CN103183616A - 一种从红腺忍冬叶制备绿原酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从红腺忍冬叶制备绿原酸的方法，该方法包括以下步骤：药材前处理、乙醇回流提取、浓缩、过滤、凝絮沉淀、树脂吸附分离、浓缩、绿原酸粗品、重结晶、制得绿原酸精品，本发明获得了从中药红腺忍冬叶中分离，纯化绿原酸的最佳工艺条件：用单因素和正交试验对红腺忍冬叶中绿原酸的分离，纯化工艺进行了最佳条件的筛选，采用正交表L9(34)，以乙醇体积、乙醇浓度、pH以及流速为因素，以绿原酸的紫外最大吸收波长320nm为指标进行试验。得到的红腺忍冬叶中大孔树脂分离纯化绿原酸的最佳洗脱工艺条件为：乙醇体积为20ml，乙醇浓度为20％，流速为80滴/min，pH为7，其提取率为1.43％，最佳上柱条件为：1g∶6ml固液比、乙醇pH为2、流速为40滴/min。
Description
技术领域
本发明属于绿原酸制备技术领域，尤其涉及一种从红腺忍冬叶制备绿原酸的方法。
背景技术
红腺忍冬花[1，2]是忍冬科植物红腺忍冬Lonicera hypoglauca Miq.的干燥花蕾或带初开的花，列在2005年版中国药典“山银花”项下，红腺忍冬资源丰富，主产于河南、山东、云南及广西等地，是山银花药材商品的主要来源之一。红腺忍冬为临床常用中药，其味甘、性寒，用于痈肿疗疮、喉痹、丹毒、热血毒痢、风热感冒、瘟病发热等症，属清热解毒之要药，山银花对多种致病菌均有抑制作用，是一种广谱抗菌中药，有“中药之中的青霉素”之美称。化学和药理研究证实[3，4]其主要化学成分有挥发油类、有机酸类、黄酮类和苷类，绿原酸是其主要有效成分，药理作用主要有抗菌、抗病毒、解热和抗氧化，其抗菌作用的主要活性成分为绿原酸，但品种与产地不同而不同，因此金银花山及山银花中绿原酸含量的高低，是其质量优劣的重要标志。
长期以来提取绿原酸以金银花为工业原料，但价格昂贵，对同属其它植物开发利用不够，尤其是对红腺忍冬植物叶的重视和研究程度不够，红腺忍冬各部位中都有一定的绿原酸，但含量高低不同，依次为花＞叶＞茎＞根，且叶中的绿原酸含量较高，是花的40左右％，大大超过了根茎，而忍冬叶的药源远比红腺忍 冬花丰富，采集容易，价格便宜，应该充分利用。因此研究红腺忍冬叶片绿原酸的提取，为充分利用红腺忍冬资源提供一定的理论和应用基础。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种从红腺忍冬叶制备绿原酸的方法，旨在解决长期以来提取绿原酸以金银花为工业原料，但价格昂贵，对同属其它植物开发利用不够，尤其是对红腺忍冬植物叶的重视和研究程度不够的问题。本发明实施例是这样实现的，一种从红腺忍冬叶制备绿原酸的方法，该方法包括以下步骤：药材前处理、乙醇回流提取、浓缩、过滤、凝絮沉淀、树脂吸附分离、浓缩、绿原酸粗品、重结晶、制的绿原酸精品。具体步骤为：
药材红腺忍冬叶片经60℃烘干，再粉碎过60目筛；称取10g红腺忍冬叶干粉置于园底烧瓶中，再加100ml、pH3、70％乙醇混合于磨口圆底烧瓶中加热提取，提取1.5小时，次数为2次，完成后，趁热抽滤，合并两次提取液，并使用旋转蒸发仪在75℃下进行浓缩，浓缩至2ml/1g药材；再用1％的醋酸溶液配成1％的壳聚糖胶体作为澄清剂，对前述浓缩液进行沉淀初步除杂；初步除杂后澄清液再上D101大孔树脂进行纯化，就上柱溶液量、上柱溶液pH值及上柱溶液吸附流速对绿原酸吸附效果的影响进行考察，确定最佳上柱吸附条件，最佳上柱吸附条件为：固液比-树脂1g∶6ml上柱溶液、乙醇pH为2、流速为40滴/min。经最佳上柱吸附条件吸附后，再就洗脱剂浓度、洗脱剂体积、洗脱剂pH值和洗脱流速对绿原酸洗脱效果的影响进行考察，确定最佳洗脱条件，最佳洗脱条件为：洗脱剂乙醇体积为20ml，乙醇浓度为20％，流速为80滴/min，pH为7；上述洗脱液乙醇相使用旋转蒸发仪在75℃下进行浓缩，再在真空干燥箱中真空干燥，干燥物以pH3的60℃热水溶解再泠却到室温，溶解液与乙酸乙酯用量比1∶2萃取，水相用乙酸乙酯萃取3-5次，乙酸乙酯相浓缩干燥得绿原酸粗品；绿原酸 粗品再用pH值3的适量甲醇溶解，再放在4℃下结晶，得到白色针状晶体，真空干燥；再进行薄层分析，以乙酸乙酯∶甲酸∶水＝10∶1∶2为展开剂展开，以1％三氯化铁乙醇溶液为显色剂，在与对照品色谱相应的位置上显相同颜色斑点，阴性对照无此斑点。
进一步，该方法进一步包括绿原酸含量测定方法，具体步骤为：
步骤1，标准样溶液的制备
精密称取绿原酸对照品1mg，置50mL量瓶中，加无水乙醇，使其完全溶解并稀释至刻度。摇匀，即得，每1mL中含绿原酸20ug；
步骤2，最大吸收波长的确定
将绿原酸标准样溶液在200～400nnl进行紫外扫描，最大吸收波长为328nm，故选328nm为检测波长；
步骤3，标准曲线的绘制
精密量取对照品溶液1、2、4、6、8mL，分别用无水乙醇定容至10mL容量瓶，摇匀。以无水乙醇作参比液，在328nm处测定其吸光度，以标准品质量浓度C(ug/mL)为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。
进一步，绿原酸的醇提方法为：
将10g药材与100ml的pH3，70％乙醇混合于磨口圆底烧瓶中加热提取，提取1.5小时，次数为2次；
完成后，趁热抽滤，并使用旋转蒸发仪在75度下进行浓缩，浓缩至2ml/1g药材，比色定量分析检测提取液绿原酸含量，以验证与薄层分析结果差异。
进一步，绿原酸的初步除杂方法为：
步骤1，壳聚糖的配制：
用1％的醋酸溶液配成1％的壳聚糖胶体作为澄清剂；
步骤2，对滤液澄清效果的考察：
每100ml浓缩液中加入1％壳聚糖溶液8ml，搅拌，在60℃静置60min，过滤，检测除杂效果，肉眼看各处理组过滤液澄清效果、薄层分析比较大极性杂质即绿原酸斑点下方杂质斑点大小及绿原酸斑点大小，同时比色定量分析检测各处理绿原酸含量，以验证与薄层分析结果差异。
进一步，该方法进一步包括上柱条件的优化试验方法：
步骤1，树脂溶液处理量的确定方法
5g经预处理的D101大孔树脂分别加入四根层析柱，每根加5g树脂，5、10、15、20ml上述壳聚糖脱色液分别上柱，60滴/分钟反复动态吸附4次，定量分析每根柱的流出液绿原酸含量，确定树脂最大吸附量；
步骤2，提取液pH值对吸附效果的影响
上述活性炭脱色液分别调pH值2、3、4、5，按最佳上样量上样，分别上柱吸附，60滴/分钟吸附，操作按上述处理，最后定量分析每根柱的流出液绿原酸含量，算出各个水平吸附率大小，分析pH值对树脂吸附绿原酸量的影响；
步骤3，流速对吸附效果的影响
按上述最佳上样量及pH值，以40、60、80、100滴/分钟流速吸附，从生产成本和生产效益等方面考虑，确定最佳上柱吸附流速。
进一步，该方法进一步包括洗脱条件的选择方法：
步骤1，洗脱剂浓度的确定
分别用pH8、20ml的10、20、40、60％乙醇以60滴/分钟的流速进行洗脱看其洗脱效果，洗脱液比色定量分析绿原酸含量，干燥后称取提取物干重。看不同浓度的乙醇洗脱对绿原酸纯度的影响，选择最佳洗脱剂；
步骤2，洗脱液体积
绿原酸洗脱率随洗脱体积增加而不断增大，分别用最佳pH值、15、20、30、40ml最佳浓度乙醇以最佳流速进行洗脱看其洗脱效果，洗脱液比色定量分析绿原酸含量，干燥后称取提取物干重。看不同流速对绿原酸纯度的影响，选择洗脱最佳洗脱体积，从解吸率来看解吸最佳洗脱体积。
步骤3，洗脱剂pH值
分别用PH6、7、8、9的20ml最佳浓度乙醇以60滴/分钟的流速进行洗脱看其洗脱效果，洗脱液比色定量分析绿原酸含量，干燥后称取提取物干重。看不同PH值的乙醇洗脱对绿原酸纯度的影响，选择洗脱剂最佳pH值，从洗脱率来看洗脱最佳pH值；
步骤4，洗脱液流速
分别用最佳pH值的20ml最佳浓度乙醇以40、60、80、100滴/分钟的流速进行洗脱看其洗脱效果，洗脱液比色定量分析绿原酸含量，干燥后称取提取物干重；看不同流速对绿原酸纯度的影响，选择洗脱最佳流速，从洗脱率来看最佳洗脱流速。
进一步，该方法进一步包括样品含量的测定及相关计算方法：
绿原酸得率(％)＝(C×V/W0)×10-6×10-3
绿原酸纯度(％)＝(C×V/W1)×10-6×10-3
式中，C为根据回归方程计算所得的绿原酸浓度(ug/ml)；V为提取液体积 (ml)；W0为红腺忍冬叶干重(g)W1为提取物干重(g)。
树脂洗脱率公式为：B(100％)＝C1V1/[(C0-C2]×100％
B为洗脱率；C0为原液中绿原酸浓度(mg/ml)；C2为吸附平衡后滤液中绿原酸浓度(mg/ml)；V为吸附原液体积(ml)；B为洗脱率；C1为洗脱液中绿原酸浓度(mg/ml)；V1为洗脱液体积(ml)。
进一步，该方法进一步包括绿原酸的纯化方法：
步骤1，乙酸乙酯纯化
上述乙醇相干燥物以PH3的60℃热水溶解再泠却到室温，溶解液与乙酸乙酯用量比1∶2萃取，水相用乙酸乙酯萃取3-5次。
步骤2，结晶纯化
经乙酸乙酯相浓缩干燥得绿原酸粗品，用pH值3的甲醇溶解，再放在4℃下结晶，得到白色针状晶体，真空干燥。
进一步，该方法进一步包括绿原酸的薄层分析方法：
用毛细管分别取待测溶液和对照品溶液各5uL，点于距硅胶薄层板下边缘2cm的位置，点样斑点的直径为1～2mm。以乙酸乙酯∶甲酸∶水＝10∶1∶2为展开剂展开；
待展开8cm时，自然晾干，喷以1％三氯化铁乙醇溶液，在120℃加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上显相同颜色斑点，阴性对照无此斑点。
进一步，红腺忍冬叶中大孔树脂分离纯化绿原酸的最佳洗脱工艺条件为：乙醇体积为20ml，乙醇浓度为20％，流速为80滴/min，pH为7，其提取率为1.43％，最佳上柱条件为：1g∶6ml固液比、乙醇pH为2、流速为40滴/min。
本发明获的了从中药红腺忍冬叶中分离，纯化绿原酸的最佳工艺条件：用单因素和正交试验对红腺忍冬叶中绿原酸的分离，纯化工艺进行了最佳条件的筛选，采用正交表L9(34)，以乙醇体积、乙醇浓度、pH以及流速的浓度为因素，以绿原酸的紫外最大吸收波长320nm为指标进行试验。得到的红腺忍冬叶中大孔树脂分离纯化绿原酸的最佳洗脱工艺条件为：乙醇体积为20ml，乙醇浓度为20％，流速为80滴/min，pH为7，其提取率为1.43％，最佳上柱条件为：1g∶6ml固液比、乙醇pH为2、流速为40滴/min。
附图说明
图1是本发明实施例提供的从红腺忍冬叶制备绿原酸的方法的流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
1.1红腺忍冬花[1，2]是忍冬科植物红腺忍冬Lonicera hypoglauca Miq.的干燥花蕾或带初开的花，列在2005年版中国药典“山银花”项下，红腺忍冬资源丰富，主产于河南、山东、云南及广西等地，是山银花药材商品的主要来源之一。红腺忍冬为临床常用中药，其味甘、性寒，用于痈肿疗疮、喉痹、丹毒、热血毒痢、风热感冒、瘟病发热等症，属清热解毒之要药，山银花对多种致病菌均有抑制作用，是一种广谱抗菌中药，有“中药之中的青霉素”之美称。化学和药理研究证实[3，4]其主要化学成分有挥发油类、有机酸类、黄酮类和苷类，绿原酸是其主要有效成分，药理作用主要有抗菌、抗病毒、解热和抗氧化，其抗菌作用的主要活性成分为绿原酸，但品种与产地不同而不同，因此金银花山及山银花中 绿原酸含量的高低，是其质量优劣的重要标志。
长期以来提取绿原酸以金银花为工业原料，但价格昂贵，对同属其它植物开发利用不够，尤其是对红腺忍冬植物叶的重视和研究程度不够，红腺忍冬各部位中都有一定的绿原酸，但含量高低不同，依次为花＞叶＞茎＞根，且叶中的绿原酸含量较高，是花的40左右％，大大超过了根茎，而忍冬叶的药源远比红腺忍冬花丰富，采集容易，价格便宜，应该充分利用。因此研究红腺忍冬叶片绿原酸的提取，为充分利用红腺忍冬资源提供一定的理论和应用基础。
红腺忍冬的成分中含有挥发油、黄酮类、有机酸类等。其中红腺忍冬的有机酸主要以绿原酸类化合物为主。绿原酸类包括绿原酸、异绿原酸、咖啡酸等 [5]。
绿原酸(chlorogenic acid，CGA)又名咖啡鞣酸，是由咖啡酸(caffeic acid)与奎尼酸(quinic acid)形成的缩酚酸，属多酚类化合物，是植物在有氧呼吸过程中经磷酸戊糖途径(HMS)的中间产物合成的一种苯丙素类物质[6]。
1.2绿原酸的化学结构及理化性质
绿原酸的分子式为C16H18O9，相对分子量是354.30，熔点是208℃。其结构式如下：
绿原酸的化学结构式
绿原酸半水合物为白色或微黄色针状结晶，其分子结构中有酯键、不饱和双键及多元酚三个不稳定部分。由于其结构的不稳定，在分离过程中，绿原酸会发生水解和分子内酯基迁移而导致异构化[7]。因此可利用甲醇、乙醇等极性溶剂将绿原酸从植物中提取出来，但其结构的不稳定性，故不可过长时间的加热，否则绿原酸将容易氧化成醌类[8]。
1.3绿原酸的药理作用[9]
1.3.1抗氧化、抗衰老作用
研究表明，绿原酸是一种有效的酸性抗氧化剂，在某些食品中可取代或部分取代目前常用的人工合成抗氧化剂。绿原酸及其衍生物具有明显的抗自由基效果，在防止衰老、促进代谢等方面有着重要作用。
1.3.2抗癌作用
国内外实验表明，绿原酸对于某些癌征的发生具有预防及抑制作用，被认为是癌症的有效防护剂。
1.3.3食品保鲜作用
绿原酸具有增香和护色作用，可用于食品和果品保鲜。绿原酸用于果汁保鲜，可有效防止饮料和食品的腐败变质。
1.3.4抗紫外线和抗辐射作用
据国外学者研究，以绿原酸为代表的天然多酚物质，具有保护胶原蛋白不受活性氧等自由基伤害的能力，并能有效防止紫外线对人体皮肤产生伤害作用。目前，有许多化妆品加入绿原酸用于防紫外线，防皮肤衰老等方面。
1.3.5其他作用
据研究表示，绿原酸具有抗菌、抗病毒、利胆、保肝、降压、兴奋中枢神经系统等作用，并且可以增加肠胃蠕动能力，并能促进胃液分泌及胆汁分泌等。绿原酸在医药、卫生、食品、保健等领域都具有很大的应用价值，因此加快对绿原酸的研究开发具有非常重要的意义。
2材料与方法
2.1实验材料
红腺忍冬叶，买于长沙市高桥大市场，经过干燥粉碎处理。
2.2实验器材
98-II-B磁力搅拌电热套(天津市泰斯特仪器有限公司)；KQ2200型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；HH数显恒温水浴锅(金坛市金城国胜实验仪器厂)；WFJ 7200型可见分光光度计(尤尼柯(上海)仪器有限公司)；AY220电子天平(SHIMADZU CORPORATION JAPAN)；植物粉碎机、药物筛、紫外/可见分光光度计、烘箱、电炉、回流冷凝装置、500mL磨口圆底烧瓶、研钵、50、10mL容量瓶、刻度吸管、三角瓶等。。
2.3实验试剂
乙醇(均为分析醇、95％的工业乙醇)，NaOH，HCL，三氯化铁，乙酸乙酯，甲醇，氨水，薄层硅胶G，壳聚糖，0.2％羟甲基纤维钠水溶液，D101大孔树脂。
2.4实验步骤
该方法包括以下步骤：药材前处理、乙醇回流提取、浓缩、过滤、凝絮沉淀、树脂吸附分离、浓缩、绿原酸粗品、重结晶、制的绿原酸精品。具体步骤为：药材红腺忍冬叶片经60℃烘干，再粉碎过60目筛；称取10g红腺忍冬叶干粉置于园底烧瓶中，再加100ml、pH3、70％乙醇混合于磨口圆底烧瓶中加热提取，提取1.5小时，次数为2次，完成后，趁热抽滤，合并两次提取液，并使用旋转蒸发仪在75℃下进行浓缩，浓缩至2ml/1g药材；再用1％的醋酸溶液配成1％的壳聚糖胶体作为澄清剂，对前述浓缩液进行沉淀初步除杂；初步除杂后澄清液再上D101大孔树脂进行纯化，就上柱溶液量、上柱溶液pH值及上柱溶液吸附流速对绿原酸吸附效果的影响进行考察，确定最佳上柱吸附条件，最佳上柱吸附条件为：固液比-树脂1g∶6ml上柱溶液、乙醇pH为2、流速为40滴/min。经最佳上柱吸附条件吸附后，再就洗脱剂浓度、洗脱剂体积、洗脱剂pH值和洗脱流速对绿原酸洗脱效果的影响进行考察，确定最佳洗脱条件，最佳洗脱条件为：洗脱剂乙醇体积为20ml，乙醇浓度为20％，流速为80滴/min，pH为7；上述洗脱液乙醇相使用旋转蒸发仪在75℃下进行浓缩，再在真空干燥箱中真空干燥，干燥物以pH3的60℃热水溶解再泠却到室温，溶解液与乙酸乙酯用量比1∶2 萃取，水相用乙酸乙酯萃取3-5次，乙酸乙酯相浓缩干燥得绿原酸粗品；绿原酸粗品再用pH值3的适量甲醇溶解，再放在4℃下结晶，得到白色针状晶体，真空干燥；再进行薄层分析，以乙酸乙酯∶甲酸∶水＝10∶1∶2为展开剂展开，以1％三氯化铁乙醇溶液为显色剂，在与对照品色谱相应的位置上显相同颜色斑点，阴性对照无此斑点。
3实验方法
3.1.绿原酸含量测定方法
3.1.1标准样溶液的制备
精密称取绿原酸对照品1mg，置50mL量瓶中，加无水乙醇，使其完全溶解并稀释至刻度。摇匀，即得(每1mL中含绿原酸20ug)。
3.1.2最大吸收波长的确定
将绿原酸标准样溶液在200～400nnl进行紫外扫描，最大吸收波长为328nm，故选328nm为检测波长。
3.1.3标准曲线的绘制
精密量取对照品溶液1、2、4、6、8mL，分别用无水乙醇定容至10mL容量瓶，摇匀。以无水乙醇作参比液，在328nm处测定其吸光度，以标准品质量浓度C(ug/mL)为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。
3.2绿原酸的醇提
将10g药材与100ml的pH3，70％乙醇混合于磨口圆底烧瓶中加热提取，提取1.5小时，次数为2次。完成后，趁热抽滤，并使用旋转蒸发仪在75度下进行浓缩，浓缩至2ml/1g药材，比色定量分析检测提取液绿原酸含量，以验证与薄层分析结果差异。
3.3绿原酸的初步除杂
壳聚糖(chnosan)学名聚脱乙酰氨基葡萄糖，是一种高分子多糖，是自然界唯一带阳离子的天然活性多糖，具有良好的水溶性、吸附性、抑菌作用，可对绿原酸原液进行第一步除杂。
3.3.1壳聚糖的配制
用1％的醋酸溶液配成1％的壳聚糖胶体作为澄清剂。
3.3.2对滤液澄清效果的考察
每100ml浓缩液中加入1％壳聚糖溶液8ml，搅拌，在60℃静置60min，过滤，检测除杂效果，肉眼看各处理组过滤液澄清效果、薄层分析比较大极性杂质即绿原酸斑点下方杂质斑点大小及绿原酸斑点大小(看绿原酸损失率)，同时比色定量分析检测各处理绿原酸含量，以验证与薄层分析结果差异。
3.4上柱条件的优化试验[16]
3.4.1树脂溶液处理量的确定。
5g经预处理的D101大孔树脂分别加入四根层析柱(每根加5g树脂)，5、10、15、20ml上述壳聚糖脱色液分别上柱(上述四根柱)，60滴/分钟反复动态吸附4次，定量分析每根柱的流出液绿原酸含量，确定树脂最大吸附量。
3.4.2提取液pH值对吸附效果的影响
上述活性炭脱色液分别调pH值2、3、4、5，按最佳上样量上样，分别上柱吸附，60滴/分钟吸附，操作按上述处理，最后定量分析每根柱的流出液绿原酸含量，算出各个水平吸附率大小，分析pH值对树脂吸附绿原酸量的影响。
3.4.3流速对吸附效果的影响
按上述最佳上样量及pH值，以40、60、80、100滴/分钟流速吸附，从生产成本和生产效益等方面考虑，确定最佳上柱吸附流速，。
3.5洗脱条件的选择
3.5.1洗脱剂浓度
分别用pH8、20ml的10、20、40、60％乙醇以60滴/分钟的流速进行洗脱看其洗脱效果，洗脱液比色定量分析绿原酸含量，干燥后称取提取物干重。看不同浓度的乙醇洗脱对绿原酸纯度的影响，选择最佳洗脱剂(能最大程度洗脱绿原酸)。
3.5.2洗脱液体积
绿原酸洗脱率随洗脱体积增加而不断增大，分别用最佳pH值、15、20、30、40ml最佳浓度乙醇以最佳流速进行洗脱看其洗脱效果，洗脱液比色定量分析绿原酸含量，干燥后称取提取物干重。看不同流速对绿原酸纯度的影响，选择洗脱最佳洗脱体积，从解吸率来看解吸最佳洗脱体积。
3.5.3洗脱剂pH值
分别用PH6、7、8、9的20ml最佳浓度乙醇以60滴/分钟的流速进行洗脱看其洗脱效果，洗脱液比色定量分析绿原酸含量，干燥后称取提取物干重。看不同PH值的乙醇洗脱对绿原酸纯度的影响，选择洗脱剂最佳pH值(洗脱解吸效果最好、能最大程度洗脱绿原酸)，从洗脱率来看洗脱最佳pH值。
3.5.4洗脱液流速
分别用最佳pH值的20ml最佳浓度乙醇以40、60、80、100滴/分钟的流速进行洗脱看其洗脱效果，洗脱液比色定量分析绿原酸含量，干燥后称取提取物干重。看不同流速对绿原酸纯度的影响，选择洗脱最佳流速(洗脱效果最好、能最大程度洗脱绿原酸)，从洗脱率来看最佳洗脱流速。
3.6大孔树脂洗脱绿原酸的正交试验
依据单因素可了解分离绿原酸效果的情况，选择洗脱剂浓度、洗脱液体积、洗脱剂pH值、洗脱液流速4个主要因素，进行正交试验(4因数3水平)，由此得到洗脱绿原酸的最佳条件。
3.7样品含量的测定及相关计算
绿原酸得率(％)＝(C×V/W0)×10-6×10-3
绿原酸纯度(％)＝(C×V/W1)×10-6×10-3
式中，C为根据回归方程计算所得的绿原酸浓度(ug/ml)；V为提取液体积(ml)；W0为红腺忍冬叶干重(g)W1为提取物干重(g)。
树脂洗脱率公式为：B(100％)＝C1V1/[(C0-C2]×100％
B为洗脱率；C0为原液中绿原酸浓度(mg/ml)；C2为吸附平衡后滤液中绿 原酸浓度(mg/ml)；V为吸附原液体积(ml)；B为洗脱率；C1为洗脱液中绿原酸浓度(mg/ml)；V1为洗脱液体积(ml)。
3.8绿原酸的纯化
3.8.1乙酸乙酯纯化
上述乙醇相干燥物以PH3的60℃热水溶解再泠却到室温，溶解液与乙酸乙酯用量比1∶2萃取，水相用乙酸乙酯萃取3-5次。
3.8.2结晶纯化
经乙酸乙酯相浓缩干燥得绿原酸粗品，用pH值3的甲醇溶解，再放在4℃下结晶，得到白色针状晶体，真空干燥。
3.9绿原酸的薄层分析研究
用毛细管分别取待测溶液和对照品溶液各5uL，点于距硅胶薄层板下边缘2cm的位置，点样斑点的直径为1～2mm。以乙酸乙酯∶甲酸∶水(10∶1∶2)为展开剂展开。待展开8cm时，自然晾干，喷以1％三氯化铁乙醇溶液，，在120℃加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上显相同颜色斑点，阴性对照无此斑点。
4实验结果与分析
4.1标准曲线的绘制
以绿原酸样品的浓度为横坐标，以在328nm下测得不同浓度的标准品的吸光值为纵坐标，做标准曲线，得到回归方程为：Y＝0.0423x+0.118，r＝0.9974。结果表明，绿原酸在2-16μg/mL范围内线性关系良好。
4.2绿原酸的醇提效果分析
经过醇提，并浓缩过滤后，做薄层分析，对照品仅有一个斑点，而供试品中与对照品同一水平的斑点也有个，阴性对照品则无此斑点，说明此点为绿原酸斑点。供试品中绿原酸斑点上下都有其他斑点，则说明供试品中有大量的杂 质，经过分光光度计测得其吸光度为0.427，通过回归曲线算得，其绿原酸得率为1.46％。
4.3絮凝沉淀的效果
在已浓缩好的绿原酸粗液中加入1％的壳聚糖溶液，静置1h可看到绿原酸粗品液的颜色明显变浅，并伴有少量沉淀产生。通过比色分析，我们可以发现供试品下方的斑点减小了一部分，说明壳聚糖可将样品中的极性粗粒子沉淀，使绿原酸原液中的杂质减少了一部分，但同时供试品中的绿原酸斑点颜色减弱几分，说明壳聚糖有可能会使小部分绿原酸流失。经分光光度计测得吸光度为0.403，通过回归方程得绿原酸得率为1.35％
4.4上柱条件的优化实验结果
4.4.1树脂溶液处理量的确定
从下表可得知，提取液的体积超过30ml后，流出液的的率变化不大，从生产成本上考虑，因此可得出5g树脂最多可处理30ml的提取液为最佳上柱条件。
表4.1树脂溶液处理量旳实验结果
| 1 | 2 | 3 | 4 | |
| 体积/ml | 10 | 20 | 30 | 40 |
| 绿原酸得率％ | 0.91 | 1.06 | 1.09 | 1.08 |
4.4.2乙醇pH值对绿原酸得率的影响
从下表可得知在乙醇ph为2时，绿原酸的得率最大，并且pH越高绿原酸得率越小，因此可判定提取液ph＝2为上柱的最佳条件。
表4.2pH对绿原酸得率影响的实验结果
| 1 | 2 | 3 | 4 | |
| pH | 2 | 3 | 4 | 5 |
[0147]
| 绿原酸得率％ | 1.12 | 1.09 | 1.03 | 0.94 |
4.4.3流速对绿原酸得率的影响
从下表可得知，当流速为40-80滴每分钟时，绿原酸得率变化不大，100滴/min时大幅下降，从生产实际中出发，流速越慢，其得率越高，但生产周期长，因此可判定流速为60滴每分钟为最佳上柱条件。
表4.3流速对绿原酸得率影响的实验结果
4.5洗脱条件的选择结果
4.5.1洗脱剂浓度
由下表可知，在乙醇浓度为20％时，其洗脱效果最佳。
表4.4洗脱剂乙醇浓度实验结果
| 乙醇浓度 | 10 | 20 | 40 | 60 |
| 绿原酸纯度 | 22.1％ | 25.2％ | 19.8％ | 7.1％ |
| 提取物干重 | 0.493g | 0.494g | 0.499g | 0.511g |
| 洗脱率 | 45.6％ | 55.3％ | 59.5％ | 62.5％ |
4.5.2洗脱液体积
表4.5洗脱剂体积实验结果
| 1 | 2 | 3 | 4 | |
| 乙醇体积 | 15 | 20 | 30 | 40 |
[0160]
| 洗脱率 | 44.5 | 49.3 | 68.4 | 69.5 |
由表可以比较得出，当乙醇体积为30ml时，洗脱率达到一个最大值，因此洗脱剂体积为30ml，差不多能将绿原酸洗脱下来，因此选择30ml乙醇为最佳洗脱剂体积。
4.5.3洗脱剂pH值
表4.6洗脱剂pH实验结果
| 1 | 2 | 3 | 4 | |
| pH | 6 | 7 | 8 | 9 |
| 洗脱率 | 58.1％ | 65.8％ | 65.1％ | 60.7％ |
由表可以知pH为7时，洗脱率达到一个最大值，因此洗脱剂pH为7，差不多能将绿原酸洗脱来，因此选择pH＝7的乙醇为最佳洗脱pH值。
4.5.4洗脱液流速
表4.7洗脱液流速实验结果
| 1 | 2 | 3 | 4 | |
| 滴/min | 40 | 60 | 80 | 100 |
| 洗脱率％ | 63.3 | 61.6 | 57 | 44.5 |
从上表中可知，当流速越快其洗脱率越低，流速越慢其洗脱率越高。从生产实际中出发，流速越慢，生产周期越长，流速越快，又会浪费洗脱剂，增加生产成本。因此综合考虑，选择流速为40滴/min为最佳条件。
4.6大孔树脂洗脱绿原酸的正交试验
依据上述单因数实验结果，以1g∶6ml固液比、乙醇pH为2、流速为40滴/min为最佳上柱条件，选取乙醇浓度、乙醇体积、乙醇pH和洗脱流速4个因素来进行正交试验(4因数3水平)，根据绿原酸含量进行考察，获取最佳分离条件。
表4.8因数水平表
表4.9绿原酸洗脱正交实验表
表4.10实验方差分析表
由表4-8直观分析可得：因素影响的显著性依次为C＞B＞D＞A，即流速对绿原酸的分离效果的影响最大，最佳方案为C3B2D2A2，但是因为没有在表4.7中出现，因此对其进行验证，经过实验结果得到的绿原酸纯度为45.9％，均高于表中数据，故认为为最佳方案，即流速为80滴/min，pH为7，体积为20ml，乙醇浓度为20％。
综合各种因素，以最佳实验方案对绿原酸进行四次分离纯化实验，结果如下
表4.11最佳方案数据分析表
| 1 | 2 | 3 | 4 | |
| 绿原酸得率％ | 1.45 | 1.34 | 1.42 | 1.49 |
| 绿原酸纯度％ | 46.6 | 44.9 | 45.8 | 46.1 |
| 提取物干重/g | 0.31 | 0.30 | 0.31 | 0.32 |
平均四次实验数据，得知红腺忍冬叶的平均提取率为1.425％，经树脂纯化绿原酸的平均纯度为45.85％，其数值高于正交实验组的各个数值。
4.7绿原酸的重结晶纯化
绿原酸干燥物以PH3的60℃热水溶解再泠却到室温，溶解液与乙酸乙酯用量比1∶2萃取，水相用乙酸乙酯萃取3-5次。经乙酸乙酯相浓缩干燥得绿原酸粗品，用pH值3的甲醇溶解，再放在4℃下结晶，得到白色针状晶体，真空干燥。对其进行薄层分析。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种从红腺忍冬叶制备绿原酸的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：药材前处理、乙醇回流提取、过滤、浓缩、凝絮沉淀、树脂吸附分离、浓缩、绿原酸粗品、重结晶、制得绿原酸精品，具体步骤为：
药材红腺忍冬叶片烘干，再粉碎过60目筛；称取红腺忍冬叶干粉置于园底烧瓶中，再加乙醇混合于磨口圆底烧瓶中加热提取，完成后，趁热抽滤，合并两次提取液，并使用旋转蒸发仪进行浓缩，浓缩至2ml/1g药材；再用醋酸溶液配成壳聚糖胶体作为澄清剂，对浓缩液进行沉淀初步除杂；初步除杂后澄清液再上D101大孔树脂进行纯化，就上柱溶液量、上柱溶液pH值及上柱溶液吸附流速对绿原酸吸附效果的影响进行考察，确定最佳上柱吸附条件，最佳上柱吸附条件为：固液比-树脂1g∶6ml上柱溶液、乙醇pH为2、流速为40滴/min；经最佳上柱吸附条件吸附后，再就洗脱剂浓度、洗脱剂体积、洗脱剂pH值和洗脱流速对绿原酸洗脱效果的影响进行考察，确定洗脱条件；上述洗脱液乙醇相使用旋转蒸发仪进行浓缩，再在真空干燥箱中真空干燥，干燥物以热水溶解再泠却到室温，溶解液与乙酸乙酯用量比1∶2萃取，水相用乙酸乙酯萃取3-5次，乙酸乙酯相浓缩干燥得绿原酸粗品；绿原酸粗品再用甲醇溶解，再结晶，得到白色针状晶体，真空干燥；再进行薄层分析，以乙酸乙酯∶甲酸∶水＝10∶1∶2为展开剂展开，以三氯化铁乙醇溶液为显色剂，在与对照品色谱相应的位置上显相同颜色斑点，阴性对照无此斑点。
2.如权利要求1所述的从红腺忍冬叶制备绿原酸的方法，其特征在于，该方法进一步包括绿原酸含量测定方法，具体步骤为：
步骤1，标准样溶液的制备
精密称取绿原酸对照品1mg，置50mL量瓶中，加无水乙醇，使其完全溶解并稀释至刻度。摇匀，即得，每1mL中含绿原酸20ug；
步骤2，最大吸收波长的确定
将绿原酸标准样溶液在200～400nnl进行紫外扫描，最大吸收波长为328nm，故选328m为检测波长；
步骤3，标准曲线的绘制
精密量取对照品溶液1、2、4、6、8mL，分别用无水乙醇定容至10mL容量瓶，摇匀。以无水乙醇作参比液，在328nm处测定其吸光度，以标准品质量浓度C(ug/mL)为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。
3.如权利要求1所述的从红腺忍冬叶制备绿原酸的方法，其特征在于，绿原酸的醇提方法为：
将10g药材与100ml的pH3，70％乙醇混合于磨口圆底烧瓶中加热提取，提取1.5小时，次数为2次；
完成后，趁热抽滤，并使用旋转蒸发仪在75度下进行浓缩，浓缩至2ml/1g药材，比色定量分析检测提取液绿原酸含量，以验证与薄层分析结果差异。
4.如权利要求1所述的从红腺忍冬叶制备绿原酸的方法，其特征在于，绿原酸的初步除杂方法为：
步骤1，壳聚糖的配制：
用1％的醋酸溶液配成1％的壳聚糖胶体作为澄清剂；
步骤2，对滤液澄清效果的考察：
100ml浓缩液中加入1％壳聚糖溶液8ml，搅拌，在60℃静置60min，过滤，检测除杂效果，肉眼看各处理组过滤液澄清效果、薄层分析比较大极性杂质即绿原酸斑点下方杂质斑点大小及绿原酸斑点大小，同时比色定量分析检测各处理绿原酸含量，以验证与薄层分析结果差异。
5.如权利要求1所述的从红腺忍冬叶制备绿原酸的方法，其特征在于，该方法进一步包括上柱条件的优化试验方法：
步骤1，树脂溶液处理量的确定方法
5g经预处理的D101大孔树脂分别加入四根层析柱，每根加5g树脂，5、10、15、20ml上述壳聚糖澄清液分别上柱，60滴/分钟反复动态吸附4次，定量分析每根柱的流出液绿原酸含量，确定树脂最大吸附量；
步骤2，提取液pH值对吸附效果的影响
上述壳聚糖澄清液分别调pH值2、3、4、5，按最佳上样量上样，分别上柱吸附，60滴/分钟吸附，操作按上述处理，最后定量分析每根柱的流出液绿原酸含量，算出各个水平吸附率大小，分析pH值对树脂吸附绿原酸量的影响；
步骤3，流速对吸附效果的影响
按上述最佳上样量及pH值，以40、60、80、100滴/分钟流速吸附，从生产成本和生产效益等方面考虑，确定最佳上柱吸附流速。
6.如权利要求1所述的从红腺忍冬叶制备绿原酸的方法，其特征在于，该方法进一步包括洗脱条件的选择方法：
步骤1，洗脱剂浓度的确定
分别用pH8、20ml的10、20、40、60％乙醇以60滴/分钟的流速进行洗脱看其洗脱效果，洗脱液比色定量分析绿原酸含量，干燥后称取提取物干重。看不同浓度的乙醇洗脱对绿原酸纯度的影响，选择最佳洗脱剂；
步骤2，洗脱液体积
绿原酸洗脱率随洗脱体积增加而不断增大，分别用最佳pH值、15、20、30、40ml最佳浓度乙醇以最佳流速进行洗脱看其洗脱效果，洗脱液比色定量分析绿原酸含量，干燥后称取提取物干重。看不同流速对绿原酸纯度的影响，选择洗脱最佳洗脱体积，从解吸率来看解吸最佳洗脱体积。
步骤3，洗脱剂pH值
分别用PH6、7、8、9的20ml最佳浓度乙醇以60滴/分钟的流速进行洗脱看其洗脱效果，洗脱液比色定量分析绿原酸含量，干燥后称取提取物干重。看不同PH值的乙醇洗脱对绿原酸纯度的影响，选择洗脱剂最佳pH值，从洗脱率来看洗脱最佳pH值；
步骤4，洗脱液流速
分别用最佳pH值的20ml最佳浓度乙醇以40、60、80、100滴/分钟的流速进行洗脱看其洗脱效果，洗脱液比色定量分析绿原酸含量，干燥后称取提取物干重；看不同流速对绿原酸纯度的影响，选择洗脱最佳流速，从洗脱率来看最佳洗脱流速。
7.如权利要求1所述的从红腺忍冬叶制备绿原酸的方法，其特征在于，该方法进一步包括样品含量的测定及相关计算方法：
绿原酸得率(％)＝(C×V/W0)×10-6×10-3
绿原酸纯度(％)＝(C×V/W1)×10-6×10-3
式中，C为根据回归方程计算所得的绿原酸浓度(ug/ml)；V为提取液体积(ml)；W0为红腺忍冬叶干重(g)W1为提取物干重(g)。
树脂洗脱率公式为：B(100％)＝C1V1/[(C0-C2]×100％
B为洗脱率；C0为原液中绿原酸浓度(mg/ml)；C2为吸附平衡后滤液中绿原酸浓度(mg/ml)；V为吸附原液体积(ml)；B为洗脱率；C1为洗脱液中绿原酸浓度(mg/ml)；V1为洗脱液体积(ml)。
8.如权利要求1所述的从红腺忍冬叶制备绿原酸的方法，其特征在于，该方法进一步包括绿原酸的纯化方法：
步骤1，乙酸乙酯纯化
上述乙醇相干燥物以PH3的60℃热水溶解再泠却到室温，溶解液与乙酸乙酯用量比1∶2萃取，水相用乙酸乙酯萃取3-5次。
步骤2，结晶纯化
经乙酸乙酯相浓缩干燥得绿原酸粗品，用pH值3的甲醇溶解，再放在4℃下结晶，得到白色针状晶体，真空干燥。
9.如权利要求1所述的从红腺忍冬叶制备绿原酸的方法，其特征在于，该方法进一步包括绿原酸的薄层分析方法：
用毛细管分别取待测溶液和对照品溶液各5uL，点于距硅胶薄层板下边缘2cm的位置，点样斑点的直径为1～2mm。以乙酸乙酯∶甲酸∶水＝10∶1∶2为展开剂展开；
待展开8cm时，自然晾干，喷以1％三氯化铁乙醇溶液，在120℃加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上显相同颜色斑点，阴性对照无此斑点。
10.如权利要求1所述的从红腺忍冬叶制备绿原酸的方法，其特征在于，红腺忍冬叶中大孔树脂分离纯化绿原酸的最佳洗脱工艺条件为：乙醇体积为20ml，乙醇浓度为20％，流速为80滴/min，pH为7，其提取率为1.43％，最佳上柱条件为：1g∶6ml固液比、乙醇pH为2、流速为40滴/min。
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