CN110780013A - 一种工业大麻花叶中次大麻二酚（cbdv）含量的测定方法 - Google Patents
一种工业大麻花叶中次大麻二酚（cbdv）含量的测定方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及检测技术领域，特别涉及一种工业大麻花叶中次大麻二酚（CBDV）的定量检测方法。本方法包括以下步骤：将干燥后的大麻花叶粉碎，用甲醇进行超声提取，离心后收集上清液，残渣重复用甲醇超声提取一次，离心合并上清液，浓缩定容得到待测液，用高效液相色谱仪对待测液进行检测。高效液相色谱仪的流动相为水和乙腈，等度洗脱。采用外标法定量得到待测液中次大麻二酚（CBDV）的含量。本方法操作简单、分离度好，使大麻花叶中的次大麻二酚（CBDV）快速得到准确定量。
Description
技术领域
本发明涉及检测技术领域，特别涉及一种工业大麻花叶中次大麻二酚（CBDV）含量的测定方法。
背景技术
工业大麻是指四氢大麻酚（THC）含量低于0.3%的大麻，我国将工业大麻称为汉麻，是大麻科大麻属一年生草本植物，大麻中的主要活性成分是大麻素类化合物，目前已知天然大麻素有70种，主要用于某些神经系统疾病中的多发性硬化症、运动性神经疾病、慢性顽固性疼痛和药源性呕吐，另外，对青光眼、哮喘和心血管疾病也有一定作用。
其中次大麻二酚（CBDV）和大麻二酚（CBD）非常相似，是大麻素稍有退化的版本，但这分子形状上小小的改变意义很大。早前，英国GW制药公司公布了一项关于次大麻二酚制药的专利，次大麻二酚和大麻二酚组成的药物组合物用于神经病症的治疗是特别安全和有效的，神经病症是指以中枢神经系统的过度兴奋、惊厥或癫痫发作例如发生在癫痫中的中枢经系统的过度兴奋、惊厥或癫痫发作。可见基于次大麻二酚的抗癫痫药物的有效且安全，现在存在探索次大麻二酚作为抗癫痫药物新治疗剂的机会。次大麻二酚还可能有助于治疗胃肠问题。安大略大学2013年研究发现这种化合物是一个“恶心战斗机”，摄入次大麻二酚（CBDV）和次氢大麻酚（THCV）的成年大鼠恶心症状显著减轻。
目前，工业大麻医用研究是新的热点，而次大麻二酚目前主要从工业大麻花叶中提取，故准确测定花叶原料中的次大麻二酚含量十分重要。但目前尚未出台权威次大麻二酚检测标准，因此开发一种能够准确测定工业大麻花叶中次大麻二酚含量的检测方法十分必要。
发明内容
本发明使用甲醇超声提取工业大麻花叶中的次大麻二酚，用高效液相色谱仪检测，外标法进行定量，能够准确、快速的检测大麻花叶中的次大麻二酚含量。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
（1）本发明提供了一种工业大麻花叶中次大麻二酚含量的测定方法，包括如下步骤：
①将新鲜工业大麻花叶样品于烘箱中60℃下干燥12小时（水分小于5%），粉碎机粉碎至20目，混匀待测。
②准确称取花叶样品于离心管中，加入有机溶剂，超声提取，然后离心收集上清液，滤渣重复超声提取一次，离心合并上清液，浓缩定容过滤膜得到待测液。
③用高效液相色谱仪对待测液进行检测，高效液相色谱仪流动相为水和乙腈，等度洗脱。
④使用外标法定量：用次大麻二酚标准对照品配得系列对照品溶液，外标法测得大麻花叶待测液中次大麻二酚的含量。
（2）进一步的，步骤①中所述大麻花叶为9月采摘的成熟工业大麻的叶和花苞组合物。
（3）进一步的，步骤②中所述有机溶剂为色谱纯溶剂，为甲醇、乙醇、正己烷、乙酸乙酯中一种或两种混合物，有机溶剂所用体积量与花叶样品质量比为5~20:1。
（4）优选地，步骤②中所述有机溶剂为色谱纯甲醇，甲醇体积与大麻花叶质量比为10:1。
（5）进一步的，步骤②中所述超声时间为5min~30min。
（6）优选地，步骤②中所述超声时间为20min，超声功率为250W，工作频率为40kHz。
（7）进一步的，步骤②中所述离心转速为5000~10000转/分钟，时间为5~10分钟。
（8）优选地，步骤②中所述离心转速为10000转/分钟，离心时间为5分钟。
（9）进一步的，步骤③中所述高效液相色谱仪品牌型号为安捷伦1260；所述流动相乙腈为色谱纯，水为去离子水，乙腈与水的比例为（60%~80%）：（20%~40%），等度洗脱，流速为0.8mL/min ~1.2mL/min；所述高效液相色谱仪进样量为8uL ~12 uL；所述高效液相色谱仪柱温为20℃~40℃；所述高效液相色谱仪检测波长为210 nm ~230nm。
（10）优选地，步骤③乙腈与水的比例为65% ：35%，流速为1mL/min；进样量为10uL；色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18，柱温为30℃，检测波长为220nm。
（11）进一步的，步骤④中所述次大麻二酚标准对照品溶液购自美国Sigma公司，浓度为1mg/mL的次大麻二酚标准品溶液分别用色谱纯甲醇稀释为1ug/mL、2ug/mL、4ug/mL、10ug/mL、20ug/mL、40ug/mL、100ug/mL的系列对照品溶液，进高效液相色谱仪检测，以物质浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。
（12）本发明的优点：
①本发明用甲醇进行超声提取大麻花叶中的次大麻二酚，实验操作简单，处理时间短，检测结果准确。
②本发明用去离子水和乙腈作为流动相、等度洗脱，目标物在7.4min即可出峰，检测时间短；且目标物峰形好、分离度好。本发明流动相使用纯水，无需配置缓冲盐，能够延长色谱柱等仪器部件的使用周期，仪器维护简单。
附图说明
图1次大麻二酚标准对照品色谱图。
图2次大麻二酚标准曲线。
图3实施例2大麻花叶样品色谱图。
图4 实施例3大麻花叶样品色谱图。
图5实施例4大麻花叶样品色谱图。
具体实施方式
以下实施例仅是对本发明予以解释说明，并未对本发明的保护范围进行任何限制。对于本领域技术人员而言，凡未脱离本发明技术精神所作的同等实施方式或变更均在本发明的保护范围之内。
实施例1
（1）将新鲜工业大麻花叶样品于60℃下干燥12小时（水分小于5%），粉碎机粉碎至20目，混匀待测。
（2）准确称取花叶样品0.5g于离心管中，加入10mL甲醇，超声提取10分钟，然后用离心机10000转/分钟离心5分钟，转移上清液至浓缩瓶中，残渣用10mL甲醇重复超声提取一次，离心，合并上清液，用旋转蒸发仪（温度40℃）浓缩除去部分溶剂，浓缩液转移至10mL容量瓶中，甲醇定容，过0.22um有机滤膜得到待测液。
（3）高效液相色谱仪（安捷伦1260）仪器条件设置为：流动相色谱纯乙腈与去离子水的比例为70% ：30%，等度洗脱，流速为0.8mL/min；进样量为10uL。色谱柱为AgilentZORBAX Eclipse Plus C18，柱温为30℃；检测波长为220nm。
（4）系列对照品溶液配置：次大麻二酚标准品溶液购自美国Sigma公司，浓度为1mg/mL的次大麻二酚标准品溶液分别用色谱纯甲醇稀释为1ug/mL、2ug/mL、4ug/mL、10ug/mL、20ug/mL、40ug/mL、100ug/mL的系列对照品溶液，以上述色谱条件进高效液相色谱仪检测，以物质浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。
（5）外标法定量：在上述色谱条件下，待测样品用液相色谱进行检测，对照次大麻二酚标准对照品的对应保留时间，记录次大麻二酚的峰面积值，将峰面积带入外标曲线，即可得到待测液中次大麻二酚的浓度，进而计算得大麻花叶样品中次大麻二酚的含量。
实施例2
（1）将新鲜工业大麻花叶样品于60℃下干燥12小时（水分小于5%），粉碎机粉碎至20目，混匀待测。
（2）准确称取花叶样品1.0g于离心管中，加入10mL甲醇，超声提取20分钟，然后用离心机10000转/分钟离心5分钟，转移上清液至浓缩瓶中，残渣用10mL甲醇重复超声提取一次，离心，合并上清液，用旋转蒸发仪（温度40℃）浓缩除去部分溶剂，浓缩液转移至10mL容量瓶中，甲醇定容，过0.22um有机滤膜得到待测液。
（3）高效液相色谱仪（安捷伦1260）仪器条件设置为：流动相色谱纯乙腈与去离子水的比例为65% ：35%，等度洗脱，流速为1mL/min；进样量为10uL；色谱柱为Agilent ZORBAXEclipse Plus C18，柱温为30℃；检测波长为220nm。
（4）系列对照品溶液配置同实施例1。
（5）外标法定量同实施例1。
注：色谱图为图3。
实施例3
（1）将新鲜工业大麻花叶样品于60℃下干燥12小时（水分小于5%），粉碎机粉碎至20目，混匀待测。
（2）准确称取花叶样品1.0g于离心管中，加入10mL乙醇，超声提取20分钟，然后用离心机10000转/分钟离心5分钟，转移上清液至浓缩瓶中，残渣用10mL乙醇重复超声提取一次，离心，合并上清液，用旋转蒸发仪（温度40℃）浓缩除去部分溶剂，浓缩液转移至10mL容量瓶中，乙醇定容，过0.22um有机滤膜得到待测液。
（3）高效液相色谱仪（安捷伦1260）仪器条件设置同实施例2。
（4）系列对照品溶液配置同实施例1。
（5）外标法定量同实施例1。
注：色谱图为图4。
实施例4
（1）将新鲜工业大麻花叶样品于60℃下干燥12小时（水分小于5%），粉碎机粉碎至20目，混匀待测。
（2）准确称取花叶样品1.0g于离心管中，加入10mL正己烷+乙酸乙酯混合液（体积比为9：1），超声提取20分钟，然后用离心机10000转/分钟离心5分钟，转移上清液至浓缩瓶中，残渣用10mL正己烷+乙酸乙酯混合液重复超声提取一次，离心，合并上清液，用旋转蒸发仪（温度40℃）浓缩除去部分溶剂，浓缩液转移至10mL容量瓶中，正己烷+乙酸乙酯混合液定容，过0.22um有机滤膜得到待测液。
（3）高效液相色谱仪（安捷伦1260）仪器条件设置同实施例2。
（4）系列对照品溶液配置同实施例1。
（5）外标法定量同实施例1。
注：色谱图为图5。由图3、图4、图5可见图3用甲醇作为提取剂色谱图峰形对称、不拖尾、分离度好。
实施例5
（1）将新鲜工业大麻花叶样品于60℃下干燥12小时（水分小于5%），粉碎机粉碎至20目，混匀待测。
（2）准确称取花叶样品2g于离心管中，加入10mL甲醇，超声提取30分钟，然后用离心机10000转/分钟离心5分钟，转移上清液至浓缩瓶中，残渣用10mL甲醇重复超声提取一次，离心，合并上清液，用旋转蒸发仪（温度40℃）浓缩除去部分溶剂，浓缩液转移至10mL容量瓶中，甲醇定容，过0.22um有机滤膜得到待测液。
（3）高效液相色谱仪（安捷伦1260）仪器条件设置为：流动相色谱纯乙腈与去离子水的比例为60% ：40%，等度洗脱，流速为1mL/min；进样量为10uL；色谱柱为Agilent ZorbaxSB-C18，柱温为30℃；检测波长为220nm。
（4）系列对照品溶液配置同实施例1。
（5）外标法定量同实施例1。
Claims (7)
1.一种工业大麻花叶中次大麻二酚（CBDV）含量的测定方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将新鲜工业大麻花叶样品于烘箱中60℃下干燥，粉碎机粉碎，混匀待测；
（2）准确称取花叶样品于离心管中，加入有机溶剂，超声提取，离心收集上清液，残渣重复超声提取一次，离心，合并上清液，浓缩定容得到待测液；
（3）用高效液相色谱仪对待测液进行检测，所述高效液相色谱仪流动相为水和乙腈，等度洗脱；
（4）使用外标法定量：用次大麻二酚（CBDV）标准对照品配得系列对照品溶液，外标法测得大麻花叶待测液中次大麻二酚（CBDV）的含量。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于所述大麻花叶为9月采摘的成熟工业大麻的叶和花苞组合物，60℃干燥至水分小于5%，粉碎机粉碎至20目。
3.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于所述有机溶剂为色谱纯溶剂，为甲醇、乙醇、正己烷、乙酸乙酯中一种或两种混合物，有机溶剂所用体积量与花叶样品质量比为5~20:1。
4.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于超声时间为5min~30min，超声功率为250W，工作频率为40kHz。
5.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于所述离心的转速为5000~10000转/分钟，时间为5~10分钟。
6.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于所述高效液相色谱仪品牌型号为安捷伦1260；所述流动相乙腈为色谱纯，水为去离子水，乙腈与水的比例为（60%~80%）：（20%~40%），等度洗脱，流速为0.8 mL/min ~1.2mL/min；所述高效液相色谱仪进样量为8 uL ~12uL；所述高效液相色谱仪柱温为20℃~40℃；所述高效液相色谱仪检测波长为210 nm ~230nm。
7.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于所述所述次大麻二酚（CBDV）标准对照品溶液购自美国Sigma公司，配制成系列对照品溶液，进高效液相色谱仪检测，以物质浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。
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