CN111766325B - 一种多组学分析的样品前处理方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种多组学分析的样品前处理方法及其应用，所述样品前处理方法包括如下步骤：(1)将待测样品加到样品前处理装置上离心上样，得到上样后的样品；(2)将样品洗脱，得到洗脱液和洗脱后样品；收集洗脱液，得到代谢组学分析样品；(3)将洗脱后样品进行酶解并转移至固相萃取膜上，洗脱，收集洗脱液，得到蛋白质组学分析样品。所述样品前处理方法能够集成化地进行单滴血液的采集、干燥样品的运输、待测物的富集以及多组学分析样品的制备，进而采用同一液相质谱分析设备对来自单滴血浆的多组学样品进行质谱分析，从样本前处理到获得分析结果的流程可控制在6小时内，实现快捷、高灵敏度和高准确性的分析检测。

Description

一种多组学分析的样品前处理方法及其应用
技术领域
本发明属于生物分析检测技术领域，具体涉及一种多组学分析的样品前处理方法及其应用。
背景技术
质谱法(MS)是一种灵敏度高、特异性强、分析速度快的谱学分析方法，质谱法在一次分析中可以获得丰富的结构信息，将质谱法和不同的分离技术相结合是分析科学方法中的一项突破性进展，尤其是液相色谱与质谱的联用，已成为一种分离和鉴定复杂混合物组成及结构的可靠手段，在生物医药、公共安全以及环境监测等多个领域有着广泛的应用。在生物医药领域，基于质谱技术的组学研究方法为疾病的预测和诊断、标志物的发现以及机理的研究等提供了强有力的工具。
在生物技术领域，组学研究方法包括蛋白质组学、基因组学、代谢组学、糖组学和脂质组学等，上述研究可以提高人们对生命活动原理的认识，进而促进新的医疗方法和药物的开发。近年来，随着组学研究在生物技术领域的发展和逐渐成熟，单从一个层次的生物分子(例如核酸、蛋白质、小分子代谢物等)的变化来分析或找寻生物标志物的策略已经很难满足生物学越来越高的研究期望。从多分子层次出发，系统研究蛋白质和代谢产物等生物分子之间的相互作用和系统机制，为疾病的研究和治疗提供了新的方向。
血液由于其易于获取的特性，是目前应用于疾病诊断和监测的最主要样本源之一。在血液中的各种分析物中，蛋白质和代谢物是生物标志物最主要的来源。通过基于抗体的测定方式，该两类生物标志物的检测已广泛用于临床诊断。自1990年初以来，基于质谱(MS)的代谢组学已广泛用于血浆生物标志物的发现和常规诊断，尤其是针对新生儿筛查。自从基于蛋白质芯片(SELDI-TOF)技术的蛋白质组学成功应用于早期卵巢癌生物标志物OVA1的发现以来，临床蛋白质组学系统规模的对生物标志物的探索已引起越来越多的关注。为了更好的全面体现生物样品的分子基础和表型关系，越来越多的研究聚焦在分析同一血浆样品中的蛋白质组和代谢组学。而通常情况下，血浆样品通常分为两部分，分别通过不同的样品制备程序和LC-MS设置对蛋白质和代谢物进行提取和分析。
基于质谱技术的蛋白质组学和代谢组学大多按照标准静脉血采样程序收集血浆样品。然而，随着生物质谱技术的灵敏度和扫描速度的快速发展，可以实现从微量血液样品中获得全面的蛋白质组和代谢组分析检。集成化的样品制备技术，例如由Mann等研究开发了iST技术(M.Mann等，Minimal,encapsulated proteomic-sample processing appliedto copy-number estimation in eukaryotic cells，Nature Methods，2014，11，319-324)；CN106770814A公开了一种蛋白质色谱分离平台及其应用，所述平台包括蛋白质组反应器和与液相色谱-质谱仪；所述蛋白质色谱分离平台集成了蛋白质的预富集、还原、烷基化、酶解、多肽的强阴离子交换分级、高pH值反相分级和低pH值液相色谱分离等操作，具有一维分离、二维分离和三维分离三种工作模式，可用于少量细胞、组织或血液样品的蛋白质大规模鉴定和定量蛋白质组学中。结合这些前沿的样品制备技术以及基于质谱的蛋白质组学检测技术，可以轻松地从单滴血浆样品中鉴定出数百种蛋白质。通过采用便捷的商业化试剂盒，可以轻松实现从几滴指尖血中获得血浆，而指尖血浆的组学分析也是近期的研究热点。最近对静脉血浆和指尖血浆进行蛋白质组学和代谢组学分析的比较证实了两者之间的差异基本可以忽略，也证明了以无创或微创方式发现血浆生物标志物的潜力。此外，针对新生儿筛查的干血的代谢组学分析技术成熟性，也为干燥血液样本的组学分析提供了最佳应用实例。最近，通过灵敏的靶向蛋白质组学方法进一步扩展了蛋白质组学在临床检测分析中的应用。根据最近的一份报道，干燥血浆样本的最主要优势之一是可方便的在室温下采集、运输和存储，稳定性可长达28天。
在目前的分析技术中，毫升级的血浆样本从在医院收集后，运送到质谱实验室进行蛋白质组学和代谢组学分析，但是这两种组学的液相色谱-质谱分析程序不同，因而经常需要分别分析，这就不可避免地会引起这两种分析结果的差异。此外，液态血浆样本的储存稳定性较差，其运输和储存的成本较高，为后续的组学分析带来了一定的局限性；而干燥血浆一般通过采血纸进行收集，此类干燥样品具有较高的被污染的风险，同时还存在低丰度蛋白质和代谢物难以分析检测等问题。
因此，开发一种针对微量生物样本能够实现便捷的储存运输和多组学分析的方法，是本领域的研究重点。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种多组学分析的样品前处理方法及其应用，所述样品前处理方法采用特定的样品前处理装置进行上样，然后通过洗脱和酶解获得代谢组学分析样品和蛋白质组学分析样品，实现了完全集成化的方式进行单滴血液的采集、干燥样品的运输、待测物的富集以及组学分析样品的制备，并将其应用于高通量、高灵敏度的质谱检测中，进而获得全面可靠的生物标志物信息。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种多组学分析的样品前处理方法，所述多组学分析包括蛋白质组学分析和代谢组学分析，所述样品前处理方法包括如下步骤：
(1)将待测样品加入到样品前处理装置上，离心进行上样，得到上样后的样品；所述样品前处理装置包括移液枪枪头，以及自下而上依次填充于所述移液枪枪头中的固相萃取膜、C18树脂和离子交换树脂；
(2)将步骤(1)得到的样品用有机溶剂进行洗脱，得到洗脱液和洗脱后样品；收集所述洗脱液，得到代谢组学分析样品；
(3)将步骤(2)得到的洗脱后样品进行酶解，得到的酶解多肽转移至固相萃取膜上，洗脱，收集洗脱液，得到蛋白质组学分析样品。
本发明提供的样品前处理方法设计了特定的样品前处理装置，所述样品前处理装置的结构示意图如图1所示，其中，1为移液枪枪头，2为固相萃取膜，3为C18树脂，4为离子交换树脂。与现有技术中进行多组学分析时需要根据分析项目分别进行样品前处理的策略不同，所述样品前处理装置能够同时进行集成化的蛋白质组学和代谢组学样品的前处理与制备，实现蛋白质和代谢物的富集，进而通过洗脱的方式获得代谢组学分析样品，通过酶解和洗脱的方式获得蛋白质组学分析样品，且两种组学分析样品的获取过程不会互相干扰，具有便捷、简化、高灵敏度和准确性的特点。
本发明提供的样品前处理方法主要包括三个步骤，步骤(1)中将待测样品(例如血浆样品或稀释后的血浆样品)加入到样品前处理装置中，通过离心的方法实现干燥和待测物的富集(即上样)；将步骤(1)得到的样品进行步骤(2)中的洗脱操作，将捕获于C18树脂上的代谢物洗脱，收集的洗脱液通过干燥、复溶后即可进行质谱检测；经过步骤(2)代谢物的洗脱后，向洗脱后样品中加入试剂酶解，使富集于离子交换树脂上的蛋白质酶解为多肽，进而将其转移至固相萃取膜上进行洗脱，收集洗脱液，即为蛋白质组学分析样品。本发明所述的样品前处理方法可以从1μL血浆样品(单滴干血)中捕获到170多种代谢物和170多种血浆蛋白质，从而实现了集成化对单滴血液的采集、干燥样品的运输以及待测物的富集。
本发明所述的样品前处理方法中，通过步骤(1)得到的样品能够在常温下稳定保存24h以上，储存24h后进行洗脱和质谱检测，在代谢物和蛋白质的鉴定和定量方面均具有良好的重现性，证明所述样品前处理装置以及样品前处理方法能够应用于便捷的指尖血液采样，并以快速、安全的方式运送干燥样品到实验室进行质谱分析。
所述样品前处理方法的结构示意图如图2所示，其中，1为移液枪枪头，2为固相萃取膜，3为C18树脂，4为离子交换树脂，5为收集管。
优选地，所述移液枪枪头的规格为200μL。
优选地，以所述移液枪枪头的规格为200μL计，所述C18树脂的填充量为0.25～1mg，例如0.3mg、0.35mg、0.4mg、0.45mg、0.5mg、0.55mg、0.6mg、0.65mg、0.7mg、0.75mg、0.8mg、0.85mg、0.9mg或0.95mg，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值，进一步优选为0.5mg。
优选地，所述固相萃取膜的填充量为1～3个，例如1个、2个或3个。
优选地，所述固相萃取膜为C18膜。
优选地，以所述移液枪枪头的规格为200μL计，所述离子交换树脂的填充量为1～3mg，例如1.2mg、0.4mg、1.5mg、1.7mg、1.9mg、2mg、2.2mg、2.4mg、2.5mg、2.7mg或2.9mg，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值，进一步优选为2mg。
优选地，所述离子交换树脂为强阳离子交换树脂(SCX)和强阴离子交换树脂(SAX)的混合物。
作为本发明的优选技术方案，所述离子交换树脂为SCX和SAX的混合物，能够进一步提升蛋白质的富集量，且酶解pH的变化不会对蛋白质产生影响。
优选地，所述强阳离子交换树脂和强阴离子交换树脂的质量比为(10～1):(1～10)。
其中，所述10～1包括9.5、9、8.5、8、7.5、7、6.5、6、5.5、5、4.5、4、3.5、3、2.5、2或1.5，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
所述1～10包括1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9或9.5，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
进一步优选地，所述强阳离子交换树脂和强阴离子交换树脂的质量比为(5～1):(1～3)，更进一步优选为1:1。
优选地，所述样品前处理装置包括规格为200μL的移液枪枪头，以及自下而上依次填充于所述移液枪枪头中的C18膜、C18树脂和离子交换树脂；所述C18膜的个数为1～3个，所述C18树脂的填充量为0.25～1mg，所述离子交换树脂的填充量为1～3mg；所述离子交换树脂为强阳离子交换树脂和强阴离子交换树脂以质量比为(10～1):(1～10)的混合物。
优选地，步骤(1)所述离心的次数为1～3次(例如1次、2次或3次)，进一步优选为2次。
优选地，步骤(1)所述待测样品为血浆样品。
优选地，步骤(1)所述待测样品为稀释的血浆样品。
优选地，所述稀释的方法为：将1μL血浆用稀释剂稀释至50～70μL(例如52μL、55μL、58μL、60μL、62μL、65μL或68μL等)，得到所述待测样品。
优选地，所述稀释剂包括碳酸氢铵溶液；所述碳酸氢铵溶液的浓度优选为10～30mM(例如12mM、15mM、18mM、20mM、22mM、25mM或28mM等)。
优选地，步骤(1)所述待测样品的加入量为20～80μL，例如25μL、30μL、35μL、40μL、45μL、50μL、55μL、60μL、65μL、70μL或75μL，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值，进一步优选为50μL。
优选地，步骤(1)所述样品前处理装置为经过预处理的样品前处理装置。
优选地，所述预处理的方法为：采用处理液对所述样品前处理装置中的填充物进行洗涤、激活和平衡。
优选地，所述处理液包括甲醇和/或碳酸氢铵溶液。
所述碳酸氢铵溶液的浓度优选为10mM，所述碳酸氢铵溶液的pH优选为7～8(例如7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8或7.9等)。
优选地，步骤(2)所述有机溶剂包括异丙醇和/或乙腈，进一步优选为异丙醇。
优选地，步骤(2)所述洗脱的次数为1～3次(例如1次、2次或3次)，进一步优选为2次。
优选地，步骤(3)所述酶解、得到的酶解多肽转移至固相萃取膜上以及洗脱的具体步骤按照标准的混合离子交换树脂模式的SISPROT操作步骤进行，例如参考文献(Xue L等，Mixed-mode ion exchange-based integrated proteomics technology for fast anddeep plasma proteome profiling，Journal of Chromatography A，2018，1564，76-84)中所记载的方法。
另一方面，本发明提供一种如上所述的样品前处理方法得到的蛋白质组学分析样品和代谢组学分析样品在质谱检测中的应用。
另一方面，本发明提供一种多组学分析的检测方法，所述多组学分析包括蛋白质组学分析和代谢组学分析，所述检测方法包括：首先将待测样品通过如上所述的样品前处理方法进行处理，得到代谢组学分析样品和蛋白质组学分析样品；然后将所述代谢组学分析样品和蛋白质组学分析样品分别进行质谱检测，得到代谢组学分析结果和蛋白质组学分析结果。
优选地，所述代谢组学分析样品通过纳升液相色谱-质谱系统或常规液相色谱-质谱系统进行。
优选地，所述蛋白质组学分析样品通过纳升液相色谱-质谱系统或高效液相色谱-质谱系统进行。
优选地，所述蛋白质组学分析样品和代谢组学分析样品通过同一个质谱检测系统进行检测。
优选地，所述质谱检测系统为纳升液相色谱-质谱系统。
示例性的，所述蛋白质组学分析样品和代谢组学分析样品通过同一个纳升液相色谱-质谱系统进行测试，采用Orbitrap质谱仪(Q Exactive，Thermo)和Easy-nLC 1000系统(Thermo)。
其中，纳升液相色谱的色谱柱为装有1.9μm的C18树脂的毛细管分析柱(内径100μm，长度20cm)；分离所用的流动相分别为：含0.1％(v/v)甲酸水溶液(A相)和含0.1％(v/v)甲酸的乙腈溶液(B相)，分离流速为250nL/min。
代谢组学分析时，代谢物的分离梯度总时长为60min，梯度设置为：0～1min 5％的B相；1～5min，5～43％的B相；5～48min，43～100％的B相；48～60min，100％的B相。
蛋白质组学分析时，多肽样品的分离梯度总时长为80min：0～2min，3～7％的B相；2～52min，7～22％的B相；52～62min，22～35％的B相；62～64min，35～90％的B相；然后64～70min，用90％的B相洗涤；70～80min，用5％的B相平衡。
优选地，所述蛋白质组学分析样品在质谱检测中的数据采集模式包括数据依赖性模式(Data Dependent Acquisition，DDA)或多反应监测模式(Multiple ReactionMonitoring，MRM)。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明提供的样品前处理方法用于多组学分析，能够同时进行集成化的蛋白质组学和代谢组学样品的前处理与制备，实现蛋白质和代谢物的富集，进而通过洗脱的方式获得代谢组学分析样品，通过酶解和洗脱的方式获得蛋白质组学分析样品，两种组学分析样品的获取过程不会互相干扰，两种组学分析样品可以通过同一个质谱检测系统进行检测，极大地简化了多组学分析的操作步骤。
(2)本发明所述的样品前处理方法可以从1μL血浆样品中捕获到170多种代谢物和170多种血浆蛋白质，实现了对单滴血液的采集、干燥样品的运输以及待测物的富集的集成化操作；进而通过质谱分析方法同时鉴定出150多种蛋白质和160多种代谢物，在靶向蛋白质组学模式下鉴定出血浆浓度丰度较低蛋白质生物标志物，具有高通量和高灵敏度；而且从样本前处理到获得分析结果的整个流程可以控制在3h以内，十分高效。
(3)本发明所述样品前处理装置能够实现待测样品在常温下的干燥保存，储存24h后进行洗脱和质谱检测，仍然具有良好的回收率和重现性。
附图说明
图1为本发明所述样品前处理装置的结构示意图，其中，1为移液枪枪头，2为固相萃取膜，3为C18树脂，4为离子交换树脂；
图2为本发明提供的样品前处理方法的结构示意图，其中，1为移液枪枪头，2为固相萃取膜，3为C18树脂，4为离子交换树脂，5为收集管；
图3为实施例1～3中得到的组学分析对比图，其中，(a)为蛋白质组学分析图，(b)为代谢组学分析图，R1和R2代表2次技术重复试验；
图4为实施例1、4、5中得到的组学分析对比图，其中，(a)为蛋白质组学分析图，(b)为代谢组学分析图，R1和R2代表2次技术重复试验；
图5为实施例1、6中得到的组学分析对比图，其中，(a)为蛋白质组学分析图，(b)为代谢组学分析图，R1和R2代表2次技术重复试验；
图6为实施例1的组学分析中代谢物鉴定数量的重复性图，R1、R2、R3代表3次技术重复试验；
图7为实施例1的组学分析中重复试验的相关性结果图，其中，(a)为R1和R2的相关性，(b)为R2和R3的相关性，(c)为R1和R3的相关性；R1、R2、R3代表3次技术重复试验；
图8为实施例1的组学分析中代谢物脂质分类的定量重复性结果图；
图9为实施例1和对比例1得到的代谢物鉴定数目对比图，其中，R1和R2代表2次技术重复试验；
图10为实施例7得到的5位结肠癌患者的蛋白质组学和代谢组学分析图；
图11为实施例8中采用MRM模式对结肠癌患者血浆中生物标志物的检测结果图；
图12为实施例8中采用MRM模式对结肠癌患者血浆中生物标志物的峰面积检测结果图；
图13为实施例7和8中与甘油三酯相关的四种GOBP分类结果图；
图14为实施例7和8中载脂蛋白和甘油三酸酯表达的相关性结果图；
图15为实施例7、8中蛋白质组学分析的结果对比图，其中，(a)为实施例7中的DDA模式，(b)为实施例8中的MRM模式；
图16为实施例8中MRM模式对标记蛋白APOA2的全色谱多肽分析图，其中，(a)为SPELQAEAK，(b)为LLAATVLLLTICSLEGALVR；
图17为实施例8中MRM模式对标记蛋白AFP的全色谱多肽分析图，其中，(a)为NIFLASFVHEYSR，(b)为ESSLLNQHACAVMK，(c)为TFQAITVTK；
图18为实施例8中MRM模式对标记蛋白CEA的全色谱多肽分析图，其中，(a)为ITPNNNGTYACFVSNLATGR，(b)为NDVGPYECGIQNK；
图19为实施例8中MRM模式对标记蛋白CNDP2的全色谱多肽分析图，其中，(a)为YNYIEGTK，(b)为LPDGSEIPLPPILLGR；
图20为实施例8中MRM模式对标记蛋白EGFR的全色谱多肽分析图，其中，(a)为IPLENLQIIR，(b)为TIQEVAGYVLIALNTVER，(c)为DSLSINATNIK；
图21为实施例8中MRM模式对标记蛋白FCGBP的全色谱多肽分析图，具体为VITVQVANFTLR；
图22为实施例8中MRM模式对标记蛋白HMGB1的全色谱多肽分析图，其中，(a)为GEHPGLSIGDVAK，(b)为RPPSAFFLFCSEYRPK，(c)为HPDASVNFSEFSK；
图23为实施例8中MRM模式对标记蛋白LGALS4的全色谱多肽分析图，其中，(a)为VGSSGDIALHINPR，(b)为VVVNGNPFYEYGHR；
图24为实施例8中MRM模式对标记蛋白MUC1的全色谱多肽分析图，其中，(a)为NYGQLDIFPAR，(b)为DISEMFLQIYK；
图25为实施例1、9中的组学分析对比图，其中，(a)为蛋白质组学分析图，(b)为代谢组学分析图，R1和R2代表2次技术重复试验；
图26为实施例1、9中的组学分析重复性对比测试图，其中，(a)为蛋白质的重复性图，(b)为代谢物的重复性图；
图27为实施例1、9中的组学分析相关性对比测试图，其中，(a)为蛋白质的相关性图，(b)为代谢物的相关性图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
本发明以下实施例中的待测样品通过如下途径获得：
空腹血液样本来自深圳市人民医院，已遵循知情同意原则，由机构审查委员会审查并批准。血液收集通过静脉穿刺方式，抽取血液到以EDTA作为抗凝剂的收集管中。血液在4℃下以2000g离心10min，即获得血浆，保存在-80℃冰箱中，以备进一步的样品处理。
招募了一名健康志愿者和五名结肠癌患者。
实施例1
一种多组学分析的样品前处理方法，具体包括如下步骤：
(1)样品前处理装置的制备以及上样：
所述样品前处理装置的结构示意图如图1所示，其中，1为移液枪枪头，2为固相萃取膜，3为C18树脂，4为离子交换树脂；制备方法如下：在200μL移液枪枪头中依次装入3块C18膜(美国3M Empore)，0.5mg C18树脂颗粒(粒径20μm，德国Dr.Maisch GmbH)，2mg离子交换树脂颗粒(SCX/SAX的质量比为1:1的混合离子交换树脂，粒径均为20μm，美国AppliedBiosystems)，得到所述样品前处理装置；
分别用80μL甲醇和40μL浓度为10mM的碳酸氢铵溶液(pH＝7.4)对样品前处理装置内填装的材料进行洗涤、激活和平衡；待测样品的配制：将1μL血浆样品用20mM碳酸氢铵稀释至60μL；将50μL待测样品加入到预处理后的样品前处理装置上，离心2次，通过离心力驱动使待测样品上样，离心后，装置内完全干燥；
(2)将步骤(1)得到的样品用20μL异丙醇(IPA)洗脱2次，收集2次的洗脱液，即代谢组学分析样品；将其真空干燥后重新溶解于80％(v/v)甲醇水溶液中，用于质谱分析；
(3)将步骤(2)得到的洗脱后样品用40μL乙腈(ACN)进行清洗平衡，按照标准SISPROT步骤(具体实验方法参考文献进行，例如参考Chen W等，Simple and IntegratedSpintip-Based Technology Applied for Deep Proteome Profiling，AnalyticalChemistry，2016，88，4864-4871)进行酶解，得到的酶解多肽转移至固相萃取膜上，洗脱，收集洗脱液，得到蛋白质组学分析样品，用于质谱分析。
质谱检测的方法如下：
代谢组学分析样品和蛋白质组学分析样品的数据均使用Orbitrap质谱仪(QExactive，Thermo)和Easy-nLC 1000系统(Thermo)进行分析。其中，纳升液相色谱的色谱柱为装有1.9μm C18树脂(德国Maisch GmbH)的毛细管分析柱(100μm×20cm)；分离所用的流动相分别为：含0.1％(v/v)甲酸水溶液(A相)和含0.1％(v/v)甲酸的乙腈溶液(B相)，分离流速为250nL/min。
代谢组学分析时，进样量为2μL，代谢物的分离梯度总时长为60min，梯度设置为：0～1min 5％的B相；1～5min，5～43％的B相；5～48min，43～100％的B相；48～60min，100％的B相。
蛋白质组学分析时，多肽样品的分离梯度总时长为80min：0～2min，3～7％的B相；2～52min，7～22％的B相；52～62min，22～35％的B相；62～64min，35～90％的B相；然后64～70min，用90％的B相洗涤；70～80min，用5％的B相平衡。
在数据依赖的采集模式DDA下，质谱仪按以下参数运行：
代谢组学分析时，全扫描的扫描范围从80～1000m/z进行代谢组学分析，质谱分辨率均为70000；MS/MS扫描使用1.6Da的隔离窗口，以高能碰撞解离模式(higher energycollisional dissociation，HCD)对碎裂一级离子，阶梯碰撞能量分别为20、35、70用于代谢组分析，并相应设置动态排除分别为6s。
蛋白质组学分析时，全扫描的扫描范围从166.7～2500m/z进行蛋白质组学分析，质谱分辨率均为70000；MS/MS扫描使用1.6Da的隔离窗口，以HCD模式碎裂一级离子，归一化碰撞能量27，相应设置动态排除分别为40s。
质谱数据的分析方法如下：
蛋白质组学的质谱数据分析(DDA模式)：使用Proteome Discoverer(PD)软件(版本1.4，Thermo)中的Sequest HT算法，针对包含68485个蛋白(下载于2016年6月1日)的人类Uniprot FASTA数据库搜索数据原始文件。参数设置如下：前体离子和产物离子的质量误差分别设置为10ppm和0.6Da；胰蛋白酶消化最大漏切数量为2；半胱氨酸氨基甲酰甲基化为固定修饰；天冬酰胺、谷氨酰胺脱酰胺和甲硫氨酸氧化作为可变修饰。肽谱匹配(PSMs)的错误发现率(FDR)和鉴定结果设置为1％。
代谢组学的质谱数据分析：采用不同的分析方法来寻找脂质和小分子代谢物，具体为：使用LipidSearch软件v4.1.16(Thermo，CA)用于脂质的鉴定和定量。其中脂质组学的鉴定基于原始的MS/MS谱图，软件参数设置如下：母离子和碎片离子的质量的误差为8ppm和15ppm。为了识别小分子代谢物来进一步补充LipidSearch结果，采用了Proteowizard附带的MSconvertGUI工具将原始数据文件转换为mzML格式文件。通过使用有关血液代谢组学的全面分析的文献数据库来确定代谢物的结构，并以5ppm的母离子质量误差范围进行搜索。
实施例2
本实施例与实施例1的区别仅在于，样品前处理装置中离子交换树脂颗粒的填充量为1mg；样品前处理装置的其他组分、样品前处理方法、质谱检测方法和质谱数据的分析方法均与实施例1相同。
实施例3
本实施例与实施例1的区别仅在于，样品前处理装置中离子交换树脂颗粒的填充量为3mg；样品前处理装置的其他组分、样品前处理方法、质谱检测方法和质谱数据的分析方法均与实施例1相同。
实施例4
本实施例与实施例1的区别仅在于，样品前处理装置中C18树脂颗粒的填充量为0.25mg；样品前处理装置的其他组分、样品前处理方法、质谱检测方法和质谱数据的分析方法均与实施例1相同。
实施例5
本实施例与实施例1的区别仅在于，样品前处理装置中C18树脂颗粒的填充量为1mg；样品前处理装置的其他组分、样品前处理方法、质谱检测方法和质谱数据的分析方法均与实施例1相同。
实施例6
本实施例与实施例1的区别仅在于，将步骤(2)中的异丙醇用等量的乙腈(ACN)替换；样品前处理装置、样品前处理方法的其他步骤、质谱检测方法和质谱数据的分析方法均与实施例1相同。
测试例1
分别测试所述样品前处理装置中离子交换树脂和C18树脂的填充量对蛋白质组学和代谢组学的检测通量和灵敏度的影响，具体比较了实施例1～5中提供的样品前处理方法得到的蛋白质组学分析样品和代谢组学分析样品在纳升液相色谱-质谱分析中可以分离鉴定出的代谢物数目、蛋白质数目和肽谱匹配数目(PSM)。
图3为采用实施例1～3中提供的样品前处理方法得到的组学分析图，其中，(a)为蛋白质组学分析图，(b)为代谢组学分析图，R1和R2代表2次技术重复试验。从图3中可知，样品前处理装置中离子交换树脂的填充量增大，有利于蛋白质组学分析中获得更多的肽谱匹配数目，但会导致代谢物的分离鉴定数目减少。
图4为采用实施例1、4、5中提供的样品前处理方法得到的组学分析图，其中，(a)为蛋白质组学分析图，(b)为代谢组学分析图，R1和R2代表2次技术重复试验。从图4中可知，样品前处理装置中C18树脂的填充量增大，有利于提高代谢物的分离鉴定数目，但是会降低蛋白质肽谱匹配结果。
因此，实施例1提供的样品前处理方法中，所述样品前处理装置中含有0.5mg的C18树脂和2mg离子交换树脂进行组合，能够有效提高蛋白质组学分析和代谢组学分析的灵敏度，使蛋白质、代谢物的分离和鉴定种类以及和肽谱匹配结果达到较高的检测水平。
测试例2
对比测试了所述样品前处理方法中步骤(2)的有机溶剂种类对蛋白质组学和代谢组学的检测通量和灵敏度的影响，具体比较了实施例1和6中所述样品前处理方法得到蛋白质组学分析样品和代谢组学分析样品在纳升液相色谱-质谱分析中可以分离鉴定出的代谢物数目和蛋白质数目。
图5为采用实施例1和6中提供的样品前处理方法得到的组学分析图，其中，(a)为蛋白质组学分析图，(b)为代谢组学分析图，R1和R2代表2次技术重复试验。从图5中可知，与常规SISPROT操作中使用的乙腈(ACN)洗脱相比，异丙醇(IPA)洗脱鉴定出更多的代谢物。经过IPA洗脱，可以分离鉴定到170多种血浆蛋白质，且相比之前的洗脱方式可以获得具有可重复性的更多的肽谱匹配结果(PSM)。而且，本发明上述实验仅仅是采用常规使用的Q-Exactive质谱仪对2μg消化的肽的分析结果，就已经达到了常规量(大量)血浆样品检测达到的较高水平。由于蛋白质部分是通过静电相互作用被捕获到离子交换树脂上的，因此破坏疏水相互作用的性能温和的IPA洗脱不会影响被捕获的蛋白质。
测试例3
测试本发明所述样品前处理装置以及样品前处理方法对代谢组学的检测重复性，具体方法为：按照实施例1提供的样品前处理方法进行3次技术重复试验，得到的组学分析重复性测试图如图6～8所示。图6为代谢物鉴定数量的重复性图，R1、R2、R3代表3次技术重复试验；图7为重复试验的相关性结果图，其中，(a)为R1和R2的相关性，(b)为R2和R3的相关性，(c)为R1和R3的相关性。图8为代谢物中脂质分类的定量重复性结果图。结合图6～8可知，本发明提供的样品前处理方法对血浆样本的代谢组学分析具有较高的灵敏度和重复性，对于代谢物中的脂质和小分子代谢物均体现出高重复性，在3次技术重复试验中，R1和R2的相关性系数为0.94，R1和R3的相关性系数为0.93，R2和R3的相关性系数为0.9。
对比例1
一种代谢组学的质谱分析方法，具体步骤为：
将100μL血浆在冰水中融化，然后加入400μL乙腈，涡旋后将样品在4℃下以13000g离心10min。将上清液真空干燥，并溶于300μL 80％(v/v)甲醇水溶液中，得到代谢组学分析样品；
通过常规的质谱检测系统对上述代谢组学分析样品进行检测，具体为UHPLC系统(UltiMate 3000，Thermo)和Orbitrap质谱仪(Q Exactive)联用的质谱系统。使用AcquityBEH C8色谱柱(2.1×50mm，1.7μm，水)，并将其保持在50℃的柱温箱中。分离用缓冲液为含0.1％(v/v)甲醛(FA)的水溶液(A相)和含0.1％(v/v)FA的ACN溶液(B相)，分离流速为0.35nL/min。代谢物以30min的梯度分离，设置为：0～0.5min保持5％的B相；0.5～24min，5～100％的B相；24～28min，保持100％的B相；最后2min保持B相平衡。
分别测试了进样量为2μL和10μL时的代谢物鉴定数量，将其与实施例1中的代谢物鉴定数量进行对比，得到的代谢物鉴定数目对比图如图9所示，R1和R2代表2次技术重复试验。从图9中可知，与常规的代谢组学质谱分析方法相比，本发明提供的样品前处理方法以及检测方法能够鉴定出血浆样本中更多种类的脂质和小分子代谢物，证明其对于血浆样本的代谢组学分析具有更高的检测灵敏度。
实施例7
采用实施例1提供的样品前处理方法对5位结肠癌患者的1μL血浆样品的蛋白质组学和代谢组学分析，质谱检测的方法与实施例1中相同，均为DDA模式，得到的组学分析图如图8所示，从图10中可知，每位患者中都非常一致地鉴定出约160种蛋白质和120种代谢物，证明了该方法用于分析实际患者样品的可行性。
实施例8
本实施例与实施例7的区别仅在于，蛋白质组学分析样品的质谱采集模式不同，具体方法为：
通过多反应监测模式(Multiple Reaction Monitoring，MRM模式)补充蛋白质组学分析，使用质谱仪TSQ Vantage(Thermo Fisher)和高效液相色谱(UHPLC)组合进行质谱分析。液相色谱分离使用的常规色谱柱(2.1mm×200mm)，装有粒径为5μm的C18树脂，色谱柱温度设置为55℃。分离所用流动相分别是：含0.1％(v/v)甲醛水溶液(A相)和含0.1％(v/v)甲醛的乙腈溶液(B相)，分离流速为250nL/min。多肽样品的分离梯度总时长为30min：0～2min，3～7％的B相；2～14.5min，7～22％的B相；14.5～17min，22～35％的B相；17～19min，35～90％的B相；然后19～23min，用90％的B相洗涤；23～25min，90～3％的B相；25～30min，用3％的B相来平衡。在MRM模式下，质谱仪运行参数：归一化碰撞能量设置为28，引发值设置为1000，正离子喷雾电压设置为4000。本实施例中选择15个生物标记离子对。
MRM模式的质谱数据分析：通过设置已总结的15种结肠癌生物标记蛋白的离子对的质荷比信息等，直接采用Xcalibur软件提取选择性采集的子离子色谱峰，并计算峰面积和信噪比S/N(Signal to Noise)，同时记录色谱峰的保留时间。借助SRMatlas数据库搜索标记蛋白信息，选择不完全酶解位点数目为0，没有特殊修饰的肽段，子离子丰度较高的b/y离子。每种目标蛋白挑选了3个母离子，每个母离子又挑选了1～3个离子对。利用DAVID(6.8版)的基因本体生物学过程(gene ontology biological process，GOBP)对所鉴定的血浆蛋白进行功能注释。GO组p值阈值设为0.05。
图11为本实施例中采用MRM模式对结肠癌患者血浆中生物标志物的检测结果图，具体为每个标志物多肽及定碎片离子的累积峰面积；图12为本实施例中采用MRM模式对结肠癌患者血浆中生物标志物的峰面积检测结果图，具体为每个标志物多肽及定碎片离子在每个病人中的总峰面积。
综合实施例7和实施例8可知，本发明提供的样品前处理方法以及检测方法能够从5个结肠癌患者的1μL血浆样品的蛋白质组学和代谢组学分析，每个患者中都非常一致地鉴定出约160种蛋白质和120种代谢物，证明了该方法用于分析实际患者样品的可行性。其中鉴定到的一些蛋白质和代谢物类已报道与结肠癌相关。为了研究蛋白质与代谢物之间的关系，通过基因本体(Gene ontology)分析进一步的对所鉴定到的蛋白进行功能注释，并主要关注代谢相关的功能蛋白。结果发现大量蛋白与代谢物稳态相关，这与先前的报道一致，即血浆中存在大量反映代谢状态的蛋白质。图13为实施例7和8中与甘油三酯相关的四种GOBP分类结果图，与甘油三酯相关的四种GOBP分类，甘油三酯是本发明确定的主要代谢物之一。载脂蛋白家族成员是四种甘油三酯相关GOBP的主要组成部分(占所有注释蛋白质的85％)，包括APOA1、APOA2、APOA4、APOB、APOC1、APOC2、APOC3、APOC4、APOE和APOH。因此，收集上述10种载脂蛋白的PSM和实施例7和8中所鉴定的9种甘油三酯的峰面积(TG10:0/12:1/22:0，TG12:0p/11:0/11:0，TG 12:0p/8:0/14:0，TG 4:0/10:3/12:4，TG 12:0p/10:0/12:0，TG 19:0/10:3/24:0，TG 4:0/8:0/10:2，TG 8:0/8:0/10:0，TG 4:0/8:0/10:1)进行进一步分析，得到的载脂蛋白和甘油三酸酯表达的相关性结果图如图14所示，结果显示了载脂蛋白和甘油三酯之间的正相关，这与先前的报道一致。
图15为实施例7中的DDA模式和实施例8中MRM模式对于蛋白质组学分析的结果对比图，其中，(a)为实施例7中的DDA模式，(b)为实施例8中的MRM模式。
图16～24分别对应实施例8中MRM模式对9种标记蛋白APOA2、AFP、CEA、CNDP2、EGFR、FCGBP、HMGB1、LGALS4、MUC1的全色谱多肽分析图。
结合实施例7、8以及图15～24可知，由于血浆蛋白质组的表达量动态范围极宽，对于灵敏度有限的单次数据依赖型(Data Dependent Acquisition，DDA)的蛋白质组学采集模式，在血浆蛋白质组中的检测范围主要集中与浓度较高的区域，鉴定出的血浆蛋白质的浓度跨度约在六个数量级左右；为进一步扩展基于MS的集成多组学方法在实际临床应用中的实用性，本实施例采用基于多反应监测质谱采集模式(multiple reaction monitoring，MRM)的靶向蛋白质组学技术对9种已知癌症生物标记蛋白(APOA2，AFP，CEA，CNDP2，EGFR，FCGBP，HMGB1，LGALS4，MUC1)的20种肽段进行60种离子对的MRM分析(图16～24)，在微升LC-TSQ Vantage三重四极杆质谱仪上重新分析了5位患者样品。尽管此老一代三重四极杆质谱仪及其200μL/min流速限制了检测灵敏度，但通过MRM分析法仍可成功检测到它们，其中DDA和MRM方法都只能检测到APOA2(图15)。以上两种质谱采集方法都能检测到APOA2，采用MRM模式可以检测到的结肠癌临床使用的生物标记物CEA，且具有良好的信噪比。这对于准确定量至关重要。所有剩余的9种蛋白质丰度都非常低，涵盖了约10ng/mL～20μg/mL的理论浓度范围。这些结果表明，本发明提供的样品前处理方法和靶向质谱技术的组合可为临床重要的生物标志定量提供更高的灵敏度和更大的动态范围分析能力。
实施例9
本实施例与实施例1的区别仅在于，将步骤(1)中得到的上样后的样品在室温下放置24h后再进入步骤(2)；样品前处理装置、样品前处理方法的其他步骤、质谱检测方法和质谱数据的分析方法均与实施例1相同。
图25为通过实施例1和实施例9中的样品前处理方法得到的组学分析图，其中，(a)为蛋白质组学分析图，(b)为代谢组学分析图，R1和R2代表2次技术重复试验。
图26为通过实施例1和实施例9中的样品前处理方法得到的组学分析重复性测试图，其中，(a)为蛋白质的重复性图，(b)为代谢物的重复性图。
图27为通过实施例1和实施例9中的样品前处理方法得到的组学分析相关性测试图，其中，(a)为蛋白质的相关性，(b)为代谢物的相关性。
结合图25～27可知，在储存24小时前后，仍然大约可以识别200种蛋白质。在鉴定和定量方面均具有良好重现性表明在室温存储过程中蛋白质的降解可忽略不计。相应的，储存后鉴定出约160种代谢物，具有与新鲜制备相当的定性重现性。与在室温下储存的蛋白质相比，代谢物的含量在24小时储存期间容易发生较大的变化，平均峰面积相关性为0.7。但是，与同一代谢物样品的技术重复分析比较表明，大多数代谢物具较好的重现性。异常数据点属于某些类别的脂质，例如甘油单酸酯(monoglyceride，MG)，它们可能通过破坏不稳定的酯键而从甘油二酸酯(diglyceride，DG)和甘油三酸酯(triglyceride，TG)转化而来。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种多组学分析的样品前处理方法及其应用，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (29)

1.一种多组学分析的样品前处理方法，其特征在于，所述多组学分析包括蛋白质组学分析和代谢组学分析，所述样品前处理方法包括如下步骤：
(1)将待测样品加入到样品前处理装置上，离心进行上样，得到上样后的样品；所述样品前处理装置包括移液枪枪头，以及自下而上依次填充于所述移液枪枪头中的固相萃取膜、C18树脂和离子交换树脂；
(2)将步骤(1)得到的样品用有机溶剂进行洗脱，得到洗脱液和洗脱后样品；收集所述洗脱液，得到代谢组学分析样品；
(3)将步骤(2)得到的洗脱后样品进行酶解，得到的酶解多肽转移至固相萃取膜上，洗脱，收集洗脱液，得到蛋白质组学分析样品；
步骤(2)所述有机溶剂为异丙醇和/或乙腈；
所述固相萃取膜为C18膜；
所述离子交换树脂为强阳离子交换树脂和强阴离子交换树脂的混合物。
2.根据权利要求1所述的样品前处理方法，其特征在于，所述移液枪枪头的规格为200μL。
3.根据权利要求1所述的样品前处理方法，其特征在于，以所述移液枪枪头的规格为200μL计，所述C18树脂的填充量为0.25～1mg。
4.根据权利要求3所述的样品前处理方法，其特征在于，以所述移液枪枪头的规格为200μL计，所述C18树脂的填充量为0.5mg。
5.根据权利要求1所述的样品前处理方法，其特征在于，所述固相萃取膜的填充量为1～3个。
6.根据权利要求1所述的样品前处理方法，其特征在于，以所述移液枪枪头的规格为200μL计，所述离子交换树脂的填充量为1～3mg。
7.根据权利要求6所述的样品前处理方法，其特征在于，以所述移液枪枪头的规格为200μL计，所述离子交换树脂的填充量为2mg。
8.根据权利要求1所述的样品前处理方法，其特征在于，所述强阳离子交换树脂和强阴离子交换树脂的质量比为(10～1):(1～10)。
9.根据权利要求1所述的样品前处理方法，其特征在于，所述强阳离子交换树脂和强阴离子交换树脂的质量比为(5～1):(1～3)。
10.根据权利要求1所述的样品前处理方法，其特征在于，步骤(1)所述离心的次数为1～3次。
11.根据权利要求10所述的样品前处理方法，其特征在于，步骤(1)所述离心的次数为2次。
12.根据权利要求1所述的样品前处理方法，其特征在于，步骤(1)所述待测样品为血浆样品。
13.根据权利要求12所述的样品前处理方法，其特征在于，步骤(1)所述待测样品为稀释的血浆样品。
14.根据权利要求13所述的样品前处理方法，其特征在于，所述稀释的方法为：将1μL血浆用稀释剂稀释至50～70μL，得到所述待测样品。
15.根据权利要求14所述的样品前处理方法，其特征在于，所述稀释剂包括碳酸氢铵溶液。
16.根据权利要求1所述的样品前处理方法，其特征在于，步骤(1)所述待测样品的加入量为20～80μL。
17.根据权利要求16所述的样品前处理方法，其特征在于，步骤(1)所述待测样品的加入量为50μL。
18.根据权利要求1所述的样品前处理方法，其特征在于，步骤(1)所述样品前处理装置为经过预处理的样品前处理装置。
19.根据权利要求18所述的样品前处理方法，其特征在于，所述预处理的方法为：采用处理液对所述样品前处理装置中的填充物进行洗涤、激活和平衡。
20.根据权利要求19所述的样品前处理方法，其特征在于，所述处理液包括甲醇和/或碳酸氢铵溶液。
21.根据权利要求1所述的样品前处理方法，其特征在于，步骤(2)所述洗脱的次数为1～3次。
22.根据权利要求21所述的样品前处理方法，其特征在于，步骤(2)所述洗脱的次数为2次。
23.一种如权利要求1～22任一项所述的样品前处理方法得到的蛋白质组学分析样品和代谢组学分析样品在质谱检测中的应用。
24.一种多组学分析的检测方法，其特征在于，所述多组学分析包括蛋白质组学分析和代谢组学分析，所述检测方法包括：首先将待测样品通过如权利要求1～22任一项所述的样品前处理方法进行处理，得到代谢组学分析样品和蛋白质组学分析样品；然后将所述代谢组学分析样品和蛋白质组学分析样品分别进行质谱检测，得到代谢组学分析结果和蛋白质组学分析结果。
25.根据权利要求24所述的检测方法，其特征在于，所述代谢组学分析样品通过纳升液相色谱-质谱系统或常规液相色谱-质谱系统进行。
26.根据权利要求24所述的检测方法，其特征在于，所述蛋白质组学分析样品通过纳升液相色谱-质谱系统或高效液相色谱-质谱系统进行。
27.根据权利要求24所述的检测方法，其特征在于，所述蛋白质组学分析样品和代谢组学分析样品通过同一个质谱检测系统进行检测。
28.根据权利要求27所述的检测方法，其特征在于，所述质谱检测系统为纳升液相色谱-质谱系统。
29.根据权利要求24所述的检测方法，其特征在于，所述蛋白质组学分析样品在质谱检测中的数据采集模式包括数据依赖性模式或多反应监测模式。
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