CN109725080A

CN109725080A - 大麻二酚、大麻二酚酸、四氢大麻酚中一种或几种物质的定性定量检测方法

Info

Publication number: CN109725080A
Application number: CN201910001235.5A
Authority: CN
Inventors: 赵立宁; 严江涛; 常丽; 张江江; 李德芳; 刘亮亮
Original assignee: Institute of Bast Fiber Crops of CAAS
Current assignee: Jiangsu Fangsheng Pharmaceutical Co ltd; Institute of Bast Fiber Crops of CAAS
Priority date: 2019-01-02
Filing date: 2019-01-02
Publication date: 2019-05-07

Abstract

本发明涉及检测技术领域，特别涉及大麻二酚、大麻二酚酸、四氢大麻酚中一种或几种物质的定性定量检测方法。该检测方法包括如下步骤：将粉碎后的大麻花叶采用甲醇进行超声提取，得到供试液；将供试液采用高效液相色谱进行分离、检测，高效液相色谱的流动相为乙酸水溶液和乙腈的混合物，等度洗脱；采用外标法检测得到大麻二酚、大麻二酚酸、四氢大麻酚中一种或几种物质的含量。本发明选择特定波长和流动相，峰型好且灵敏度高，便于研究，使得大麻二酚、大麻二酚酸和四氢大麻酚的定性定量可以在同一样品处理下得到快速准确的检测。

Description

大麻二酚、大麻二酚酸、四氢大麻酚中一种或几种物质的定性定量检测方法

技术领域

本发明涉及检测技术领域，特别涉及大麻二酚、大麻二酚酸、四氢大麻酚中一种或几种物质的定性定量检测方法。

背景技术

大麻(学名：Cannabis sativa L.)是桑科大麻属植物，一年生直立草本。大麻原分布于印度、不丹和中亚细亚，现各国均有野生或栽培。果实中医称“火麻仁”或“大麻仁”入药，性平，味甘，功能：润肠，主治大便燥结。花称“麻勃”，主治恶风，经闭，健忘。果壳和苞片称“麻蕡”，有毒，治劳伤，破积、散脓，多服令人发狂；叶含麻醉性树脂可以配制麻醉剂。

大麻中主要化学物质为大麻素，大麻素主要成分为大麻二酚酸、大麻二酚(caimabidiol，CBD)、四氢大麻酚(tetrahydrocannabinol，THC)以及大麻酚，在植物体内主要以大麻二酚酸的形式存在。据文献报道，大麻二酚是大麻中目前应用前景最广泛的大麻提取物，是一种淡黄色树脂或者结晶，在医学上对癫痫、癌症，多发性硬化症、等多种疾病有明显的治愈效果。四氢大麻酚在吸食或口服后有精神和生理的活性作用。人类吸食大麻的历史长达千余年，20世纪在毒品和宗教方面的使用有增加倾向。由于大麻中含有四氢大麻酚，曾一度受到世界范围内的严格管制。因此对大麻二酚酸、大麻二酚、四氢大麻酚此三种物质的检测有助于开发评估对大麻的基础性研究。

由于大麻二酚酸与大麻二酚存在转化关系，现有的检测条件无法对大麻二酚酸和大麻二酚的信号峰实现完全分离且不重叠，无法实时检测其具体含量。采用高效液相色谱对上述三种物质进行检测时存在许多问题，例如检测波长的选择，流动相的比例、溶剂的选择都对其出峰时间和峰型产生重大影响，从而影响定量测定。目前还未见同时对大麻中大麻二酚酸、大麻二酚、四氢大麻酚三种物质的分离方法。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了大麻二酚、大麻二酚酸、四氢大麻酚中一种或几种物质的定性定量检测方法。该检测方法可使大麻二酚、大麻二酚酸和四氢大麻酚的定性定量可以在同一样品处理下得到快速准确的检测。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了大麻二酚、大麻二酚酸、四氢大麻酚中一种或几种物质的定性定量检测方法，包括如下步骤：

将粉碎后的大麻花叶采用甲醇进行超声提取，得到供试液；

将供试液采用高效液相色谱进行分离、检测，高效液相色谱的流动相为乙酸水溶液和乙腈的混合物，等度洗脱；

采用外标法检测得到大麻二酚、大麻二酚酸、四氢大麻酚中一种或几种物质的含量。

作为优选，所述甲醇为分析纯甲醇。

作为优选，以g/mL计，大麻花叶与甲醇的比例为1：(15～25)。

优选地，以g/mL计，大麻花叶与甲醇的比例为1：20。

作为优选，超声提取的温度为15～30℃，超声提取的功率为90～110W，频率为70～90kHz，超声提取的时间为8～12min。

优选地，超声提取的温度为常温，超声提取的功率为100W，频率为80kHz，超声提取的时间为10min。

作为优选，超声提取与得到供试液之间还包括静置、离心、取上清液的步骤。

作为优选，静置的时间为50～100min。

优选地，静置的时间为60min。

作为优选，离心的转速为3000～5000r/min，离心的时间为4～6min。

优选地，离心的转速为4000r/min，离心的时间为5min。

作为优选，乙酸水溶液的体积百分含量为0.05％～0.15％。

优选地，乙酸水溶液的体积百分含量为0.1％。

作为优选，乙酸水溶液与乙腈的体积比为(20～30)：(70～80)。

优选地，乙酸水溶液与乙腈的体积比为25：75。

作为优选，高效液相色谱的进样量为8～12μL。

优选地，高效液相色谱的进样量为10μL。

作为优选，高效液相色谱的流速为0.7～0.9mL/min。

优选地，高效液相色谱的流速为0.8mL/min。

作为优选，高效液相色谱的柱温为24～26℃。

优选地，高效液相色谱的柱温为25℃。

作为优选，高效液相色谱的检测波长为210～230nm。

优选地，高效液相色谱的检测波长为220nm。

本发明提供了大麻二酚、大麻二酚酸、四氢大麻酚中一种或几种物质的定性定量检测方法。该检测方法包括如下步骤：将粉碎后的大麻花叶采用甲醇进行超声提取，得到供试液；将供试液采用高效液相色谱进行分离、检测，高效液相色谱的流动相为乙酸水溶液和乙腈的混合物，等度洗脱；采用外标法检测得到大麻二酚、大麻二酚酸、四氢大麻酚中一种或几种物质的含量。本发明具有的技术效果为：

1、本发明选择波长220nm、流动相为0.1％乙酸作水相，乙腈为有机相，在流动相比例为25:75时峰型好且灵敏度高，便于研究，使得大麻二酚、大麻二酚酸和四氢大麻酚的定性定量可以在同一样品处理下得到快速准确的检测。

2、提取溶剂的选择中，一般溶剂四氢大麻酚的峰值或检测不到或被其他相似峰重叠，影响大麻产品的安全性评估。相比较乙醇、正己烷等有机溶剂，本研究在使用甲醇作溶剂在特定波长条件下，各物质的波峰之间不重叠，相对比其他有机试剂甲醇提取效率显著提高。同时因为大麻中存在精神活性成分四氢大麻酚，在使用甲醇作溶剂四氢大麻酚的峰不被覆盖，从而方便评估大麻产品安全性，并且各物质信号峰直接不重叠。

3、大麻二酚酸与大麻二酚存在转化关系，采用其它试剂(无水乙醇、正己烷和乙酸乙酯按不同体积比)作为溶剂去提取，结果发现甲醇作为溶剂时，能够实现大麻二酚酸与大麻二酚的实时定量转化，并且波峰不重叠。

4、相对于传统蒸馏萃取，本研究采用外标法对大麻二酚、大麻二酚酸和四氢大麻酚的定性和定量时间显著较少，且准确率高。

附图说明

图1示大麻二酚(CBD)标准曲线；

图2示CBD标准曲线色谱图；

图3示四氢大麻酚(THC)标准曲线；

图4示THC标准曲线色谱图；

图5示大麻二酚酸标准曲线；

图6示大麻二酚酸标准曲线色谱图；

图7示实施例1中大麻二酚酸、大麻二酚和四氢大麻酚的色谱图；

图8示对比例1中大麻二酚酸、大麻二酚和四氢大麻酚的色谱图；

图9示对比例2中大麻二酚酸、大麻二酚和四氢大麻酚的色谱图；

图10示对比例3中大麻二酚酸、大麻二酚和四氢大麻酚的色谱图。

具体实施方式

本发明公开了大麻二酚、大麻二酚酸、四氢大麻酚中一种或几种物质的定性定量检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的大麻二酚、大麻二酚酸、四氢大麻酚中一种或几种物质的定性定量检测方法中所用试剂或仪器均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

1、取经粉碎后的大麻花叶0.2g，用料液比为1:20的甲醇4mL，采用常温超声提取，提取时间为10分钟，静置一个小时。

2、用离心机转速为4000r/min离心5分钟，取上清液转移至5mL容量瓶中进行定容。

3、使用2mL注射器装样过0.45μm有机滤膜注射至液相进样瓶。

4、高效液相设置条件为进样量10μL。色谱柱为Waters Xbridge,250mm×4.6mmi.d.,5μm。流动相为0.1％的乙酸和乙腈(25:75)、流速为0.8mL/min、柱温25℃、波长为220nm。

5、标准曲线的绘制。

配制浓度为1mg/mL的大麻二酚酸甲醇溶液，移液枪分别量取50μL、100μL、200μL、300μL、400μL加入到容量为5mL的棕色容量瓶中，-10℃下保存定容至刻度待用；配制浓度为1mg/mL的大麻二酚甲醇溶液，移液枪分别量取50μL、100μL、200μL、300μL、400μL加入到容量为5mL的棕色容量瓶中，-10℃下保存定容至刻度待用；配制浓度为1mg/mL的四氢大麻酚甲醇溶液，移液枪分别量取50μL、100μL、150μL、200μL、250μL加入到容量为5mL的棕色容量瓶中，-10℃下保存定容至刻度待用。在如上的液相色谱条件下，以各物质浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，R²可达到0.99以上。

6、大麻二酚酸、大麻二酚和四氢大麻酚分别会在保留时间为9.20、10.80、21.40出峰表示有该物质，最后可通过积分得出峰面积带入相应物质的标准曲线即可定量。

7、试验结果如下：

大麻二酚(CBD)标准曲线结果见表1、图1。CBD标准曲线色谱图见图2。

四氢大麻酚(THC)标准曲线结果见表2、图3。THC标准曲线色谱图见图4。

大麻二酚酸标准曲线结果见表3、图5。大麻二酚酸标准曲线色谱图见图6。

表1 CBD标准曲线

浓度(μg/mL)	10	20	40	60	80	100
							峰面积(s)	411.8	897.1	1811.9	2270.3	3589.4	4150.5

表2 THC标准曲线

浓度(μg/mL)	10	20	30	40	50
						峰面积(s)	481.9	1013.2	1508.1	1955.9	2306.6

表3大麻二酚酸标准曲线

浓度(μg/mL)	10	20	40	60	80	100
							峰面积(s)	485.6	967.2	1965.6	3024.3	4079.3	5138.5

大麻二酚酸、大麻二酚和四氢大麻酚的色谱图见图7。大麻二酚酸、大麻二酚和四氢大麻酚分别会在保留时间为9.20、10.80、21.40出峰，其中，第三种成的色谱图在保留时间为21分钟处，含量降低故峰不高。

由图7可知，本发明提取方法及高效液相色谱条件可实现大麻二酚酸、大麻二酚和四氢大麻酚的分离与定量。

对比例1

将实施例1步骤1中所用提取溶剂甲醇改为乙醇，其它条件同实施例1。其高效液相色谱图见图8。

由图8可见，采用乙醇作为提取溶剂，波峰会产生部分重叠。

对比例2

将实施例1步骤1中所用提取溶剂甲醇改为正己烷与乙酸乙酯混合液(V：V＝9:1)，其它条件同实施例1。其高效液相色谱图见图9。

由图9可见，采用正己烷与乙酸乙酯混合液作为提取溶剂，波峰会产生部分重叠且四氢大麻酚峰(保留时间为21.40处)消失。

对比例3

将实施例1步骤4中所用色谱条件改为流动相为0.1％的乙酸和乙腈(15:85)、流速为1.0mL/min、柱温25℃、波长为220nm，其它条件同实施例1。其高效液相色谱图见图10。

由图10可见，采用该色谱条件进行分离，波峰会产生部分重叠。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.大麻二酚、大麻二酚酸、四氢大麻酚中一种或几种物质的定性定量检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

将粉碎后的大麻花叶采用甲醇进行超声提取，得到供试液；

将供试液采用高效液相色谱进行分离、检测，所述高效液相色谱的流动相为乙酸水溶液和乙腈的混合物，等度洗脱；

2.根据权利要求1所述的定性定量检测方法，其特征在于，所述甲醇为分析纯甲醇；以g/mL计，所述大麻花叶与所述甲醇的比例为1：(15～25)。

3.根据权利要求1所述的定性定量检测方法，其特征在于，所述超声提取的温度为15～30℃，所述超声提取的功率为90～110W，频率为70～90kHz，所述超声提取的时间为8～12min。

4.根据权利要求1所述的定性定量检测方法，其特征在于，所述超声提取与得到供试液之间还包括静置、离心、取上清液的步骤。

5.根据权利要求4所述的定性定量检测方法，其特征在于，所述静置的时间为50～100min；所述离心的转速为3000～5000r/min，离心的时间为4～6min。

6.根据权利要求1所述的定性定量检测方法，其特征在于，所述乙酸水溶液的体积百分含量为0.05％～0.15％，所述乙酸水溶液与所述乙腈的体积比为(20～30)：(70～80)。

7.根据权利要求1所述的定性定量检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱的进样量为8～12μL。

8.根据权利要求1所述的定性定量检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱的流速为0.7～0.9mL/min。

9.根据权利要求1所述的定性定量检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱的柱温为24～26℃。

10.根据权利要求1所述的定性定量检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱的检测波长为210～230nm。