KR100678791B1

KR100678791B1 - 아카시아로부터 이중의 사이클로옥시게나제-2 및5-리폭시게나제 억제제의 분리

Info

Publication number: KR100678791B1
Application number: KR1020037008055A
Authority: KR
Inventors: 지아퀴이; 니콜스티모티씨.; 로든에릭이.; 웨이트스콧
Original assignee: 유니젠 파아마슈티컬스,인크.
Priority date: 2002-03-22
Filing date: 2003-03-21
Publication date: 2007-02-05
Also published as: US8124134B2; EP1490081A1; KR20030090614A; US9168242B2; WO2003082312A1; US8568799B2; US20120329863A1; JP2005521715A; EP1490081A4; AU2003224748A1; US20030180402A1; US7108868B2; US20140088183A1; US20060269627A1

Abstract

본 발명은 COX-2 및 5-LO 효소를 동시에 억제하는 새로운 방법을 제공한다. 상기 방법은 아카시아 속의 단독 식물 또는 다수의 식물로부터 분리된 단독 플라반 및/또는 다수의 플라반의 혼합물을 포함하는 조성물을 호스트의 필요에 따라 투여하는 것으로 이루어진다. 또한 본 발명은 COX-2 및 5-LO에 의해 매개되는 질병과 이상증상을 예방하고 치료하는 방법을 제공한다. 상기 COX-2 및 5-LO에 의해 매개되는 질병과 이상증상을 예방하고 치료하는 방법은 아카시아 속의 단독 식물 또는 다수의 식물로부터 분리된 단독 플라반 및/또는 다수의 플라반의 혼합물을 포함하는 조성물과 약재학적으로 수용가능한 운반체를 호스트의 필요에 따라 유효한 양으로 투여하는 것으로 이루어진다. 본 발명은 아카시아 속의 식물로부터 COX-2 및 5-LO에 대해 이중적 특이성을 가지는 플라반 조성물을 분리하고 정제하는 방법을 포함한다.

Description

아카시아로부터 이중의 사이클로옥시게나제-2 및 5-리폭시게나제 억제제의 분리{Isolation of a Dual COX-2 and 5-Lipoxygenase Inhibitor from Acacia}

본 발명은 일반적으로 사이클로옥시게나제-2(COX-2) 및 5-리폭시게나제(5-lipoxygenase)에 의해 매개되는 질병과 이상증상의 예방법과 치료법에 관련된 것이다. 더욱 상세하게는, 아카시아 나무로부터 추출되는 프라반(flavans)이라는 특정 화합물 클래스(class)의 투약에 의해 사이클로옥시게나제-2 및 5-리폭시게나제에 의해 매개되는 질병과 이상증상을 예방하고 치료하는 방법에 관련된 것이다. 본 발명은 식물 원료로부터 추출된 표준화된 프라반을 생산하는 방법을 포함한다.

세포막으로부터 아라치돈산(arachidonic acid)의 유리(liberation)와 대사작용은 몇 가지 다른 경로에 의해 전-염증성(pro-inflammatory) 대사산물을 생산한다. 거의 확실하게, 염증의 가장 중요한 두 가지 경로는 5-리폭시게나제(5-LO) 및 사이클로옥시게나제(COX)에 의해 매개된다. 이러한 경로들은 각각 염증성 반응의 개시와 진행에 중요한 역할을 하는 루코트리엔(leukotriene)과 프로스타글란딘(prostaglandin)을 생산하는 경로와 병행하여 일어난다. 이러한 혈관 활성 화합물이 케모탁신(chemotaxin)이며, 이것은 염증성 세포의 조직 침윤을 촉진하고 염증성 반응을 연장하는 역할을 한다. 결론적으로, 염증의 매개물을 생 산하는 상기 효소는 류마티즘성 관절염, 골 관절염, 알츠하이머 병(Arzheimer's disease), 및 몇 종류의 암과 같은 질병의 병인(pathogenesis)이 되는 염증의 치료를 목표로 하는 신약을 개발하기 위한 표적이 되어왔다.

대부분 비스테로이드성 항-염증성 약제(nonsteroidal anti-inflammatory drugs NSAIDS)에 기여하는 작용기작은 사이클로옥시게나제의 억제이다. 대략적으로 60%의 염기서열은 동일하지만, 발현형태와 기능이 상이한 사이클로옥시게나제(COX-1과 COX-2)의 두 가지 이성체(isoform)가 있다. COX-1은 혈소판 응집, 위장에서의 세포기능의 보호 및 정상적인 신장기능의 유지와 같은 정상적인 생리적 기능을 조절하는 것을 도와주는, 생리적으로 중요한 프로스타글란딘의 생산과 연관된 효소의 구조적 형태이다. (Dannhardt and Kiefer (2001) Eur. J. Med. Chem. 36:109-26). 두번째 이성체인 COX-2는 인터루킨-1β(IL-1β)와 기타 다른 성장요인들인 전-염증성 시토킨(cytokines)에 의해 유도되는 효소의 형태다.(Herschman (1944) Cancer Metastasis Rev. 134:241-56; Xie et al. (1992) Drug Dev. Res. 25:249-65). 이러한 이성체가 아라치돈산으로부터 프로스타글란딘 E2(PGE2)의 생성을 촉진한다. 따라서 NSAIDs는 COX-2를 억제하는 항-염증 활성을 나타낸다.

COX-1과 관련하여 COX-2 선택도를 유지하는 동안 COX-2 및 5-LO에 대한 이중 특이성을 나타내는 억제제는 아라치돈산 대사의 여러 경로를 억제하는 명백한 이점을 가지고 있다. 이러한 억제제는 그들의 생산물을 제한함으로써, 다수의 루코트리엔(LT)의 염증성 효과뿐만 아니라 PGE2의 염증성 효과도 차단할 수 있다. 상 기 억제제는 LTB4와 LTD4의 혈관확장(vasodilation), 혈관투과성(vasopermeability), 및 화학주성 효과(chemotactic effects)와 아나파락시스(anaphalaxis)의 물질의 반응을 저하시키는 것으로 알려진 LTE4의 효과를 포함한다. 이들 중, LTB4는 가장 강력한 화학주성 효과와 화학동성 효과(chemokinetic effects)를 가지며 (Moore (1985) Prostanoids : pharmacological, physiological and clinical relevance. Cambridge University Press, N.Y., pp.229-30), 염증성 위장 질병을 가진 환자의 위장내 점막에서 상승되는 것으로 보이며 (Sharon and Stenson (1983) Gastroenterology 84:1306-13), 류마티즘 관절염 환자의 활액에 있어 상승되는 것으로 보인다. (Klicksein et al. (1980) J.Clin.Invest. 66:1166-70; Rae et al. (1982) Lancet ii:1122-4).

상기 언급한 COX-2/5-LO 이중 억제제의 이점과 더불어, 많은 이중 억제제는 전형적인 NSAIDs에 의해 야기되는 위장내의 손상과 불편함을 포함하여 NSAIDs 또는 COX-2의 부작용중 일부를 야기하지 않는다. 위의 염증을 유발하는 NSAID는 대부분 5-LO의 대사산물, 특히 LBT4 때문인 것으로 논의되어 왔다. (Kircher et al. (1997) Prostaglandins leukotrienes and essential fatty acids 56:417-23). 루코트리엔은 위장 점막내에서 프로스타노이드(prostanoid) 억제가 뒤따르는 초기 아라치돈산 대사산물을 나타낸다. 이 화합물은 NSAIDs의 사용으로 인한 위장 상피 피해의 중요한 원인이 되는 것을 보인다. (Celotti and Laufer (2001) Pharmacological Research 43:429-36). 또한 COX 및 5-LO의 이중 억제제는 실험 쥐 모델의 노화된(arthritic) 심장의 관상동맥 수축을 억제하는 것으로 나타난다. (Gok et al. (2000) Pharmacology 60:41-46). 이 특징들은 COX-2억제제나 NSAIDs를 단독으로 사용하는 경우보다 COX-2 및 5-LO의 이중 억제제가 효능은 증가되고 부작용을 감소한다는 면에서 뚜렷한 이점이 있음을 나타낸다.

COX 억제제의 작용기작이 대부분의 통상적인 NSAID's의 반응기작과 일치하기 때문에, COX 억제제는 염증이 결정적인 역할을 하는 일시적인 이상상태나 만성적인 질병에서의 염증으로 인한 통증과 부종(swelling)을 포함하여 이와 동일한 많은 증상들을 치료하는데 사용된다. 일시적 이상증상의 치료는 경미한 찰과상(minor abrasion), 일광화상(sunburn), 접촉성 피부염(contact dermatitis)과 관련된 염증치료와 긴장(tension), 편두통(migraine headaches), 월경통(menstrual cramps) 등의 통증의 완화를 포함한다. 만성질병은 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 골관절염(osteoarthritis)과 같은 관절질병(arthritic diseases)을 포함한다. 비록 류마티스 관절염은 대개 자가면역성 질병이고 골관절염은 관절연골의 퇴화에 기인하지만, 각 질병들과 관련된 염증들의 완화는 그러한 질병들로 고통받는 사람들의 삶의 질을 향상시킨다.(Wienberg (2001) Immunol. Res. 22:319-41; Wollihem (2000) Curr.Opin.Rheum. 13:193-201). 염증은 류마티스 관절염과 더불어 대부분의 류마티스성 질병을 구성한다. 따라서, COX 억제제의 사용은 전신 낭창 적백혈병(SLE)(Goebel et al. (1999) Chem.Res.Tox. 12:488-500; Patrono et al. (1985) J. Clin. Invest. 76:1011-1018)과 피부경화증(scleroderma)과 같은 류마티스성 피부이상과 같은 질병의 치료에까지 확장되고 있다. 또한 COX 억제제는 건선 과 같은 류마티스성이 아닌 염증성 피부이상의 완화에도 사용되는데, 이는 프로스타글란딘의 과잉생산으로 인한 염증을 감소시킴으로서 직접적인 효능을 발휘하는 것이다. (Frgh et al. (1993) Acta Derm Venerologica 73:191-3). 간단히 말하면, COX 억제제는 만성적인 염증 질병뿐만 아니라 간헐적인 통증과 염증으로 유발되는 통증의 치료에도 유용하다.

COX 억제제는 항-염증성 약제로서의 용도뿐 아니라, 암의 치료라는 잠재적인 역할을 가진다. COX-2의 과잉발현은 다양한 인간의 악성종양에서 입증되었으며, 피부암, 유방암, 방광암에 걸린 동물의 치료에도 효과적임이 나타났다. 그러한 반응기작이 완전히 규명되지 않았지만, COX-2의 과잉발현이 세포자살을 억제하고 발암세포형의 침입을 증가시킴을 보여왔다.(Dempke et al. (2001) J.Can.Res.Clin.Oncol. 127:411-17; Moore and Simmons (2000) Current Med.Chem. 7:1131-44). COX-2의 과잉 발현으로 인한 프로스타글란딘의 증가된 생성이 세포분열을 촉진하고 결과적으로, 신생혈관생성(angiogenesis)의 증가를 가능하게 한다.(Moore (1985) in Prostanoids: pharmacological, physiological and clinical relevance, Cambridge University Press, N.Y.,pp.229-30; Fenton et al.(2001) Am.J.Clin.Oncol.24:453-57).

다른 형태의 암들을 예방하고 치료하는데 있어서 COX-2 억제제의 잠재적인 용도에 관한 많은 임상연구들이 있어왔다. 1999년 미국에서는 130,000가지의 새로운 직장암이 진단되었다. 예를들면, 비특이적 NSAID인 아스피린이 직장암의 발병율을 40내지 50% 감소시키고 (Giovannucci et al. (1995) N Engl J Med. 333:609- 614), 치사율을 50% 감소시키는 (Smalley et al. (1999) Arch Intern Med. 159:161-166) 것으로 확인되었다. 1999년 미국식품의약청은 COX-2 억제제 셀레콕시브(CeleCOXib)를 직장암 치사율을 감소시키기 위한 FAP(Familial Ademonatous Polyposis)에서의 사용을 허가하였다. COX-2가 관여하는 다른 암들도 COX-2를 사용하여 성공적으로 예방 및/또는 치료될 수 있는 것으로 보인다. 다른 암들로는 식도암, 두경부암, 유방암, 방광암, 경부암, 전립선암, 간장암과 비-소세포폐암을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.(Jaeckel et al. (2001) Arch. Otolarnygol. 127:1253-59; Kirschenbaum et al. (2001) Urology 58:127-31; Dannhardt and Kiefer (2001) Eur.J.Med.Chem. 36:109-26). 또한, COX-2 억제제는 고위험도 환자의 직장암을 효과적으로 예방하는 것으로 입증되었다. COX-2 억제제가 생명을 위협하는 여러 형태의 암을 예방하거나 심지어 전환할 수 있음을 보이는 연구결과들이 있다. 현재까지, 50여개의 연구들이 COX-2 억제제가 동물에 있어서 악성전단계의 종양과 악성종양을 예방할 수 있고, 방광암, 식도암 및 피부암도 예방할 수 있음을 보여준다. COX-2 억제제는 현대의 가장 중요한 예방 의학적 성과 중 하나임이 입증되었다.

최근의 과학적 진보로 COX-2의 발현, 일반적인 염증 및 알츠하이머 병(Alzheimer's disease(AD))의 발병학 사이의 상호관계가 확인되었다.(Ho et al. (2001) Arch. Neurol. 58:487-92). 동물모델에서, COX-2 효소를 과잉발현하는 유전형질전환 쥐는 훨씬 손상되기 쉬운 뉴런을 갖는다. NIA(National Institute on Aging)는 NSAIDs가 알츠하이머 병의 진행을 늦출 수 있는 지를 측정하는 임상시험 에 착수하였는데, 비선택적인 NSAID인 나프록센(Naproxen)과 특정적으로 선택적인 NSAID인 로페콕시브(rofecoxib, 상품명: 바이옥스(Vioxx))가 평가될 것이다. 알츠하이머 병에 대한 염증의 관여에 대해서도 입증되었고, 알츠하이머 협회와 NIA에 따르면 미국에서 알츠하이머 병으로 약 4백만 명이 고통 받고 있으며, 반세기가 지나면 14백만 명으로 증가될 것으로 예상된다고 한다.

프로스타글란딘 H2 신타제(prostaglandin H2 synthase)라 알려진 COX-2 효소는 2가지 독립적인 반응을 촉진한다. 첫 번째 사이클로옥시게나제 반응에서는 아라치돈산이 물질대사하여 불안정한 프로스타글란딘 G2(PGG2)를 형성하며, 두 번째 퍼옥시다제 반응에서는 PGG2가 엔도퍼옥시드 PGH2로 바뀐다. PGH2는 비효소적으로 PGE2로 곧 바뀐다. 여기서 기술하는 화합물들은 신규한 COX효소 억제제를 확인하기위하여 화학적 비복제(chemical dereplication) 과정을 이용한 COX-1과 COX-2퍼옥시다제의 활성억제를 초점으로 한 분석과 결합한 발견전략(discovery stategy)의 결과물이다.

아카시아는 콩과(leguminous) 나무와 관목 속이다. 아카시아 속은 콩과와 미모소이데아(Mimosoideae)의 서브과(subfamily)에 속하는 1000종류 이상을 포함한다. 아카시아는 가장 많은 풍토종을 가지고 있는 호주뿐 아니라 중앙과 남 아메리카, 아프리카 및 아시아의 일부에 열대지방과 서브열대지방 등 전세계적으로 분포한다. 아카시아는 가시 많은 관목이 숲의 대부분인 건조하고 메마른 지역에서 주로 나타난다. 아카시아 속은 잎의 형태에 따라 -아카시아(Acacia), 아큘리퍼룸(Aculiferum)과 헤테로피륨(Heterophyllum)-의 3가지 서브속(subgenera) 으로 나뉘어진다. 그러나, 성숙한 나무의 잎의 본질을 기초로 하여 아카시아 속은 전통적인 이화우상(bipinnate) 잎 종과 필로데노우스(phyllodenous) 종의 두 가지 대중적인 그룹으로 나뉠 수 있다. 가엽(phyllode)은 건성적인 조건에 적응할 수 있는 리프렛(leaflets)이 없고 잎 같은 구조로 확장되는 페티올(petiole)로 변형된다. 전형적인 이화우상 잎을 가진 종은 주로 열대지방에서 나타나며, 필로데노우스 종은 주로 호주에서 나타난다. 아카시아의 40종 이상이 인도에서 보고되었다. 갬블(Gamble)은 그의 마드라스 프래지던스(Madras Presidency)의 식물상(flora)에서 남인도의 23개 토착종을 리스트에 올렸으며, 그 중 15개는 타미 나두(Tamil Nadu)에서 발견된다. 그때 이후로, 많은 새로운 아카시아 종이 인도로 도입되었다. 대략 40종이 현재 타미 나두(Tamil Nadu)에서 발견된다. 토착종은 주로 가시 많은 나무와 관목이고, 일부는 아카시아 카에시아(A.caesia), 아카시아 페나타(A.pennata) 와 아카시아 시누아타(A.sinuata)와 같은 가지많은 스트레글러(stragglers)이다. 많은 종은 아프리카와 호주로부터 유입되었다. 즉, 이화우상의 잎을 가진 종인 아카시아 메아르시(Acacia mearnsii), 아카시아 피카난사(A.picnanntha)와 아카시아 데알바타(A.dealbata)와 필로데노우스 종인 아카시아 아우리쿠리포르미스(A.auriculiformis), 아카시아 호로세레시아(A.holoserecia)와 아카시아 만기윰(A.mangium)이다.

아카시아는 타닌산, 고무, 목재, 연료와 사료를 제공하는 등 경제적으로 매우 중요하다. 주로 껍질로부터 분리되는 타닌산은 피부의 태닝(tanning)을 위하여 광범위하게 사용된다. 또한 어떤 아카시아 껍질은 토속주(local spirits)의 향기 를 내기 위하여 사용된다. 또한 아카시아 시누아타(A.sinuata)와 같은 어떤 토착종은 물과 섞이면 미끄러운 비누거품을 형성하는 다양한 식물 글루코사이드(glucosides)인 사포닌(saponins)을 생산한다. 사포닌은 세정제, 거품제와 유화제로 사용된다. 어떤 아카시아 종의 꽃은 향기가 있으며 향수를 만드는데 사용된다. 예를들면, 카시에(Cassie) 향수는 아카시아 페루제네아(Acacia ferrugenea)로부터 얻어진다. 많은 아카시아의 심재(heartwood)는 건축도구를 만드는데 사용되고 장작으로도 공급된다. 아카시아 고무는 의약과 과자에서 광범위한 용도로 발견되며, 섬유산업에 있어서 풀칠(sizing)과 마무리(finishing) 재료로 발견된다. Lac 벌레는 아카시아 니로티카(A.nilotica)와 아카시아 카테츄(A.catechu)를 포함하여, 몇개의 종에서 자란다. 홍수에 견딜 수 있는 아카시아 니로티카(A.nilotica)를 포함하여 어떤 종들은 불모지의 조림(forestation)을 위하여 사용되어왔고 그 몇 지역은 새의 보호지역이 되어왔다.

현재까지 대략 330개의 화합물이 다양한 아카시아 종으로부터 분리되었다. 수용성 식물 색소인 플라보노이드(flavonoids)는 아카시아로부터 분리된 화합물의 주된 클래스(class)이다. 대략 180개의 다른 플라보노이드가 확인되었고, 그 중 111개는 플라반이다. 테르페노이드(terpenoids)는 아카시아 속의 종으로부터 분리되는 두번째로 큰 화합물 클래스이고, 48개의 화합물이 확인되었다. 아카시아로부터 분리되는 화합물의 다른 클래스는 알칼로이드(alkaloids)(28), 아미노산/펩타이드(peptides)(20), 탄닌산(16), 카르보하이드레이트(carbohydrates)(15), 옥시젠 헤테로사이클(oxygen heterocycles)(15)와 알리파틱(aliphatic) 화합물(10)을 포함 한다.(Buckingham, The Combined Chemical Dictionary, Chapman & Hall CRC, version 5:2, Dec. 2001).

페놀릭(phenolic) 화합물, 특히 플라반은 모든 아카시아 종에서 높은 농도를 나타낸다.(Abdulrazak et al. (2000) Journal of Animal Sciences. 13:935-940). 역사적으로, 식물의 대부분과 아카시아 속의 추출물은 위장병, 설사 및 소화불량을 치료하고 출혈을 멈추게하는 수렴제로 사용되어 왔다.(Vautrin (1996) Universite Bourgogne (France) European abstract 58-01C:177; Saleem et al. (1998) Hamdard Midicus. 41:63-67). 아카시아 아라비카 윌드(Acacia arabica Willd)는 많은 양의 탄닌산을 포함하고 있으며 수렴제와 거담약으로 사용되어 왔다.(Nadkarni(1996) India Materia Medica, Bombay Popular Prakashan, pp.9-17). 소말리아의 아카시아 토르티리스(Acacia tortilis) 의 줄기 껍질로부터 분리된 디알리프로파놀(diarylpropanol) 유도체들은 근육이완 효과를 가진 것으로 보고되었다.(Hagos et al. (1987) Planta Medica. 53:27-31,1987). 아카시아 빅토리아(Acacia victoriae)로부터 분리되는 테르페노이드 사포닌은 쥐과의 동물의 피부암을 유발하고(Hanausek et al. (2000) Proceedings American Association for Cancer Research Annual Meeting. 41:663) 아포토시스(apotosis)를 유발하는(Haridas et al. (2000) Proceeding American Association for Cancer Research Annual Meeting. 41:600) 디메틸벤젠 안드라센(dimethylbenz anthracene)에 대한 억제 효과를 가지는 것으로 보고되어 왔다. 아카시아 니로티카(Acacia nilotica)의 식물 추출물은 스파스모제닉(spasmogenic), 혈관수축제와 항-고혈압효 (Amos et al. (1999) Phytotherapy Research 13:683-685; Gilani et al. (1999) Phytotherapy Research. 13:665-669)와 항혈소판 응집효(Shah et al. (1997) General Pharmacology. 29:251-225)를 가지는 것으로 보고되어 왔다. 항-염증성 활성은 아카시아 니로티카(A.nilotica)에서 보고되어 왔다. 플라보노이드, 폴리사카라이드(polysaccharides)와 유기산은 잠재적인 활성 성분이라고 추측되어 왔다. (Dafallah and AL-Mustsfs (1996) American Journal of Chinese Medicine. 24:263-269). 현재까지, 아카시아로부터 분리된 5-리포옥시게나제 억제제로 보고된 것은 모노테르페노이달 카르복아미드(monoterpenoidal carboxamide)뿐이다.(Seikine et al. (1997) Chemical and Pharmaceutical Bulletin. 45:148-11).

아카시아 고무는 다른 식물 성분들과 제제되어 왔으며 활성성분의 어떤 동일함(identification) 없이 궤양예방을 위해 사용되어 왔다.(Fuisz, U.S.Pat.No. 5,651,987). 아카시아 고무는 또한 다른 식물 성분들과 제제되어 왔으며, 영양적 혼합물의 점성을 낮춤으로써 약의 용해를 향상시키는데 사용되어 왔다.(Blank, U.S.Pat.No. 4,946,684)(Chancellor,U.S.Pat.No. 5,545,411).

아카시아 껍질로부터의 추출은 미백제(whitening agent)로서(Abe,JP10025238), 치과용(dental application) 글루코실(glucosyl) 전이효소 억제제로서(Abe, JP07242555), 단백질 중합 억제제로서(Fukai,JP07165598), 외피 조제약을 위한 활성 산소 제거제(scavenging)로서(Honda, JP 07017847,Bindra U.S. Pat.No.6,1266,950) 그리고 염증, 꽃가루 과민증, 및 기침을 예방하기 위한 경구 질환용(oral consumption) 히알루로니다아제(hyaluronidase) 억제제로서의 외 부용도로(Ogura,JP 07010768) 일본에서 특허되었다.

카테친(catechin)은 주로 녹차에서 발견되는 플라반이며 다음과 같은 구조를 갖는다.

(카테친)

카테친은 단독으로 또는 차에서 발견되는 다른 플라보노이드와 함께 작용하며, 항바이러스성 활성과 산화방지 활성을 가진다. 카테친은 바이러스성 간염의 치료에 있어서 효과적인 것으로 나타났다. 이것은 또한 심장, 신장, 폐와 비장의 산화적 손상을 예방하는 것으로 나타났다. 카테친은 또한 위암 세포의 성장을 억제하는 것으로 나타났다.

카테친과 그 이성체인 에피카테친(epicatechin)은 IC₅₀값40μmol/L에서 프로스타글란딘 엔도페록시드 중합(Prostaglandin endoperoxide)을 억제한다.(Kalkbrenner et al. (1992) Pharmacol. 44:1-12). (+)-카테친과 갈로카테친(gallocatechin)을 포함하는 4개의 식물 종으로부터 분리된 5개의 플라반-3-올(flavan-3-ol) 유도체들(Atuna racemosa, Syzygium carynocarpum, Syzygium malaccense, Vantanea peruviana)은 IC₅₀값 3.3μM 내지 138 μM에서 COX-1과 비례하여 COX-2에 대하여 약한 억제 활성을 나타낸다.(Noreen et al. (1998) Planta Med. 64:520-524). 세이바 펜탄드라(Ceiba pentandra)의 껍질로부터 분리되는 (+)-카테친은 IC₅₀값 80μM 에서 COX-1을 억제한다.(Noreen et al . (1998) J.Nat. Prod. 61:8-12). 경제적으로 유요한 순수 (+)-카테친은 COX-2의 선택도 없이 IC₅₀값 183 내지 279μM 정도일때 실험조건에 따라 COX-1을 억제한다.(Noreen et al. (1998) J.Nat.Prod. 61:1-7).

녹차의 카테친이 다우레이(Dawley) 숫쥐의 식이에 보충되었을때, 혈소판 포스포리파제(phospholipase) A2의 활성 레벨(level)을 낮추었으며 혈소판 사이클로옥시나아제의 레벨(level)을 상당히 낮추었다.(Yang et al. (1999), J.Nutr.Sci.Vitaminol. 45:337-346). 보고에 의하면 카테친과 에피카테친은 인간 결장암 DLD-1 세포(IC₅₀=415.3μM )에서 COX-2 유전자 전사를 약하게 억압한다. (Mutoh et al. (2000) Jpn.J.Cancer Res. 91:686-691). (+)-카테친의 신경보호적 기능(ability)은 사이클로옥시게나아제, 리포옥시게나아제 또는 마이트릭 옥사이드(mitric oxide) 중합제와 같은 내세포성 효소의 억제적인 효과보다는 카테친의 산화방지적 특성에서 기인한다.(Bastianetto et al. (2000) Br.J.Pharmacol. 131:711-720). 에피갈로카테친-3-갈레이트(epigallocatechin-3-gallate)(EGCG), 에피갈로카테친(epigallocatechin)(EGC), 에피카테친-3-갈레이트(epicatechin-3-gallate)(ECG)와 같은 카테친의 유도체들은 녹차와 홍자로부터 정제되었고, 세아플라빈(theaflavins)은 인간 결장점막과 결장종양조직에서 아라치돈산의 대사에 의존 하는 사이클로옥시게나제와 리포옥시게나제를 억제하는 것으로 나타났고 COX-2 발현과 PGE(2) 생산을 유도한다.(Park et al. (2001) Biochem. Biophys.Res.Commun. 286:721-725). 세라스트러스 오르비쿠라투스(Celastrus orbiculatus)의 기생부분(aerial parts)으로부터 분리되는 에피아프제렉신(epiafzelechin)은 IC₅₀ 값 15μM 에서 COX-1의 복용-의존적(dose-dependent) 억제를 나타내었고, 한번에 100mg/kg의 구강 투약에 따른 쥐발의 수종으로 유도된 카라게닌(carrageenin)와 반대로 항-염증성 활성도 나타냈었다.(Min et al. (1999) Planta Med. 65:460-462).

다양한 식물 원료로부터, 특히 녹차잎으로부터 분리된 카테친과 그 유도체들은 콘다로마 마쿠미나타(Condyloma acuminata)를 감염시키는 HPV의 치료에 사용되며(Cheng, U.S. Pat.No. 5,795,911), 파필로마 바이러스(papilloma virus)에 의해 유발되는 하이퍼플라시아(hyperplasia)의 치료에 사용된다.(Cheng, U.S.Pat.Nos. 5,968,973 and 6,197,808). 카테친과 그 유도체들은 체모-성장제(hair-growing agent)로서(Takahashi, U.S.Pat.No.6,126,940) 유전자 발현과 효소 활성 수준에 있어서 산화질소를 억제하기 때문에(Chan, U.S.Pat.No. 5,922,756) 쥐에 있어서 종양형성을 유도하는 UVB(Agarwal et al.(1998) Photochem. Photobiol. 58:695-700)와 대하여 피부암, 건선, 거미 시맥(spider vein) 또는 눈 밑 조직(under eye circle)(Anderson, U.S.Pat.No.6,248,341)와 같은 포유동물 조직에서 혈관형성을 주로 억제하는데 사용되어 왔다. 조성물의 기본인 카테친은 또한 좌창을 치료하고(Murad U.S.Pat.No.5,962,517), 소화기관의 조직을 단단하게 하고(Shi, U.S.Pat.No. 5,470,589), 질병과 종양과 관련된 남성호르몬(androgenic) 장애를 치료하는데 있어 5 알파-환원효소를 억제하기 위하여(Liao, U.S.Pat.No. 5,605,929), 다른 추출물과 비타민과 함께 제제되어 왔다. 녹차 추출물은 특정 활성 성분들의 동일함(identification) 없이 COX-2 효소의 억제에 의해 염증을 감소시키기 위해 7 가지 다른 식물 추출물과 제제되어 왔다.(Mewmark, U.S.Pat.No.6,264,995).

지금까지, 천연으로 존재하는 플라보노이드가 다양한 용도를 위해 상업되어 왔다. 예를들면, 스쿠텔라리아(Scutellaria) 추출물의 리포좀 제제는 피부 보호제로 사용되어 왔다.(U.S.Paent Nos.5,643,598: 5,443,983). 바이칼린(baicalin)은 종양을 일으키는 유전자에 대한 억제 효과 때문에, 종양을 예방하는데 사용되어 왔다.(U.S.Patent No.6,290,995). 바이칼린과 다른 화합물은 항바이러스제, 항박테리아제, 면역조절제(U.S.Patent No.6,083,921)와 천연 항산화제(Poland Pub.No.9,849,256)로 사용되어 왔다. 크리신은 안정제로 사용되어 왔다.(U.S.Patent No.5,756,538). 항-염증성 플라보노이드는 식욕감퇴성 질병과 대장성 질병의 조절제, 치료제(U.S.Paent No5,858,371) 및 리포옥시게나제의 억제(U.S.Patent No.6,217,875)로 사용되어 왔다. 이러한 화합물들은 또한 연경조직의 치료와 유지를 위하여 글루코사민 콜라겐(glucosamine collagen)과 다른 성분들과 함께 제제되어 왔다.(Bath, US pat.6,333,304). 플라보노이드 에스테르는 화장품 조성물의 활성성분을 구성한다.(U.S.Patent No.6,235,294). 펠로덴드론 아무렌센(Phellodendron amurense)에서 분리된 껍질, 추출물과 화합물은 염증질병의 치료에서의 사용으로 특허되었다.(U.S.Pat.Nos.5,766,614; 5,908,628; 6,113,909; 6,193,977). 프루누스 아비윰(Prunus avium)과 프루누스 세라수스(Prunus cerasus)의 체리 바이오플라보노이드(cherry bioflavonoids)는 구조의 안소사이아니딘(anthocyanidin)형과 함께 사이클로옥시게나제 억제제로서 특허되었다.(U.S.Pat.No.6,194,469, U.S.Pat.Appl.20010002407).

[발명의 요약]

본 발명은 사이클로옥시게나제-2(cyclooxygenase-2, COX-2) 효소 및 5-리포옥시게나제(5-lipoxygenase, 5-LO)를 동시에 억제하는 효과가 있는 방법을 포함한다. COX-2 및 5-LO의 동시적 이중 억제를 위한 방법은 아카시아 속의 하나 또는 여러개의 식물로부터 분리된 단독 플라반 및/또는 다수의 플라반의 혼합물로 구성된 조성물을 필요로 하는 호스트(host)에 투여하는 것으로 구성된다.

본 발명은 또한 COX-2와 5-LO에 의해 매개되는 질병과 이상상태를 예방하고 치료하기 위한 방법을 포함한다. COX-2와 5-LO에 의해 매개되는 질병과 이상상태를 예방하고 치료하는 방법은 아카시아 속의 하나 또는 여러개의 식물로부터 분리된 단독 플라반 및/또는 다수의 플라반의 혼합물과 약제학적으로 허용되는 운반체로 구성된 조성물을 필요로 하는 호스트에 투약하는 것으로 구성된다.

하기와 같이 사용되는 플라반은 다음과 같은 일반적인 구조식으로 나타내어지는 화합물로 구성된다.

상기 구조식에서,

R₁, R₂, R₃, R₄ 및 R₅는

H, -OH, SH, -OCH₃, -SCH₃, -OR, -SR, -NH₂, -NRH, -NR₂, -NR ₃ ⁺X^-, 갈레이트(gallate), 아세테이트(acetate), 시나모일(cinnamoyl) 및 하이드록실 시나모일 에스테르(hydroxylcinnamoyl esters), 트리하이드록시벤조일 에스테르(trihydroxybenzoyl esters) 및 카페오일 에스테르(caffeoyl esters)를 포함하지만 이에 한정되지 않는 언급된 치환기들의 에스테르; 알도펜토시스(aldopentoses), 메틸 알도펜토스(methyl aldopentose), 알도헥소시스(aldohexoses), 케토헥소스(ketohexose) 및 이들의 화학적 유도체를 포함하지만 이에 한정되지 않는 단독 다당류 또는 복합 다당류의 탄소(carbon), 산소(oxygen), 질소(nitrogen) 또는 황(sulfur) 글리코시드(glycoside); 다이머(dimer), 트라이머(trimer) 및 기타 중합 플라반(polymerized flavans); 으로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된다.

R은 탄소수 1 내지 10의 알킬 기이고, X는 하이드록실(hydroxyl), 클로라이 드(chloride), 아이오다이드(iodide), 설페이트(sulfate), 포스페이트(phosphate), 아세테이트(acetate), 플루오르화물(fluoride), 카보네이트 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는 약제학적으로 허용되는 중심(counter) 음이온들의 그룹으로부터 선택된다.

본 발명은 골관절염, 류마티스 관절염, 월경통, 조직 낭창 적백혈병, 건선, 만성 두통, 편두통, 국부적인 상처와 경미한 염증 상태 및 염증적 내장 질병과 고형암을 포함하지만 이에 한정되지 않는 COX-2와 5-LO에 의해 매개되는 질병과 이상상태를 예방하고 치료하기 위하여 사용되는 방법을 포함한다.

상기에서 언급된 것과 같이 본 발명의 플라반은 식물 또는 아카시아 속으로부터 선택된 식물로부터 얻어질 수 있다. 더욱 상세하게는, 아카시아 카테츄(Acacia catechu), 아카시아 콘신나(Acacia concinna), 아카시아 파르네시아나(Acacia farnesiana), 아카시아 세네갈(Acacia Senegal), 아카시아 스페시오사(Acacia speciosa), 아카시아 아라비카(Acacia arabica), 아카시아 카에시아(A.caesia), 아카시아 펜나타(A.pennata), 아카시아 시누아타(A.sinuata), 아카시아 미아르시(A.mearnsii), 아카시아 픽난사(A.picnantha), 아카시아 데알바타(A.dealbata), 아카시아 아루리쿠리포미스(A.auriculiformis), 아카시아 호로세레시라(A.holoserecia) 및 아카시아 만기윰(A.mangium)으로 구성된 그룹으로부터 얻어질 수 있다.

본 발명의 조성물은 선행기술 상의 전형적인 방법의 하나에 의해 투약될 수 있다. 투약 형태는 장(경구)투약, 장관내(정맥내, 피하 및 근육내) 투약 및 국부 투약을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 본 발명에서의 치료법은 천연적으로 얻어지는 것 또는 합성물을 포함하지만 이에 한정되지 않는 단독 원료 또는 복합 원료로 부터 얻어지는 단독 플라반 및/또는 다수 플라반의 혼합물의 치료적으로 효율적인 양을 환자에게 내부적 또는 국부적으로 투약하는 것으로 이루어진다.

본 발명은 아카시아 속으로부터 플라반을 분리하고 정제하는 방법을 포함한다. 본 발명은 a) 아카시아 속으로부터 선택된 식물의 분쇄된 바이오매스(식물자원)을 추출하는 방법, b) 상기 추출물을 중화 및 농축하는 방법, c) 상기 중화 및 농축된 추출물을 정제하는 방법으로 이루어진다. 본 발명의 바람직한 실시예에서 추출물은 정제, 침전, 용매상 분리 및/또는 크로마토그라피 분리로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의하여 정제된다. 본 발명은 생리학적으로 바람직한 활성을 갖는 아카시아 플라반의 분리 및 정제를 위하여 상업적으로 수행 가능한 방법을 제공한다.

본 발명은 COX-2와 5-LO 효소 활성과 염증을 특이적으로 억제하는 이러한 추출물내에서 활성 식물 추출물과 특정 화합물을 선별하기 위하여 일련의 생체분자 검색과 화학적 비복제 처리를 결합하는 전략을 수행한다. 1230 가지 식물의 추출물은 재결합 COX-2에 관하여 페록시다제 활성을 억제하는 능력에 대하여 검색되었다. 첫번째 검색은 세포에 의한 분석(cell based assays)와 완전 혈액 분석(whole blood assays)에 의해 생체밖에서 COX-2를 특이적이고 선택적으로 억제하기 위한 그들의 능력을 연구하기 위하여 22 가지 식물 추출물이 선별하였다. 생체밖에서 효과적인 이러한 추출물들은 다수의 방법(IP 와 경구)에 의해 투여되었을 때 공기 주머니와 국부적인 귀-부종 모델을 사용하여 생체내에서 염증을 억제하는 능력이 실험되었다. 이러한 연구들은 COX-2 활성을 억제하고 생체밖과 생체내에서 효율적인 식물성 추출물의 발견을 가져왔다. 이러한 추출물은 5-LO를 억제하는 능력이 실험되었다. 이러한 실험은 COX-2 및 5-LO에 대한 이중 특이성을 나타내는 아카시아 속의 플라반 추출물을 선별하는 결과를 가져왔다. 본 발명은 COX-2 및 5-LO에 대해 이중 특이성을 나타내는 아카시아 속으로부터 분리된 조성물에 대한 첫 번째 기록이다.

상기의 대략적인 설명과 하기의 상세한 설명은 단지 예시적이고 설명적인 것이며 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

도 1은 아카시아 카테츄(Acacia catechu)의 유기적인 추출물로부터 얻어지는 HTP 분취물에 의한 COX-1과 COX-2의 억제를 그래프로 도시한 것이다. 상기 추출물은 양의 COX-1(■) 또는 양의 COX-2(●)의 결합의 페록시다아제 활성의 억제에 대하여 시험되었다. 시험 결과 값은 처리되지 않은 대조군에 대한 %값으로 제시하였다.

도 2는 아카시아 카테츄의 수용성 추출물로부터 얻어지는 HTP 분취물에 의한 COX-1과 COX-2의 억제를 그래프로 도시한 것이다. 상기 추출물은 양의 COX-1(■) 또는 양의 COX-2(●)의 결합의 페록시다아제 활성의 억제에 대하여 시험되었다. 시험 결과 값은 처리되지 않은 대조군에 대한 %값으로 제시하였다.

도 3은 실시예 3에서 기술된 활성 HTP 분취물 D11의 LC/PDA/MS 분석의 결과 를 도시한 것이다. 도 3A는 HTP 분취물 D11의 LC/PDA 크로마토그램을 도시한 것이다. 도 3B는 m/z=579에서 HTP 분취물 D11의 선택적 이온 크로마토그램과 로비네티니돌(robinetinidol)-(4-6/8)-카테친 화합물의 구조를 도시한 것이다. 도 3C는 m/z=291에서 HTP 분취물 D11의 선택적 이온 크로마토그램과 카테친 화합물의 구조를 도시한 것이다.

도 4는 아카시아 카테츄로부터 얻어지는 유기성(도 4A)과 수용성(도 4B) 추출물의 고-압력 액체 크로마토그라피(HPLC)를 도시한 것이다.

도 5는 5-LO 활성에 대하여 아카시아 카테츄 유기성 추출물의 효과를 그래프로 도시한 것이다.

도 6은 아카시아 카테츄에 의하여 염증을 유발하는 아라치돈산의 억제를 나타낸다. 생체내에서 효율은 실시예 9에서 기술된 것처럼 아라치돈산의 직접적인 투여(application)에 의해 유발된 부종의 억제 능력을 기초로 하여 향상되었다. 치료된 귀와 조절된 귀 사이 부종의 평균 차이는 도 6A에 도시되었다. 도 6B 아라치돈산이 처치된 대조군과 상응하는 각 그룹의 억제도 %를 도시하였다. (IP-비경구적 투여, G-경구적 투여)

도 7은 자이모산(Zymosan)에 의해 유도된 염증에 대한 규격화된 아카시아 추출물의 영향을 나타내었다. 자이모산은 실시예 9와 같이 공기 주머니에서 전-염증성 반응을 이끌어내는데 사용되었다. 전-염증적 세포의 침투를 포함하는 염증의 표지(도 7A), 상이한 실험 조건하에서의 MPO 농도(도 7B)와 공기 주머니내에서의 MPO활성 억제도 %(도 7C)는 아카시아 추출물의 항-염증성 활성의 효율과 대사기작 을 향상시키기 위하여 사용되었다.

도 8은 용액내 MeOH가 80%에서 아카시아 카테츄로부터 추출된 플라반의 HPLC를 나타낸다.

도 9는 실시예 11과 같이 플라시보(placebo),셀레콕시브(celecoxib)를 200mg/1일, 250mg/1일, 500mg/1일의 투여량으로 60일 동안 처리한 후 WOMAC 지수의 %변화를 그래프로 도시한 것이다.

도 10은 실시예 11과 같이 플라시보(placebo),셀레콕시브(celecoxib)를 200mg/1일, 250mg/1일, 500mg/1일의 투여량으로 60일 동안 처리한 후 경직성에 대한 WOMAC 지수의 %변화를 그래프로 도시한 것이다.

도 11은 실시예 11과 같이 플라시보(placebo),셀레콕시브(celecoxib)를 200mg/1일, 250mg/1일, 500mg/1일의 투여량으로 60일 동안 처리한 후 신체 기능과 관련한 WOMAC 지수의 %변화를 그래프로 도시한 것이다.

도 12는 실시예 11과 같이 플라시보(placebo),셀레콕시브(celecoxib)를 200mg/1일, 250mg/1일, 500mg/1일의 투여량으로 60일 동안 처리한 후 통증과 관련한 WOMAC 지수의 %변화를 그래프로 도시한 것이다.

이하에서 사용되는 다양한 용어들은 본 발명의 여러 관점을 나타내기 위함이다. 본 발명을 명확하게 설명하기 위하여 본 발명의 화합물들은 다음과 같이 정의한다.

"플라반(Flavans)"은 일반적으로 다음과 같은 구조를 갖는 플라보노이드의 특정 군이다.

[화학식 2]

상기 구조식에서,

R₁, R₂, R₃, R₄ 및 R₅는

R은 탄소수 1 내지 10의 알킬 기이고, X는 하이드록실(hydroxyl), 클로라이드(chloride), 아이오다이드(iodide), 설페이트(sulfate), 포스페이트(phosphate), 아세테이트(acetate), 플루오르화물(fluoride), 카보네이트 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는 약제학적으로 허용되는 중심(counter) 음이온들의 그룹으로부터 선택된다

"치료학의(Therapeutic)"는 치료 및/또는 예방을 포함한다. 동물뿐 아니라 사람과 관련된 것을 의미한다.

"약제학적 또는 치료학적 유용량(Pharmaceutically or therapeutically effective dose or amount)"은 바람직한 생물학적 결과를 유도하기에 충분한 투여량을 의미한다. 이 결과는 약학제, 징후, 증상 또는 질병 원인의 경감 또는 생물학적 시스템의 원하는 다른 결과일 수 있다.

"호스트(host)"는 여기서 설명되는 조성물이 투여되는 생명체, 인간 또는 동물을 말한다.

본 출원에서 제시되는 다양한 인용문들은 온전히 참조용으로 여기에 포함된다.

본 발명은 사이클로옥시게나제(COX-2) 및 5-리포옥시게나제(5-LO) 효소를 동시에 억제하는데 효과적인 방법을 포함한다. COX-2 및 5-LO 효소의 동시적 이중 억제의 방법은 아카시아 속에서 선택된 하나의 식물 또는 다수의 식물로부터 분리된 단독 플라반 및/또는 다수의 플라반의 혼합물로 구성된 조성물을 이를 필요로 하는 호스트에 투여하는 것으로 이루어진다.

본 발명은 또한 COX-2와 5-LO가 매개하는 질병과 이상상태를 예방하고 치료하는 방법을 포함한다. COX-2와 5-LO가 매개하는 질병과 이상상태를 예방하고 치료하는 방법은 아카시아 속에서 선택된 하나의 식물 또는 다수의 식물로부터 분리된 단독 플라반 및/또는 다수의 플라반의 혼합물과 약제학적으로 허용되는 담체로 구성된 조성물을 이를 필요로 하는 호스트에 유효한 양으로 투여하는 것으로 이루어진다.

본 발명에 따르는 플라반은 상기 일반적인 구조식에 따른다. 본 발명의 플라반은 아카시아 속으로부터 선택된 하나 또는 다수의 식물로부터 분리된다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 식물은 아카시아 카테츄(Acacia catechu), 아카시아 콘시나(Acacia concinna), 아카시아 파르네시아나(Acacia farnesiana), 아카시아 세네갈(Acacia Senegal), 아카시아 스페시오사(Acacia speciosa), 아카시아 아라비카(Acacia arabica), 아카시아 카에시아(A. caesia), 아카시아 펜나타(A.pennata), 아카시아 시누아타(A.sinuata), 아카시아 미아르시(A.mearnsii), 아카시아 픽난사(A.picnantha), 아카시아 데알바타(A.dealbata), 아카시아 아우리쿠리포르미스(A.auriculiformis), 아카시아 호로세레시아(A.holoserecia) 및 아카시아 만기윰(A.mangium)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

플라반은 줄기, 줄기껍질, 작은 가지, 괴경, 뿌리, 뿌리 껍질, 어린 순, 씨, 근경, 꽃과 다른 생식기관 및 잎과 다른 기생부분을 포함하지만 이에 한정되지 않는 식물의 다른 부위에서 발견할 수 있다.

COX 효소를 억제하는 화합물을 선별하기 위해, 중국, 인도 및 다른 나라로부터 수집한 615가지 약용 식물로부터 얻은 1230가지 추출물로 구성된 추출물 라이브러리가 만들어 졌다. 첫번째 검색에서 세포에 의한 분석(cell based assays)과 완전 혈액 분석(whole blood assays)에 의해 생체밖에서 COX-2를 특이적이고 선택적으로 억제하기 위한 그들의 능력을 연구하기 위하여 22 가지 식물 추출물이 선별되었다. 추출물을 준비하기 위한 일반적인 방법은 실시예 1에 기술되었고, 설명의 목적으로 아카시아 카테츄 종을 사용하였다. 아카시아 카테츄 껍질의 분쇄된 분말(ground powder)은 이온이 제거된(deionized : DI) 물에 의한 유기용매와 함께 추출되었다. 그러한 추출과정에 의해 시험하기 위한 각 종의 유기 및 액상 추출물이 얻어진다. 추출의 결과는 표 1에 제시된다. 이 첫번째 추출물은 COX 효소의 주된 기능적 활성 중 하나이고 상기 기술한 것처럼 PGG2를 PGH2로 궁극적으로는 PGE2로 변환시키는 원인이 되는 COX 효소의 페록시다제 활성을 억제하는지 알아보기 위한 예비 분석에서 사용될 원료 물질이다. 이 분석은 실시예 2에서 기술되었고 그 결과는 표 2에 제시된다. 표 2와 관련하여, 아카시아 카테츄로부터의 유기 및 액상 추출물이 정도는 다를지라도 COX-2의 페록시다제 활성을 억제한다는 것을 보여준다.

정제하지 않은 추출물의 첫 번째 분석으로부터 얻은 COX-2의 억제 활성은 투여량에 따른 반응과 IC₅₀(효소의 활성의 50% 억제하기 위해 요구되는 농도)에 의해 확인된다. IC₅₀ 값은 표 3에 제시된다. 상기 분석에 의하면, 아카시아 카테츄의 유기 추출물은 인간/양의 COX-2(IC₅₀=3/6 μg/mL)와 양의 COX-1(IC₅₀=2.5 μg/mL) 에 대하여 효과가 있었다. 따라서, COX 효소의 억제제에 관한 첫 번째 검색은 아카시아 속으로부터 얻은 유기 추출물이 COX-2 효소에 대해 효과가 있음을 나타내었다.

실시예 3에서 설명한 바와 같이, 식물 추출물로부터 얻은 활성 화합물을 선별하기 위해 고생산량 분취방법이 사용되었다. 간단히 말하면, 아카시아 카테츄로부터 얻은 유기 및 액상 추출물은 듀 채널 브로드밴드 UV 검색기(due channel broadband UV detector)와 투 길슨 222XL 리퀴드 핸들러(two Gilson 222XL liquid handlers)로 연결되는 고생산량 정제 시스템으로 분취된다. 88개의 분취물이 두개의 96 딥 웰 플레이트(96deep well plates)에서 수집되었다. 실시예 4에서와 같이 각 분취물은 첫 번째 검색에서 COX 활성을 억제하는 능력이 시험되었고 구조 비복제(structure dereplication)는 (+)HTP 분취물에 관하여 오프라인 LC/PDA와 LC/MS 분석으로 초기화되었다. 그 결과를 나타낸 도 1과 2은, 아카시아 카테츄의 유기 및 액상 추출물로부터 유도된 다양한 HTP 분취물에 의한 COX-1과 COX-2 억제도에 대한 내용 분석도(profile)이다. 다수의 HTP 분취물은 전체 추출물에서 발견되는 선택적 억제 효과의 원인이 되는 추출물에서의 다수의 화합물이 있음을 암시하면서 선택적 COX-2 억제 활성을 실질적으로 나타낸다.

#C8 내지 F7에 부착된(labeled) 액상 추출물로부터 얻은 활성 HTP 분취물은 (+) 모드(mode)로 LC/MS를 사용하여 분석되었다. 분취물 D11의 LC/PDA/PDA/MS 분석은 도 3에 제시되었다. 첫 번째 활성 피크(peak)는 분취물 C9 내지 D9 사이에 위 치하였고 291m/z에서 [분자 이온 +1]⁺과 함께 카테친 화합물을 포함하였다. COX-1의 선택도를 나타내는 두 번째 피크는 분취물 D9 내지 E2 사이에 위치하였고 578 m/z에서 하나의 분자 이온을 가지는 카테친 다이머(dimer)를 포함하였다. COX-2의 선택도를 나타내는 세 번째 절정은 #E8 내지 F8 사이에 위치하였고 573m/z와 579m/z에서 각각 4-하이드로옥시시나몰-올레아넨-3-올(4-hydroxycinnamoyl-oleanen-3-ol)과 로비네티니돌-카테친(robinetinidol-catechin)에 상응하는 다수의 화합물을 포함하였다.

아카시아 카테츄의 유기 추출물에 존재하는 활성 화합물의 분리, 정제 및 선별이 실시예 5에서 설명된다. 실시예 5의 방법에 의해, 카테친과 에피카테친은 아카시아 카테츄의 뿌리로부터 얻어진 유기 추출물에 있어서 IC₅₀ 5 내지 7μg/mL을 가지는 두 개의 주된 활성 화합물로서 선별되었다.

아카시아 카테츄로부터 얻은 활성 추출물의 HPLC 양화(quantification)는 실시예 6에 제시되었다. 표 4에서 제시된 결과는 HPLC에 의해 결정되는 유기 및 액상 추출물에 있어서 플라반 양은 각각 30.4%와 1.0%임을 나타낸다. 이것은 유기 추출물의 억제 활성이 액상 추출물의 억제 활성보다 두 배 이상 높은 이유를 설명한다. 또한 HPLC 분석은 각 추출물이 선택적 COX-2 억제 활성의 원인이 되는 마이너(minor) 플라반 성분을 포함한다는 것을 나타낸다. HPLC 결과는 도 4A와 B에 제시되었다.

실시예 2에 기술된 첫 번째 분석은 재결합 효소를 이용한 비세포 시스템이 다. 활성 추출물과 화합물의 생물학적 활성도를 입증하기 위하여, 세포에 의한 생체밖에서 효능과 동물에 의한 생체내에서의 효능을 나타내기 위한 두 가지 모델이 사용되었다. 생체내에서의 효능과 선택도를 평가하기 위해 사용되는 방법이 실시예 7에 설명된다. 첫 번째로 COX-1(THP-1 세포)과 COX-2(HOSC 세포)를 각각 발현할 수 있는 두 개의 세포주가 선택되었다. 각 세포 형태가 COX 효소의 첫 번째 생성물인 PGE₂의 생산에 대하여 시험되었다. 그 결과를 표 5에 제시하였는데, 아카시아 유기 추출물은 COX-1과 COX-2 효소 모두에 대해 억제도를 보이며, COX-1 효소에 대한 억제도가 더 우세함을 보인다. THP-1 세포주의 사용이 중요하고 세포막을 통과하는 활성 화합물의 능력을 입증하지만 이것은 사멸하지 않는 세포주이다. 따라서, 좀 더 적절한 모델 시스템을 기초로 하여 효능에 대한 평가가 바람직하다. 이에 따라서, COX-1과 COX-2의 첫 번째 원천인 완전 혈액(whole blood)을 이용하여 평가되었다. 상기 시스템은 COX-1과 COX-2 억제 활성을 구별하기 위해 PGE₂ 대 TXB₂의 생산량의 억제를 측정하였다. 표 5에 나타낸 결과에 의하면, COX-1과 COX-2 효소는 아카시아 추출물에 의해 억제된다. IC₅₀의 값은 상기 시스템내에서 아카시아 추출물이 COX-2에 대해 더 효율적이라는 것을 제시한다. 총괄적으로 말하면, 상기 추출물에서 활성 화합물의 억제 효과는 세포내의 비세포 시스템과 세포 시스템에서 중요하고 효율적이다.

상기에서 언급한 바와 같이, COX 및 5-LO의 이중 억제제는 COX 단독 억제제보다 뚜렷한 장점을 가지고 있다. 이러한 장점은 아라치돈산 대사산물의 억제, 위 장 내 독성의 결핍, 및 혈관수축의 잠재적 감소와 같은 광범위한 효과를 포함하지만,이에 한정되는 것은 아니다. 따라서, 실시예 8에서 기술한 바와 같이 아카시아 유기 추출물은 5-LO 억제에 대한 그들의 효과에 대해 시험되었다. 간단히 말하면, 재결합, 인간 5-LO는 효소 물질(umbelliferyl arachidonate)을 첨가하기에 앞서 15분 동안 아카시아 추출물과 함께 배양되었다. 그 결과를 도 5에 나타내었다. 상기 아카시아 추출물은 생체밖 비세포 시스템에서 5-LO 활성을 억제하였으며 IC₅₀은 70μg/mL를 나타내었다. 비록 5-LO에 대한 아카시아 추출물의 IC₅₀은 COX-2보다 높지만, 아라치돈산의 대사에 의해 유도된 염증을 치료하는데 잠재적으로 중요한 이점을 추가한다.

아카시아 추출물로부터 발견된 생체밖에서의 효능이 생체내에서의 염증 반응을 억제한는 능력으로 번역되는지 결정하기 위해 개별적인 생체내 모델이 사용되었다. 두 가지 모델이 실시예 9에 설명된다. 이 시스템의 첫 번째는 아라치돈산의 대사경로에 의한 직접적인 염증을 측정하기 위해 고안되었다. 이러한 실시예에서 염증성 반응을 유도하기 위해 쥐의 귀에 아라치돈산을 국부적으로 투여하기에 앞서 쥐를 아카시아로부터 얻은 추출물로 처리하였다. 쥐의 전처리 효과는 마이크로미터를 사용하여 귀의 부종의 억제 정도로 측정되었다. 아카시아 추출물은 아라치돈산으로 유도된 염증 반응의 특이적 억제를 나타냄으로써 좋은 억제 반응을 나타내었다. 그 결과는 도 6A와 6B에 설명되었다. 더불어, 추출물은 구강적으로 또는 내복막적으로(interperitoneally) 투여되었을 때 중요한 억제를 보여준다. 따라 서, 아카시아 추출물은 다수의 경로에 의한 투약으로 염증을 감소시키는데 효율적임을 나타내었다.

아카시아로부터 얻어진 유기 추출물은 아라치돈산으로 직접적으로 유도된 염증에 대하여 가장 효율적이었다. 따라서, 표준화된 아카시아 추출물의 효능은 궁극적으로 다수의 염증 대사가 최후의 효과의 원인이 되는 두 번째 모델을 사용하여 시험되었다. 그러므로 이 시스템은 자연스럽게 발생하는 염증성 반응 더 연관이 있다. 이 모델을 사용하여, 보완 시스템의 잠재적 활성제가 Balb/C 쥐의 등에 생긴 공기 주머니에 주입된다. 이것은 염증세포의 침윤, COX 효소의 활성을 포함하고 PGE₂, 효소 마에로페록시다제(myeloperoxidase, MPO)의 방출 결과, TNF-α를 포함하는 전-염증성 시토킨(cytokines)의 특이적 내용 분석 결과를 포함하여 일련의 단계적 반응의 염증 결과를 낳는다. 상기와 같은 연구는 아카시아가 염증 세포로부터 공기 주머니로의 최초 침윤을 억제하지는 못할지라도 염증 세포의 활성을 방해함을 입증하였다. 이것은 공기 주머니에서 세포밖 유체로 분출되는 MPO 부족과 TNF-α 생산의 부족으로 입증되며 도 7에 나타낸다. 그 결과 아카시아 추출물이 효율적이라는 것과 다수의 염증적 경로가 활성인 모델 시스템에서 염증 반응을 통제하는 것을 돕는다는 것이 입증되었다. 그러나, 표준화된 추출물은 아카시아 추출물 IP의 가장 높은 농도 (200mg/kg)를 투여한 동물의 60%가 치명적인 독성효를 생산한다. 상기 독성효는 같은 양이 위관 영양(gavage)에 의해 투여된 경우에는 관찰되지 않는다.

제약의 형태로 투여하기 위한 제품의 제조는 당업자에게 잘 알려진 다양한 방법에 의해 수행될 수 있다. 플라반은 천연의 형태로 존재하는 허브 파우더;다양한 농도의 용매 및/또는 초임계 유체 추출물; 재결정, 컬럼 분리, 용매상 분리, 침전 및 다른 방법을 통한 농축 및 정제된 화합물 및 합성에 의해 준비된 정제된 플라반을 포함하는 단일 및/또는 혼합물로 제제될 수 있다.

종래 알려진 다양한 운반 시스템이 본 발명의 치료적 조성물을 투여하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 수용액, 리포좀에 의한 캡슐, 미립자 및 마이크로 캡슐이다.

약제 투여 방법으로는 동맥주사(intraarticular injection), 흡입성 분무제(inhalant mists), 경구적으로 활성인 제제(orally active formulation), 경피성 전리요법(transdermal iontophoresis) 또는 좌약(suppositories)과 같은 효과적 투여 방법을 들 수 있으나, 본 발명의 약제학적 조성물은 주사에 의한 비경구적 방법으로 투여될 수 있다. 바람직한 운반체로는 생리 염수를 들 수 있으나, 다른 약제학적으로 허용될 수 있는 운반체들도 사용될 수 있을 것이다. 바람직한 실시예로서, 운반체 및 플라반이 생리적으로 융화되어 서서히 방출되는 제제를 구성하는 것을 들 수 있다. 상기 운반체에서 주요 용매는 본래 수용성 또는 비수용성일 수 있다. 게다가, 운반체는 약제의 pH, 삼투압(osmolarity), 점성(viscosity), 투명도(clarity), 색(color), 무균성(sterility), 안정성(stability), 용해율(rate of dissolution) 또는 제제의 향(odor of formulation)을 조절하거나 유지하기 위하여 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함할 수 있다. 유사하게, 운반체는 안정 성, 용해율, 리간드의 방출 또는 흡착을 조절하거나 유지하기 위하여 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함할 수 있다. 상기 부형제들은 단일 약제 또는 복합 약제 형태의 비경구 투여용 약제로 성형하기 위하여 통상적으로 사용되는 물질들이다.

치료용 조성물이 제제화되면, 용액, 현탁액(suspension), 겔, 유화제(emulsion), 고체 또는 탈수된(dehydrated) 또는 동결 건조된(lyophilized) 파우더; 또는 직접 캡슐화 된 형태 및/또는 경구 투여용 불활성 운반체들과 정제(tablete)화된 형태로 살균 바이알(vials)에 저장될 수 있다. 이러한 제제들은 튜여되기 전에 바로 사용할 수 있는 형태이거나 물에 타서 사용할 수 있는 분말의 형태로 저장될 수 있다. 전신 운반용 조성물을 함유하는 제제를 투여하는 방법은 장, 피하, 근육내, 정맥내, 비경, 질 또는 직장을 통하여 투여된다.

특별한 병 또는 이상 증상을 치료하는 데 유효한 조성물의 양은 병 또는 이상 증상의 성질에 따라 좌우되며, 표준적인 임상 기술에 의해 결정될 수 있다. 게다가, 최적의 투여량 확인을 위하여 생체밖 또는 생체내의 분석이 선택적으로 이용될 수 있다. 제제로 투여되는 정확한 양은 투여 경로, 질병 또는 이상 증상의 심각성이나 진전에 따라 좌우되며, 의사와 환자의 상화에 따라 결정된다. 유효한 투여량은 생체밖 또는 동물 모델 테스트 시스템으로부터 유도되는 투여량에 따른 반응 곡선으로부터 외삽하여 추정될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 유효한 투여량은 본 발명 조성물을 등급화 된 양으로 투여하여 원하는 효과를 관찰함으로써 쉽게 결정된다.

본 발명에 따른 치료 방법은 단일한 원료 또는 복합적 원료로부터 얻은 단독 플라반 및/또는 다수의 플라반의 치료학상으로 유효한 양을 필요로 하는 환자의 내부에 또는 국부에 투여하는 것을 포함하여 이루어진다. 단독 플라반 및/또는 다수의 플라반의 순도는 0.01 내지 100% 범위내에 포함되지만, 이에 한정되지 않으며, 화합물을 얻기 위하여 사용되는 방법에 의존한다. 바람직한 실시예에서 플라반과 플라반을 함유하는 약제 조성물의 투여량은 체중의 0.01 내지 200mg/kg의 범위 내에서 선택된 양으로 투여하는 것이 유효하고 비독성이다. 일상적인 임상 테스트를 이용하는 당업자들은 치료되어야 할 개개의 질병에 따라 최적의 투여량을 결정할 수 있다.

본 발명은 실시예 10에서 설명한 바와같이 아카시아로부터 얻은 플라반을 분리하고 정제하는데 있어서 향상된 방법을 포함한다. 실시예 10에서는 아카시아 카테츄로부터 얻은 플라반을 다른 용매 시스템으로 추출하였다. 그 결과를 표 6에 나타내었다. 본 발명의 향상된 발명은 단독 유기 용매 또는 유기 용매 및/또는 물과의 혼합물과 플라반을 함유하는 식물의 분쇄된 바이오매스(식물자원) 추출물; 중화 및 중화된 추출물의 농축; 및 재결정 및/또는 크로마토그래피에 의한 상기 추출물의 정제를 포함하여 이루어진다. 표 6에서와 같이 물의 80%가 메탄올인 경우 아카시아로부터 플라반을 추출하기 위한 좋은 용매 중 하나이다. 상기 제공한 바와 같이, 본 발명의 플라반은 아카시아 속의 식물로부터 분리될 수 있다. 본 발명의 방법은 본 발명의 화합물을 함유하는 식물 원료로부터 본 발명의 화합물을 분리하는 방법을 포함한다,

게다가, 플라반은 식물 전체, 줄기, 줄기껍질, 가지, 괴경, 꽃, 열매, 뿌리, 뿌리껍질, 어린순, 씨, 근경 및 기타 기생부분을 포함하지만 이에 한정되지 않는 식물의 다양한 부분으로부터 분리될 수 있다. 바람직한 실시예에서 플라반은 뿌리, 생식기 또는 식물 전체로부터 분리된다.

식물의 분쇄된 바이오매스의 추출을 위하여 사용되는 용매는 물, 산성화된 물, 혼화할 수 있는 수산화 유기 용매와 배합된 물을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 상기 혼화할 수 있는 수산화 유기 용매는 메탄올 또는 에탄올 그리고 알콜과 THF, 아세톤, 에틸 아세테이트 등과 같은 유기 용매의 혼합물을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 바람직한 실시예에서 추출물은 4.5 내지 5.5의 pH로 중화되고, 중화된 후 농축 및 건조되어 파우더로 된다. 플라반은 재결정(recrystallization), 용매상 분배(solvent partition), 침전(precipitation), 승화(sublimation) 및/또는 크로마토그래피를 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 방법에 의하여 정제될 수 있다. 상기 크로마토그래피는 이온교환크로마토그래피(ion exchange chromatography), 흡착크로마토그래피(absorption chromatography), 역상크로마토그래피(reverse phase chromatography), 겔투과크로마토그래피(size exclusive chromatography), 초여과(ultra-filration) 또는 이들의 복합된 방법을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.

실시예 11은 류마티즘 관절염 또는 무릅 및/또는 골반의 골관절염에 의하여 발생하는 통증의 완화에 대한 플라반의 효능을 평가하기 위하여 수행되는 임상적 연구를 설명한다. 상기 연구는 단일-중심(single-center), 무작위(randomized), 이중-맹검법(double-blind), 플라시보-조절(placebo-controlled) 방법을 사용하였 다. 류마티즘 관절염 또는 무릅 및/또는 골반의 골관절염이 있는 60명의 피시험자(n=60)들을 무작위로 4개의 그룹으로 나눈 후 60일 동안 플라시보, 조성물 A(250mg/일 또는 500mg/일) 또는 셀레콕시브(200mg/일)로 치료하였다. 조성물 A는 총 플라반 함량이 10.3%(w/w)인 아카시아 카테츄 추출물을 포함하는 표준화된 추출물의 적절한 비율로 구성된다. 셀레브렉스로 알려진 셀레콕시브는 COX-2 선택적 억제제인 처방약의 상표명이다. 표 7은 치료 전의 WOMAC 지수 값(기준 점수)을 나타내고, 표 8은 치료 후의 WOMAC 지수 값의 변화를 나타낸다. 도 9 내지 12가 상기 연구 결과를 도식적으로 설명한다.

도 9 내지 12에서 보여주는 바와 같이, 통증, 경직성, 신체 기능과 관련 있는 WOMAC 종합 점수 및 개별적인 항목 점수가 플라시보 투여 그룹에 비하여 플라반의 투여 그룹이 상당히 향상되었음이 나타났다. 더욱이, 플라반은 처방약 셀레코시브와 같은 통증 감소 효능 및 물리작용의 향상을 보였다. 결론적으로 플라반을 두 가지 다른 형태로 투여하였을 때 그 효능에 있어서 어떤 차이도 발견되지 않았다.

하기 실시예들은 단지 설명을 위한 목적으로 제공될 뿐 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

실시예 1. 아카시아 카테츄(Acacia cathechu)로부터 얻은 유기 및 수용성 추출물의 제조

아카시아 카테츄 (L) 윌드(Acacia cathechu(L) Willd)로부터 얻은 식물 원 료를 2mm이하의 입자 크기로 분쇄하였다. 분쇄한 식물 원료를 건조한 후 60g을 에를렌마이어(Erlenmeyer) 플라스크(삼각 플라스크)에 옮기고 1:1 비율의 메탄올과 디클로로메탄의 혼합용매 600ml을 첨가하여 혼합물을 준비하였다. 준비된 혼합물을 1시간 동안 교반한 후 여과하였고, 바이오매스를 1:1 비율의 메탄올과 디클로로메탄의 혼합용매 600ml로 다시 추출하였다. 유기 추출물들을 배합하여 진공 증착하여 하기 표 1의 유기 추출물을 제조하였다. 유기 추출 후에 바이오매스는 공기 건조하여 초순수(ultra pure water) 600ml로 한번 추출하였다. 수용액은 여과하여 냉동 건조한 후 하기 표 1의 수용성 추출물을 제조하였다.

아카시아 카테츄의 유기 및 수용성 추출물들의 수율

식물 원료	식물 원료의 양	유기 추출물	수용성 추출물
아카시아 카테츄	60g	27.2g	10.8g

실시예 2. 아카시아 카테츄로부터 얻은 식물 추출물에 의한 COX-2 및 COX-1 페록시다아제의 억제

특이한 COX-2 억제제의 선별을 위한 생분석적 검색과정(screening process)이 하기의 방법대로 효소의 페록시다아제 활성을 분석하고자 고안되었다.

페록시다아제 분석(Peroxidase Assay). COX-2 억제제를 검출하기 위한 분석이 고생산량 플랫트폼(platform)을 위하여 변형되었다.(Raz and Needleman(1990) J.Biol.Chem. 269:603-607). 간단히 말하면, 페록시다아제 버퍼(100mM TBS,5mM EDTA, 1μM 헴(Heme), 0.01mg 에피네프린(epinephrine), 0.094% 페놀)내의 재결합 양의 COX-2(캐이먼사, Cayman)를 1:500의 비율로 희석된 추출물과 함께 15분 동안 인큐베이트에서 배양시켰다. 배양시킨 후 쿠안타블루(Quantablu, 피어스(Pierce)사) 기질을 첨가하여 25℃에서 45분 동안 성숙시켰다. 성숙시킨 후 월락 빅토 2 플레이트 판독기(Wallac Victor plate reader)로 발광(luminescence)을 판독하여 그 결과를 표 2에 나타내었다.

표 2의 결과 값은 재결합 양의 COX-2 효소와 기질만으로 이루어진 군에 대한 페록시다아제 활성의 %값으로 제시된다. 억제 %는 수용성 추출물에 관해 30%(70% of contro)에서 유기 추출물에 관해 75%의 범위로 나타났다. 결과는 명확히 생체밖에서 유기 추출물이 더욱 효율적임을 보여준다.

아카시아 카테츄에 의한 COX-2 페록시다아제 활성의 억제도

식물 원료	유기 추출물에 의한 COX-2 억제	수용성 추출물에 의한 COX-2 억제
아카시아 카테츄	75%	30%

COX-1과 COX-2 이성체의 상대적인 억제도를 비교하기 위해서는 이러한 효소들 각각에 대한 IC₅₀ 값을 얻을 필요가 있다. IC₅₀ 값이란 대조군에 대한 효소 활성의 억제 정도가 특정 억제제에 의하여 50% 달성되었을 때의 농도로 정의된다. 본 실시예의 경우, 표 3에서 나타나는 바와 같이 COX-1 및 COX-2 효소 각각에 대한 IC₅₀값이 3 내지 6μg/ml 및 2.5μg/ml의 범위 내에 있는 것으로 나타났다.

인간과 양의 COX-2 및 COX-1에 대한 IC₅₀ 값

식물 원료	IC₅₀인간 COX-2(μg/ml)	IC₅₀양 COX-2(μg/ml)	IC₅₀양 COX-1(μg/ml)
아카시아 카테츄	3	6.25	2.5

실시예 3. 활성 추출물들의 HTP 분취

실리카 겔로 미리 충전된 플래시 칼럼(2cm ID × 8.2cm, 10g silica gel)에 아카시아 카테츄로부터 얻은 유기 추출물(400mg)을 로딩(loading)한 후 (A) 50:50의 에틸아세테이트:헥산 용리액 100%에서 (B) 메탄올 용리액 100%까지의 변화에 따른 이동상의 HTP 시스템(Hitachi High throughput purification system)을 이용하여 5mL/min의 유속으로 30분 동안 용리하였다. 용리하여 분리한 분리액을 브로드밴드(broadband) 파장 UV 검출기로 검출한 후 분취액을 길슨 분취 수집기(Gilson fraction collector)를 이용하여 96-딥-웰 플레이트(96-deep-well plate)에 1개의 웰 당 1.9mL의 양으로 수집하였다. 시료 플레이트를 낮은 진공 하에서 건조하고 원심분리하였다. 각 셀에 있는 시료를 DMSO(1.5mL)로 용해하여 그 중 100μL를 취하여 COX 억제 분석을 위하여 사용하였다.

아카시아 카테츄로부터 얻은 수용액 추출물(750mg)을 물(5mL)로 녹인 후 1μm 시린지 여과기로 여과하고 4mL HPLC 바이알에 옮겨 담았다. 그 용액을 자동시료주입기(autosampler)로 미리 충전된 역상 칼럼에 주입하였다.(C-18,15μm 입자 크기, 2.5cm ID ×10cm with precolumn insert). 그 칼럼을 HTP(Hitachi high throughput purification) 시스템을 이용하여 용리하는데, (A) 물 100%에서 (B) 메탄올 100%까지의 변화량에 따른 이동상으로 20분 동안 흘려준 후 100% 메탄올로 5분 동안 10mL/min의 유속으로 용리시켰다. 분리액을 브로드밴드 파장 UV 검줄기로 검출한 후 그 분획물을 길슨 분할 수집기(Gilson fraction collector)를 이용하여 96-딥-웰 플레이트(96-deep-well plate)에 1개의 웰 당 1.9mL의 양으로 수집하였 다. 시료 플레이트를 냉각 건조한 후 각 셀(cell)의 시료를 초순수(Ultra pure water, 1.5mL)로 용해한 후 100μL를 취하여 COX 억제 분석을 위하여 사용하였다. 웰 #C8 내지 F7의 활성 HTP 분취물을 수퍼 소닉(super sonic) 이온화 원료와 함께 (+) 모드(mode)로 LC/MS/PDA로 분석하였다. 활성 분취물 D11의 결과를 도 3에 나타내었다.

실시예 4. 아카시아 카테츄로부터 얻은 HTP분취물에 의한 COX 페록시다아제 활성의 억제도

개개의 유기 추출물들은 COX-1 및 COX-2 재결합 효소의 페록시다아제 활성을 억제하는 능력에 대하여 HTP 분취물 각각을 시험함으로써 더욱 특정화되었다. 그 결과를 도시한 표 1 과 2에 의하면, 실시예 1에서 설명한바 대로 분리된 아카시아로부터 HTP 분취에 의한 COX-2 및 COX-1 활성의 억제도를 나타낸다. 도 1에 도시한 내용분석(profile)을 보면 COX-2에 대하여 매우 선택적인 억제 피크(peak)와 같은 효율로 두 효소를 억제하는 다수의 피크가 나타났다. 그러나, COX-1 및 COX-2 효소에 대하여 다수의 피크가 보임에 따라 이들의 개시적 억제 프로필(profile)에 기여하는 분자가 하나 이상일 것임을 추측할 수 있다.

실시예 5. 아카시아 카테츄로부터 얻은 활성 화합물의 분리 및 정제

상기 실시예 1에서 분리된 아카시아 카테츄 뿌리로부터 얻은 유기 추출물(5g)을 실리카 겔로 미리 충전된 플래쉬 칼럼(120g silica, 40μm 입자 크기 32-60μm ,25cm × 4cm)에다 로딩(loading)한 후, (A) 50:50 에틸아세테이트:헥산 100%에서 (B) 메탄올로 100%까지의 변화량에 따른 이동상으로 60분 동안 15mL/min의 유속으 로 용리하였다. 용리하여 분취한 분취물(fraction) 중에서 10mL을 시험용 튜브에 수짐하였다. 그 용매를 진공 하에서 증발시키고, 각 분취물에서 용매를 증발시켜 얻은 시료를 1mL의 DMSO에 용해하여 20μL의 분취량(aliquot)을 96 웰 샐로우 디쉬 프레이트(96 well shallow dish plate)에 옮겨 담은 후, COX 억제 활성에 대하여 시험하였다. COX분석을 근거로 하여 활성 분취액(fractions) #31 에서 #39을 배합하여 고체 2.6g이 생산되도록 증착시켰다. HPLC/PDA 및 LC/MS에 의한 분석이 두 개의 중요 호합물의 체류 시간(retention time)이 각각 15.8분과 16.1분임을 보였다. 그 생성물을 C18 반-준비 칼럼(semi-preparation column, 25cm × 1cm)에서 더 정제하고, 생성물 212.4mg을 로딩(loading)하고, (A)물과 (B)아세토니트릴(ACN)을 비율 변화에 따른 이동상을 이용하여 5mL/분의 유속으로 60분 동안 용리하였다. 88개의 분취액을 수집하여 두 개의 활성 화합물이 분리되었다. 화합물 1(11.5mg)과 화합물 2(16.6mg). 순도는 표준물(카테친과 에피카테친) 및 NMR 데이터를 기준으로 HPLC/PDA 및 LC/MS에 의해서 결정되었다.

화합물 1. ¹³C NMR: δppm.(DMSO-d6) 27.84(C4), 66.27(C3), 80.96(C2), 93.78(C9), 95.05(C7), 99.00(C5), 114.48(C12), 115.01(C15), 118.36(C16), 130.55(C11), 144.79(C14), 155.31(C6), 156.12(C10), 156.41(C8). ¹H NMR:δppm.(DMSO-d6) 9.150(1H,s,OH), 8.911(1H,s,OH), 8.835(1H,s,OH), 8.788(1H,s,OH), 6.706(1H,d,J=2Hz,H2'), 6.670(1H,d,J=8.0Hz,H-6'), 6.578(1H,dd,J=2,8Hz,H-5'), 5.873(1H,d,J=2Hz,H8), 5.670(1H,d,J=2Hz,H8), 4.839(1H,d,J=4Hz,OH), 4.461(1H,d,J=7.3Hz,H2), 3.798(1H,m,H3), 2.625(1H,m,H4b), 2.490(1H,m,H4a). MS: [M+1]⁺=291m/e. 이 화합물은 카테친으로 확인되었다. COX-1 과 COX-2 효소에 대한 에피카테친의 IC₅₀ 값은 각각 6μg/mL 와 40μg/mL 이다.

화합물 2. ¹³C NMR: δppm.(DMSO-d6) 28.17(C4), 64.87(C3), 78.02(C2), 94.03(C9), 95.02(C7), 98.44(C5), 114.70(C12), 114.85(C15), 117.90(C16), 130.56(C11), 144.39(C14), 155.72(C6), 156.19(C10), 156.48(C8). ¹H NMR:δppm.(DMSO-d6)9.083(1H,s,OH), 8.873(1H,s,OH), 8.777(1H,s,OH), 8.694(1H,s,OH), 6.876(1H,d,J=2Hz,H2'), 6.646(2H,s,H-5',6'), 5.876(1H,d,J=2Hz,H8), 5.700(1H,d,J=2Hz,H6), 4.718(1H,s,OH), 4.640(1H,d,J=4.5Hz,H2), 3.987(1H,d,J=4.5Hz,H3), 2.663(1H,dd,J=4.6,6.3Hz,H4b), 2.463(1H,dd,J=4.6, 6.3Hz,H4a). MS: [M+1]⁺=291m/e. 이 화합물은 에피카테친으로 확인되었다. COX-1 과 COX-2 효소에 대한 에피카테친의 IC₅₀ 값은 각각 7μg/mL 와 20μg/mL 이다.

실시예 6. 아카시아 카테츄로부터 얻어진 활성 추출물의 HPLC 정량분석

아카시아 카테츄로부터 얻어진 유기 및 액상 추출물에서의 플라반 성분은 포토다이오드(PhotoDiode) 분석기(HPLC/PDA)와 루나(Luna) C18 컬럼(250 mm× 4.6 mm)를 사용하여 HPLC에 의해 정량되었다. 플라반은 20분 동안 10% 내지 30%, 60분 동안 60%의 아세토니트롤 곡선을 사용 하여 컬럼으로부터 용리되었다. 그 결과를 표 4에 나타냈다. 상기 플라반은 표준으로 카테친과 에피카테친을 사용하여 PDA 데이터와 머무른 시간을 기초로하여 정량되었다. 두 개의 주된 플라반의 머무른 시간은 각각 12.73분과 15.76분이었다. HPLC 크로마토그래피는 도 4A와 4B에 도시되었다.

활성 식물 추출물에서 프리-비-링 플라보노이드(Free-B-Ring Flavonoid) 성분

활성 추출물	추출물의 무게(g)	바이오매스로부터의 추출물 %	추출물에서의 플라반 %
아카시아 카테츄 (액상 추출물=AE)	10.8	18.0	0.998
아카시아 카테츄 (유기 추출물=OE)	27.2	45.3	30.37

실시예 7. 아카시아 카테츄로부터 얻은 유기 추출물의 COX 억제 활성도의 생체밖에서의 연구

아카시아 카테츄로부터 얻은 유기 추출물의 COX 억제 활성도의 생체밖에서의 효능 및 COX-2 특이성이 아라치돈산 대사산물의 생성을 억제하는 그들의 능력에 대하여 세포에 의한 시스템에서 시험되었다. 본질적으로 COX-2를 발현하는 세포주(cell line)의 HOSC 및 COX-1을 발현하는 THP-1이 아라치돈산 존재 하에 프로스타글라딘 E2(PGE 2)를 생성하는 그들의 능력에 대하여 시험되었다.

COX-2 세포에 의한 분석(COX-2 Cell Based Assay). HOSC(ATCC#8304-CRL) 세포들을 80 내지 90%까지 충분히 배양시킨 후, 배양시킨 세포를 트립신 처리하여 세척하고, 조직 배양 배지(MEM)에서 1×10⁶ cells/mL의 농도의 10mL로 재현탁하였다. 그 세포 현탁액(200μL)을 96 웰 조직 배양 플레이트에 옮겨 담은 후 37℃의 온도 및 5% CO₂ 인큐베이터에서 2시간 동안 배양하였다. 그 배지를 1ng/mL의 IL-1b를 함유하는 새로운 HOSC 배지로 교체한 후 밤새 배양하였다. 그 배지를 다시 제거한 후 190mL의 HOSC 배지로 교체하였다. 시험 화합물을 10μL의 HOSC 배지에 첨가하고 37℃에서 15분 동안 인큐베이터에서 배양하였다. HOSC 배지(20mL, 100μM)에 있는 아라치돈산을 첨가한 혼합물을 세이커(shaker) 위에서 실온으로 10분 동안 배양하였다. 상충액(20μL)을 엘리사 버퍼에 있는 100μM 인도메타신(indomethacin) 190μL/well을 함유하는 새로운 플레이트에 옮겨 담았다. 상충액은 하기와 같이 엘리사(ELISA)에 의해 분석하였다.

COX-1 세포에 의한 분석(COX-1 Cell Based Assay). THP-1 세포를 5×10⁵cells/mL의 농도의 30mL 부피량으로 현탁하였다. TPA를 최종농도가 10nM가 되도록 첨가한 후 세포들을 대식세포(macrophage, adherent)에서 분화시키기 위하여 48시간 동안 배양하였다. 세포들을 HBSS(25mL)에 재현탁시킨 후 200mL 부피의 96 웰 플레이트에 5×10⁵cells/mL의 양으로 첨가하였다. RPMI 1640(10μL)에 있는 시험 화합물을 첨가한 후 37℃에서 15분 동안 인큐베이트에서 배양하였다. RPMI(20μL)에 있는 아라치돈산을 첨가한 혼합물을 세이커 위에서 10분 동암 실온에서 배양하였다. 상충액(20μL)을 인도메타신(indomethacin)을 함유하는 엘리사 버퍼(190μL)에 첨가한 후, 그 상충액을 하기에 설명되는 바와 같이 엘리사에 의하여 분석하였다.

COX-2 완전 혈액 분석(COX-2 Whole Blood Assay). 정상적이고 건강한 헌 혈자로부터 얻은 말초 혈액(Peripheral blood)을 정맥천자(veinpuncture)에 의하여 수집하였다. 완전 혈액(500μL)을 시험 화합물과 추출물과 함께 인큐베이터에서 배양하여 37℃에서 15분 동안 배양하였다. 리포폴리사카라이드(Lipopolysaccharide, from E.Coli serotype 0111:B4)를 최종 농도가 100μg/mL로 될 때까지 첨가하고 37℃에서 밤새 동안 배양하였다. 혈액을 원심분리(12000×g)하여 플라즈마를 수집하였다. 수집한 플라즈마(100μL)에 메탄올(400μL)를 첨가하여 단백질을 침전시키고, 상부층은 엘리사에 의하여 PGE2 생성에 대하여 측정하였다. 이러한 처리 과정은 브리디아우(Brideau et al. (1996) Inflamm.Res. 45:68-74)에 의해서 보고된 방법을 변형하여 사용한 것이다.

COX-1 완전 혈액 분석(COX-1 Whole Blood Assay). 항응고제를 함유하지 않는 튜브에 신선한 혈액을 수집한 후, 즉시 실리콘화된 마이크로 원심분리기의 500μL 분취기에 분취하였다. 시험 시료를 첨가하여 와동시킨 후 37℃에서 1시간 동안 응고시켰다. 시료를 원심분리(12000×g)하여 플라즈마를 수집하였다. 수집한 플라즈마(100μL)에 메탄올(400μL)를 첨가하여 단백질을 침전시켰다. 상층액은 엘리사에 의하여 TXB2 생성에 대하여 측정되었다. 이러한 처리 과정은 브리디아우(Brideau et al. (1996) Inflamm.Res. 45:68-74)에 의해서 보고된 방법을 변형하여 사용한 것이다.

엘리사 분석(ELISA Assay). 이뮤놀론-4(Immunolon-4) 엘리사 플레이트를 pH 9.2 카보네이트 버퍼에 0.5-4μg/mL의 포획 항체로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 코팅한 플레이트를 세척하고 실온에서 2시간 동안 블로킹 버퍼(blocking buffer,PBS+1% BSA)로 배양하였다. 배양한 플레이트를 다시 세척한 후 시험 시료(100μL)를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 흔들면서 배양하였다. 두 번째 항체와 결합된 페록시다아제가 0..5-4mg/mL의 양으로 50μL의 체적을 가한 후 실온에서 1시간 동안 흔들면서 배양하였다. 배양한 플레이트를 3번 세척한 후 TMB 기질(100μL)을 첨가하였다. 이러한 플레이트를 30분 동안 성장하도록 하고, 1M의 인산(100μL)을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 반응을 정지시킨 후 월랙 빅토 2 플레이트 판독기로 450nm에서 판독하였다.

세포독성에 의한 세포파괴(Cytotoxicity). 세포독성에 의한 세포파괴가 손상세포내에서 락테이트 디하이드로게나제(lactate dehydrogenase)의 방출을 측정하는 측색계 키트(옥스포드 생화학 연구소)를 이용하여 평가되었다. 분석이 제조자의 사용지침에 따라 수행되었다. 아카시아 카테츄로부터 얻어진 정제된 플라반과 표준화된 추출물이 시험되었다. 시험된 화합물에서는 세포독성에 의한 세포파괴가 발견되지 않았다.

이러한 분석의 결과를 표 5에 나타내었다. 그 결과 값은 직접적인 비교를 위한 IC₅₀ 값으로 제시된다. 표 5에서 알 수 있는 바와 같이, IC₅₀ 값은 대개 COX-2 보다는 COX-1의 값이 더 낮다. 더불어, 완전 혈액 또한 PGE2의 구별되는 억제(이러한 시스템내에서의 COX-2의 측정) 또는 트롬복산 B2(thromboxane B2,TXB2,COX-1 활성의 측정)에 대하여 측정되었다. 표 5에 의하면, 이러한 연구가 시험된 완전 혈액 용액에 기초한 분석에서 COX-2 억제에 대한 특이성을 명확하게 보여준다. 그 러나, 모델 시스템에 기초한 THP-1과 HOSC를 사용한 연구는 COX-1에 대한 높은 선택도를 나타냈다. 이러한 특이성에 대한 가능한 이유는 효소 각각을 구성적으로 발현하는 영구 세포 계열과 COX 효소가 발현되도록 하는 완전 혈액으로부터 유도되는 프라이머리 세포 사이에서의 근본적인 차이 때문이다. 프라이머리 세포는 생체내의 염증 과정을 연구하는데 더 적절한 모델이다. 게다가, 각 시스템에서 COX-1 대 COX-2의 활성을 확인하기 위해 사용되는 화합물은 각 시스템에서 다양하며 결론적으로 직접적으로 비교되지 않는다.

전체 세포 시스템에서의 COX 활성의 억제도

	세토주에 의한 분석		완전 혈액에 의한 분석
식물 원료	IC₅₀ COX-2 (μg/mL)	IC₅₀ COX-1 (μg/mL)	IC₅₀ COX-2 (μg/mL)	IC₅₀ COX-1 (μg/mL)
아카시아 카테츄	78	22	40	＞50

실시예 8. 아카시아 카테츄로부터 얻은 유기 추출물에 의한 5-LO의 억제도

5-LO 분석(5-LO Assay). 인간 재결합 5-LO 효소(Cayman)를 분석 버퍼(50mM Tris-HCL,pH 7.5, 2mM CaCl₂, 1 mM ATP)에 1:50으로 희석하였다. 1:500 으로 희석한 샘플의 같은 부피와 희석된 효소를 15분동안 세이킹하면서 배양하였다. 기질(umbelliferyl arachidonate, 1:5000 in assay buffer)을 첨가하고 혼합물을 세이킹하면서 실온에서 30분 동안 배양하였다. 발광의 결과는 왈락 빅터 2 플레이트 리더(Wallac Victor 2 plate reader)를 사용하여 측정되었다. 그 결과는 도 5에 제시되었다.

실시예 9. 아카시아카테츄로부터 얻은 유기 추출물의 COX 억제 활성에 대한 생체내에서의 연구

염증에 대한 생체내에서의 억제도가 두 가지 모델 시스템을 이용하여 측정되었다. 첫 번째 시스템(귀 부종 모델)은 아라치돈산에 의하여 직접적으로 유도된 염증을 측정하는 것이다. 이러한 시스템은 COX-2의 우수한 측정방법이지만, 포스포리파제(phospholipase) A2(PLA2)에 의한 세포 막 인지질로부터의 아라치돈산 방출의 역행을 일으키는 세포의 어떤 결과들을 측정하지는 못한다. 따라서 좀 더 생물학적 관련 반응 내에서 억제제가 어떻게 작용하는지를 결정하기 위하여 공기 주머니 모델(air pouch model)이 사용되었다. 이러한 모델은 아라치돈산 대사산물뿐만 아니라 시토킨(cytokine)을 함유하는 강한 세포 침윤 및 염증성 매개자 생성에 의하여 특정화되는 염증성 반응을 유도하기 위하여 강력한 활성자의 보체를 이용한다.

귀 부종 모델(Ear Swelling Model). 귀 부종 모델은 아라치돈산 물질대사의 억제에 대한 직접적인 측정방법이다. 간단히 말하면, 아세톤에 있는 아라치돈산을 국부적으로 쥐의 귀에 투여한다. 아라치돈산의 물질대사는 COX-2와 같은 효소의 작용에 의하여 생성되는 전 염증성 매개자를 생성한다. 부종의 억제는 이러한 경로에 관여하는 효소를 직접적으로 억제하는 방법이다. 그 결과를 나타낸 도 6은 튜브에 의한 경구적 투여(G) 또는 비경구적 장내로의 투여(IP) 방법으로 24시간이 되는 점과 1시간이 되는 두 점에서 운반되는 추출물의 효과를 보여준다. 아카시아 추출물은 IP와 경구적 투여에 의해 운반되었을때 부종을 억제한다.(도 6A 및 6B)

공기 주머니 모델(Air Pouch Model). 아카시아 유기 추출물이 귀 부종 모델 에서 훨씬 효과적이기 때문에 규격화된 아카시아 추출물 또한 염증의 공기 주머니 모델을 이용하여 시험되었다. 간단히 말하면, 공기 주머니는 3mL의 무균 공기를 쥐의 등에 주입하여 발생되는 것이다. 공기 주머니는 일주일 동안 이틀에 한번씩 1mL의 무균 공기를 추가 주입하여 유지시켰다. 동물들은 귀 부종 모델에 대하여 보고된 바대로의 방법과 농축으로 투여되고 염증성 반응을 개시하기 위하여 공기 주머니내로 자이모산(Zymosan)을 투여하였다. 4시간 이후에 주머니 내에 유체가 수집되었고, 염증성 세포의 침윤, 마이크로페록시다아제(macroperoxidase, MPO) 활성도(세포의 활성도 측정, 탈과립(degranulation))에 대하여 측정되었다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7A는 공기 주머니 유체로부터 수집한 총 세포수를 보여준다. 대조군(인도메타신, indomethacin)에 의하여 억제되었던 강한 반응이 있는 반면에, 규격화된 아카시아 추출물은 염증성 세포(케모택시스, chemotaxisis)의 침윤을 억제하지 않았다. 주화성 반응(chemotactic response)이 감소되지 않았을 지라도, 유체가 세포를 침윤하는 것이 MPO 활성도에 의해 활성화되는지 결정하기 위하여 시험되었다. 도 7B 및 7C는 추출물이 튜브를 통한 투입이 아닌 장내 투입되었을 때 MPO 활성도가 상당히 감소됨을 보여준다. 이러한 결과는 추출물은 주화성 반응에 의해 유도된 주화성 반응을 억제하지 못할지라도 그들은 여전히 전-염증성 매개자의 방출과 생성의 예방을 통하여 염증을 감소하는데 효과적임을 제시한다.

귀 부종을 유도하는 아라치돈산(Arachidonic Acid induced ear swelling). 생체내의 염증을 직접적으로 억제하는 아카시아 추출물의 능력이 이전에 보고된 바 에 따라 측정되었다.(Greenspan et al. (1990) J.Med.Chem. 42:164-172; Young et al (1984) J.Invest.Dermat. 82:367-371). 간단히 말하면, 5Balb/C 쥐 그룹에 아라치돈산(AA)을 투여한 후 24시간 및 1시간 후에 시험용 화합물을 비경구적 장내로의 투여(IP) 또는 튜브에 의한 경구적 투여 방법으로 투여하였다. 아세톤(2mg/15μL)을 왼쪽 귀에 투여하고, 음성적 대조군으로서 아세톤(15μL)을 오른쪽 귀에 투여하였다. 1시간 이후에 동물들을 이산화탄소를 흡입하게 하여 사멸하게 하고, 귀의 두께를 공학용 마이크로미터기로 측정하였다. 아라치돈산이 투여된 동물을 포함하는 대조군은 항-염증성 제제로 처리하지 않았으며, 어떤 동물에는 아라치돈산 및 인도메타신(indomethacin, I.P.) 5mg/kg으로 처리하였다.

염증성 공기 주머니 모델(Air pouch model of inflammation). 공기 주머니 모델은 리오자의 방법(RioJa, et al. (2000) Eur.J.Pharm. 397:207-217)을 적용한 것이다. 5Balb/C 쥐 그룹에 무균 공기(3mL)를 주입하여 공기 주머니가 생기도록 하고, 6일 동안 이틀에 한번씩 1mL의 무균 공기를 추가 주입하여 유지하였다. 동물들의 공기 주머니에 1%의 자이모산(Zaymosan, 1mL)을 주입한 후 24시간 및 1시간 후에 시험용 화합물을 비경구적 장내로의 투여 또는 튜브에 의한 경구적 투여 방법으로 투여하였다. 4시간 이후에 동물들은 이산화탄소 흡입에 의하여 죽고, 공기 주머니를 무균의 살린(salin, 3mL)으로 세척하였다. 세척한 유체를 원심분리하여 침윤 세포의 총 수를 결정하였다. 또한, 상층액을 보유하여, 마이리오페록시다아제(myleoperoxidase, MPO) 활성 및 활성도의 측정으로서 엘리사에 의한 TNF-a의 존재에 대하여 분석하였다.

실시예 10. 아카시아 카테츄의 표준화된 추출물의 추출, 확인 및 정량분석

아카시아 카테츄(분쇄된 뿌리 500mg)를 (1) 100%의 물, (2) 80:20의 물:에탄올, (3) 60:40의 물:에탄올,(4) 40:60의 물:에탄올,(5) 20:80의 물:에탄올,(6) 100%의 메탄올, (7) 80:20의 메탄올:THF, (8) 60:40의 메탄올:THF와 같은 용매 시스템으로 추출하였다. 추출물은 농축시키고 낮은 진공 하에서 건조하였다. 포토다이오드 어래이 검출기(PhotoDiode Array,PDA) 및 250mm×4.6mm C18 칼럼을 이용한 HPLC를 수행하여 화학적 조성물을 확인하였다. 화학적 조성물은 표준으로 카테친과 에피카테친을 사용하여 머무른 시간 및 PDA 값을 기초로 하여 정량분석 되었다. 그 결과를 표 6과 도 8에 나타내었다. 표 6과 도 8에 나타낸 바와 같이, 80% 메탄올/물의 용매 추출액으로부터 생성된 플라반 추출물은 플라반 성분의 최고의 농도를 제공한다.

아카시아 카테츄의 표준화된 추출물을 생산하기 위한 용매

추출 용매	추출물의 무게(mg)	바이오매스로부터 추출할 수 있는 %	카테친의 총양(mg)	추출물에서의 카테친 %
100% 물	292.8	58.56	0.13	12.02
물:메탄올(80:20)	282.9	56.58	0.13	11.19
물:메탄올(60:40)	287.6	57.52	0.15	13.54
물:메탄올(40:60)	264.8	52.96	0.19	13.70
물:메탄올(20:80)	222.8	44.56	0.15	14.83
100% 메탄올	215.0	43.00	0.15	12.73
메탄올:THF(80:20)	264.4	52.88	0.11	8.81
메탄올:THF(60:40)	259.8	51.98	0.15	9.05

실시예 11. 무릅 및/또는 둔부의 류마티즘 관절염 또는 골관절염의 통증 완화에 대한 플라반 효능의 임상 평가

단일-중심(single-center), 무작위(randomized), 이중-맹검법(double- blind), 플라시보-조절(placebo-controlled) 방법을 통하여 임상 연구를 하였다. 무릅 및/또는 둔부의 류마티즘 관절염 또는 골관절염이 걸린 60명의 피시험자(n=60)들을 무작위로 다음 4그룹으로 나누었다.

A0 플라시보 n=15 플라시보(placebo)

A1 투여 1 n=15 조성물A 250mg/일(1일 125mg씩 2회 투여)

A2 투여 2 n=15 조성물A 500mg/일(1일 250mg씩 2회 투여)

A3 활성 대조군 n=15 셀레코시브 200mg/일(1일 100mg씩 2회 투여)

조성물 A는 총 플라반 성분 10.3%(w/w0인 아카시아 카테츄의 추출물을 포함하는 표준화된 추출물의 적절한 혼합으로 구성된다. 셀레브렉스로 알려진 셀레콕시브는 일종의 COX-2 선택적 억제제인 처방약의 상표명이다.

피시험자들은 남성과 여성의 쌍으로 이루어지며 40 내지 75세 나이의 사람들이었다. 처치 방법은 상기 투여 스케줄에 따라 플라시보 또는 활성 화합물(조성물 A)를 60일 동안 경구 투여하는 방식으로 하였다. 본 연구를 시작하기 전에 NSAIDs를 복용한 피시험자들은 2주간의 장세척 기간에 참여하게 했다. 신체적 활동은 제한라지 않았다. 피시험자들은 어떤 이유, 어떤 때에 그 시험으로부터 철회할 수 있도록 하였다. 시험자는 WOMAC(Western Ontario and McMaster Universities) 골관절염 지수를 이용하여 경구 투여 후 60일 동안 처치의 효능을 평가하였다. (See Lingard et al. (2001) the Journal of Bone & Joint Surgery 83(12):1856-1864; Soderman & Malchu (2000) Acta Orthop Scand. 71(1):39-46). 몬트리올 대학(University for Montreal)의 IRB 위원회가 상기와 같은 프로토콜(protocol, 환자 치료 실험계획서)을 검토하여 승인하였다. 표 7은 기준값이 되는 처치전의 WOMAC 지수 값을 나카내며, 표 8은 60일 동안 처치 후의 WOMAC 지수 값의 변화를 나타낸다. 도 9내지 12는 이러한 연구 결과를 그래프로 도시하였다.

처치전의 기준에서의 WOMAC 값

기준에서의 WOMAC 평가 항목 값
WOMAC 평가 항목	플라시보		셀레콕시브		조성물A 125		조성물A 250
WOMAC 평가 항목	평균	표준편차	평균	표준편차	평균	표준편자	평균	표준편차

통증	10.00	2.60	10.20	2.40	10.10	2.80	10.30	2.50
경직성	4.80	1.00	4.70	1.30	4.90	1.50	4.70	1.20
신체 기능	38.00	9.50	37.00	9.90	37.50	100.00	36.50	1.00
WOMAC 종합점수	52.80	13.10	51.90	13.60	52.50	104.30	51.50	4.70

모든 군에서 환자의 체질량 지수(BMI)가 31 내지 33±6.5이고, 처치군에서 통계학적으로 중요한 차이점이 발견되지 않았다.

처리 60일 이후의 WOMAC 값

WOMAC 평가 항목	플라시보		셀레콕시브		조성물 A 125		조성물 A 250
WOMAC 평가 항목	평균	%변화	평균	%변화	평균	%변화	평균	%변화
통증	-0.95	-9.50	-2.90	-28.43	-2.80	-27.72	-2.90	-28.16
경직성	-0.40	-8.33	-1.10	-23.40	-1.20	-24.49	-1.40	-29.79
신체기능	-3.25	-8.55	-8.90	-24.05	-8.20	-21.87	-8.50	-23.29
WOMAC 종합점수	-4.60	-8.71	-12.90	-24.86	-12.20	-23.24	-12.80	-24.85

Claims

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아카시아 카테츄(Acacia catechu), 아카시아 콘시나(Acacia concinna), 아카시아 파르네시아나(Acacia farnesiana), 아카시아 세네갈(Acacia Senegal), 아카시아 스페시오사(Acacia speciosa), 아카시아 아라비카(Acacia arabica), 아카시아 카에시아(A.caesia), 아카시아 펜난타(A.pennata), 아카시아 시누아타(A.sinuata), 아카시아 메아르시(A.mearnsii), 아카시아 픽난사(A.picnantha), 아카시아 데알바타(A.dealbata), 아카시아 아우리쿠리포르미스(A.auriculiformis), 아카시아 호로세레시아(A.holoserecia) 및 아카시아 만기윰(A.mangium)으로 이루어진 군으로부터 선택된 식물로부터 분리된 플라반을 유효성분으로 하는 추출물과

약제학적으로 허용되는 담체의 유효한 양을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는,

골관절염, 류마티즘 관절염, 월경통, 건선, 만성 두통, 편두통, 염증성 내장 질병과 관련된 염증; 국부적인 상처 및 경미한 찰과상, 일광화상 또는 접촉성 피부염으로 이루어진 군으로부터 선택된 경미한 염증성 이상증상; 및 고형암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 사이클로옥시게나제-2 및 5-리포옥시게나제 효소에 의해 매개되는 질병과 이상 증상을 동시적으로 예방 및 치료하기 위한 약제학적 조성물.
제 8 항에 있어서,

상기 플라반이 식물의 부분에서 분리됨을 특징으로 하는 조성물.
제 9 항에 있어서,

상기 식물의 부분이 줄기, 줄기 껍질, 가지, 괴경, 뿌리, 뿌리 껍질, 어린 순, 씨, 근경, 꽃과 생식기관, 및 잎과 다른 기생기관으로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 조성물.
삭제
제 8 항에 있어서,

상기 추출물이 플라반 0.01 내지 100%의 플라반으로 이루어짐을 특징으로 하는 조성물.
제 8 항에 있어서,

상기 조성물이 체중에 대하여 0.01 내지 200mg/kg의 양으로 투여됨을 특징으로 하는 조성물.
제 8 항에 있어서,

상기 조성물의 투여 경로가 적절한 제제 형태의 경구적 투여, 국부적 투여, 좌약식 투여, 정맥내 투여 및 내피 투여, 위내 투여, 근육내 투여, 복막내 투여 및 정맥내 투여 경로로 이루어지는 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 조성물.
아카시아 카테츄(Acacia catechu), 아카시아 콘시나(Acacia concinna), 아카시아 파르네시아나(Acacia farnesiana), 아카시아 세네갈(Acacia Senegal), 아카시아 스페시오사(Acacia speciosa), 아카시아 아라비카(Acacia arabica), 아카시아 카에시아(A.caesia), 아카시아 펜난타(A.pennata), 아카시아 시누아타(A.sinuata), 아카시아 메아르시(A.mearnsii), 아카시아 픽난사(A.picnantha), 아카시아 데알바타(A.dealbata), 아카시아 아우리쿠리포르미스(A.auriculiformis), 아카시아 호로세레시아(A.holoserecia) 및 아카시아 만기윰(A.mangium)으로 이루어진 군으로부터 선택된 식물로부터,

골관절염, 류마티즘 관절염, 월경통, 건선, 만성 두통, 편두통, 염증성 내장 질병과 관련된 염증; 국부적인 상처 및 경미한 찰과상, 일광화상 또는 접촉성 피부염으로 이루어진 군으로부터 선택된 경미한 염증성 이상증상; 및 고형암으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 사이클로옥시게나제-2 및 5-리포옥시게나제 효소에 의해 매개되는 질병과 이상 증상을 동시적으로 예방 및 치료하는 용도를 가지는 플라반을 유효성분으로 하는 추출물의 분리 및 정제방법으로서, 하기의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법

(a) 상기 선택된 식물의 분쇄된 식물 원료를 추출하는 단계;

(b) 상기 추출물을 중화시키고 농축시키는 단계; 및

(c) 상기 중화시키고 농축시킨 추출물을 정제하는 단계.
제 15 항에 있어서,

상기 플라반을 유효성분으로 하는 추출물이 물, 알콜, 유기 용매 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 용매로 추출됨을 특징으로 하는 방법.
제 15 항에 있어서,

상기 플라반을 유효성분으로 하는 추출물이 재결정, 용매상 분리, 침전, 승화 및 크로마토그래피적 분리로 이루어진 군으로부터 선택된 방법을 이용하여 정제됨을 특징으로 하는 방법.
제 17 항에 있어서,

상기 크로마토그래피적 분리가 이온교환크로마토그래피, 흡착크로마토그래피, 역상크로마토그래피, 겔투과크로마토그래피, 초여과 또는 이들 방법들 중에서 2가지 이상의 결합을 포함하나, 이에 한정되지 않는 군으로 이루어진 군으로부터 산택됨을 특징으로 방법.