CN111747914A - 一种银杏根皮中分离得到的化合物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种银杏根皮中分离得到的化合物“银杏根皮酸”，即1,8‑二羟基‑二苯并呋喃‑2,6‑二羧酸，其分子式为C₁₄H₈O₇，还公开了该化合物提取分离方法及其在银杏叶提取物中鉴定银杏根皮提取物的应用。

Description

一种银杏根皮中分离得到的化合物及其用途

技术领域

本发明涉及生物技术及医药技术领域，具体涉及银杏根皮中得到的一个新化合物以及用途。

背景技术

银杏叶提取物(Ginkgo biloba extract，GBE)源于银杏科植物银杏的干燥叶，广泛用于心脑血管疾病的治疗，是全球植物药制剂的重要品种之一。其主要活性化学成分为黄酮类及银杏萜内酯，其中黄酮类成分主要包括槲皮素、山奈素、异鼠李素的苷类化合物等，具有保护毛细血管通透性、扩张冠状动脉、恢复动脉血管循环、缓解心平滑肌痉挛等功效；银杏萜内酯主要包括银杏内酯A(GA)、银杏内酯B(GB)、银杏内酯C(GC)、银杏内酯J(GJ)和白果内酯(BB)等，具有抑制血小板聚集、抑制血栓形成等作用，为强血小板活化因子拮抗剂。

国内外GBE质量标准中明确规定了银杏总黄酮醇苷与银杏萜内酯含量。2015版《中国药典》(ChP2015)规定了银杏总黄酮醇苷测定采用以槲皮素为参比对照的“一测多评”法，银杏总黄酮醇苷(以槲皮素、山奈素和异鼠李素之和计)含量≥24％；银杏萜内酯(以GA+GB+GC+BB之和计)含量≥6.0％。《美国药典(USP36)》与《欧洲药典(EP8.0)》规定了银杏总黄酮醇苷(以槲皮素、山奈素和异鼠李素之和计)含量在22.0％～27.0％范围内，但萜内酯含量有所区别。其中USP36规定萜内酯中BB含量在2.6％～5.8％，GA+GB+GC含量在2.8％～6.2％，BB+GJ+GA+GB含量在5.4％～12.0％；EP8.0规定萜内酯中BB含量在2.6％～3.2％范围内，GA+GB+GC含量在2.8％～3.4％范围内。在检测方法方面，高效液相法(HPLC)由于其操作简单、灵敏度高、准确度高等特点成为国内外使用广泛的检测方法，也是ChP2015、USP36与EP8.0中规定的检测GBE中总黄酮醇苷和银杏萜内酯的方法。由于总黄酮醇苷与银杏萜内酯的结构不同，检测条件各不相同。总黄酮醇苷方面，ChP2015、USP36与EP8.0中均以甲醇-磷酸溶液为流动相，采用不同的紫外(UV)波长达到检测的目的；银杏萜内酯方面，ChP2015以正丙醇-四氢呋喃-水(1：15：84)为流动相，蒸发光散射检测器检测；USP36以甲醇-水为流动相，蒸发光散射检测器检测；EP8.0以甲醇-四氢呋喃-水(20：10：75)为流动相，示差折光检测器检测。各国GBE中银杏黄酮类化合物与银杏萜内酯的含量指标与检测有所区别。

银杏萜内酯是银杏叶、银杏果与银杏根皮中特有的活性化合物。有报道指出，银杏根皮中萜内酯含量比银杏叶要高出一倍左右，尤以银杏内酯C含量最高，银杏根皮由此成为银杏萜内酯的重要来源之一。银杏根皮虽富含银杏萜内酯，但不含黄酮类物质，成分单一。此外，银杏根皮提取物未经过系统的药理药效实验和临床验证，其心血管疾病的治疗功效不明，无法作为GBE的药用原料。因此，银杏根皮作为银杏种植的附属产品，其多被当作废料处理。近年来，已经开始出现以价格低廉的银杏根皮为原料，提取银杏萜内酯添加到GBE中以满足GBE中关于银杏萜内酯含量指标要求的情况，存在严重的质量及临床安全隐患。故认为有必要建立一个能够区别银杏萜内酯来源的检测方法，以保证GBE的质量和临床疗效、安全性。

当前GBE成分鉴别研究主要集中在银杏总黄酮方面。如ChP2015已将槐角苷检测用于GBE中槐角的鉴定。《Identification of Ginkgo biloba supplements adulterationusing high performance thin layer chromatography and ultra high performanceliquid chromatography-diode array detector-quadrupole time of flight-massspectrometry(使用高效薄层色谱和超高效液相色谱-二极管阵列检测器-四极杆飞行时间质谱鉴定银杏叶补充剂)》通过超高效液相色谱-二极管阵列检测器-四极杆飞行时间质谱法鉴定出染料木素，因其不曾在银杏叶中检测出而作为特有成分指标物，最终通过山奈酚-3-O-槐糖苷、sophorabioside等其他成分辅助检测，确定该GBE中含有日本槐树。我公司在国家药典基础上采用HPLC-UV建立了“一测多评”的检测方法并发表了《银杏叶提取物HPLC指纹图谱研究及共有峰LC-MS鉴定》一文，用于GBE企业内控标准的提升。该方法通过标定20个共有峰的银杏提取物HPLC指纹图谱，对GBE中黄酮类化合物进行系统的分析，对GBE黄酮类物质成分判别具有指导意义。截止目前，GBE中银杏萜内酯的来源鉴别研究未见国内外报道，其难点在于找到区别于GBE的指标成分。此外，当前的GBE鉴定还存在检测时间长，成分来源判断困难等问题。

银杏根皮作为银杏萜内酯的重要原料之一，通过找到一种银杏根皮中普遍稳定存在而银杏叶中不存在的标志性化合物作为“特征成分”，建立一种能快速准确鉴定GBE中银杏根皮“特征成分”的检测方法，促进GBE质量标准提升，保证GBE临床安全有效。

发明内容

本发明的目的是提供一种从银杏根皮中分离得到的化合物，其化学名为1,8-二羟基-二苯并呋喃-2,6-二羧酸(1,8-dihydroxydibenzofuran-2,6-dicarboxylic acid)，分子式为C₁₄H₈O₇，分子量为288.21。该化合物未见国内外报道，是发明人首次从银杏根皮中分离纯化得到，命名为银杏根皮酸。该化合物具有如下特征：

(1)化学结构式为：

(2)溶解度：易溶于甲醇，乙醇，溶于1％氢氧化钠溶液。

(3)质谱数据：EI-MS m/z＝287，243，215，187，159。

(4)氢谱核磁共振数据：¹HNMR(400MHz，MeOD-d4)δ：7.16(d，J＝8.5Hz，1H)，7.56(d，J＝2.0Hz，1H)，7.77(d，J＝8.5Hz，1H)，9.30(d，J＝2.0Hz，1H)，10.27(s，1H)，11.36(s，1H)，12.76(s，2H)。

(5)碳谱核磁共振数据：¹³CNMR(100MHz，MeOD-d4)δ：126.3，116.5，145.2，120.9，119.3，142.5，152.1，113.0，123.0，116.5，143.3，121.3，167.5，160.4。

本发明还提供上述化合物银杏根皮酸的制备方法，其过程包括如下步骤：

1)银杏根皮干燥破碎，得到银杏根皮粗粉；

2)银杏根皮粗粉在用乙醇提取、浓缩后，用碱溶液处理、过滤，再用酸溶液调节pH，得到银杏根皮粗提物溶液；

3)银杏根皮粗提物溶液上于大孔树脂柱，用纯化水洗脱并将洗脱液回收浓缩，得到层析浓缩液；

4)在层析浓缩液中加入有机酸调节pH后用大孔树脂柱层析，先用纯化水洗脱并弃去洗脱液，再用浓度为10％～20％乙醇洗脱并弃去洗脱液，最后用浓度为30％～50％乙醇洗脱，收集洗脱液得到银杏根皮酸粗品；

5)银杏根皮酸粗品用聚酰胺柱层析纯化，依次用纯化水、25％～35％乙醇洗脱并弃去洗脱液，再用浓度为75％～95％乙醇洗脱，收集洗脱液浓缩得到银杏根皮酸即1,8-二羟基-二苯并呋喃-2,6-二羧酸。

上述方法制得的银杏根皮酸纯度不低于65.3％。

优选的，上述步骤2)乙醇提取银杏根皮粗粉的温度为50℃～90℃，乙醇浓度为50％～95％，乙醇溶剂体积为银杏根皮粗粉投样量的5～8倍。

优选的，上述步骤2)碱溶液为氢氧化钠或氢氧化钾，浓度为0.5mol/L～2mol/L。

优选的，上述步骤2)酸溶液为盐酸、硫酸或磷酸，浓度为1mol/L～4mol/L。

优选的，上述步骤2)调节pH为中性或弱碱性。

优选的，上述步骤3)大孔树脂为D101、DM130、HPD100、HP20、AB-8或DA201中任一种。

优选的，上述步骤4)有机酸为甲酸或乙酸。

优选的，上述步骤4)有机酸调节pH至4～6。

再者，本发明还提供一种鉴定GBE中银杏根皮提取物的方法，其以银杏根皮酸作为银杏根皮提取物特征成分，通过高效液相或液质联用的方法检测GBE中银杏根皮酸含量，确认GBE中是否存在银杏根皮提取物，高效液相法检测流程如下：

1)供试品溶液的制备：取GBE样品600mg于10mL量瓶，用50％甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，过滤，取续滤液得供试品。

2)对照品溶液的制备：取银杏根皮酸样品20mg于1000mL量瓶，加50％甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，过滤，取续滤液对照品。

3)检测方法：以0.1％甲酸溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，按表1中的规定进行梯度洗脱；检测波长为254nm；柱温为30℃；流速为1.0mL/min。

表1洗脱梯度

银杏萜内酯是GBE治疗心脑血管疾病的药效成分，是相关产品的质量检测指标之一。市场上存在部分厂家为了降低GBE生产成本，同时满足药品质量检测标准要求，加入以银杏根皮为原料提取的银杏萜内酯等成分或者在银杏叶原料中部分加入银杏根皮提取GBE，得到的GBE可能含有其他潜在影响质量安全的物质，且其未经临床验证，存在严重的质量及临床安全隐患。本发明的目的是提供一种以银杏根皮酸为标志物的GBE质量检测方法，有效鉴别GBE中的银杏根皮成分。

银杏根皮酸分离自银杏根皮，与现有化合物数据库比对，未发现其结构相同及相似化合物。该化合物母核(即二苯并呋喃结构)非常规天然化合物母核，除银杏根皮外尚未在其他植物或者部位(包括银杏叶)中发现，故检测到该化合物，则可判断检测对象可能与银杏根皮相关。而且该化合物在银杏根皮中含量低，极性与BB相似，紫外检测响应高，检测灵敏；粗放且低成本的制备工艺很难将该物质与BB完全分离，粗制的银杏根皮提取物中常含有银杏根皮酸，故在GBE中检测出银杏根皮酸能推断GBE加入了银杏根皮提取物。

因此，银杏根皮酸可以作为GBE中银杏根皮提取物的一种特征性物质，高效液相色谱检测与液质联用技术可以专属的、高灵敏度的检测银杏根皮酸，判断GBE中是否加入了银杏根皮提取物。

可见，本发明提供了一种银杏根皮中分离得到的化合物与用途，其取得有益效果如下：

1.提供了一种新化合物银杏根皮酸，其作为银杏根皮的特征成分，可以用于鉴别GBE中是否加入银杏根皮提取物，规范市场行为，保证GBE及其制剂的临床使用安全有效。

2.当前GBE成分鉴定方法存在检测时间长、物质来源判断困难等缺点，本发明利用银杏根皮酸作为特征成分，通过HPLC-UV法实现GBE中银杏根皮提取物检测，该方法操作方便，检测时间短，该检测方法灵敏度高，银杏根皮酸的检测限为0.0014mg/mL，GBE中检出银杏根皮含量为25mg/kg。

3.原HPLC-UV方法能同时检测GBE中的芦丁、槲皮素、异鼠李素、槐角苷等黄酮类成分，但无法检测银杏萜内酯成分、判断银杏萜内酯来源。以银杏根皮酸度作为特征成分检测GBE中银杏根皮提取物，改变了原方法只能检测GBE中黄酮类成分的缺陷，实现了同时鉴定银杏萜内酯成分来源的目的，更好的实现“一测多评”的目标，适合工业化推广。

4.化合物采用酸化提取工艺，实现银杏根皮酸与BB的有效分离，化合物纯度不低于65.3％，满足GBE中银杏根皮酸的鉴定要求；此外，化合物分离采用绿色环保工艺，减少环境污染。

附图说明

图1为银杏根皮一级质谱图。

图2为银杏根皮酸二级质谱图。

图3为银杏根皮酸1H MNR谱图

图4为银杏根皮酸13C MNR谱图

图5为银杏根皮酸H-H COSY谱图

图6为银杏根皮酸HSQC谱图

图7为银杏根皮酸HMBC谱图

图8为银杏根皮酸高效液相专属性图，银杏根皮酸的一般出峰时间为25.4min～25.9min，并根据前后出峰的峰形可作出判断。其中图8A为银杏根皮酸高效液相图，银杏根皮酸出峰时间为25.526min；图8B为银杏叶提取物高效液相图，a部及其局部放大图表明在25.4min～25.9min无特征峰，即无银杏根皮酸出峰；图8C为添加银杏根皮酸的银杏叶提取物高效液相图，b部及其局部放大图表明银杏根皮酸在25.577min有出峰。由图8可知，银杏根皮酸在银杏叶提取物中非天然存在，可作为银杏根皮酸掺入银杏叶提取物的特征物质。

图9为银杏根皮酸高效液相色谱柱耐用性图，银杏根皮酸的一般出峰时间为25.4min～25.9min，并根据前后出峰的峰形可作出判断。其中图9A为色谱柱1，c部及其放大图显示，添标后银杏叶提取物中银杏根皮酸的出峰时间为25.626min；图9B为色谱柱2，d部及其放大图显示，添标后银杏叶提取物中银杏根皮酸的的出峰时间为25.916min；图9C为色谱柱3，银杏根皮酸单体的出峰时间19.325min；图9D为色谱柱3，e部及其放大图显示，添标后银杏叶提取物中银杏根皮酸在19.3min前后无银杏根皮酸特征峰，说明色谱柱3无法有效地将银杏根皮酸与其他物质分离。

图10为银杏根皮酸高效液相甲酸耐用性图，银杏根皮酸的一般出峰时间为25.4min～25.9min，并根据前后出峰的峰形可作出判断。其中图10A为流动相0.1％甲酸-水溶液，f部及其放大图显示，添标后银杏叶提取物中银杏根皮酸的出峰时间为25.626min；图10B为流动相0.08％甲醇-水溶液，g部及其放大图显示，添标后银杏叶提取物中银杏根皮酸的出峰时间为25.561min；图10C为流动相0.12％甲酸-水溶液，h部及其放大图显示，添标后银杏叶提取物中银杏根皮酸的出峰时间为25.501min。说明本法对流动相甲酸在0.08％～0.12％范围检测结果影响不大。

图11为银杏根皮酸高效液相柱温耐用性图，银杏根皮酸的一般出峰时间为25.4min～25.9min，并根据前后出峰的峰形可作出判断。其中图11A为柱温30℃，i部及其放大图显示，添标后银杏叶提取物中银杏根皮酸的出峰时间为25.626min；图11B为柱温28℃，j部及其放大图显示，添标后银杏叶提取物中银杏根皮酸的出峰时间为25.987min；图11B为柱温32℃，k部及其放大图显示，添标后银杏叶提取物中银杏根皮酸的出峰时间为25.946min。说明本法对柱温在25℃～32℃范围检测结果影响较大，需明确柱温。

图12为银杏根皮粗提物中银杏根皮酸的检测图，银杏根皮酸的一般出峰时间为25.4min～25.9min，并根据前后出峰的峰形可作出判断。其中图12A为郯城出产的银杏根皮粗提物，银杏根皮酸的出峰时间为25.723min；图12B为兰溪出产的银杏根皮粗提物，银杏根皮酸的出峰时间为25.815min；图12C为邳州出产的银杏根皮粗提物，银杏根皮酸的出峰时间为25.442min；图12D为巴州出产的银杏根皮粗提物，银杏根皮酸的出峰时间为25.629min；图12E为银杏叶提取物，l部及其放大图显示，银杏叶提取物在25.4～25.9min无银杏根皮酸出峰。说明不存在于银杏叶提取物的银杏根皮酸普遍存在于银杏根皮粗提物中。

图13为自制银杏叶提取物中银杏根皮酸的检测图，银杏根皮酸的一般出峰时间为25.4min～25.9min，并根据前后出峰的峰形可作出判断。其中图13A为自制银杏叶提取物1号样品，m部及其放大图显示，银杏叶提取物在25.4～25.9min无特征峰，即无银杏根皮酸出峰；图13B自制银杏叶提取物2号样品，n部及其放大图显示，银杏叶提取物在25.4～25.9min无特征峰，即无银杏根皮酸出峰。说明银杏叶提取物1号和2号样品中不存在银杏根皮酸。

图14为市售银杏提取物中银杏根皮酸的检测图，银杏根皮酸的一般出峰时间为25.4min～25.9min，并根据前后出峰的峰形可作出判断。其中图14A为厂商一供试品高效液相图，o部及其放大图显示，银杏根皮酸的出峰时间为25.362min；图14B为厂商一供试品质谱图，其中标★的分子离子峰[M-H]-m/z＝287.02为银杏根皮酸特征的分子离子峰。说明银杏根皮酸存在于该市售银杏提取物中。

具体实施方式：

下面结合具体实施例对本发明进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1：银杏根皮酸的分离纯化-1

1.银杏根皮的前处理与提取

取银杏根皮干燥破碎后的粉末10kg，分别加8倍、6倍量70％乙醇在85℃下提取两次，每次1.5h，浓缩至约1倍药材体积，再加入等体积的1.5mol/L氢氧化钠溶液，过滤(500目筛)，将滤液用3mol/L盐酸调pH至7后浓缩、干燥，得银杏根皮粗提物。

2.银杏根皮粗提物第一次D101柱层析

将干燥后的粗提物用10倍量50％乙醇溶液加热溶解过滤，滤渣重复溶解过滤，滤液合并浓缩至无醇味，上于D101柱层析(Φ10cm、柱体积(BV)＝2.5L)，3BV纯化水洗脱，将水洗脱成分合并浓缩至5L，得层析浓缩液。

3.银杏根皮提取物调酸后第二次D101柱层析

将层析浓缩液中加入乙酸，调节pH至4，静置30min，上于D101柱层析(Φ10cm，柱体积(BV)＝2.5L)，3BV纯化水洗脱，再依次用3BV 20％乙醇、40％乙醇洗脱，将40％乙醇部位浓缩、干燥，得到银杏根皮酸粗品。

4.银杏根皮提取物聚酰胺柱层析

取约7g银杏根皮酸粗品用1L 10％乙醇加热溶解，上于聚酰胺树脂柱(30-60目，Φ＝5.5cm，BV＝250mL)，用6BV纯化水洗脱，再依次用6BV 35％乙醇、14BV 90％乙醇洗脱。最后将90％乙醇洗脱的组分合并浓缩干燥，得到银杏根皮酸，设为批号1。

实施例2：银杏根皮酸的分离纯化-2

1.银杏根皮的前处理与提取

取银杏根皮干燥粉碎后的粉末1kg，分别加6倍、5倍量50％乙醇，90℃下提取两次，每次2h，浓缩至约1倍药材体积，再加入等体积的0.5mol/L氢氧化钠溶液，过滤(500目筛)，将滤液用1mol/L硫酸调pH至8后浓缩、干燥，得银杏根皮粗提物。

2.银杏根皮粗提物第一次HPD100柱层析

将粗银杏根皮提物用10倍量50％乙醇溶液加热溶解过滤，滤渣重复溶解过滤，滤液合并浓缩至无醇味，上于HPD100柱层析(Φ5.5cm、柱体积(BV)＝300mL)，3BV纯化水洗脱，将水洗脱成分合并浓缩至500mL，得层析浓缩液。

3.银杏根皮提取物调酸后第二次HPD100柱层析

将层析浓缩液中加入甲酸，pH调节至6，静置30min，上于HPD101柱层析(Φ5.5cm、柱体积(BV)＝300mL)，3BV纯化水洗脱，再依次用3BV 10％乙醇、50％乙醇洗脱，将50％乙醇部位浓缩、干燥，得到银杏根皮酸粗品。

4.银杏根皮提取物聚酰胺柱层析

取约3g银杏根皮酸粗品用500mL 10％乙醇加热溶解，上于聚酰胺树脂(30-60目，Φ＝3cm，BV＝150mL)，用6BV纯化水洗脱，再依次用6BV 30％乙醇、16BV 75％乙醇洗脱。最后将75％乙醇洗脱的组分合并浓缩干燥，得到银杏根皮酸，设为批号2。

实施例3：银杏根皮酸的分离纯化-3

1.银杏根皮的前处理与提取

取银杏根皮干燥粉碎后粉末1kg，分别加6倍、5倍量95％乙醇，50℃提取两次，每次1.5h，浓缩至约1倍药材体积，再加入等体积的2mol/L氢氧化钾溶液，过滤(500目筛)，将滤液用4mol/L磷酸调pH至7后浓缩、干燥，得银杏根皮粗粉。

2.银杏根皮粗提物第一次DM130柱层析

将银杏根皮粗粉用10倍量50％乙醇溶液加热溶解过滤，滤渣重复溶解过滤，滤液合并浓缩至无醇味，上于DM130柱层析(Φ5.5cm、柱体积(BV)＝300mL)，3BV纯化水洗脱，将水洗脱成分合并浓缩至400mL，得层析浓缩液。

3.银杏根皮提取物调酸后第二次DM130柱层析

将层析浓缩液中加入乙酸，pH调节至5，静置30min，上于DM130柱层析(Φ5.5cm、柱体积(BV)＝300mL)，3BV纯化水洗脱，再依次用3BV 15％乙醇、30％乙醇洗脱，将30％乙醇部位浓缩、干燥，得到银杏根皮酸粗品。

4.银杏根皮提取物聚酰胺柱层析

取约2g银杏根皮酸粗品用500mL 10％乙醇加热溶解，上于聚酰胺树脂(100-200目，Φ＝1.5cm，BV＝20mL)，用6BV纯化水洗脱，再依次用6BV25％乙醇、10BV 95％乙醇洗脱。最后将95％乙醇洗脱的组分合并浓缩干燥，得到银杏根皮酸，设为批号3。

实施例4：银杏根皮酸纯度检查

将上述实施例1～3得到的银杏根皮酸样品进行纯度检查。

1.操作方法

称取银杏根皮酸约5mg，精密称定，至25mL量瓶中，用80％甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，过滤，取续滤液得供试品，进行高效液相检测。

2.条件

Intertsil ODS-3，5μm，4.6*250mm为色谱柱；以0.1％甲酸溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，如表1所示中的规定进行梯度洗脱；柱温为30℃；流速为1.0mL/min。蒸发光散射检测器蒸发温度为30℃、雾化温度为70℃，紫外检测波长为254nm。

结果ELSD检测峰面积比均大于80％；254nm下峰面积比大于60％。254nm下检测可见更多杂质，可以体现更多信息，因此根皮特征物质(银杏根皮酸)最终含量以紫外检测确定纯度。结果见表2。

表2银杏根皮酸纯度

实施例5：银杏根皮酸的结构鉴定

1.银杏根皮酸质谱检测

如图1所示，EI质谱中，碎片离子峰为287.0188[M-H]^-，575.0465[2M-H]^-；从而判断化合物的分子离子峰为287.0188[M-H]^-，分子式为C₁₄H₈O₇。

如图2所示，特征碎片m/z＝269.01，243.03，215.03，215.03，199.04，187.04，143.05，115.06。

2.银杏根皮酸核磁检测

如图3所示，氢谱中各氢原子信号均处于低场，初步判读结构存有苯环片段；化学位移δ12.76，δ11.36和δ10.37四个活泼质子；化学位移δ9.30和δ7.56为双重峰，且相互耦合，耦合常数为2.0Hz，推测为间位链接；化学位移δ7.77和δ7.16为双重峰，且相互耦合，耦合常数为8.5Hz，推测为邻位链接。

如图4所示，碳谱中碳信号均处于低场，与质子谱判断一致，从而确定含有苯环结构；碳信号显示为13个碳，其中化学位移δ116.5为两个碳信号重叠。

如图5所示，H-H COSY谱中显示化学位移δ7.77和δ7.16链接。

如图6所示，HSQC谱中显示化学位移δ9.30与δ120.9链接；化学位移δ7.77与δ123.0链接；化学位移δ7.56和δ7.16均与δ116.5链接。

如图7所示，HMBC谱中，C-2与C-4，C-6和C-13有相关，C-4与C-6和C-12有相关，可以判断C-2和C-4为苯环A的间位相连；C-9与C-11和C-14有相关，C-10与C-8和-12有相关，可以判断C-9和C-10为苯环B邻位相连；C-4与C-12相关，判断苯环A和苯环B链接。

最终如表3确定所述碳氢相关数据，并根据分子量确定分子式为C₁₄H₈O₇，推测所述化合物如下：

表3银杏根皮酸核磁数据整理表

实施例6：GBE中银杏根皮酸测定的方法学研究

1.仪器与试药

1.1.仪器

Agilent1260高效液相色谱仪、Agilent1100高效液相色谱仪、色谱柱(IntertsilODS-3，5μm，4.6*250mm)、MSA225S-1CE-Du电子分析天平、Milli-QA10纯水机。

1.2.试药

银杏根皮酸(经实施例5鉴定得到)，GBE(批号180107；浙江康恩贝制药股份有限公司)。

1.3.模拟添标样品制备

根皮内酯提取物：干燥的银杏根皮进行破碎，分别加8倍70％乙醇微沸提取两次，每次1.5h，提取液浓缩至无醇味后加水至约4倍药材体积，过滤，滤液上大孔树脂柱D101柱，4BV纯化水洗脱，弃去水洗脱液，再用3BV 60％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩干燥得根皮内酯提取物(经测得内酯含量为15％，银杏根皮酸含量为1.2％)。

取GBE 93.27g与根皮内酯提取物4.85g(理论内酯含量提高了0.7％)，分别用乙醇溶解后混合、浓缩、干燥，得添标样品(银杏根皮酸含量约0.05％)。

2.测定法

2.1.色谱条件与系统适用性试验

以Intertsil ODS-3，5μm，4.6*250mm为色谱柱；以0.1％甲酸溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，按表1中的规定进行梯度洗脱；检测波长为254nm、202nm；柱温为30℃；流速为1.0mL/min。

表1洗脱梯度

2.2.供试品溶液的制备

取GBE样品600mg，精密称定，至10mL量瓶，用50％甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

2.3.对照品溶液的制备

取银杏根皮酸对照适量，精密称定，加50％甲醇制成1mL含20μg的对照品溶液，即得。

3.方法学验证

3.1.样品专属性研究

取供试品溶液、阴性供试品溶液、对照品溶液，按测定法进行测定。结果如图8所示，阴性供试品溶液无干扰，方法专属性良好。

3.2.检测限度研究

取银杏根皮酸对照品适量，得对照品浓溶液。取不同体积加至阴性供试品溶液中，按本实施例中2.1的方法进行测定。以对照品加入量与信噪比信息确定检测限度。结果表明银杏根皮酸的检测限为0.0014mg/mL，检出银杏根皮含量为25mg/kg。

3.3.耐用性研究

a)色谱柱耐用性研究，取模拟添标样品，按测定法进行测定。考察如表4所示不同厂家色谱柱下银杏根皮酸的分离情况。

表4色谱柱编号

结果如图9所示，色谱柱1、色谱柱2对于银杏根皮酸的分离均良好。色谱柱3保留时间与其他两种柱填料区别较大，且不能够与其他物质分开。说明本法适用于ODS类型色谱柱，色谱柱耐用性方面有一定要求。

b)流动相耐用性研究，取模拟添标样品，按测定法进行测定。考察流动相中不同甲酸浓度下银杏根皮酸的分离情况。

结果如图10所示，在不同甲酸浓度下均能检测到目标物质，分离度均良好。说明本法对流动相中甲酸含量影响不大。

c)柱温耐用性考察，取模拟添标样品，按测定法进行测定。考察不同柱温(28℃、30℃、32℃)下银杏根皮酸的分离情况。

结果如图11所示，温度升高出峰时间提前，温度降低出峰时间延后。当温度为28℃时，银杏根皮酸被并入其他杂峰中；温度32℃时提前出峰，与前面一个峰重叠。说明本法对柱温影响较大，需明确柱温。

d)稳定性实验，取模拟添标样品，按测定法进行测定，分别于不同时间点内进样，考察供试品溶液的稳定性。

结果如表5所示，供试品溶液24h内稳定性良好。

表5溶液稳定性

实施例7：市售银杏叶相关样品中银杏根皮酸测定

1.银杏根皮中银杏根皮酸的测定

1.1.银杏根皮粗提物及GBE制备

银杏根皮提取物：取银杏根皮干燥粉末10g，分别加8倍、6倍量70％乙醇85℃下提取两次，每次1.5h，浓缩干燥得银杏根皮粗提物。称取银杏根皮粗提物约20mg，精密称定，至10mL量瓶中，用80％甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，过滤，取续滤液得银杏根皮供试品，进行高效液相检测。分别制得6个产地的银杏根皮粗提物。

GBE(批号180107；浙江康恩贝制药股份有限公司)

1.2.银杏根皮粗提物及GBE检测

按实施例6中的2.1测定法测定。

1.3.结果

如图12，对比银杏根皮粗提物均含银杏根皮酸物质峰，GBE中不含有该物质峰，同时在VWD检测数据上，该物质峰出峰时间处没有GBE中其他成分相干扰，故银杏根皮酸可作为银杏根皮与GBE的区别物质。

2.银杏叶中银杏根皮酸的含量测定

2.1.供试品制备方法

按照本实施例1.1中银杏叶提取方法制得GBE供试品溶液，分别制得12个不同年份、产地的GBE供试品溶液。按实施例6中的2.1测定法测定。

2.2.检测结果

结果如表6所示，12个不同年份、产地的银杏叶中均未检出银杏根皮酸。通过LC-MS进一步确定，上述银杏叶均不含有银杏根皮酸，部分GBE中银杏根皮酸的LC-MS检测结果见图13。

表6银杏叶中银杏根皮酸的含量

由银杏根皮中银杏根皮酸与银杏叶中银杏根皮酸的检测结果可得，银杏根皮酸普遍稳定存在于银杏根皮中且不存在于银杏叶中，因此较适宜作为GBE中检测银杏根皮的特征物质进行分析。

3.市售GBE中银杏根皮酸的含量测定

按照本实施例1.1中银杏叶提取方法制得市售GBE供试品溶液，按实施例6中的2.1测定法测定。结果如表7所示，有4个厂商的批次含有银杏根皮酸。

表7市售GBE中根皮特征成分含量

取厂商一供试品进行液质联用进一步确定。结果如图14所示，紫外检测部分有银杏根皮酸特征峰、该峰位置提取色谱有银杏根皮酸特征的分子离子峰[M-H]^-m/z＝287.02。厂商三、厂商七、厂商八的液质联用检测结果同厂商一。

故推测厂商一、厂商三、厂商七、厂商八GBE有加入银杏根皮提取物的嫌疑。

为本领域的专业人员易于理解，以上所述仅为本发明所述的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均落在本发明要求的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种银杏根皮中分离得到的化合物，其化学名称为1,8-二羟基-二苯并呋喃-2,6-二羧酸，其分子式为C₁₄H₈O₇，其化学结构式为：

2.一种如权利要求1所述化合物的分离纯化制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

1)银杏根皮干燥粉碎，得到银杏根皮粗粉；

2)银杏根皮粗粉用乙醇提取、浓缩后用碱溶液处理、过滤，再用酸溶液调节pH，浓缩干燥后得到银杏根皮粗提物；

3)银杏根皮粗提物上于大孔树脂柱，用纯化水洗脱并将洗脱液回收浓缩，得到层析浓缩液；

4)层析浓缩液中加入有机酸调节pH后用大孔树脂柱层析，先用纯化水洗脱并弃去洗脱液，再用浓度为10％～20％乙醇洗脱并弃去洗脱液，最后用浓度为30％～50％乙醇洗脱，收集洗脱液得到银杏根皮酸粗品；

5)银杏根皮酸粗品用聚酰胺柱层析纯化，依次用纯化水、25％～35％乙醇洗脱并弃去洗脱液，再用浓度为75％～95％乙醇洗脱，收集洗脱液浓缩得到权利要求1所述化合物。

3.如权利要求2所述的化合物分离纯化制备方法，其特征在于，所述步骤2)提取温度为50℃～90℃；乙醇浓度为50％～95％，乙醇溶剂体积为银杏根皮粗粉投样量的5～8倍；碱溶液为氢氧化钠或氢氧化钾，浓度为0.5mol/L～2mol/L；酸溶液为盐酸、硫酸或磷酸，浓度为1mol/L～4mol/L；调节pH至中性或弱碱性。

4.如权利要求2所述的化合物分离纯化制备方法，其特征在于，所述步骤3)大孔树脂为D101、DM130、HPD100、HP20、AB-8或DA201中任一种。

5.如权利要求2所述的的化合物分离纯化制备方法，其特征在于，所述步骤4)有机酸为甲酸或乙酸，调节pH至4～6。

6.如权利要求1所述化合物的用途，所述化合物可以作为银杏根皮的特征成分，通过仪器分析所述化合物用于鉴定银杏叶提取物的原料中银杏根皮提取物的含量。

7.如权利要求6所述化合物的用途，其特征在于所述仪器分析可为高效液相法或高效液相-质谱联用法。

8.如权利要求7所述化合物的用途，其特征在于所述高效液相法检测流程如下：

1)供试品溶液的制备：取银杏叶提取物样品600mg于10mL量瓶，用50％甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，过滤，取续滤液得供试品；

2)对照品溶液的制备：取银杏根皮酸样品20mg于1000mL量瓶，加50％甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，过滤，取续滤液得对照品；

3)检测方法：以0.1％甲酸溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，按表1中的规定进行梯度洗脱；检测波长为254nm；柱温为30℃；流速为1.0mL/min。

表1 洗脱梯度

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