CN104068211A - 小花棘豆黄酮的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种小花棘豆黄酮的制备方法及应用，包括以下步骤：(1)超临界CO2提取小花棘豆黄酮；(2)小花棘豆黄酮制备绵羊饲料添加剂。本发明具有制有机溶剂消耗少，生产工艺稳定，污染少，所得产品提取率和纯度均较高的特点，提取得到的小花棘豆黄酮可用于增强绵羊免疫、抗氧化功能。
Description
技术领域
本发明属于畜牧养殖技术领域，涉及一种小花棘豆黄酮的制备方法及应用。
背景技术
目前，食品的安全问题已经成为人们高度关注的焦点。其中抗生素的长期滥用所带来的药物残留、耐药性及耐药性的垂直和横向传播问题也引起了人们的普遍关注。有鉴于此，饲料安全问题越来越受到人们的重视，世界卫生组织(WHO)已经正式提出抗生素不可用于除人类以外的领域，欧美发达国家在饲料中禁用或限用抗生素，毫无疑问，饲用抗生素被取缔的趋势不可逆转。其替代物的选择已成为动物营养学的研究热点。部分营养活性物质如生物碱、多酚、皂甙、多糖和黄酮等已应用于饲料生产。其中黄酮类化合物是自然界分布广泛的一类次生代谢产物，是药用植物中主要的活性成分之一，在畜牧业生产中的研究应用发现，该化合物能提高饲料转化率，促进动物生长；提高畜禽机体免疫力，具有抗菌消炎、提高抗氧化应激能力和保健等作用。
小花棘豆(Oxytropis glabra DC)是豆科(Leguminosae)棘豆属(Oxytropis)植物，在新疆分布广泛。据蒙药典记载，小花棘豆具有麻醉、镇静和止痛等作用。黄酮类化合物是小花棘豆的有效成分之一，具有抗菌、抗炎、抗突变、降压、清热解毒、镇静、利尿等作用，在抗氧化及抑制脂肪酶等方面有显著效果。可作为营养活性物质直接参与激发机体抗氧化和免疫反应，也可参与机体营养代谢活动，促进营养物质合成。饲料中添加小花棘豆黄酮可能会起到维持机体正常抗氧化能力的作用，对维持动物机体的正常生理功能，提高生产性能具有重要意义。到目前为止，并未有小花棘豆黄酮应用于动物饲料的专利申请。
发明内容
本发明的目的在于克服上述技术存在的缺陷，提供一种小花棘豆黄酮的制备方法及应用，是一种动物饲料添加剂，其含有的小花棘豆黄酮具有提高动物免疫和抗氧化功能的作用。
其具体技术方案为：
小花棘豆黄酮的制备方法，包括以下步骤：
(1)小花棘豆黄酮的分离：取小花棘豆地上部分，阴干、粉碎、过20目筛后备用。采用超临界CO2提取法，称取适量小花棘豆粉末和2倍质量的硅藻土，装柱，两端用适量的脱 脂棉以防止柱子堵塞，扭紧提取池，以防止气体泄露，将提取池放于加热恒温箱中接通整个提取管道，保证整个提取系统不存在漏气。设定温度、压力、夹带剂流速、CO2流速等参数，参数稳定后进行提取。提取液经旋转蒸发仪浓缩，冷冻干燥仪干燥，得到棕黄色粉末。
(2)超临界CO2提取法的优化：设置提取温度范围为30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃和65℃；提取压力范围为10MPa、15MPa、20MPa、25MPa和30MPa；设置提取时间范围为0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h、3.0h、3.5h、4.0h、4.5h和5.0h；设置夹带剂浓度为10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％和100％；设置夹带剂流速为0.1mL/min、0.2mL/min、0.3mL/min、0.4mL/min和0.5mL/min；设置CO2流速为0.5mL/min、1.0mL/min、1.5mL/min、2.0mL/min和2.5mL/min。根据Central Composite中心组合试验设计原理，整个试验过程以小花棘豆黄酮提取率为响应值，得到最佳提取工艺为：提取温度45℃，提取压力20MPa，提取时间2.0h，夹带剂为乙醇，夹带剂浓度80％，夹带剂流速0.4mL/min，CO2流速1.5mL/min。
(3)小花棘豆黄酮含量的测定：采用HPLC法。色谱柱为C18(2.1*150mm，1.8μm)，流动相为乙腈和水，柱温30℃，流速1.0mL/min，检测波长为360nm，检测标准品槲皮素，进样量1μL。采用梯度洗脱：0min，乙腈∶水＝10％∶90％；1min，乙腈∶水＝10％∶90％；3min，乙腈∶水＝20％∶80％；6min，乙腈∶水＝45％∶55％；8min，乙腈∶水＝75％∶25％。结果表明小花棘豆黄酮提取率为18.84mg/g。
小花棘豆黄酮在制备绵羊饲料添加剂中的应用：将小花棘豆黄酮按照10-50mg/kg的比例添加入绵羊饲料中。除此以外，动物饲料中还可以含有或不含有其它来源植物的化学化合物。将小花棘豆黄酮添加入绵羊饲料是通过制备活性成分预混物来实现。这种预混物含有1-10％小花棘豆黄酮和90％-89％的吸附载体。然后，将预混物与维生素、酶、矿物质、蛋白组分、糖类组分、脂肪组分等混合，制备成含有0.5-5％小花棘豆黄酮的饲料添加剂。之后将该饲料添加剂按1-5％添加到饲料中。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明所述方法有机溶剂消耗少，生产工艺稳定，污染少，所得产品提取率和纯度均较高，可适用于实验室和工业化制备。本发明建立了小花棘豆黄酮应用于绵羊饲料的新用途，为进一步开发小花棘豆资源提供了新的思路。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明
小花棘豆黄酮提取试验：
为了综合考察小花棘豆黄酮提取的影响因素，根据Central Composite中心组合试验设计原理，选取提取温度、提取压力、提取时间、夹带剂浓度、夹带剂流速和CO2流速作为考察因素，并结合多次提取的经验每因素各选取几个水平安排试验，小花棘豆黄酮提取率为响应值，优选最佳提取工艺。
表1超临界CO2提取小花棘豆黄酮试验
根据正交试验中结果最大的K值选出各因素中的最佳水平为：提取温度45℃，提取压力20MPa，提取时间2.0h，夹带剂为乙醇，夹带剂浓度80％，夹带剂流速0.4mL/min，CO2流速1.5mL/min。。
精密称取粉碎好的小花棘豆草粉10.00g5份，按照最佳提取工艺提取，步分别得到小花棘豆黄酮188.53mg、189.02mg、188.63mg、188.85mg、188.99mg，平均提取率为18.88 mg/g，变异系数为0.28％。结果表明：该制备方法具有较好的精密性。
小花棘豆黄酮饲喂试验：
选用相同饲喂条件下的6月龄羔羊20只，分为4个试验组，对照组饲喂普通日粮，三个试验组分别添加0.1％、0.3％和0.5％的小花棘豆黄酮，自由饮水，饲喂45d。试验日粮配方见表2。
表2日粮配方(以风干样为基础)
试验羊生产指标、免疫指标及抗氧化指标的测定：
相对于对照组，添加小花棘豆黄酮提高了试验羊的平均采食量和日增重，并提高了试验羊机体免疫功能和抗氧化功能从而提高了机体的健康程度，有益于绵羊养殖。
表3添加小花棘豆黄酮对绵羊采食量和日增重的影响
表4添加小花棘豆黄酮对绵羊免疫指标的影响
表5添加小花棘豆黄酮对绵羊抗氧化指标的影响
小花棘豆饲喂绵羊的安全性试验：
45d饲喂试验结束后，通过测定对照羊和试验羊血清生化指标、血常规指标和瘤胃微生物及原虫数量，发现小花棘豆黄酮的添加量不超过0.5％时，对试验绵羊无不良影响。
表6绵羊血清生化指标测定结果
表7绵羊血常规指标测定结果
表8绵羊瘤胃微生物及原虫数量测定结果
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
Claims (3)
1.小花棘豆黄酮的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)小花棘豆黄酮的分离：取小花棘豆地上部分，阴干、粉碎、过20目筛后备用；采用超临界CO2提取法，称取适量小花棘豆粉末和2倍质量的硅藻土，装柱，两端用适量的脱脂棉以防止柱子堵塞，扭紧提取池，以防止气体泄露，将提取池放于加热恒温箱中接通整个提取管道，保证整个提取系统不存在漏气；设定温度、压力、夹带剂流速、CO2流速的参数，参数稳定后进行提取；提取液经旋转蒸发仪浓缩，冷冻干燥仪干燥，得到棕黄色粉末；
(2)超临界CO2提取法的优化：设置提取温度范围为30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃和65℃；提取压力范围为10MPa、15MPa、20MPa、25MPa和30MPa；设置提取时间范围为0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h、3.0h、3.5h、4.0h、4.5h和5.0h；设置夹带剂浓度为10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％和100％；设置夹带剂流速为0.1mL/min、0.2mL/min、0.3mL/min、0.4mL/min和0.5mL/min；设置CO2流速为0.5mL/min、1.0mL/min、1.5mL/min、2.0mL/min和2.5mL/min；根据Central Composite中心组合试验设计原理，整个试验过程以小花棘豆黄酮提取率为响应值，得到最佳提取工艺为：提取温度45℃，提取压力20MPa，提取时间2.0h，夹带剂为乙醇，夹带剂浓度80％，夹带剂流速0.4mL/min，CO2流速1.5mL/min；
(3)小花棘豆黄酮含量的测定：采用HPLC法；色谱柱为C18、2.1*150mm，1.8μm，流动相为乙腈和水，柱温30℃，流速1.0mL/min，检测波长为360nn，检测标准品槲皮素，进样量1μL；采用梯度洗脱：0min，乙腈∶水＝10％∶90％；1min，乙腈∶水＝10％∶90％；3min，乙腈∶水＝20％∶80％；6min，乙腈∶水＝45％∶55％；8min，乙腈∶水＝75％∶25％；结果表明小花棘豆黄酮提取率为18.84mg/g。
2.一种权利要求1所述小花棘豆黄酮在制备绵羊饲料添加剂中的应用。
3.根据权利要求2所述小花棘豆黄酮在制备绵羊饲料添加剂中的应用，其特征在于，将小花棘豆黄酮按照10-50mg/kg的比例添加入绵羊饲料中；将小花棘豆黄酮添加入绵羊饲料是通过制备活性成分预混物来实现；这种预混物含有1-10％小花棘豆黄酮和90％-89％的吸附载体；然后，将预混物与维生素、酶、矿物质、蛋白组分、糖类组分、脂肪组分混合，制备成含有0.5-5％小花棘豆黄酮的饲料添加剂；之后将该饲料添加剂按1-5％添加到饲料中。
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