CN112697941A - 牛黄解毒片中黄芩规范投料的快速鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种牛黄解毒片中黄芩规范投料的快速鉴定方法，该方法是以黄芩苷和汉黄芩苷为对照品，采用高效液相色谱法进行测定，得到牛黄解毒片的高效液相色谱图，通过汉黄芩苷色谱峰峰面积与黄芩苷色谱峰峰面积对比进行判断，当汉黄芩苷色谱峰峰面积大于黄芩苷色谱峰峰面积的50%时，黄芩存在不规范投料的现象。本发明的方法采用高效液相色谱法快速得到汉黄芩苷、黄芩苷的色谱峰峰面积，仅通过两种成分的色谱峰峰面积比即可判断出黄芩是否存在不规范投料的现象，鉴定成本低、时间短、操作简便，且鉴定结果较为准确。通过本发明的鉴定方法对牛黄解毒片进行鉴定分析，可以规范牛黄解毒片中黄芩的投料方式，保证药效及用药安全。

Description

牛黄解毒片中黄芩规范投料的快速鉴定方法

技术领域

本发明涉及中医药质量检测技术领域，具体是一种牛黄解毒片中黄芩规范投料的快速鉴定方法。

背景技术

牛黄解毒片是由享八百年历史名药的牛黄解毒丸改变剂型研制而成，为清热解毒名方，主治火热内盛、咽喉肿痛、牙龈肿痛、口舌生疮、目赤肿痛等，疗效确切，现今仍为临床常用药物，是很多家庭常备的“祛火药”。《中国药典》中记载牛黄解毒片由大黄200g、黄芩150g、桔梗100g、甘草50g、石膏200g、人工牛黄5g、冰片25g、雄黄50g八味中药制成，其中黄芩为水煎煮液浓缩的干浸膏入药。现有研究表明，黄芩的主要成分为黄芩苷、 黄芩素、 汉黄芩苷和汉黄芩素等黄酮类化合物，黄芩会因保存或者炮制不当而使黄芩苷元中邻三酚羟基被氧化，转化成醌类衍生物而变绿，使有效成分黄芩苷收到破坏，质量随之降低。所以在牛黄解毒片中黄芩苷的含量是确定其质量的重要指标。现有技术中公开了很多关于牛黄解毒片中黄芩苷的含量测定方法，也有很多关于黄芩中黄芩苷、 黄芩素、汉黄芩苷或汉黄芩素成分的含量测定方法；但是对于牛黄解毒片中黄芩的质量控制仅凭测定黄芩苷的含量并不能保证牛黄解毒片的用药安全及疗效。

薛胜利等人运用 HPLC 法测定不同厂家牛黄解毒片中黄芩苷的含量，测定结果显示三个不同厂家的数值不相同，其含量在0.98%～2.49%之间，相差较远，这势必会对临床疗效产生一定的影响。其还公开了HPLC的检测方法为：对照品溶液的制备：精密称取黄芩苷对照品10mg，置10ml 量瓶中，加甲醇溶解，并稀释到刻度，摇匀，超声振荡使充分溶解，配制成1mg/ml 的溶液，作为对照品储备液。供试品溶液的制备：取牛黄解毒片20片，研细，称取适量，置于容量瓶中，加甲醇至刻度，称重。超声提取 30min，补足减失的重量，摇匀，5000r/min 离心15min，取上清液，即得所需浓度的供试品溶液。色谱条件及系统适应性试验：色谱柱：DiamonsilC18柱（250nm×4.6 mm，5μm）；流动相：甲醇-水-磷酸（50: 50: 0.2），流速：0.8ml/min；检测波长：280nm；柱温：20℃。进样量：20μl。取黄芩苷对照品和牛黄解毒片样品溶液各 20μl 进样，记录色谱图，见图 1、2。本实验条件下，黄芩苷与样品中其他成分达到基线分离，分离度大于 1.5，理论塔板数大于2000（薛胜利，孟娜娜，李珂. HPLC法测定不同厂家牛黄解毒片中黄芩苷的含量[J]《泰山医学院学报》，2015年1期）。吴琼莲等人对牛黄解毒片含量测定项下高效液相色谱图进行分析，结果发现，按有关标准检验合格的云南、贵州、广东、广西9家药厂生产的13批牛黄解毒片，在同一色谱条件下含量测定的高效液相色谱图间存在显著差异，说明某些厂家在生产牛黄解毒片时，有偷工减料、使用不合格原辅料或未按规定工艺生产的嫌疑。建议在牛黄解毒片的质量标准中增加以牛黄解毒片标准浸膏为对照的液相色谱鉴别，规定样品含量测定的高效液相色谱图中应有与对照浸膏相同的色谱共有峰（吴琼莲，何继祥，陈忠琴，许庆.牛黄解毒片质量标准中含量测定项应予改进[J]《中国药业》ISTIC-2007年4期）。马宁等人以1%乙醇溶液作为溶出介质，建立了牛黄解毒片中黄芩苷的溶出度测定方法，结果表明，不同厂家及同一厂家不同批号的样品之间的溶出度差异较大，非常不利于稳定中药片剂的疗效（马宁，龚秋红，欧燕，黄海萍，李焕德.牛黄解毒片溶出度测定方法的研究[J] 《湖南中医药导报》ISTIC-2004年5期）。

综上，按照目前的牛黄解毒片质量标准，牛黄解毒片中容易存在偷工减料、使用不合格原辅料或未按规定工艺生产的嫌疑，虽然已有部分文献提出了一些解决方法，但是至今还未有一种能够快速鉴定牛黄解毒片中黄芩是否存在不规范投料现象的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种牛黄解毒片中黄芩规范投料的快速鉴定方法，该鉴定方法成本低、时间短、操作简便，且鉴定结果较为准确。通过本发明的鉴定方法对牛黄解毒片进行鉴定分析，可以规范牛黄解毒片中黄芩的投料方式，保证药效及用药安全。

本发明的技术方案如下：

一种牛黄解毒片中黄芩规范投料的快速鉴定方法，该方法是以黄芩苷和汉黄芩苷为对照品，采用高效液相色谱法进行测定，具体如下：

（1）色谱条件与系统适用性试验：色谱柱：CAPCELL PAK C18 MGII；以甲醇为流动相A，0.4%磷酸水溶液为流动相B，流速1.0mL/min，按下表1中的规定进行梯度洗脱；检测波长为274nm。

（2）对照品溶液的制备：取黄芩苷对照品、汉黄芩苷对照品适量，加甲醇溶解并稀释至刻度，混匀，制成每1mL含黄芩苷、汉黄芩苷各0.4mg的溶液，即得。

（3）供试品溶液的制备：取牛黄解毒片样品，除去包衣，研细，精密称取适量，置锥形瓶中，按3g：200mL的配比加入体积浓度为50%的乙醇，超声处理30分钟，滤过，即得。

（4）测定：精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得。

（5）判定：在供试品色谱中，汉黄芩苷色谱峰峰面积不得大于黄芩苷色谱峰峰面积的50%。

进一步，还能利用以上色谱、质谱条件，增加黄芩素、汉黄芩素作为对照品，对黄芩药材、黄芩二次提取物、黄芩醇提物、黄芩提取物、黄芩浸膏、黄芩浸膏制备过程中废液等黄芩的不同提取物及提取废弃液进行分析，得到黄芩各提取物及提取废弃液的高效液相色谱图，通过将黄芩异常投料的牛黄解毒片样品的高效液相色谱图与黄芩各提取物及提取废弃液的高效液相色谱图进行对比，可以确定异常投料的牛黄解毒片样品中黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素或汉黄芩素成分的来源，从而判定异常投料的原因。

本发明的有益效果是：

本发明的鉴定方法采用高效液相色谱法快速得到汉黄芩苷、黄芩苷的色谱峰峰面积，仅通过两种成分的色谱峰峰面积比即可判断出黄芩是否存在不规范投料的现象，对照品需求量少，鉴定成本低、时间短、操作简便，且鉴定结果较为准确。通过本发明的鉴定方法对牛黄解毒片进行鉴定分析，可以规范牛黄解毒片中黄芩的投料方式，保证药效及用药安全。

利用本发明的色谱、质谱条件，增加黄芩素、汉黄芩素作为对照品，对黄芩药材、黄芩二次提取物、黄芩醇提物、黄芩提取物、黄芩浸膏、黄芩浸膏制备过程中废液等黄芩的不同提取物及提取废弃液进行分析，还可以判定异常投料的原因。

附图说明

图1是M公司生产的批号为180905的牛黄解毒片的高效液相色谱图；

图2是M公司生产的批号为180602的牛黄解毒片的高效液相色谱图；

图3是M公司生产的批号为190304的牛黄解毒片的高效液相色谱图；

图4是M公司生产的批号为190203的牛黄解毒片的高效液相色谱图；

图5是M公司生产的批号为190402的牛黄解毒片的高效液相色谱图；

图6是P公司生产的批号为190802的牛黄解毒片的高效液相色谱图；

图7是S公司生产的批号为18121767的牛黄解毒片的高效液相色谱图；

图8是牛黄解毒片模拟制剂的高效液相色谱图；

图9是黄芩药材的高效液相色谱图；

图10是黄芩二次提取液（70%、95%乙醇提取）的高效液相色谱图；

图11是黄芩二次提取液（30%、50%乙醇提取）的高效液相色谱图；

图12是黄芩95%乙醇提取液的高效液相色谱图；

图13是黄芩70%乙醇提取液的高效液相色谱图；

图14是黄芩提取物的高效液相色谱图；

图15是黄芩浸膏的高效液相色谱图；

图16是陕西黄芩（批号：1712005）浸膏制备过程中废液的高效液相色谱图；

图17是河北黄芩（批号：180301）浸膏制备过程中废液的高效液相色谱图；

图18是山西黄芩（批号：20180701）浸膏制备过程中废液的高效液相色谱图；

图19是甘肃黄芩（批号：180201）浸膏制备过程中废液的高效液相色谱图。

具体实施方式

为了更加详细的介绍本发明，下面结合实施例，对本发明做进一步说明。

实施例

仪器：安捷伦1260 超高效液相色谱仪，配DAD检测器；ML204型电子分析天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司），Hei-VAP 型旋转蒸发仪（德国Heidolph公司）。

药剂：雄黄、石膏、大黄、桔梗和冰片购自玉林药材市场，人工牛黄、黄芩、甘草为2018、2019年抽检合格药材，黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷和汉黄芩素均由中国食品药品检定研究院提供。牛黄解毒片均为2019广西壮族自治区评价性抽验的样品，批号及生产企业见表2。乙腈、甲醇(色谱级，merck)，甲酸、磷酸(优级纯，天津市光复精细化工研究所)，超纯水(由Millipore 纯水系统制备)。

一种牛黄解毒片中黄芩规范投料的快速鉴定方法，具体如下：

（1）色谱条件与系统适用性试验：色谱柱：CAPCELL PAK C18 MGII（4.6×250mm，5μm）；以甲醇为流动相A，0.4%磷酸水溶液为流动相B，流速1.0mL/min，按下表1中的规定进行梯度洗脱；检测波长为274nm。

（2）供试品溶液的制备：取牛黄解毒片样品20片，除去包衣，研细，精密称取0.6g，置锥形瓶中，加体积浓度为50%的乙醇40mL，超声处理30分钟，滤过，即得。

（3）对照品溶液的制备：取黄芩苷对照品、汉黄芩苷对照品、黄芩素对照品、汉黄芩素对照品各10mg，置25mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

（4）测定：精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得。

（5）判定：在供试品色谱中，汉黄芩苷色谱峰峰面积不得大于黄芩苷色谱峰峰面积的50%。

本申请人按照以上鉴定方法对2019广西壮族自治区评价性抽验的样品（来自20个生产企业的45批样品，其中不同批号为44批，样品信息见表2）进行检测，结果显示，其中有两家企业生产的共6批样品异常，异常样品的高效液相色谱图见图1-6，可以看到异常样品中黄芩苷、汉黄芩苷和汉黄芩素峰面积都比较大的；而在正常样品的高效液相色谱图中，黄芩苷峰面积较大，汉黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素的峰面积较小，见图7（由S公司生产的批号为18121767的牛黄解毒片的色谱图）。

为了排除是由黄芩来源不同造成的异常，本申请人采用不同产地不同批号的10批黄芩药材按《中国药典》2015版第一部牛黄解毒片制法制成了牛黄解毒片模拟制剂共10批，模拟制剂中人工牛黄1g、雄黄10g、石膏40g、大黄40g、黄芩30g、桔梗20g、冰片5g和甘草10g。采用以上牛黄解毒片中黄芩规范投料的快速鉴定方法对该10批牛黄解毒片模拟制剂进行检测分析，其中一批牛黄解毒片模拟制剂的高效液相色谱图见图8，检测结果表明10批牛黄解毒片模拟制剂的高效液相色谱图与对照品溶液及正常牛黄解毒片样品的高效液相色谱图一致、相似，排除异常样品是由黄芩来源不同造成的异常。

为了进一步确定牛黄解毒片样品异常的原因，本申请人还做了以下试验：

1、异性有机物检查

方法一、运用近红外（NIR）对异常牛黄解毒片中异性有机物进行检查，结果，所有批次牛黄解毒片异性有机物检查都合格，未检出黄芩植物组织。

方法二、对黄芩药材进行高效液相分析，并与异常牛黄解毒片样品的高效液相色谱图进行对比，步骤如下：

（1）取黄芩药材30g，加入体积浓度为50%的乙醇，超声处理30分钟，滤过，得到黄芩50%乙醇提取液。

（2）取以上黄芩50%乙醇提取液10μL，注入高效液相色谱仪，测定，得到黄芩的高效液相色谱图见图9。将其与异常牛黄解毒片的高效液相色谱图进行对比，结果表明，异常牛黄解毒片的色谱图与经50%乙醇超声提取后的黄芩的色谱图并不一致，可以排除原粉投料的可能。

2、黄芩二次提取物筛查

（1）黄芩二次提取液制备：取黄芩药材10g，加水适量，煎煮2小时后过滤，滤渣再煎煮1小时，过滤，取滤渣，平均分为四份，分别用体积浓度为30%、50%、70%和95%的乙醇回流提取一小时，滤过，即得。

（2）取以上黄芩二次提取液10μL，注入高效液相色谱仪，测定，得到黄芩二次提取液的高效液相色谱图见图10、11。将其与异常牛黄解毒片的高效液相色谱图进行对比，结果表明，几种体积浓度的乙醇回流提取无太大差异，黄芩二次提取物的色谱图与异常牛黄解毒片的色谱图不一致、不相似。95%乙醇提取的黄芩色谱图中，极性越低的物质提取越充分，即出峰时间越晚，峰面积逐渐增加，70%乙醇提取的黄芩色谱图与50%乙醇提取黄芩色谱图相似。

3、黄芩醇提物筛查

（1）黄芩醇提液制备：取黄芩药材0.5g，分别加70%乙醇和95%乙醇50mL超声处理（功率250W，频率33kHz）30分钟，滤过，即得。

（2）取以上黄芩醇提液10μL，注入高效液相色谱仪，测定，得到黄芩醇提液的高效液相色谱图见图12、13。将其与异样牛黄解毒片的高效液相色谱图进行对比，结果表明，黄芩醇提液的色谱图与异常牛黄解毒片的色谱图不一致、不相似，可排除黄芩醇提物投料的可能。

4、黄芩提取物溶液筛查

（1）黄芩提取物溶液制备：取黄芩药材，加水煎煮2次，第一次2小时，第二次1小时，每次煎煮后过滤，合并2次煎液，浓缩至适量，用盐酸调节pH值至1.0-2.0，80℃保温，静置，滤过，沉淀物加适量水搅匀，用40%氢氧化钠溶液调节pH值至7.0，加等量乙醇，搅拌使溶解，滤过，滤液用盐酸调节pH值至1.0-2.0，60℃保温，静置，滤过，沉淀依次用适量水及不同浓度的乙醇洗至pH值至7.0，挥尽乙醇，减压干燥，即得。取黄芩提取物10mg，加50%乙醇超声溶解，定容至10mL量瓶中，滤过，即得。色谱图见图14。

5、黄芩浸膏筛查

（1）黄芩浸膏溶液制备：取黄芩药材，加水煎煮三次，第一次1.5小时，第二次1小时，第三次4分钟，合并煎液，滤过，滤液用盐酸调节pH值至1-2，静置1小时，取沉淀，用水洗涤使pH值至5-7，烘干，粉碎成细粉。取黄芩浸膏10mg，加50%乙醇适量超声溶解，定容至10mL量瓶中，滤过，即得。

（2）取以上黄芩浸膏溶液10μL，注入高效液相色谱仪，测定，得到黄芩浸膏溶液的高效液相色谱图见图15。将其与异样牛黄解毒片的高效液相色谱图进行对比，结果表明，黄芩浸膏经过多次纯化，黄芩苷纯度高，黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素含量都较低，黄芩浸膏溶液的色谱图与异常牛黄解毒片的色谱图不一致、不相似，可排除黄芩浸膏投料的可能。

5、黄芩浸膏制备过程中废液的筛查

（1）黄芩浸膏制备过程中废液制备：取黄芩药材，加水煎煮三次，第一次1.5小时，第二次1小时，第三次4.分钟，合并煎液，滤过，滤液用盐酸调节pH值至1-2，静置1小时，析出沉淀后进行过滤，将滤液浓缩，加适量50%乙醇超声处理30分钟，滤过，即得。

（2）取以上黄芩浸膏制备过程中废液10μL，注入高效液相色谱仪，测定，黄芩浸膏制备过程中废液的高效液相色谱图见图16-19。将其与异样牛黄解毒片的高效液相色谱图进行对比，结果表明，黄芩浸膏制备过程中废液中黄芩苷、汉黄芩苷和汉黄芩素峰面积都是比较大的，黄芩素峰面积则较前三者小很多，汉黄芩苷峰面积与黄芩苷峰面积相当，有的甚至比黄芩苷峰面积值大，这些都与异常样品的色谱图非常相似，即异常牛黄解毒片存在回收利用黄芩浸膏生产过程中产生的废液的可能。

Claims (2)

1.一种牛黄解毒片中黄芩规范投料的快速鉴定方法，其特征在于，所述鉴定方法是以黄芩苷和汉黄芩苷为对照品，采用高效液相色谱法进行测定，得到牛黄解毒片的高效液相色谱图，通过汉黄芩苷色谱峰峰面积与黄芩苷色谱峰峰面积对比进行判断，当汉黄芩苷色谱峰峰面积大于黄芩苷色谱峰峰面积的50%时，黄芩存在不规范投料的现象。

2.根据权利要求1所述牛黄解毒片中黄芩规范投料的快速鉴定方法，其特征在于，所述鉴定方法的具体过程如下：

（1）色谱条件与系统适用性试验：色谱柱：CAPCELL PAK C18 MGII；以甲醇为流动相A，0.4%磷酸水溶液为流动相B，流速1.0mL/min，进行梯度洗脱，洗脱程序为：0～50min，35→55A%，50～65min，55→90A%，65～70min，90A%；检测波长为274nm；

（2）对照品溶液的制备：取黄芩苷对照品、汉黄芩苷对照品适量，加甲醇溶解并稀释至刻度，混匀，制成每1mL含黄芩苷、汉黄芩苷各0.4mg的溶液，即得；

（3）供试品溶液的制备：取牛黄解毒片样品，除去包衣，研细，精密称取适量，置锥形瓶中，按3g：200mL的配比加入体积浓度为50%的乙醇，超声处理30分钟，滤过，即得；

（4）测定：精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得；

（5）判定：在供试品色谱中，汉黄芩苷色谱峰峰面积不得大于黄芩苷色谱峰峰面积的50%。

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