CN103202872A - 一种小花棘豆黄酮的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种小花棘豆黄酮的制备方法及其应用，包括以下步骤：(1)小花棘豆粉碎；(2)超声波协助法提取小花棘豆总提取物；(3)小花棘豆黄酮的分离；(4)小花棘豆黄酮的定性检测；(5)小花棘豆黄酮含量的测定。本发明具有制备工艺简单，成本较低的特点，适合推广和应用。
Description
技术领域
本发明属于医药和保健品技术领域，涉及一种小花棘豆黄酮的制备方法及其应用。
背景技术
小花棘豆(Oxytropis glabra DC)是豆科(Leguminosae)棘豆属(Oxytropis)植物，在新疆分布广泛。据蒙药典记载，小花棘豆是一种重要的中蒙药原料，具有麻醉、镇静和止痛作用，主治牙痛、关节痛、失眠、健忘、神经衰弱及皮肤瘙痒。如小花棘豆4.5g、北五加皮6g及地枸叶9g，水煎服，可治关节痛。
黄酮类化合物是小花棘豆的有效成分之一。目前，已从小花棘豆中分离得到了7种黄酮类化合物，均以黄酮苷的形式存在，且均为氧苷。苷元主要为山柰酚、槲皮素、鼠李素和异鼠李素等，糖取代基有D-葡萄糖、L-鼠李糖和D-芸香糖等。并且发现小花棘豆的黄酮含量高于传统藏药“达夏”(镰形棘豆)，表明小花棘豆黄酮具有较好的开发利用前景。国内外研究认为黄酮类化合物除具有抗菌、抗炎、抗突变、降压、清热解毒、镇静、利尿等作用，在抗氧化、抗癌、抑制脂肪酶等方面有显著效果，同时也是大多数氧自由基的清除剂，对冠心病、心绞痛等疾病的治疗效果显著；而且黄酮类化合物安全性好、毒性小。而到目前为止，并未有小花棘豆黄酮保肝和抗氧化作用的研究报道和专利申请。
发明内容
本发明的目的在于克服上述技术存在的缺陷，提供一种小花棘豆黄酮的制备方法及其应用，提取得到新疆小花棘豆黄酮类成分，通过体外抗脂质氧化试验、体外自由基清除试验、肝损伤小鼠体内自由基清除试验，小鼠饲喂安全性试验等，发现小花棘豆黄酮具有保肝和抗氧化作用，可以用于制备保肝和抗氧化药物及保健食品。。
其具体技术方案为：
一种小花棘豆黄酮的制备方法，包括以下步骤：
(1)小花棘豆粉碎：取小花棘豆地上部分，阴干、粉碎、过20目筛后备用；
(2)超声波协助法提取小花棘豆总提取物：称取小花棘豆样品，按照物料比1∶10～1∶20g/mL的比例加入体积分数60％～100％的甲醇超声波提取45～90min，超声波功率800W，温度45℃，提取完成后过滤，滤液采用旋转蒸发仪浓缩，恒温干燥箱干燥，即得到小花棘豆总提取物；
(3)小花棘豆黄酮的分离：将小花棘豆总提取物用水充分溶解；向层析柱中加入1/3体积的去离子水，然后将D-101型大孔吸附树脂用去离子水转移至层析柱中，加入70％的乙醇溶液(V/V)，体积为树脂体积的2倍，流速为1倍树脂体积/min，然后用去离子水洗至无醇味后进行小花棘豆总提取物水溶液的梯度洗脱，用10％～100％的乙醇洗脱，收集50％～85％的乙醇洗脱液，经旋转蒸发仪浓缩，冷冻干燥仪干燥，得到棕黄色粉末；
(4)小花棘豆黄酮的定性检测：通过显色反应和纸层析法鉴定，显色反应包括盐酸-镁试验、碱液试验和荧光试验；纸层析反应条件为：取待测液10μL点在滤纸上，用正丁醇∶冰乙酸∶水体积比＝4∶1∶5为展开剂，上行展开5h，取出晾干，喷1％氯化铝乙醇溶液，吹干后紫外灯下观察，结果表明得到棕黄色粉末为黄酮类物质；
(5)小花棘豆黄酮含量的测定：采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色方法操作，在500nm或者274nm波长处测定吸光度，结果表明小花棘豆样品中黄酮含量为16.54mg/kg。
本发明所述的小花棘豆黄酮在制备保肝和抗氧化药物及保健食品中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明建立了小花棘豆黄酮保肝和抗氧化作用的新用途，为进一步开发小花棘豆资源提供了新的思路。
(2)本发明中的制备工艺简单，成本较低。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
小花棘豆提取试验：
为了综合考察小花棘豆黄酮提取的影响因素，利用正交法“均衡分散”的特点，选取超声时间、甲醇浓度、物料比作为考察因素，并结合多次提取的经验每因素又选取3个水平安排试验，以黄酮的得率为衡量提取效率的客观指标，优选最佳提取工艺。
表1正交试验设计
表2小花棘豆黄酮提取试验结果
由正交试验结果与方差分析可以看出，各影响因素中，甲醇浓度的影响最显著，超声时间次之，料液比影响最小。根据最大的K值选出各因素中的最佳水平为：甲醇浓度100％，超声时间90min，料液比1∶15。
一种小花棘豆黄酮的制备方法，包括以下步骤：精密称取粉碎好的小花棘豆草粉100.00g5份，按照最佳提取工艺提取，步骤(3)的方法分离小花棘豆黄酮，分别得到棕黄色粉末1.775mg、1.832mg、1.830mg、1.745mg、1.733mg；按照步骤(5)方法检测，发现黄酮含量分别为16.33mg/kg、16.67mg/kg、16.84mg/kg、16.40mg/kg、16.46mg/kg，平均含量为16.54mg/kg，变异系数为1.27％，样品纯度范围91％～95％。结果表明：该制备方法具有较好的精密性，提取得到的小花棘豆黄酮纯度较高。
小花棘豆黄酮的抗脂质过氧化作用：
以BHT、维生素C和维生素E为阳性对照，以空白油脂为阴性对照，测定小花棘豆黄酮的抗脂质过氧化作用。氧化稳定性测试仪参数设置为：气体流量15L/h，温度120℃，诱导时间采用活性氧法确定。在反应体系中最终V(油脂)∶V(抗氧化剂)＝3∶2。采用AI值表示抗氧化能力的大小，AI值越大说明样品抗氧化能力越好。
结果表明：小花棘豆黄酮对菜籽油的抗氧化性作用强于微生物E和BHT，对棉籽油和葵花籽油的抗氧化性作用均强于所有阳性对照；对菜籽油、棉籽油和葵花籽油等植物油均有较好的抗脂质过氧化作用。
小花棘豆黄酮的体外抗氧化作用：
(1)DPPH自由基清除率：小花棘豆黄酮对DPPH有较好的清除效果，其IC50值(DPPH自由基由起始浓度减少至50％时样品的添加量)为16.54mg/L，远低于维生素C的28.80mg/L，维生素E的35.68mg/L，BHT的40.25mg/L；
(2)超氧阴离子自由基清除率：用邻苯三酚自氧化法测定小花棘豆黄酮及对照品的超氧阴离子自由基清除率，小花棘豆黄酮在较低质量浓度时(10mg/L～30mg/L)清除超氧阴离子自由基的效果好于维生素C和维生素E，质量浓度较高时(30mg/L～50mg/L)清除率低于维生素C，但高于维生素E；
(3)羟基自由基清除率：以55％乙醇(V/V)为空白对照，维生素C和维生素E为阳性对照测定羟基自由基清除率，结果表明小花棘豆黄酮质量浓度与羟基自由基清除率呈量效的正相关关系，而且清除效果好于维生素C和维生素E。
小花棘豆黄酮保肝作用：
选取6～8周龄昆明种小白鼠为试验动物，将其随机分为正常对照组、CCl4对照组、试验I组、试验II组、试验III组、阴性对照组和阳性对照组。试验I、II、III组分别按10、20、30mg/(kg·d)的剂量灌服小花棘豆黄酮，阴性对照组灌服1g/L的维生素E，阳性对照组灌服1g/L的维生素C，每天1次，每次0.2mL，连续14d。末次灌服1h后，除正常对照组外，其他试验组均灌胃0.1％CCl4，禁食16h后解剖小鼠，取血液和肝脏测定SOD、GSH-Px和MDA含量。
结果表明，小花棘豆黄酮可抑制CCl4导致的SOD、GSH-Px活性降低，30mg/(kg·d)剂量的小花棘豆黄酮还可提高小鼠体内抗氧化作用能力；并且小花棘豆黄酮可显著降低小鼠血清和肝脏中的MDA含量，而且效果优于维生素C和维生素E。
表3小花棘豆黄酮对小鼠血清指标的影响
注：同列数据大写字母不同表示差异极显著(P＜0.01)，小写字母不同表示差异显著(P＜0.05)。下同。
表4小花棘豆黄酮对小鼠肝脏指标的影响
小花棘豆黄酮的安全饲喂试验：
选用48只6～8周龄，体重为(20±2)g的小鼠，随机分为4组，每组12只，雌雄各半。对照组饲喂全价饲料，试验I、II、III组在全价饲料中分别添加小花棘豆黄酮10、30、50mg/kg的日粮，试验期为30d。结果表明，小鼠采食小花棘豆黄酮后未见异常临床症状，小鼠血液学指标、血清生化指标和脏器系数均在正常范围内。说明小鼠日粮中添加小花棘豆黄酮未发现亚慢性毒性，可以被安全利用。
表5小花棘豆黄酮对小鼠体质量的影响(X±S，g)
表6小花棘豆黄酮对小鼠采食量的影响(X±S，g)
表7小鼠血清生化指标测定结果(X±S)
表8小鼠血液学指标测定结果(X±S)
表9小花棘豆黄酮对小鼠脏器系数的影响(X±S)
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
Claims (2)
1.一种小花棘豆黄酮的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)小花棘豆粉碎：取小花棘豆地上部分，阴干、粉碎、过20目筛后备用；
(2)超声波协助法提取小花棘豆总提取物：称取小花棘豆样品，按照物料比1∶10～1∶20g/mL的比例加入体积分数60％～100％的甲醇超声波提取45～90min，超声波功率800W，温度45℃，提取完成后过滤，滤液采用旋转蒸发仪浓缩，恒温干燥箱干燥，即得到小花棘豆总提取物；
(3)小花棘豆黄酮的分离：将小花棘豆总提取物用水充分溶解；向层析柱中加入1/3体积的去离子水，然后将D-101型大孔吸附树脂用去离子水转移至层析柱中，加入70％的乙醇溶液，体积为树脂体积的2倍，流速为1倍树脂体积/min，然后用去离子水洗至无醇味后进行小花棘豆总提取物水溶液的梯度洗脱，用10％～100％的乙醇洗脱，收集50％～85％的乙醇洗脱液，经旋转蒸发仪浓缩，冷冻干燥仪干燥，得到棕黄色粉末；
(4)小花棘豆黄酮的定性检测：通过显色反应和纸层析法鉴定，显色反应包括盐酸-镁试验、碱液试验和荧光试验；纸层析反应条件为：取待测液10μL点在滤纸上，用正丁醇∶冰乙酸∶水体积比＝4∶1∶5为展开剂，上行展开5h，取出晾干，喷1％氯化铝乙醇溶液，吹干后紫外灯下观察，结果表明得到棕黄色粉末为黄酮类物质；
(5)小花棘豆黄酮含量的测定：采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色方法操作，在500nm或者274nm波长处测定吸光度，结果表明小花棘豆样品中黄酮含量为16.54mg/kg。
2.权利要求1所述的小花棘豆黄酮在制备保肝和抗氧化药物及保健食品中的应用。
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