CN105622374A - 一种从紫草中分离制备具有神经氨酸酶抑制活性的化合物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从紫草中分离制备具有神经氨酸酶抑制活性的化合物的方法,步骤如下:(1)以石油醚作为提取溶剂,制备得到紫草提取液;(2)将紫草提取液与神经氨酸酶混匀,反应后进行超滤离心,离心后加入甲醇使酶变性,释放出结合的化合物,进一步离心超滤,滤液采用HPLC检测;以变性神经氨酸酶作为对照,通过对比HPLC图谱筛选出具有神经氨酸酶抑制活性的化合物;(3)利用半制备色谱制备筛选出的具有神经氨酸酶抑制活性的化合物。采用本发明的方法,制备的化合物的纯度高,其纯度均在98%以上,可以直接作为标准品使用;分离的化合物的神经氨酸酶的抑制活性高,可以用于制备神经氨酸酶抑制剂类药物。
Description
技术领域
本发明涉及一种从紫草中分离制备具有神经氨酸酶抑制活性的化合物的方法。
背景技术
流感(流行性感冒)是由流感病毒引起的急性呼吸道感染,具有传染性强,发病率高,容易引起暴发流行或大流行等特点。特别是近年来,新型流感不断爆发,给人类健康带来了严重的危害。神经氨酸酶是流感病毒表面一种重要的病毒表面糖蛋白,具有糖苷外切酶活性,可以水解唾液酸(sialicacid)残基与邻近寡糖之间的α-糖苷键。协助成熟流感病毒脱离宿主细胞感染新的细胞,在流感病毒的生活周期中扮演了重要的角色,因而神经氨酸酶是流感治疗药物的主要作用靶点之一。神经氨酸酶抑制剂(neuraminidase,NA)是目前各国普遍采用治疗流感的药物。然而,已有的抗流感药物仍然存在数量少、疗效不理想且不良反应较大等特点,急需开发高效,低毒,天然的新型神经氨酸酶抑制剂。
紫草(Lithospermiunerythrorhizon)是紫草科(Boraginaceae)植物新疆紫草(Amebiaeuchroma(Royte)Johnst.)或内蒙紫草(ArnebiaguttataBunge)的干燥根,在我国有悠久的药用历史。其味甘、咸,性寒,归心、肝经。有活血凉血,清热,解毒、透疹等功效。到目前为止,还没有从紫草中发现神经氨酸酶抑制剂并以其为指标对紫草进行质量控制的报道。
发明内容
针对上述现有技术,本发明的目的是提供一种从紫草中分离制备具有神经氨酸酶抑制活性的化合物的方法。
为实现上述目的,本发明采用下述技术方案:
一种从紫草中分离制备具有神经氨酸酶抑制活性的化合物的方法,步骤如下:
(1)以石油醚作为提取溶剂,制备得到紫草提取液;
(2)将紫草提取液与神经氨酸酶混匀,孵育,孵育后超滤离心,离心后加入甲醇使酶变性,释放出结合的化合物,HPLC检测;以变性神经氨酸酶作为对照,通过对比HPLC图谱筛选出具有神经氨酸酶抑制活性的化合物;
(3)利用半制备色谱制备筛选出的具有神经氨酸酶抑制活性的化合物。
步骤(1)中,所述紫草提取液的制备方法为:将紫草与石油醚按料液比为1:80-1:120,优选为1:100,混合,超声提取20-40min(优选为30min)后,蒸干滤液,用乙醇和MES缓冲液复溶后过膜待用,作为紫草提取液。
步骤(2)中,紫草提取液和神经氨酸酶加入的体积比为1:4-6,优选为1:5。本发明综合考虑到紫草的提取溶剂对酶反应的影响以及反应体系中神经氨酸酶的终浓度,确定紫草提取液和神经氨酸酶加入的体积比为1:4-1:6;当体积比高于1:4时,神经氨酸酶浓度较低,筛选效果不明显;体积低于1:6时,反应体系中活性成分含量过低与神经氨酸酶结合差异较小,均不利于筛选的进行。
步骤(2)中,孵育的条件为:37℃恒温孵育30min。
步骤(2)中,所述超滤离心的操作为:将紫草提取液和神经氨酸酶反应后的溶液移至超滤离心管中,所述超滤离心管的截留分子量为100KD,7000-9000r/min离心5-10min,再用MES缓冲液离心冲洗,以除去未结合的小分子。
步骤(2)中,筛选具有神经氨酸酶抑制活性的化合物的方法为:通过对比紫草提取液与神经氨酸酶反应后的HPLC图以及紫草提取液与变性神经氨酸酶反应后的HPLC图,HPLC图谱发生明显变化的色谱峰所对应的化合物即为潜在的神经氨酸酶抑制剂。
步骤(3)中,所述半制备色谱的制备条件为:紫草提取液的进样量为400-600μL,乙腈:水=80:20作为洗脱流动相,流速为5-7mL/min,检测波长为280nm。
步骤(3)中,半制备色谱的色谱柱优选为Shim-packPrep-ODS(H)KIT色谱柱。
上述方法中,提取溶剂的选择对制备得到的紫草提取液的活性影响很大,本发明在试验过程中选择了多种提取溶剂对紫草进行提取,将不同提取溶剂得到的紫草提取液进行体外酶活验证,结果发现,不同提取溶剂得到的紫草提取液对神经氨酸酶的抑制活性差别显著,以石油醚作为提取溶剂得到的紫草提取液,其对神经氨酸酶的抑制活性最高,达45.67±0.71%以上。说明以石油醚作为提取溶剂可以对紫草中的具有神经氨酸酶抑制活性的化合物进行有效的提取。
采用本发明的方法可以制备得到五种具有神经氨酸酶抑制活性的化合物,分别为阿卡宁、乙酰阿卡宁、异丁酰阿卡宁、β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁和异戊酰阿卡宁。化合物的结构式如下:
本发明还提供上述五种化合物在制备神经氨酸酶抑制剂类药物中的应用。
上述五种化合物作为紫草质量控制指标的应用也是本发明保护的范围。
本发明的有益效果:
(1)本发明提供了一种从紫草中快速分离制备天然的具有神经氨酸酶抑制活性的化合物的方法,制备的化合物的纯度高,其纯度均在98%以上,可以直接作为标准品使用;经试验验证,上述分离的化合物的神经氨酸酶的抑制活性高,可以用于制备神经氨酸酶抑制剂类药物。
(2)紫草的资源丰富,而且本发明的分离制备方法简单易行,可以有效解决目前神经氨酸酶抑制剂类药物贫乏的问题。
附图说明
图1:紫草石油醚提取物超滤筛选的HPLC图谱。
图2:紫草中筛选出的化合物的制备图谱;图中,1:阿卡宁;2.乙酰阿卡宁;3.异丁酰阿卡宁;4:β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁;5:异戊酰阿卡宁。
图3:紫草中筛选出的化合物的制备图谱及纯度检测图谱;图中,1:阿卡宁;2.乙酰阿卡宁;3.异丁酰阿卡宁;4:β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁;5:异戊酰阿卡宁。
具体实施方式
结合实施例对本发明作进一步的说明,应该说明的是,下述说明仅是为了解释本发明,并不对其内容进行限定。
实施例1:提取溶剂的筛选
(1)紫草提取液的制备
将紫草药材粉碎,过40目筛,精密称取粉末0.5g,置于具塞锥形瓶中加入提取溶剂50mL,超声提取30min,滤液过滤,于50℃条件下旋蒸至干,称量。加入50%乙醇和MES缓冲液(含5%DMSO)复溶备用。
本实施例中,提取溶剂分别为:纯水、80%乙醇、乙酸乙酯和石油醚。
(2)体外酶活试验:
将四种不同提取溶剂得到的紫草提取液、神经氨酸酶溶液和MES缓冲液按3:3:4比例加入96孔板,混匀后37℃孵育30min,加入20μLMUNANA底物继续孵育1h,加入终止剂100μL,终止反应后在酶标仪激发波长355nm,发射波长460nm下测定。空白是将神经氨酸酶溶液替换为MES缓冲液,将样品溶液换为复溶溶液。对照则为将样品溶液换为复溶溶液。抑制率计算公式为:(A对照-A样品)/(A对照-A空白)×100%。A对照,A空白和A样品分别表示对照,空白和样品的荧光吸收。
检测结果显示浓度为50μg/mL的四种不同提取溶剂制得的紫草提取物的抑制率分别为:7.66±0.17%(纯水),26.13±0.52%(80%乙醇),29.6±0.28%(乙酸乙酯)和45.67±0.71%(石油醚)。
结果表明:紫草的石油醚提取液神经氨酸酶抑制率最高,其对神经氨酸酶的半数抑制浓度(IC50)为IC50(μg/mL)=158.7±11.3。
因此,以石油醚作为提取溶剂进行后续的实验研究。
实施例2:从紫草中分离制备具有神经氨酸酶抑制活性的化合物
(1)紫草提取液的制备
将紫草药材粉碎,过40目筛,精密称取粉末0.5g,置于具塞锥形瓶中加入石油醚50ml,超声提取30min,滤液过滤,于50℃条件下旋蒸至干,称量。加入乙醇和MES缓冲液(含5%DMSO)各1.0mL复溶后过膜备用;
(2)具有神经氨酸酶抑制活性的化合物的筛选
紫草石油醚提取物10μL和神经氨酸酶50μL与缓冲溶液240μL一起加到截留分子量为100KD的YM-100型超滤管中,置于37℃恒温培养箱孵育30min,8000r/min离心5min,缓冲液离心冲洗三次以便除去未结合小分子。之后加入纯甲醇150μL静置20min后8000r/min离心收集滤液,重复三次。氮吹吹干后加入150μL甲醇复溶,用于HPLC分析。空白试验采用变性神经氨酸酶替代神经氨酸酶溶液作为空白对照重复以上反应;通过对比紫草提取液与神经氨酸酶反应后的筛选图以及紫草提取液与变性神经氨酸酶反应后的筛选图,HPLC图谱发生明显变化是色谱峰对应的化合物即为潜在的神经氨酸酶抑制剂。
(3)利用半制备色谱快速制备筛选出的具有神经氨酸酶抑制活性的化合物
半制备色谱条件为:岛津LC-20AR,Shim-packPREP-ODS(H)KIT色谱柱,流速:6mL/min;80%乙腈;进样量:500μL;检测波长:280nm。
等度洗脱,得到5种化合物,经过峰面积归一化法对其纯度进行了鉴定。纯度均达到98%以上。经核磁检测这五种化合物为:阿卡宁、乙酰阿卡宁、异丁酰阿卡宁、β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁和异戊酰阿卡宁。
紫草中筛选出的具有神经氨酸酶抑制活性的化合物的制备图谱及纯度检测图谱如图1所示;紫草中活性成分的ESI-Q-TOF/MS鉴别结果如表1所示。
表1紫草中活性成分的ESI-Q-TOF/MS鉴别
实施例3:化合物对神经氨酸酶抑制活性的验证
将实施例2制备的阿卡宁,乙酰阿卡宁,异丁酰阿卡宁,β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁,异戊酰阿卡宁5种化合物分别配置不同浓度溶液,按照实施例1中“体外酶活试验”的方法分别鉴定得出这五种化合物对神经氨酸酶的抑制活性。
结果表明:上述5中化合物对神经氨酸酶的抑制活性较好,其IC50分别为:62.85μg/mL,54.39μg/mL,200.23μg/mL,59.44μg/mL,60.87μg/mL。
实施例4:紫草中阿卡宁,乙酰阿卡宁,异丁酰阿卡宁,β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁,异戊酰阿卡宁5种化合物的含量测定
以实施例2制备的阿卡宁,乙酰阿卡宁,异丁酰阿卡宁,β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁,异戊酰阿卡宁5种化合物作为标准品,配制混标溶液,并稀释到不同浓度进样分析,以浓度(mg/L)为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制得到这五种化合物的标准曲线。其回归方程如表2所示:
表2紫草中筛选出的五种化合物的回归方程
利用上述回归方程对不同批次的紫草中上述5种化合物的含量进行测定,结果如表3所示:
表3不同批次紫草样品五种化合物的含量
Claims (10)
1.一种从紫草中分离制备具有神经氨酸酶抑制活性的化合物的方法,其特征在于,步骤如下:
(1)以石油醚作为提取溶剂,制备得到紫草提取液;
(2)将紫草提取液与神经氨酸酶混匀,孵育,孵育后超滤离心,离心后加入甲醇使酶变性,释放出结合的化合物,HPLC检测;以变性神经氨酸酶作为对照,通过对比HPLC图谱筛选出具有神经氨酸酶抑制活性的化合物;
(3)利用半制备色谱制备筛选出的具有神经氨酸酶抑制活性的化合物。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(1)中,所述紫草提取液的制备方法为:将紫草与石油醚按料液比为1:80-1:120混合,优选为1:100,超声提取20-40min后,蒸干滤液,用乙醇和MES缓冲液复溶后过膜待用,作为紫草提取液。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(2)中,紫草提取液和神经氨酸酶加入的体积比为1:4-1:6,优选为1:5。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(2)中,孵育的条件为:37℃恒温孵育30min。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(2)中,所述超滤离心的操作为:将紫草提取液和神经氨酸酶反应后的溶液移至超滤离心管中,所述超滤离心管的截留分子量为100KD,7000-9000r/min离心5-10min,再用MES缓冲液离心冲洗,以除去未结合的小分子。
6.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(3)中,所述半制备色谱的制备条件为:紫草提取液的进样量为400-600μL,乙腈-水=80:20作为洗脱流动相,流速为5-7mL/min,检测波长为280nm。
7.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(3)中,半制备色谱的色谱柱为Shim-packPrep-ODS(H)KIT色谱柱。
8.权利要求1至7任一项所述的方法分离制备的具有神经氨酸酶抑制活性的化合物,其特征在于,所述化合物分别为阿卡宁、乙酰阿卡宁、异丁酰阿卡宁、β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁和异戊酰阿卡宁。
9.权利要求8所述的化合物在制备神经氨酸酶抑制剂类药物中的应用。
10.权利要求8所述的化合物在作为紫草质量控制指标中的应用。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108445114A (zh) * | 2018-06-07 | 2018-08-24 | 山东省分析测试中心 | 一种筛选金银花中微量神经氨酸酶抑制剂的方法 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1548036A (zh) * | 2003-05-08 | 2004-11-24 | 北京金本草中药科技发展有限公司 | 含有阿卡宁类化合物作为活性成分的药物 |
CN101342170A (zh) * | 2007-07-14 | 2009-01-14 | 新疆安迪尔生物科技有限责任公司 | 新疆软紫草用于治疗扁平疣、寻常疣、尖锐湿疣的应用 |
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Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1548036A (zh) * | 2003-05-08 | 2004-11-24 | 北京金本草中药科技发展有限公司 | 含有阿卡宁类化合物作为活性成分的药物 |
CN101342170A (zh) * | 2007-07-14 | 2009-01-14 | 新疆安迪尔生物科技有限责任公司 | 新疆软紫草用于治疗扁平疣、寻常疣、尖锐湿疣的应用 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
于黎鑫等: "新疆紫草羟基萘醌有效部位制备工艺研究", 《中国中医药信息杂志》 * |
刘舒等: "中药黄芩中神经氨酸酶抑制剂的超滤质谱筛选研究", 《化 学 学 报》 * |
韩涛等: "紫草蔡醒类成分的提取与纯化工艺优选", 《第二届中药现代化新剂型新技术国际学术会议》 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108445114A (zh) * | 2018-06-07 | 2018-08-24 | 山东省分析测试中心 | 一种筛选金银花中微量神经氨酸酶抑制剂的方法 |
CN108445114B (zh) * | 2018-06-07 | 2021-01-05 | 山东省分析测试中心 | 一种筛选金银花中微量神经氨酸酶抑制剂的方法 |
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