JP2003501381A - 関節炎の処置 - Google Patents

関節炎の処置

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JP2003501381A JP2001501199A JP2001501199A JP2003501381A JP 2003501381 A JP2003501381 A JP 2003501381A JP 2001501199 A JP2001501199 A JP 2001501199A JP 2001501199 A JP2001501199 A JP 2001501199A JP 2003501381 A JP2003501381 A JP 2003501381A
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クレアー アドコックス，
ピーター コリン，
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、関節炎の種々の形態の処置におけるカテキンの使用（上記処置におけるカテキンおよび他の抗関節炎薬剤の組み合わせの使用を含む）；上記処置における使用のための医薬品および組成物；ならびに抗関節炎特性を有する薬剤を同定する方法、に関する。より詳細には、関節炎処置のための医薬品の製造のための、没食子酸エピカテキン、没食子酸カテキン、没食子酸ガロカテキン、没食子酸エピガロカテキンから選択される、カテキン没食子酸エステルの使用である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、すべての形態の関節炎の処置における、カテキン類、またはその改
変体の使用に関する。
【０００２】 緑茶は、極東における非常に一般的な飲料であり、そしてその有益な健康性質
は数百年もの間認識されている。従って、緑茶は、上記の健康効果の原因となる
活性薬剤を同定する大規模な研究の主題となっている。緑茶は、天然に存在する
植物抽出物の複雑な混合物である。これらの一群は、フラバノール類、カテキン
類またはプロアントシアニジン類として種々に記載されている。緑茶中のこれら
の成分の最も一般的なものは：エピカテキン（ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ）（ＥＣ
）、エピガロカテキン（ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ）（ＥＧＣ）、没食
子酸エピカテキン（ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ ｇａｌｌａｔｅ）（ＥＣＧ）およ
び没食子酸エピガロカテキン（ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ ｇａｌｌａ
ｔｅ）（ＥＧＣＧ）である。図１を参照のこと。
【０００３】 カテキン類は、多くの臨床症状を軽減することが報告されている。これらは、
発作および脳出血（Ｓａｔｏら、１９８９）、心臓血管疾患および肝臓疾患（Ｉ
ｍａｉ＆Ｎａｋａｃｈｉ、１９９５）、細菌感染（Ｉｋｉｇａｉら、１９９３）
および胃潰瘍（Ｍｕｒａｋａｍｉら、１９９２）を含む。カテキン類はまた、ヒ
スタミンおよびロイコトリエンの放出を阻害することが示されており、このこと
は、カテキン類が、種々のアレルギー性障害の処置に関して利点を有し得ること
を示す（Ｍａｔｓｕｏら、１９９７）。
【０００４】 さらに、カテキン類は、活性化マクロファージからの転写および放出の両方の
レベルで、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）産生のリポ多糖（ＬＰＳ）誘導放出を阻
害することが知られており、そしてそれ故、炎症の阻害における使用を有し得る
（Ｙａｎｇら、１９９８）。
【０００５】 カテキン類は、コレステロールレベルを調節すること；抗変異誘発性質を有す
ること；血圧を低下すること；肝臓に対する種々の薬剤の効果を阻害することが
示されており、そしてまた歯を崩壊から保護し得る。明らかにカテキン類は、当
該分野で周知である多くの有益な健康効果を有する。
【０００６】 これまで、最も多くの興味は、カテキン類の抗癌効果にあった。疫学的研究に
より、緑茶の消費がヒトにおける癌を防ぐ助けとなり得ることが示唆されており
（Ｙａｎｇら、１９９３ら）、そして少なくとも１７の臨床研究が公開されてい
る（例えば、Ｇａｏら、１９９４）。
【０００７】 本発明者らは、関節炎の処置に関するさらなるカテキン類の有益な治療効果を
発見した。
【０００８】 カテキンは、カテキン自身の構造（３’，３’，４’，５，７−フラバンペン
トール）に基く一群の化合物に対する一般名である。図１を参照のこと。
【０００９】 本発明者らは、最近、カテキン類が軟骨保護的であること、すなわち、それら
が軟骨細胞外マトリックスの分解を阻害することを発見した。２０μＭの用量で
、ＥＧＣＧ、ＥＣＧおよびＥＣは、組換えヒトインターロイキン１α（ｒｈＩＬ
−α）を用いたウシ軟骨外殖片の処理から生じるプロテオグリカン損失を有意に
阻害した。組換えヒトＴＮＦα（ｒｈＩＬ−α）が異化刺激を提供したとき、Ｅ
ＧＣＧは、プロテオグリカン損失の阻害について用量依存性曲線を生成し、２μ
Ｍの濃度で約５０％の阻害が達成された。図２を参照のこと。これらの実験では
、ＥＧＣＧは、毒性影響を示さなかった。２１８μＭで、ＥＧＣＧは、外殖片に
よるラクテート産生に対し影響を及ぼさなかった。また、２μＭおよび２０μＭ
の有効濃度範囲で、プロテオグリカン合成の尺度としての35Ｓ取り込みは影響さ
れなかった。さらに、ＴＮＦ媒介プロテオグリカン分解に対するＥＧＣＧの阻害
効果は、外殖片からのカテキンの除去の後には完全に可逆的であった（データは
示さず）。
【００１０】 ＥＧＣＧは、ＴＮＦα合成を阻害することが報告され（Ｙａｎｇら、１９９８
；Ｓｕｇａｎｕｍａら、１９９６）、これは、その抗炎症効果の基礎を提供し得
る。本発明者らは、ＥＧＣＧが実際にこの重要な性質を有することを確認した。
２０μＭの濃度で、それは、２つの異なる市販のＥＬＩＳＡキットを用い、２人
の異なるボランティアからの血液サンプルからの細菌リポ多糖刺激ＴＮＦα合成
を６６％および３０％阻害した。しかし、これは、軟骨分解の阻害の機構を提供
し得ない。なぜなら、図２に示されたような実験では、大量の外因性サイトカイ
ンが軟骨培養に添加されているからである。
【００１１】 これは、カテキン類が、関節炎罹患者に有益である２つの別個の性質、抗炎症
効果および別の軟骨保護効果を有するという結論に至る。
【００１２】 本発明の第１の局面によれば、関節炎の処置のための医薬の製造のために少な
くとも１つのカテキンの使用が提供される。
【００１３】 本発明の好適な実施形態では、上記カテキンは：（＋）エピカテキン、（＋）
カテキン、（−）エピカテキン；（−）カテキン、（−）エピガロカテキン；（
−）ガロカテキン；（−）没食子酸エピカテキン；（−）没食子酸カテキン；（
−）没食子酸エピガロカテキン；（−）没食子酸ガロカテキン；またはそれらの
改変体、から選択される。
【００１４】 本発明のさらなる好適な実施形態では、上記カテキンは、没食子酸エピガロカ
テキンである。
【００１５】 本発明のなおさらなる好適な実施形態では、上記カテキンは没食子酸エピカテ
キンである。
【００１６】 本発明のなおさらなる好適な実施形態では、上記医薬は、変形性関節炎、慢性
関節リウマチ、炎症性関節炎；骨軟骨炎；急性ピロリン酸塩関節炎；反応性関節
炎；乾癬性関節炎；若年性関節炎；エリテマトーデス；シェーグレン症候群；再
発性多発性軟骨炎；強直性脊椎炎；乾癬性関節炎；ＭＳＵＭ（通風）；ＣＰＤＤ
（偽通風、軟骨石灰化）；軟骨融解；滑液包炎、から選択される関節炎状態の処
置のためである。
【００１７】 本発明のさらになおさらなる好適な実施形態では、上記医薬は、変形性関節炎
の処置のためである。
【００１８】 本発明のさらになおさらなる好適な実施形態では、上記医薬は、慢性関節リウ
マチの処置のためである。
【００１９】 本発明のさらになおさらなる好適な実施形態では、上記医薬は、関節炎の予防
的処置における使用のためである。理想的には、上記予防的処置は、関節炎、好
ましくは変形性関節炎に対し遺伝的素因をもつ動物のためである。
【００２０】 あるいは、または好ましくは、上記予防的処置は、関節損傷（例えば、十字靭
帯損傷）に起因する関節炎を発症する増加した可能性を有する動物を保護するた
めである。関節損傷を受ける個体が関節炎の増加した発生率を有することは当該
分野で周知である（Ｐｒｉｃｅら，１９９９）。
【００２１】 本発明の第２の局面によれば、少なくとも１つのカテキンおよび少なくとも１
つの抗関節炎薬剤またはバイオポリマーを含む治療用組成物が提供される。好ま
しくは、この組成物は、関節炎、理想的には変形性関節炎の処置のための医薬の
製造における使用のためである。なおより理想的には、上記抗関節炎薬剤は、ヒ
アルロン酸、またはその改変体である。
【００２２】 あるいは、または好ましくは、上記抗関節炎薬剤はグルコサミン、またはその
改変体、好ましくはグルコサミン硫酸（ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ ｓｕｌｐｈａ
ｔｅ）である。グルコサミンは関節炎症状の有効な処置であることが報告されて
いる（ＭａｃＣａｒｔｙ、１９９４；ＭａｃＣＡｒｔｙ、１９９８）。現在の見
解は、グルコサミンが関節中のヒアルロン酸のようなグリコサミノグリカン類の
産生を刺激することを示唆している。
【００２３】 ヒアルロン酸は、Ｎ−アセチルグルコサミンおよびグルクロン酸分子のポリマ
ーであり、そして抗関節炎性質を有することが周知である（Ｂａｌａｚｓ、１９
６８；Ｇｉｂｂｓら、１９６８；Ｂａｌａｚｓ＆Ｇｉｂｂｓ．、１９７０；Ｒｙ
ｄｅｌｌら、１９７０；Ｗｅｉｓｓら、１９８１；Ｄｅｎｌｉｎｇｅｒ、１９８
２；Ｂａｌａｚｓ、１９８２；Ｂａｌａｚｓ＆Ｄｅｎｌｉｎｇｅｒ、１９８５；
Ｗｅｉｓｓ．＆Ｂａｌａｚｓ、１９８７；Ｂａｌａｚｓ＆Ｄｅｎｌｉｎｇｅｒ、
１９８９；ＭｃＣａｉｎら、１９８９；Ａｄａｍｓ、１９９３；Ｂａｌａｚｓ＆
Ｄｅｎｌｉｎｇｅｒ、１９９３；Ｍｏｒｅｌａｎｄら、１９９３；Ｐｅｙｒｏｎ
、１９９３ａ；Ｐｅｙｒｏｎ、１９９３ｂ；Ｓｃａｌｅら、１９９４；Ａｄａｍ
ｓら、１９９５；Ｂａｎｄら、１９９５；Ｂａｋｅｒ、１９９７ Ｂａｌａｚｓ
＆Ｌａｒｓｅｎ、１９９７；Ａｄａｍｓ、１９９８；Ｄｅｎｌｉｎｇｅｒ、１９
９８；Ｄｉｃｋｓｏｎ＆Ｈｏｓｉｅ、１９９８；Ｅｓｔｅｙ、１９９８；Ｗｏｂ
ｉｇら、１９９８およびＰｅｙｒｏｎ、１９９９）。
【００２４】 それは、すべての哺乳動物において種々の組織中（例えば、滑液、硝子体液）
およびいくつかの細菌種中に天然に存在する。ヒアルロン酸は、分子量が５０ｋ
Ｄａ〜８×１０3ｋＤａで変動し得、そして高度に粘性の溶液を形成する。非炎
症性である純粋なサンプルを調製する方法は、当該分野で周知である。例えば、
欧州特許ＥＰ ０２３９３３５号＆米国特許ＵＳ ４８７９３７５号は、非炎症
性であると称するヒアルロン酸の高度に純粋なフラクションを調製する方法を開
示する。ヒアルロン酸は、種々の治療効果を有することが知られている。例えば
、そして限定するものではなく、種々の皮膚障害の処置（米国特許ＵＳ５９１４
３２２号に記載）およびコルチコステロイド処置の結果としての関節変性の処置
である（米国特許ＵＳ４８０１６１９号）。ヒアルロン酸などは、粘性補充およ
び／または粘性潤滑を提供し（Ｂａｌａｚｓ＆Ｄｅｎｌｉｎｇｅｒ、１９９３；
Ｐｅｙｒｏｎ、１９９３ａ；Ｓｃａｌｅら、１９９４；Ｌｕｓｓｉｅｒら、１９
９６）、関節炎疾患の結果としてのフラグメント化したヒアルロン酸を置換する
。
【００２５】 本発明の好適な実施形態では、上記カテキンおよび抗関節炎薬剤は、単純な混
合物として投与される。あるいは、上記カテキンおよび抗関節炎薬剤は、一緒に
架橋、カップリング（ｃｏｕｐｌｅｄ）または会合（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）さ
れる。
【００２６】 ヒアルロン酸を種々の治療分子に架橋または結合することが可能である。例え
ば、欧州特許第０２９６７４０号は、ヒアルロン酸結合体の産生を記載する。ヒ
アルロン酸は、多くの遊離の水酸基およびカルボキシル基を有し、それらに対し
カテキン類が直接的に、または架橋剤を介するかのいずれかにより架橋またはカ
ップリングされ得る。あるいは、ヒアルロン酸およびカテキンは、以下に詳細に
記載されるように、リポソーム調製物内にカプセル化される。
【００２７】 本発明の代替の実施形態では、上記カテキンは、ヒアルロン酸と架橋、カップ
リングまたは会合される。
【００２８】 本発明の第３の局面によれば、少なくとも１つのカテキンを、少なくとも１つ
の抗関節炎薬剤に架橋またはカップリングする方法が提供され、この方法は： ｉ）少なくとも１つのカテキンおよび少なくとも１つの抗関節炎薬剤を提供する
工程； ｉｉ）上記カテキンの上記薬剤への架橋またはカップリングを行う条件を提供す
る工程；および、最適には、 ｉｉｉ）反応混合物から架橋またはカップリング複合体を精製する工程 を包含する。
【００２９】 本発明の好適な方法では、上記抗関節炎薬剤はヒアルロン酸であり、そして上
記カテキンは：（＋）カテキン；（＋）エピカテキン；（−）カテキン；（−）
エピガロカテキン；（−）ガロカテキン；（−）没食子酸エピカテキン；（−）
没食子酸カテキン；（−）没食子酸エピガロカテキン；（−）没食子酸ガロカテ
キン；またはそれらの改変体、から選択される。
【００３０】 本発明のなおさらなる局面によれば、関節炎状態を処置する方法が提供され、
この方法は、動物に、薬理学的に有効な量の本発明の治療組成物／医薬を投与す
る工程を包含する。
【００３１】 本発明の好適な方法では、上記関節炎状態は；変形性関節炎；慢性関節リウマ
チ；骨軟骨炎；急性ピロリン酸塩関節炎；反応性関節炎；乾癬性関節炎；若年性
関節炎；エリテマトーデス；シェーグレン症候群；再発性多発性軟骨炎；強直性
脊椎炎；乾癬性関節炎；ＭＳＵＭ（通風）；ＣＰＤＤ（偽通風、軟骨石灰化）；
軟骨融解；滑液包炎、から選択される。
【００３２】 本発明のなお好適な方法では、上記関節炎状態は変形性関節炎である。
【００３３】 本発明のさらになおさらなる好適な方法では、上記関節炎状態は慢性関節リウ
マチである。
【００３４】 治療組成物／医薬が、送達を容易にするために種々の方法で処方され得ること
は当業者に明らかである。例えば、リポソーム組成物が、上記組成物／医薬を送
達するために有用に採用され得る。
【００３５】 リポソームは、選択された治療用薬剤をカプセル化し次いで患者中に導入され
る、脂質を基礎にした小胞である。代表的には、リポソームは、純粋なリン脂質
またはリン脂質とホスホグリセリドの混合物のいずれかから製造される。
【００３６】 代表的なリポソームは、静脈注射され得かつ肺の毛細血管を通過し得る直径２
００ｎｍ未満で製造され得る。さらに、リポソームの生化学的特性は、血管膜を
横切って選択された組織へ接近させる透過性を与える。リポソームは、比較的短
い半減期を有する。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に被膜されたリポソーム
を含む、いわゆるＳＴＥＡＬＴＨ（登録商標）リポソームが、開発された。患者
に静脈内投与される場合、ＰＥＧ処理リポソームは、顕著に増加された半減期を
有する。さらに、ＳＴＥＡＬＴＨ（登録商標）リポソームは、細網内皮系におけ
る減少した取り込みおよび選択された組織における増加した蓄積を示す。さらに
、治療用組成物／医薬を選択された細胞／組織へ送達する特異性を増加する脂質
ベースのビヒクルが抗体に結合する、いわゆる免疫リポソーム（ｉｍｍｕｎｏ−
ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ）が開発された。
【００３７】 送達手段としてのリポソームの使用は、米国特許第５５８０５７５号および米
国特許第５５４２９３５号に記載される。
【００３８】 組成物／医薬が経口スプレーまたは鼻腔内スプレー、エアロゾル、懸濁液、エ
マルジョンおよび／または点眼薬の形態で接種（ｉｍｂｉｄｅｄ）または提供さ
れることは、当業者には明白である。あるいは、医薬は錠剤の形態で提供され得
る。あるいは、送達手段は、呼吸器または噴霧器を含む。
【００３９】 あるいはまたは好ましくは、医薬は、関節へ直接注射によって送達され得る。
組成物／医薬が静脈内、筋肉内、皮下または局所的に送達されることが、想定さ
れる。なおさらに、医薬は、直腸に処方され得る。
【００４０】 また、ヒト以外の動物（例えば、非限定的に、愛玩動物（ｆａｍｉｌｙ ｐｅ
ｔ）、家畜、馬）において、組成物／医薬が関節炎状態を予防および／または軽
減するに効果的であることは、明白である。
【００４１】 本発明の第４の局面に従って、抗関節炎特性について、薬剤をスクリーニング
する方法が提供される。
【００４２】 本発明の好ましい方法は、以下を含む： ｉ）軟骨サンプルを提供すること、 ｉｉ）有効量の、少なくとも１つの試験される薬剤の添加、 ｉｉｉ）少なくとも１つの前炎症性（ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）サイ
トカインの添加；および ｉｖ）軟骨分解を示す少なくとも１つの分子のモニタリング。
【００４３】 本発明のさらに好ましい実施形態において、この炎症性サイトカインは、イン
ターロイキン１α；インターロイキン１β；オンコスタチンＭ；腫瘍壊死因子α
より選択される。本発明の好ましい方法は、以下を含む： ｉ）軟骨サンプルを提供すること、 ｉｉ）有効量の、少なくとも１つの試験される薬剤の添加、 ｉｉｉ）ビタミンＡ代謝産物の添加；および ｉｖ）軟骨分解を示す少なくとも１つの分子のモニタリング。
【００４４】 好ましいこのビタミンＡ代謝産物は、全てトランスの（ａｌｌ−ｔｒａｎｓ）
レチノイン酸である。
【００４５】 軟骨分解をモニタリングする方法が周知でありかつ本明細書中に記載されるこ
とが、当業者には明白である。
【００４６】 本発明のさらなる局面に従って、本発明のスクリーニング法によって同定され
る薬剤が提供される。
【００４７】 また、上記のカテキンが天然の植物供給源（例えば、Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉ
ｎｅｎｓｉｓ、Ｕｎｃａｒｃｉａ ｇａｍｂｉｒ）から単離され得るかまたは当
該分野で周知の方法を使用して研究室で合成され得るかのいずれかであることは
、当業者には明白である。
【００４８】 本発明の１つの実施形態は、実施例のみによって、ならびに／または以下の表
および図面を参照してここで記載される。
【００４９】 表１は、（ｉ）鼻軟骨外移植片および（ｉｉ）関節軟骨外移植片を使用する、
サイトカイン刺激した軟骨分解、またはビタミンＡ代謝産物刺激した軟骨分解に
対するカテキンの阻害効果を示す。
【００５０】 表２は、ヒト変形性関節炎（ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｃ）関節の外移植片
に対するＥＧＣＧおよびＥＣＧの阻害効果を示す。
【００５１】 表３は、ヒト慢性関節リウマチ膝軟骨のプロテオグリカンの分解に対するＥＧ
ＣＧおよびＥＣＧの阻害効果を示す。
【００５２】 表４は、ヒト非関節軟骨のプロテオグリカンの分解に対するＥＧＣＧおよびＥ
ＣＧの阻害効果を示す。
【００５３】 表５および６は、ｒｈＩＬαで刺激したウシ鼻軟骨外移植片におけるＩＩ型コ
ラーゲン分解に対するＥＧＣＧ、ＥＣＧ、ＥＣおよびＥＧＣの阻害効果を示す。
【００５４】 表７は、２８日の期間の後半部分にわたる外移植片によるラクテート産生を示
す。
【００５５】 表８は、ヒトＴＮＦα合成に対するＥＧＣＧの阻害効果を示す。
【００５６】 （序論） ウシの系における軟骨プロテオグリカン分解を、プロ炎症性サイトカインであ
るインターロイキン１α（ＩＬ１α）または腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）で、あ
るいはビタミンＡ誘導体である全てトランスのレチノイン酸（Ｒｅｔ）で刺激し
た。分解過程を、インターロイキン１β（ＩＬ１β）およびＴＮＦαの組合せを
使用して、ヒト軟骨で開始した。関節炎において生じる軟骨プロテオグリカン成
分の分解についての標準インビトロモデルが存在する（Ｂｒｙｓｏｎら、１９９
８；Ｉｌｉｃら、１９９２）。
【００５７】 （方法） （軟骨プロテオグリカン分解の阻害） ウシ鼻中隔および中手指節関節の軟骨を、Ｂｕｔｔｌｅら（１９９２）によっ
て記載されるように調製した。鼻中隔軟骨を、死後、ナイフを使用して取り外し
、そして覆う膜を破棄した。摘出した軟骨を、イソプレニルを染ませたＡｚｏｗ
ｉｐｅで拭い、組織培養フード中のペトリ皿に静置し、そして滅菌リン酸緩衝化
生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。軟骨を、小刀を使用して約２ｍｍ×３ｍｍ×
３ｃｍ切片に薄切し、これらの切片から、ベルトパンチ（ｂｅｌｔ ｐｕｎｃｈ
）の補助でディスクを切り出した。約２００個のディスク（約３ｍｍ直径、２ｍ
ｍ厚）を、それぞれの動物から得た。
【００５８】 ウシ中手指節関節からの軟骨の切片を切開し、鼻外移植片と類似の大きさであ
る小片に切断した。全てのウシ軟骨外移植片を、新生仔ウシ血清（ＮＣＳ）（５
％）およびヒドロコルチゾン（０．１μｇ／ｍｌ）を含有するＤＭＥＭ（Ｄｕｌ
ｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅｓ Ｍｅｄｉｕｍ）中で一晩培
養した後、実験を開始した。
【００５９】 異なる実験において、種々の外科的手順後に、ヒト関節軟骨を得た。軟骨を切
片に切開し、そしていくつかの実験においてプロテオグリカンを、５％ ＮＣＳ
含有ＤＭＥＭ中に５μＣｉ／ｍｌの35ＳＯ4で５日間生合成的に標識した。次い
で、軟骨を放射標識のない５％ ＮＣＳ含有ＤＭＥＭ中で２日間洗浄した後、実
験を開始した。
【００６０】 （ウシおよびヒトの軟骨のプロテオグリカン成分の分解に対するＥＧＣＧおよ
びＥＣＧの効果） 上記のように処置された軟骨外移植片を、９６ウェルプレートのウェルに個々
に移し、そして、組換えヒトＩＬ１α（ｒｈＩＬ１α）、組換えヒトＩＬ１β（
ｒｈＩＬ１β）、組換えヒトＴＮＦα（ｒｈＴＮＦα）およびＲｅｔ（のいずれ
か単独または組合せ）の存在または非存在下で、無血清ＤＭＥＭ中で９日目まで
培養した（３日目および６日目、または４日目に培地交換）。外移植片において
平均５０％を超える硫酸グリコサミノグリカン（ｓＧＡＧ）が、刺激後に放出さ
れ、これは、基礎放出量の２倍であった。特定のカテニンをジメチルスルフォキ
シド（ＤＭＳＯ）中のストック溶液として調製し、さらにＤＭＳＯまたはＤＭＥ
Ｍで希釈して培養培地中の適切な最終濃度および一定の１％（ｖ／ｖ）のＤＭＳ
Ｏ濃度を得た。
【００６１】 馴化培地中のｓＧＡＧおよび組織中に保持されるｓＧＡＧ（パパイン消化後に
測定される）は、ジメチルメチレンブルーアッセイ（Ｆａｒｎｄａｌｅら、１９
８６）または35ＳＯ4での標識後のシンチレーション計測（Ｉｌｉｃら、１９９
５）のいずれかによって、決定される。データを、組織から放出されたｓＧＡＧ
の百分率またはｓＧＡＧ放出の阻害の百分率として表す。対ではない（ｕｎｐａ
ｉｒｅｄ）非パラメーターのデータについてのマン−ホイットニー（Ｍａｎｎ
Ｗｈｉｔｎｅｙ）Ｕ検定法を使用して、結果の統計的有意性を決定した。
【００６２】 （ｒｈＩＬ−１α刺激したウシ鼻軟骨外移植片におけるＩＩ型コラーゲン分解
） ＩＩ型コラーゲン分解に対するカテキンの効果を調べるために、ウシ鼻軟骨外
移植片の培養を、週に２回の培地交換でｒｈＩＬ−１α（４．５ｎＭ）および２
０μＭのカテキン；ＥＧＣＧ、ＥＣＧ、ＥＣおよびＥＧＣＧの存在または非存在
下において２８日間維持した。実験の終了時に、軟骨残渣に残存するＩＩ型コラ
ーゲンを、５６℃で１５時間のプロテイナーゼＫ（ＥＣ ３．４．２１．６４）
での消化によって抽出した。抽出物を、変性したＩＩ型コラーゲンに対するマウ
スＩｇＧモノクローナル抗体（以前に記載されたＣｏｌ２−３／４ｍ（Ｈｏｌｌ
ａｎｄｅｒら、１９９４））を使用する阻害酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩ
ＳＡ）によってアッセイした。培養期間を通じての各培地交換で放出されたコラ
ーゲンの量を、各培養ウェルにおける総コラーゲン（培地プラス組織残渣）の百
分率として計算した。
【００６３】 （プロテオグリカン合成に対するカテキンの効果） ウシ鼻軟骨外移植片を、上記のように得た。プロテオグリカン合成を、35ＳＯ 4 から35Ｓへの取り込みを測定することによって評価した。以下の３群を調製し
た：（ａ）殺滅した外移植片（３度の凍結融解）、（ｂ）無血清ＤＭＥＭ単独中
で培養した外移植片、（ｃ）無血清ＤＭＥＭおよび２μＭまたは２０μＭのＥＧ
ＣＧ中で培養した外移植片。３群全てを、５μＣｉの35ＳＯ4／ｍｌの存在下で
１８時間培養し、そして35Ｓの取り込みを、以前に記載された（Ｂｕｔｔｌｅら
、１９９３）ように評価した。
【００６４】 （軟骨細胞代謝活性の評価のためのラクテート（ｌａｃｔａｔｅ）試験） 軟骨細胞は、無気呼吸的に呼吸する（Ｓｔｅｆａｎｏｖｉｃ−Ｒａｃｉｃら、
１９９４）。従って、化合物の毒性の測定を、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｃｏからのキットでラクテートオキシダーゼ／ペルオキシダーゼ法の使用によっ
て馴化培地中でのラクテートのレベルを決定することによってなし得る。
【００６５】 （ヒト末梢血細胞によるＴＮＦα産生に対するカテキンの効果） 末梢血をボランティアから得、そして５０ｉｕ／ｍｌのヘパリンを添加した。
血液を無血清ＤＭＥＭで１：６に希釈して、そして水浴中で、１μｇ／ｍｌ リ
ポ多糖類（ＬＰＳ）（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびＥＧＣＧ（２０μＭ）の存在下また
は非存在下において、３７℃で４時間インキュベートした。血液を−４０℃で３
回凍結融解し、次いで、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞片を除いた。
次いでＴＮＦαのＥＬＩＳＡを、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓかまたはＤｉａｃｌｏ
ｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈのいずれかからのキットを使用して、製造業者の説明書
に従って上清について実施した。
【００６６】 （結果） （２０μＭのカテキンによる基底レベルおよび刺激レベルのウシ鼻軟骨および
関節軟骨プロテオグリカン分解の阻害） 表１（ｉ）において示されるように、ＥＧＣＧは、ウシ鼻軟骨外植片モデルに
おけるｒｈＴＮＦα刺激軟骨プロテオグリカン分解を有意に阻害したが、しかし
有意な効果は、基底の放出、ｒｈＩＬ１α刺激放出、またはＲｅｔ刺激放出につ
いては観察しなかった。ＥＣＧおよびＥＣの両方は、ＩＬ１α刺激分解を有意に
阻害したが、ｒｈＴＮＦα刺激分解またはＲｅｔ刺激分解（ｂｒｅａｋｄｏｗｎ
）は阻害しなかった。
【００６７】 ウシ関節外植片モデルにおいて（表１ ｉｉ）において、ＥＧＣＧは再び、ｒ
ｈＴＮＦα刺激応答を強力に阻害したが、一方より少ない程度で、基底応答、ｒ
ｈＩＬ−１α応答およびＲｅｔ応答もまた阻害した。ｒｈＩＬ−α応答およびＲ
ｅｔ応答の両方は、ＥＣＧにより、より強力に阻害された。
【００６８】 （ＥＧＣＧによるｒｈＴＮＦα刺激ウシ軟骨プロテオグリカン分解の阻害につ
いての用量応答） ２０μＭ ＥＧＣＧによるｒｈＴＮＦα刺激軟骨プロテオグリカン分解の強力
な阻害を考慮して、用量応答曲線を構築した（図２）。阻害は、２μＭで統計的
有意（４７％阻害）に達し、そしてそれぞれ２０μＭおよび２００μＭで、８４
％および１３８％まで増加した。阻害が１００％を越える場合、いくらかの基底
の分解ならびにｒｈＴＮＦα刺激分解を示す。
【００６９】 （軟骨細胞のラクテート排出に対するカテキンの影響） ２００μＭのＥＧＣＧは、ｒｈＴＮＦαを用いて刺激されたウシ鼻軟骨外植片
の馴化培地におけるラクテートレベルの測定により、５日間にわたって毒性がな
いことが示された。ＤＭＥＭ単独において培養される外植片は、８９６μｇラク
テート／外植片を産生し、そしてＥＧＣＧの存在下で、これは、１０４０μｇラ
クテート／外植片であった。外植片を、ｒｈＴＮＦαの存在下で培養した場合、
総計１２４８μｇラクテート／外植片が産生され、ＥＧＣＧの存在下で培養した
場合、８９６μｇまでわずかに減少した。これらの結果は、５日間にわたってＥ
ＧＣＧが、軟骨細胞によるラクテートの排出において顕著な効果を有さなかった
ことを実証する。
【００７０】 （ウシ鼻軟骨プロテオグリカンの合成に対するＥＧＣＧの効果） ２μＭのＥＧＣＧは、ウシ鼻軟骨外植片におけるプロテオグリカン合成に対し
て有意な効果を有さず、有意でない刺激（１２％±１５％）を与えるが、一方２
０μＭでは、それは３２％±８％の有意でない阻害を与えた（２個体の動物、ｎ
＝８外植片／動物）。
【００７１】 （ヒト軟骨プロテオグリカン分解に対するカテキンの効果） 表２、３および４において示されるように、ＥＣＧ（２０μＭ）は、変形性関
節症関節、リウマチ様関節および非関節炎関節由来のヒト軟骨からのプロテオグ
リカン分解の有意な阻害を生じた。ＥＧＣＧは、変形性関節炎軟骨から、基底レ
ベルのプロテオグリカン損失を阻害した（表２）。
【００７２】 （ｒｈＩＬ−１α刺激軟骨プロテオグリカン分解におけるコラーゲン分解に対
するカテキンの効果） 表５および表６が示すように、ｒｈＩＬ１αの存在下での２８日間のウシ鼻軟
骨外植片の培養は、ＩＬ１αによるＩＩ型コラーゲンのほとんど全ての放出を伴
う、その外植片のほとんど完全な分解（図３に可視的に示される）を生じた。Ｅ
ＧＣＧ、ＥＣＧおよびＥＧＣ（２０μＭ）は、この分解を有意に減少させ（表６
）、外植片から放出されるＩＩ型コラーゲンの割合は、３つの場合全てにおいて
、５０％より多く減少した。表７が示すように、ｒｈＩＬ１αおよびＥＧＣＧま
たはＥＣＧの存在下で２８日間のウシ鼻軟骨外植片の培養は、１７〜２０日およ
び２４〜２８日の培養期間にわたる馴化培地におけるラクテートレベルにより決
定されるように、いかなる毒性効果とも関連しなかった。
【００７３】 （ヒト末梢血球によるＴＮＦα合成に対するカテキンの効果） ＥＧＣＧは、ヒト胃癌細胞株ＫＡＴＯ ＩＩＩ（Ｏｋａｂｅら、１９９９）に
おいて、およびＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞（Ｓｕｇａｎｕｍａら、１９９９）におい
て、ＴＮＦα合成を阻害することが報告された。本発明者らは、全血によるＬＰ
Ｓ刺激ＴＮＦα合成に対するＥＧＣＧ（２０μＭ）の効果を試験した。異なるボ
ランティアからの血液サンプルおよび異なる供給源からのＥＬＩＳＡキットを使
用した別々の実験において、本発明者らは、ＥＧＣＧによるＴＮＦα合成の阻害
を確認した（表８）。
【００７４】 （参考文献）
【００７５】
【表１】
【００７６】
【表２】 （表１） ウシ鼻軟骨外移植片およびウシ関節軟骨外移植片を、ｒｈＩＬ−１α（鼻につ
いて０．３ｎＭ；関節について３ｎＭ）、ｒｈＴＮＦα（鼻について３ｎＭ；関
節について６ｎＭ）、またはＲｅｔ（１μＭ）の存在下または非存在下中、およ
び最終濃度２０μＭのカテキンＥＧＣＧ、ＥＣＧ、ＥＣまたはＥＧＣの存在下ま
たは非存在下中での、無血清ＤＭＥＭ中で５日間培養した。３日目に培地を交換
した。軟骨プロテオグリカンの分解を、ＤＭＢアッセイを使用して、総ｓＧＡＧ
のパーセントとして、外移植片から放出されたｓＧＡＧを測定することによって
、決定した。データを、刺激した軟骨プロテオグリカン分解の平均阻害パーセン
ト±平均値の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）、または基底の軟骨プロテオグリカン分
解の平均阻害パーセント±平均値の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）として示す。(a)
４匹の動物、ｎ＝３２；(b)６匹の動物、ｎ＝４８；(c)２匹の動物、ｎ＝１６； (d) ７匹の動物、ｎ＝５６。非パラメーター性データについて両側マン−ホイッ
トニー検定法を使用して決定した場合、*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．００５およ
び***ｐ＜０．０００５。
【００７７】
【表３】 ヒト変形性関節症関節軟骨外移植片を、35ＳＯ4（５μＣｉ／ｍｌ）を使用し
て、５％（ｖ／ｖ）新生仔ウシ血清（ＮＣＳ）含有ＤＭＥＭ中で５日間、生合成
的に標識した。外移植片を２日間洗浄し、次にさらに９日間、ｒｈＩＬ１β（３
ｎＭ）およびｒｈＴＮＦα（６ｎＭ）の組合せの存在下または非存在下、そして
また２０μＭのカテキンＥＧＣＧまたはＥＣＧの存在下または非存在下にて培養
した。培地を３日目および６日目に交換した。軟骨プロテオグリカンの分解を、
シンチレーションカウンターの使用によって、培養培地中に放出された35Ｓおよ
び組織中に保持された35Ｓを定量することによって、総放射標識のパーセントと
して、外移植片から放出された放射標識を測定することによって、決定した。デ
ータを、平均放出パーセント±平均値の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）として示す。
ｓＧＡＧの放出が、カテキンの存在下において培養された群と、カテキン非存在
下において培養された群との間において比較される場合、両側、非パラメーター
性データについてマン−ホイットニーＵ検定法によって決定した場合、*ｐ＜０
．０５。
【００７８】
【表４】 ヒト慢性関節リウマチ関節軟骨を、外科手術によって入手して、そして５％（
ｖ／ｖ）ＮＣＳ含有ＤＭＥＭ中で一晩培養した。外移植片を、９６ウェルプレー
トに個別に移し、そして９日間、ｒｈＩＬ−１β（３ｎＭ）およびｒｈＴＮＦα
（６ｎＭ）の組合せの存在下または非存在下、そしてまた２０μＭのカテキンＥ
ＧＣＧまたはＥＣＧの存在下または非存在下にて無血清ＤＭＥＭ中で培養した。
培地を３日目および６日目に交換した。軟骨プロテオグリカンの分解を、ＤＭＢ
アッセイを使用して、総ｓＧＡＧのパーセントとして、外移植片から放出された
ｓＧＡＧを測定することによって、決定した。非パラメーター性データについて
両側マン−ホイットニー検定法を使用して決定した場合、サイトカインの組み合
わせとともに培養した群から放出されたプロテオグリカンを、他の群と比較した
場合、*ｐ＜０．０５。
【００７９】
【表５】 ヒト非慢性関節リウマチ関節軟骨を、マルファン症候群に罹患する患者から、
外科手術によって入手し、そして、５％（ｖ／ｖ）ＮＣＳ含有ＤＭＥＭ中で一晩
培養した。外移植片を、９６ウェルプレートに個別に移し、そして９日間、ｒｈ
ＩＬ−１β（３ｎＭ）およびｒｈＴＮＦα（６ｎＭ）の組合せの存在下または非
存在下、そしてまた２０μＭのカテキンＥＧＣＧまたはＥＣＧの存在下または非
存在下にて無血清ＤＭＥＭ中で培養した。培地を３日目および６日目に交換した
。軟骨プロテオグリカンの分解を、ＤＭＢアッセイを使用して、総ｓＧＡＧのパ
ーセントとして、外移植片から放出されたｓＧＡＧを測定することによって、決
定した。非パラメーター性データについて両側マン−ホイットニー検定法を使用
して決定した場合、サイトカインの組合せとともに培養した群から放出されたプ
ロテオグリカンを、他の群と比較した場合、**ｐ＜０．００５。
【００８０】
【表６】 ウシ鼻軟骨外移植片を、ｒｈＩＬ１α（４．５ｎＭ）と、カテキンＥＧＣＧま
たはＥＣＧ（２０μＭ）の存在下または非存在下で、２８日間培養した。培地を
、１週間に２回交換した。ＩＩ型コラーゲンの分解を、ＣＢ１１Ｂ阻害ＥＬＩＳ
Ａを使用して測定し、そしてデータをＩＩ型コラーゲンの累積的放出として表し
た。両側、非パラメーター性データについてマン−ホイットニーＵ検定法によっ
て決定し、ＩＬ１α単独の存在下で培養した群と比較した場合、*ｐ＜０．０５
、**ｐ＜０．０５および***ｐ＜０．００５。データは、２匹の動物に関する、
ｎ＝６／群／動物。
【００８１】
【表７】 （表６） ｒｈＩＬ１α（４．５ｎＭ）およびカテキンＥＧＣＧ、ＥＣＧ、ＥＣまたはＥ
ＧＣ（２０μＭ）の存在下または非存在下で、ウシ鼻軟骨外移植片を２８日間培
養した。培地を、１週間に２回交換した。軟骨ＩＩ型コラーゲンの分解を、ＣＢ
１１Ｂアッセイを使用して測定し、そしてデータをＩＩ型コラーゲンの累積的放
出として表した。両側、非パラメーター性データについてマン−ホイットニーＵ
検定法によって決定し、ｒｈＩＬ−１α単独の存在下で培養した群と比較した場
合、*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０５および***ｐ＜０．００５。各表のデータは
、４匹の動物から得られた結果を示す、ｎ＝１４／群全体。
【００８２】
【表８】 ウシ鼻外移植片を、２０μＭのｒｈＩＬ１αならびにカテキンＥＧＣＧおよび
ＥＣＧの存在下または非存在下において、２８日間培養した。培地を、１週間に
２回交換し、そして−２０℃で保存し、アッセイを待った。１７〜２０日目の培
地中および２４〜２８日目の培地中のラクテートレベルを、Ｓｉｇｍａからのキ
ットを使用して測定した。データは、２匹の動物に関する、ｎ＝６／動物。両側
、非パラメーター性データについてマン−ホイットニーＵ検定法を行った。全て
の群を、ＩＬ−１α存在下で培養した群と比較した。有意な差異は、観察されな
かった。
【００８３】
【表９】 ヒト末梢血を、無血清ＤＭＥＭで１：６に希釈し、次に細菌性リポ多糖類（Ｌ
ＰＳ）（１μｇ／ｍｌ）およびＥＧＣＧ（２０μＭ）の存在下または非存在下で
、水浴中で３７℃で４時間インキュベートした。血液を３回凍結融解し、そして
ＴＮＦαのレベルを、ＥＬＩＳＡキットを使用して定量した。***ｐ＜０．００
０５、ｎｄ＝検出不可能。
【図面の簡単な説明】
【図１ａ】 図１ａは、カテキンおよびその改変体の集まり（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）の化学
構造を示す。
【図１ｂ】 図１ｂは、カテキンおよびその改変体の集まり（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）の化学
構造を示す。
【図２】 図２は、ＴＮＦα誘導軟骨プロテオグリカン分解に対するＥＧＣＧの阻害活性
についての用量応答性を示す。
【図３】 図３は、ｒｈＩＬ−１α、ＥＣおよびＥＧＣの存在または非存在下で２８日間
培養したウシ鼻軟骨外移植片における巨視的変化を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 29/00 Ａ６１Ｐ 29/00 Ｃ０７Ｄ 311/62 Ｃ０７Ｄ 311/62 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 33/50 33/50 Ｚ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ， ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ， ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 アドコックス， クレアー イギリス国 エス10 ２アール シェフィ ールド， ビーチ ヒル ロード， メデ ィカル スクール， ユニバーシティ オ ブ シェフィールド (72)発明者 コリン， ピーター アメリカ合衆国 メイン 04681， スト ニングトン， ピー．オー． ボックス 151 Ｆターム(参考） 2G045 BB14 BB20 BB51 CB01 DA30 FB03 FB08 4C062 FF44 4C084 AA19 MA02 NA05 NA14 ZA961 ZA962 ZB111 ZB112 4C086 AA01 AA02 BA08 EA02 EA24 MA01 MA02 MA04 NA05 NA14 ZA96 ZB11

Claims (21)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 変形性関節症の処置のための医薬品の製造のための、以下か
    ら選択されるカテキン没食子酸エステルの使用：没食子酸エピカテキン；没食子
    酸カテキン；没食子酸ガロカテキン；没食子酸エピガロカテキン。
  2. 【請求項２】 前記医薬品が変形性関節症の予防処置のための、請求項１に
    記載の使用。
  3. 【請求項３】 前記予防処置が、変形性関節症に対する遺伝的素因を有する
    動物のための、請求項１に記載の使用。
  4. 【請求項４】 前記予防処置が、関節損傷に起因して変形性関節症を発症す
    る増加した可能性を有する動物を守るための、請求項３に記載の使用。
  5. 【請求項５】 薬理学的に有効な量の、請求項１〜４のいずれか１項に記載
    の医薬品を動物に投与する工程を包含する、変形性関節症を処置するための方法
    。
  6. 【請求項６】 少なくとも１つのカテキンおよび少なくとも１つの抗関節炎
    薬剤または生体高分子を含む、治療的組成物。
  7. 【請求項７】 前記抗関節炎薬剤がヒアルロン酸である、請求項５に記載の
    治療的組成物。
  8. 【請求項８】 前記抗関節炎薬剤がグルコサミンである、請求項５に記載の
    治療的組成物。
  9. 【請求項９】 グルコサミンがグルコサミン硫酸である、請求項７に記載の
    治療的組成物。
  10. 【請求項１０】 前記組成物が免疫サイレントである、請求項５〜９のいず
    れか１項に記載の治療的組成物。
  11. 【請求項１１】 前記カテキンおよび前記抗関節炎薬剤が、混合物として投
    与される、請求項５〜１０のいずれか１項に記載の治療的組成物。
  12. 【請求項１２】 前記カテキンおよび前記抗関節炎薬剤が、一緒に、架橋さ
    れるか、カップリングされるか、または会合される、請求項５〜１０のいずれか
    １項に記載の治療的組成物。
  13. 【請求項１３】 前記カテキンがヒアルロン酸と架橋されるか、カップリン
    グされるか、または会合される、請求項１２に記載の治療的組成物。
  14. 【請求項１４】 少なくとも１つのカテキンを、少なくとも１つの抗関節炎
    薬剤と架橋するかまたはカップリングする方法であって、以下： ｉ）少なくとも１つのカテキンおよび少なとも１つの抗関節炎薬剤を提供する
    工程； ｉｉ）該カテキンの該薬剤への架橋またはカップリングを行う条件を提供する
    工程；および必要に応じて ｉｉｉ）反応混合物から架橋されたかまたはカップリングされた複合体を精製
    する工程、 を包含する、方法。
  15. 【請求項１５】 請求項１４に記載の方法であって、前記抗関節炎薬剤がヒ
    アルロン酸であって、そして前記カテキンが以下：（＋）エピカテキン；（＋）
    カテキン；（−）エピカテキン；（−）カテキン；（−）エピガロカテカテキン
    ；（−）ガロカテキン；（−）没食子酸エピカテキン；（−）没食子酸カテキン
    ；（−）没食子酸エピガロカテキン；（−）没食子酸ガロカテキンから選択され
    る、方法。
  16. 【請求項１６】 抗関節炎特性を有する薬剤をスクリーニングする方法。
  17. 【請求項１７】 請求項１６に記載の方法であって、ここで該方法が以下： ｉ）軟骨サンプルを提供する工程； ｉｉ）有効量の、試験されるべき少なくとも１つの薬剤を添加する工程； ｉｉｉ）少なくとも１つの前炎症性サイトカインを添加する工程；および ｉｖ）軟骨分解を示す少なくとも１つの分子をモニターする工程、 を包含する、方法。
  18. 【請求項１８】 前記前炎症性サイトカインが以下から選択される、請求項
    １７に記載の方法：インターロイキン１α；インターロイキン１β；オンコスタ
    チンＭ；腫瘍壊死因子α。
  19. 【請求項１９】 請求項１６に記載の方法であって、ここで該方法が以下： ｉ）軟骨サンプルを提供する工程； ｉｉ）有効量の、試験されるべき少なくとも１つの薬剤を添加する工程； ｉｉｉ）少なくとも１つのビタミンＡ代謝産物を添加する工程；および ｉｖ）軟骨分解を示す少なくとも１つの分子をモニターする工程、 を包含する、方法。
  20. 【請求項２０】 前記ビタミンＡ代謝産物が全てｔｒａｎｓ−レチノイン酸
    である、請求項１９に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 請求項１６〜２１に記載のスクリーニング方法により同定
    される薬剤。
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