一优选例中，与野生型相比，酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-2的活性降低10%，较佳地降低20%，更佳地降低30%，更佳地降低40%，更佳地降低50%，更佳地降低60%，更佳地降低70%，更佳地降低80%，更佳地降低90%，最佳地，完全没有酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-2的活性。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤：在培养体系中添加胆固醇代谢物。

在另一优选例中，所述的胆固醇代谢物包括氧化型胆固醇类、固醇类激素、胆汁酸类等。

在另一优选例中，所述的胆固醇代谢物包括（但并不限于）：27-羟基胆固醇、25-羟基胆固醇、24-羟基胆固醇、22-羟基胆固醇、20-羟基胆固醇、7-羟基胆固醇、7-酮基胆固醇、环氧胆固醇、或其组合。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤：在培养体系中添加额外的抗癌药物。

在另一优选例中，所述的抗癌药物包括化疗药、肿瘤抗体等。

在另一优选例中，所述的抗癌药物包括（但并不限于）：阿霉素、长春新碱、紫杉醇、顺铂、卡铂、5-FU、或其组合。

在本发明的第四方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物包括药学上可接受的载体和作为活性成分的酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-2的抑制剂。

在另一优选例中，所述的药物组合物还包括胆固醇代谢物。

在另一优选例中，所述的胆固醇代谢物包括氧化型胆固醇类、固醇类激素、胆汁酸类等。

在另一优选例中，所述的胆固醇代谢物包括（但并不限于）：27-羟基胆固醇、25-羟基胆固醇、24-羟基胆固醇、22-羟基胆固醇、20-羟基胆固醇、7-羟基胆固醇、7-酮基胆固醇、环氧胆固醇、或其组合。

在另一优选例中，所述的药物组合物还包括额外的抗癌药物。

在另一优选例中，所述的抗癌药物包括化疗药、肿瘤抗体等。

在另一优选例中，所述的抗癌药物（但并不限于）：阿霉素、长春新碱、紫杉醇、顺铂、卡铂、5-FU或其组合。

在另一优选例中，所述的药物组合物的给药方式为局部给药或癌内给药。

在本发明的第五方面，提供了一种用于治疗癌症的药盒，所述药盒包括组分：

(a)第一治疗剂，所述第一治疗剂是含酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-2的抑制剂；和

(b)使用说明书。

在另一优选例中，所述药盒还包括：

(c)第二治疗剂，所述第二治疗剂是含胆固醇代谢物的药物制剂。

在另一优选例中，所述药盒还包括：(d)第三治疗剂，所述第三治疗剂是抗癌药物，所述的抗癌药物含有不同于第一治疗剂和第二治疗剂的活性成分。

在本发明的第六方面，提供了一种治疗癌症的方法，包括步骤：给需要的对象施用酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-2的抑制剂，或本发明的第四方面所述的药物组合物。

在另一优选例中，所述的对象包括哺乳动物，较佳地为人。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1显示ACAT2基因表达mRNA和胆固醇代谢物水平的测定结果：图1A,运用定量PCR的方法分析19对人肝癌（T）及癌旁组织（NT）中ACAT2基因的mRNA水平，ACAT2基因mRNA水平在癌组织和癌旁组织中的差异采用Ratio t test进行统计分析，点代表每例癌组织或癌旁组织中经对数转换的ACAT2基因的相对mRNA水平；图1B,测定6对人肝癌（T）及癌旁组织（NT）中胆固醇代谢物27-和24-羟胆固醇的量，胆固醇代谢物水平在癌组织和癌旁组织中的差异采用Wilcoxon matched paired t test进行统计分析。

图2显示ACAT2在肝癌细胞中介导胆固醇代谢物的分泌外排；利用快速蛋白液相色谱（FPLC），从经过实验处理后的肝癌细胞株Huh7的培养液中分离得到3种脂蛋白（图2A），由气相色谱-质谱联用（GC-MS）测定胆固醇代谢物（27-和24-羟胆固醇）主要在脂蛋白VLDL-II中，图2B显示细胞外胆固醇代谢物量，表明ACAT2抑制剂显著抑制胆固醇代谢物的分泌外排。

图3显示ACAT2抑制剂显著提高胆固醇代谢物抑制肝癌细胞的生长；图3A，ACAT2抑制剂显著提高胆固醇代谢物对肝癌细胞株Huh7生长的抑制效应，以未经任何处理的对照组细胞数作为100%；图3B，ACAT2抑制剂抑制胆固醇代谢物的分泌外排、显著提高细胞内胆固醇代谢物（27-和24-羟胆固醇）累积；ACAT2抑制剂显著提高胆固醇代谢物累积引起肝癌细胞株Huh7发生细胞凋亡，用流式细胞仪测定subG1期细胞数目进行定量分析（图3C）和用DAPI染色方法检测凋亡形态细胞进行定量分析（图3D）。

图4显示肝癌细胞Huh7移植瘤体积（图4A）与重量（图4B）分析结果，表明ACAT2抑制剂与胆固醇代谢物联用比胆固醇代谢物单用更显著抑制肝癌细胞Huh7移植瘤的生长。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，降低ACAT2基因的表达或抑制ACAT2蛋白的活性具有抑制肝癌细胞生长的效应。具体地，本发明人发现，胆固醇代谢物的累积能抑制肝癌细胞的生长，胆固醇代谢物的外排则能解除这种抑制效应；肝癌组织中ACAT2基因的表达与胆固醇代谢物的累积相关；ACAT2在肝癌细胞中参与了胆固醇代谢物的外排，ACAT2活性的抑制可以在细胞水平和动物水平有效地抑制肝癌的生长，这种抑制效应是通过阻断ACAT2介导的胆固醇代谢物外排而使细胞内胆固醇代谢物累积，进而促进了细胞凋亡而产生的。在此基础上完成了本发明。

术语

ACAT2基因

如本文所用，术语“ACAT2基因”或“酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-2基因”可以互换使用。

本发明提供了肝癌组织中ACAT2基因的表达与胆固醇代谢物累积的关系。抑制ACAT2的活性可以在细胞水平和动物水平有效抑制肝癌的生长，这种抑制效应是通过阻断ACAT2介导的胆固醇代谢物外排，使细胞内胆固醇代谢物累积而产生的。ACAT2可以作为潜在的治疗肝癌（特别是晚期肝癌）的药物靶标。

本领域的普通技术人员可以使用常规方法对ACAT2基因或蛋白进行调节，降低ACAT2基因的表达或对ACAT2基因表达进行失活处理（中断失活，敲除，同源重组，干扰RNA等）。

较佳地，与野生型相比，ACAT2基因表达降低10%，较佳地降低20%，更佳地降低30%，更佳地降低40%，更佳地降低50%，更佳地降低60%，更佳地降低70%，更佳地降低80%，更佳地降低90%，最佳地ACAT2基因完全没有表达。

降低ACAT2蛋白表达量与活性的方法包括（但不限于）：添加ACAT2特异性抑制剂。

ACAT2抑制剂

如本文所用，术语“ACAT2抑制剂”、“ACAT2的抑制剂”、“ACAT2特异性的抑制剂”、“酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-2的抑制剂”、“酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-2的特异性抑制剂”、或“酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-2抑制剂”可以互换使用，都是指对酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-2具有抑制效果的化合物，如Pyripyropene A、或具有相同效应的Pyripyropene A衍生物与类似物、或同样具有抑制酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-2效应的化合物等。

本发明还提供了ACAT2抑制剂的用途，它被用于制备治疗癌症的药物组合物；制备治疗癌症扩散转移的药物组合物；制备抑制癌症的体外增殖生长的药物组合物；制备抑制癌症细胞体外增殖生长的药物组合物；制备抑制癌症细胞成癌的药物组合物；或制备促进癌症细胞凋亡的药物组合物。在另一优选例中，所述的癌症包括肝癌、肺癌、肠癌、胃癌、脑癌（瘤）、骨癌；更佳地为肝癌。

胆固醇

如本文所用，术语“胆固醇”，“胆甾醇”、或“cholesterol”可以互换使用。胆固醇是环戊烷多氢菲的衍生物，由甾体部分和一条长的侧链组成。胆固醇广泛存在于动物体内，尤以脑及神经组织中最为丰富，在肾、脾、皮肤、肝和胆汁中含量也高。胆固醇溶解性与脂肪类似，不溶于水，易溶于乙醚、氯仿等溶剂。胆固醇是动物组织细胞所不可缺少的重要物质，它不仅参与形成细胞膜，而且是体内代谢合成胆汁酸、维生素D以及甾体激素的原料。

本领域的普通技术人员可使用常规方法获得胆固醇，如从血液、组织中分离，或通过常规商业途径获得，或进行人工化学合成。

胆固醇代谢物

如本文所用，术语“胆固醇代谢物”、“胆固醇合成代谢物”、“胆固醇代谢合成物”、“胆固醇合成物”、“胆固醇分解代谢物”、“胆固醇代谢分解物”、“胆固醇分解物”、“胆固醇氧化代谢物”、“胆固醇代谢氧化物”、“胆固醇氧化物”、“氧化型胆固醇”、或“cholesterolmetabolites”、“cholesterol catabolites”、“oxysterols”、“oxycholesterols”可以互换使用，都是指胆固醇在体内的代谢产物。

所述的胆固醇代谢物可以包括氧化型胆固醇类、固醇类激素、胆汁酸类等。胆固醇代谢物为可以在体内代谢产生的胆固醇前体、胆固醇衍生物等。具体地，胆固醇代谢物包括（但不限于）：27-羟基胆固醇、25-羟基胆固醇、24-羟基胆固醇、22-羟基胆固醇、20-羟基胆固醇、7-羟基胆固醇、7-酮基胆固醇、环氧胆固醇、或其组合。

本领域的普通技术人员可使用常规方法获得各种胆固醇代谢物，如从血液、组织中分离，或通过常规商业途径获得，或进行人工化学合成（如以胆固醇为底物，用蛋白酶进行催化合成，或化学催化合成）。

胆固醇代谢物的用途

本发明提供了胆固醇代谢物的用途：它被用于它被用于制备治疗癌症的药物组合物；制备治疗癌症扩散转移的药物组合物；制备抑制癌的体外增殖生长的药物组合物；制备抑制癌细胞体外增殖生长的药物组合物；制备抑制癌细胞成瘤的药物组合物；或制备促进癌细胞凋亡的药物组合物。在另一优选例中，所述的癌症包括肝癌、肺癌、肠癌、胃癌、脑癌（瘤）、骨癌；更佳地为肝癌。

在另一优选例中，所述的胆固醇代谢物包括（但不限于）：27-羟基胆固醇、25-羟基胆固醇、24-羟基胆固醇、22-羟基胆固醇、20-羟基胆固醇、7-羟基胆固醇、7-酮基胆固醇、环氧胆固醇、或其组合。

药物组合物和施用方法

本发明提供了一种能抑制肝癌细胞和移植瘤的生长药物组合物，它包括药学上可接受的载体和有效量的作为活性成分的ACAT2抑制剂，较佳地，所述的活性成分还包括胆固醇代谢物。

如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”或“效应量”或“效应剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。

“药学上可以接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人或动物使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和药物中的活性成分以及它们之间相互掺和，而不明显降低药效。

药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。

本发明化合物或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：局部给药、瘤旁、瘤内、腹膜内或静脉内等。

组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。

除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油（特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油）或这些物质的混合物等。

除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂和香料。

除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，例如乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。

一种优选的剂型是注射剂。用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。

一种优选的剂型是缓释剂型。用于本发明的缓释剂没有特别选择，可以是本领域采用的各类缓释剂或材料，尤其是生物可降解材料（如PLA等）。

药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物优选被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，还可与其他治疗剂（如抗肿瘤剂）一起使用（包括之前、之中或之后使用）。

使用药物组合物时，是将安全有效量的药物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

所述的药物组合物还可以包括额外的抗癌药物。所述的抗癌药物包括化疗药、肿瘤抗体等。在另一优选例中，所述的抗癌药物包括（但并不限于）：阿霉素、长春新碱、紫杉醇、顺铂、卡铂、5-FU或其组合。

药盒及其应用

本发明提供一种药盒，所述药盒包括：第一治疗剂，所述第一治疗剂是以酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-2的抑制剂（即ACAT2抑制剂）作为活性成分的药物制剂；和使用说明书。

在本发明的另一优选例中，所述药盒还包括第二治疗剂，所述第二治疗剂是以胆固醇代谢物作为活性成分的药物制剂。

所述药盒还可以包括：第三治疗剂，所述的第三治疗剂是抗癌药物。

所述的以酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-2的抑制剂作为活性成分的药物制剂为：将ACAT2抑制剂在溶剂中溶解获得，所述的溶剂包括水、醇类（甲醇和乙醇）、乙酸乙酯、丙酮、氯仿、二氯甲烷、正己烷或石油醚等有机溶剂。

所述的抗癌药物优选为含有阿霉素和/或长春新碱的制剂，将阿霉素和/或长春新碱在溶剂中溶解获得，所述的溶剂包括水、醇类（甲醇和乙醇）、乙酸乙酯、丙酮、氯仿、二氯甲烷、正己烷或石油醚等有机溶剂，优选乙酸乙酯和丙酮等中等极性溶剂。

所述的以胆固醇代谢物作为活性成分的药物制剂，选自针剂、片剂、胶囊、或栓剂等，优选针剂。将胆固醇代谢物在溶剂中溶解或于运载体中获得，所述的溶剂包括水、醇类（甲醇和乙醇）、乙酸乙酯、丙酮、氯仿、二氯甲烷、正己烷或石油醚等有机溶剂，优选乙酸乙酯和丙酮等中等极性溶剂；所述的运载体包括蛋白类（高密度脂蛋白HDL、低密度脂蛋白LDL）、环糊精类（CDX、HPCD），优选HDL类等中等体内脂蛋白类似物运载体。

所述的以酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-2的抑制剂作为活性成分的药物制剂选自针剂、片剂、胶囊、或栓剂等，优选针剂。

所述的以胆固醇代谢物作为活性成分的药物制剂可以是含有胆固醇代谢物的单元剂型，所述的以酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-2的抑制剂作为活性成分的药物制剂可以是含有ACAT2抑制剂的单元剂型。

如本文所用，术语“单元剂型”是指为了使用方便，将组合物制备成单次使用所需的剂型，包括但不限于各种液体剂、固体剂(如片剂)、胶囊剂、缓释剂、靶向剂。

本发明提供的药盒通过下述步骤制备得到：将含有ACAT2抑制剂的制剂，以及说明书一起放置，形成药盒。

本发明提供的药盒用于治疗癌症，所述的癌症包括肝癌及其转移与非转移的肺癌、肠癌、胃癌、脑癌（瘤）、骨癌；优选肝癌。

本发明的主要优点包括：

(1)肝癌组织中ACAT2基因的表达与胆固醇代谢物的累积相关；ACAT2在肝癌细胞中参与了胆固醇代谢物的外排；

(2)ACAT2活性的抑制可以在细胞水平和动物水平有效地抑制肝癌的生长，这种抑制效应是通过阻断ACAT2介导的胆固醇代谢物外排而使细胞内胆固醇代谢物累积、进而促进了细胞凋亡而产生的。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

材料和方法

试剂

细胞培养基（DMEM）和胎牛血清购自Invitrogen公司；限制性内切酶和琼脂糖购自Promega公司（Madison,USA）；Taq酶（Hot Start Version）和dNTPs购自TaKaRa公司；去脂蛋白血清（LPDS）以胎牛血清为原料，通过超速离心方法制备；27-羟胆固醇(27OH)购自Medical isotope公司；24-羟胆固醇(24OH)购自Enzo life science；胆固醇代谢物27-与24-羟胆固醇混合物（OSm）：2×浓度约为人血浆浓度（0.3μg/ml）；ACAT2特异性抑制剂（Pyripyropene A）购自Alexis biochemicals公司。

细胞株和组织样本

人肝癌细胞株Huh7购自中国科学院细胞库，用含10%胎牛血清的Dulbecco'smodified Eagle's medium(DMEM)培养基培养。培养基都加入100U/ml的氨苄青霉素和100μg/ml链霉素，细胞均在37℃、5%CO₂条件下培养。实验用培养基A为含5%LPDS的DMEM培养基，培养基B为不含血清的DMEM培养基。

肝癌和癌旁组织由上海市中山医院提供，取自进行外科手术治疗的肝癌病人，所有病人都签署了知情同意声明，。

定量反转录聚合酶链式反应（RT-quantitative PCR）

利用Absolutely RNA Miniprep Kit（Stratagene）抽提细胞中的总RNA，经过反转录后得到cDNA。RT-qPCR利用SYBR Green qPCR Master Mix试剂在Mx3005PTM定量PCR仪（Stratagene）上进行，基因特异性引物列于表1。基因的相对mRNA水平用内标基因GAPDH的mRNA水平进行校正。

表1

肝癌组织胆固醇代谢物水平分析

稳定同位素内标胆固醇代谢物(27-羟胆固醇-26,26,26,27,27-d5和24-羟胆固醇-25,26,26,26,27,27,27-d7购自Medical isotope公司。N,O-Bis(trimethylsilyl)-trifluoroacetamide(BSTFA)购自Sigma公司。肝组织中的脂质采用改进Folch method(Folch J et al.1957)，简述如下,50mg肝组织经匀浆破碎以后，使用氯仿/甲醇（体积比2/1，含有30μg/ml BHT以及两种同位素内标）进行脂质抽提，抽提获得的脂质经过皂化以及衍生化后利用GC-MS（气相色谱-质谱联用）进行胆固醇代谢物27-与24-羟胆固醇含量分析测定。

肝癌细胞胆固醇代谢物水平分析

将肝癌细胞株Huh7接种于10-cm培养皿，在细胞贴壁24小时后，将细胞培养基换成培养基A，同时加入胆固醇代谢物27-与24-羟胆固醇混合物培养24小时，然后将细胞培养基换成培养基B，并加入ACAT2抑制剂，继续培养3小时后，分别收集细胞培养液和细胞进行分泌的及胞内的胆固醇代谢物水平分析。对于分泌胆固醇代谢物的分析，收集的细胞培养液经过浓缩后通过快速蛋白液相色谱（FPLC）进行脂蛋白分离，分离得到的脂蛋白经过脂质抽提（方法同上）后，利用GC-MS（气相色谱-质谱联用）进行胆固醇代谢物27-与24-羟胆固醇含量分析；有关细胞内胆固醇代谢物的分析，对收集的细胞进行脂质抽提（方法同上）后，利用气相色谱-质谱联用（GC-MS）进行胆固醇代谢物27-与24-羟胆固醇含量分析。

细胞生长实验

将Huh7细胞接种于96孔板中。在细胞贴壁24小时后，将细胞培养基换成培养基A，同时加入胆固醇代谢物27-与24-羟胆固醇培养24小时，然后加入ACAT2抑制剂，继续培养48小时后，细胞数目用Cell Counting Kit CCK8(Dojin Laboratories,Kumamoto,Japan)试剂盒进行测定。

细胞凋亡检测

Huh7细胞培养同上细胞生长实验。细胞凋亡使用流式细胞仪以及DAPI染色的方法进行分析。对于流式细胞仪分析，Huh7细胞在胰酶消化后用75%的乙醇在4°C固定18小时，固定的细胞用PBS冲洗两次，然后重悬于含100μg/ml RNase A且不含钙镁的PBS中，在37°C孵育30分钟后，向细胞悬液中加入Propidiumiodine(PI)至终浓度50μg/ml，避光孵育20分钟，最后使用流式细胞仪和分析软件（FlowJo analysis software）进行流式细胞分析；对于DAPI染色分析，Huh7细胞用冷的PBS洗两次后，用2%多聚甲醛室温下30分钟进行固定，接下来将细胞至于0.1%Triton X-100/PBS溶液中室温下30分钟进行通透处理，最后使用4'-6-Diamidino-2-phenylindole(DAPI)进行染色，并用荧光显微镜观察。

裸鼠移植瘤模型

将Huh7细胞(4×10⁶)悬于100μl DMEM中后注射在BALB/c裸鼠皮下(上海SIPPR-BK实验动物中心)以生成移植瘤。当瘤长到可观察的大小(大约100mm³)时，将移植瘤大小相近的裸鼠随机分成2组进行不同处理(每组7只)。每次处理首先向瘤内注射胆固醇代谢物27-与24-羟胆固醇混合物(6μg/cm³瘤),24小时后,再向瘤内注射ACAT2抑制剂（60μg/cm³瘤）。10天共处理两次。移植瘤体积每3天用游标卡尺测量一次，计算公式：瘤体积=(a×b²)/2（a：瘤最宽的直径；b：与a垂直的瘤直径）。10天处理完成后，将移植瘤解剖、称重和拍照。

统计分析

所有分析均使用GraphPad Prism软件完成。P<0.05认为有显著性差异。

实施例1

人肝癌组织中ACAT2的高表达与胆固醇代谢物的累积相关

在本实施例中，发明人利用19对肝癌病人的癌组织及癌旁组织，首先检测其中ACAT2基因的mRNA水平并进行统计学分析。

结果表明，与癌旁组织细胞相比，肝癌组织细胞中ACAT2基因的mRNA水平显著提高（图1A）。接下来对肝癌和癌旁组织细胞中胆固醇代谢物水平进行了检测。结果显示，6对肝癌组织的胆固醇代谢物水平显著高于癌旁组织（图1B）。

以上结果表明，肝癌组织中ACAT2基因的高表达与胆固醇代谢物的累积相关。

实施例2

ACAT2参与肝癌细胞胆固醇代谢物的分泌外排

为了研究ACAT2在肝癌细胞胆固醇代谢物的代谢的作用，发明人在肝癌细胞株Huh7中通过外源递送高量的胆固醇代谢物（27-和24-羟胆固醇）的条件下检测细胞内和分泌到细胞外的胆固醇代谢物含量。Huh7细胞分泌的脂蛋白通过FPLC分离后，用GC-MS检测其中胆固醇代谢物的含量。

结果显示，肝癌细胞Huh7能够分泌3种脂蛋白（依次命名为VLDLI、VLDLII和HDL），对其中总胆固醇含量进行测定显示，胆固醇主要分布在VLDLII组分中（图2A）；进而ACAT2抑制剂的处理能够显著降低分泌到细胞外的VLDLII组分中胆固醇代谢物的含量（图2B）。

上述结果表明，ACAT2在肝癌细胞胆固醇代谢物的分泌外排中发挥重要作用。

实施例3

ACAT2抑制剂与胆固醇代谢物联用能抑制肝癌细胞的生长

在本实施例中，发明人研究了ACAT2抑制剂在抑制肝癌细胞生长中的作用。

生长实验结果表明，在没有外源递送胆固醇代谢物的条件下，ACAT2抑制剂对Huh7细胞的生长几乎没有影响；而在外源递送胆固醇代谢物27-与24-羟胆固醇混合物的条件下，随着其浓度的提高（2×至4×），胆固醇代谢物显著抑制Huh7细胞的生长，而与ACAT2抑制剂联用则非常显著提高胆固醇代谢物对Huh7细胞生长的抑制效应（图3A）。

对Huh7细胞内胆固醇代谢物含量的分析表明，在外源递送胆固醇代谢物27-与24-羟胆固醇混合物的条件下，ACAT2抑制剂显著提高细胞内胆固醇代谢物的累积（图3B）。

以上结果表明，ACAT2抑制剂与胆固醇代谢物联用能非常显著抑制肝癌细胞的生长。发明人进一步研究了ACAT2抑制剂对肝癌细胞生长抑制的具体机制。流式细胞仪的分析结果和DAPI染色实验结果均显示，在外源递送胆固醇代谢物27-与24-羟胆固醇混合物的条件下，ACAT2抑制剂引起凋亡细胞非常显著增加（图3C,3D）。

总之，ACAT2抑制剂与胆固醇代谢物联用能非常显著抑制肝癌细胞的生长，这种抑制效应是通过ACAT2活性抑制引起的胆固醇代谢物累积，进而促进细胞凋亡造成的。

实施例4

ACAT2抑制剂与胆固醇代谢物联用能抑制肝癌细胞移植瘤的生长

本实施例在动物水平进行ACAT2抑制剂对肝癌细胞移植瘤生长抑制的验证。利用裸鼠Huh7细胞移植瘤模型，向移植瘤内直接注射胆固醇代谢物，从而在短期内模拟体内肝癌组织中胆固醇代谢物的积累过程，同时注射ACAT2抑制剂。

结果显示，ACAT2抑制剂处理中的第7天就能观察到显著抑制移植瘤的生长（图4A），处理结束后肿瘤重量分析也显示了肿瘤生长受到显著抑制（图4B）。

上述结果表明，在裸鼠移植瘤模型中，ACAT2抑制剂与胆固醇代谢物联用能显著抑制Huh7细胞移植瘤的生长。

实施例5

药盒制备

本实施例提供了一种用于治疗癌症的药盒及其制备，给药盒包括下属组分：

(a)第一治疗剂，酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-2抑制剂；

(b)第二治疗剂，胆固醇代谢物；和

(c)使用说明书。

将上述成分一同置于药盒中。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (2)

1.一种酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-2的抑制剂的用途，其特征在于，所述用途选自下组的一种或多种：

(a)用于制备治疗肝癌的药物组合物；

(b)用于制备治疗肝癌扩散转移的药物组合物；

(c)用于制备促进肝癌细胞凋亡的药物组合物。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-2的抑制剂为Pyripyropene A。