CN113956319B - 一种提取精制蜕皮甾酮的方法 - Google Patents
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Abstract
一种提取精制蜕皮甾酮的方法，包括如下步骤：干燥露水草粉碎；乙醇浸提；过滤；向提取液中加入ZTC1+1澄清剂，搅拌沉淀后保留清液部分；将经澄清剂处理的滤液经大孔树脂柱纯化；对大孔树脂柱流出液浓缩得到粗品浓缩液；通过有机溶剂稀释粗品浓缩液；用Fe3O4磁性纳米粒子吸附纯化；取清液部分过层析柱层析；将层析液减压浓缩，真空冷冻干燥，干燥后可得到纯的蜕皮甾酮。本发明可得98%含量以上蜕皮甾酮，以此提高产品含量，使得产品纯度和收率大幅提高，在生产过程中使用过的乙醇和乙酸乙酯可根据其沸点重新回收利用，以此方法提取出来的产品中几乎无溶剂残留，产品纯度更高，更安全。
Description
技术领域
本发明涉及天然化合物提取技术领域，具体涉及一种提取精制蜕皮甾酮的方法。
背景技术
蜕皮甾酮，又叫蜕皮激素、蜕皮激素（ecdysteroids）是一类具有昆虫蜕皮活性的天然甾体化合物。早在1919年生物学家Polish就提出了昆虫蜕皮的激素机制，1954年Butenadt和Karlson从家蚕蛹中分离到α-蜕皮激素，并确定了其α、β不饱和烯酮的甾体化合物结构。蜕皮激素属于植物甾体，因此正规的品名应该叫蜕皮甾酮。而其内含物主要是β-蜕皮激素(β-ecdysone)，起到蜕皮促长作用，所以也可叫作蜕皮激素。又因为其分子结构上有20个氢基，所以也被称之为20-羟基蜕皮激素。
蜕皮激素是昆虫的内源激素，在昆虫生理过程中控制其生长发育，促进蜕皮和繁殖，最初是苏联科学家从蚕蛹中得到，主要用来生产增强宇航员的体质保健品，后来经过科学界进一步发展，从昆虫界也得到很多类似化合物。植物源的目前发现有80个科属都含有这种物质。包括石竹，筋骨草，紫杉，罗汉松，马鞭草，怀牛膝，芦根，毛茛等，但从成本及技术成熟度而言，目前较优而且提取最广的是鸭跖草科露水草源地上部分天然含量在0.8-1.5%左右，而根部高达1.8-2.9%左右，且主要是活性较强的β-蜕皮激素。
目前，蜕皮甾酮提取工艺存在如下不足：
（1）蜕皮甾酮的水溶性强，但水的沸点较高，在许多基于水提取蜕皮甾酮的方法中，浓缩水提液的过程浓缩温度较高，浓缩时间长，会对蜕皮甾酮的生物活性造成不利影响；
（2）在许多基于水提取蜕皮甾酮的方法中，所得水浸膏经大孔树脂的分离提纯后，还需经过醇水或丙酮水的浓缩，该浓缩过程同样存在浓缩温度较高，浓缩时间长的问题。
（3）蜕皮甾酮的水溶性强，萃取时效果不佳，易导致收率大打折扣，同时生产废水中含有大量蜕皮甾酮，不能直接排放至环境，提高了废水处理成本。
CN102872167A公开了一种富含β-蜕皮激素的露水草提取物及其制备方法，该方法以露水草根为原料，通过包括水循环提取、离心分离、树脂吸附、纯化工序制得。CN105440095A公开了一种富含β-蜕皮甾酮的露水草提取纯化方法，可得到含量为50%~100%的β-蜕皮甾酮。该方法以露水草为原料，通过包括水回流提取，醇沉、树脂吸附、重结晶等工序制得。上述两专利提取效率较低，原料利用率低，工艺过程对蜕皮甾酮的活性有较大影响。
CN108084242A公开了一种提取蜕皮激素的方法，该方法用甲醇或甲醇-丙酮混合液浸泡露水草提取蜕皮激素，然后经过脱色、结晶、重结晶获得蜕皮激素，本发明方法简单易操作，无需柱层析，成本低、周期短，适于工业化应用和市场推广。但是该方法涉及甲醇、丙酮和四氢呋喃，溶剂残留大。产品可用于兽用养殖，不适于更高要求的药用，化妆品等使用，产品的用途受限。
发明内容
针对现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种提取精制蜕皮甾酮的方法，从而提高产品纯度和收率，降低有机溶剂的残留或降低其毒性，提高产品安全性；提高生产效率，便于工业化生产；有针对性的纯化精制，处理主峰前后的几个杂质峰，根据杂质峰出峰时间的不同的，使用合适的方法，去除杂质，只剩蜕皮甾酮主峰，从而使其纯度变高。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种提取精制蜕皮甾酮的方法，包括如下步骤：
（1）干燥露水草粉碎；
（2）乙醇法浸提；
（3）过滤；
（4）向热的提取液中加入ZTC1+1澄清剂，搅拌沉淀后保留清液部分；
（5）将经澄清剂处理的滤液经大孔树脂柱纯化；
（6）对大孔树脂柱流出液浓缩得到粗品浓缩液；
（7）通过有机溶剂稀释粗品浓缩液；
（8）用Fe3O4磁性纳米粒子吸附纯化；
（9）取清液部分过层析柱层析；
（10）将层析液减压浓缩，真空冷冻干燥，干燥后可得到纯的蜕皮甾酮。
优选的，步骤（1）干燥露水草粉碎时，将干燥的露水草在粉碎机上粉碎，颗粒大小为能过60目筛左右，注意不要太碎，避免影响过滤。
优选的，步骤（2）乙醇法浸提时，采用超声提取法。具体可将粉碎的原料放入浸提池中，按料液比为1：60加入70%的工业乙醇，投入超声波震板，超声20-40min，最少不能低于20min，提取2-3次，合并滤液。
优选的，步骤（3）过滤时，将滤液放入减压浓缩池中浓缩静置过夜，再过滤除去残渣。将残渣再次浸提一次，过滤后与之前的滤液合并。
优选的，步骤（4）加入ZTC1+1澄清剂时，首先趁热加入澄清剂B组份，搅拌，每隔30min搅拌1次；2h后，再加入澄清剂A组份并搅拌，每隔30min搅拌1次；2h后，吸取上清液，沉淀部分滤除；把上清液加热到50～80℃后，加入B组份，2h后再加入A组份，方法同第1次。
优选的，步骤（7）所用的有机溶剂为乙醇/乙酸乙酯，较为优选的配比是乙醇：乙酸乙酯体积比为1：4的混合溶剂，加热使其溶解，冷却后过滤。
优选的，步骤（9）所用的层析柱为中性氧化铝层析柱。
优选的，根据如下反应方程式合成Fe3O4磁性纳米粒子：
Fe2++2Fe3++80H-→ Fe3O4+4H2O （1）
首先2.6993g FeCl3·6H2O和0.407g FeCl2·4H2O加入于两口烧瓶中，加入10mL水和2 mL浓HCl，通入N2，电动搅拌至全部溶解，再将100 mL纯水和20 mL浓NH3·H2O加入250mL三颈烧瓶，通N2除去水中氧气，以300 r/min的速度电动搅拌5 min，然后将配制好的FeCl3和FeCl2倒入该三颈烧瓶中，转速改为500 r/min，在25℃的恒温水浴锅中恒温晶化20min，制备出Fe3O4磁性纳米粒子，在N2保护下进行整个过程。磁场分离去除上清液，用纯水和甲醇分别多次洗涤直至中性，最后用甲醇定容到80mL。保存于锥形瓶中，储存于4℃冰箱中备用。
本发明的有益效果为：
通过新的工艺将蜕皮甾酮从露水草原料中提取出来，相较于传统提取方法中的加热回流法或浸泡提取法，本工艺改进为超声提取法，料液比为1：60，时间为40min，可提高生产速度，省时省力。在提取液中加入ZTC1+1澄清剂2%-20%，往粗品中加入乙醇：乙酸乙酯（1：4）溶解萃取，加热溶解冷却过滤，用Fe3O4磁性纳米粒子吸附纯化，过层析柱，浓缩，得98%含量以上蜕皮甾酮。以此提高产品含量，使得产品纯度和收率大幅提高，在生产过程中使用过的乙醇和乙酸乙酯可根据其沸点重新回收利用。综合下来，生产成本降低约20-30%，并且，以此方法提取出来的产品中几乎无溶剂残留，产品纯度更高，更安全。随着提取效率的升高，产品回收率要比传统工艺的高。
（1）本发明利用乙醇对干燥露水草进行浸提，避免使用具有高沸点的水和其他污染性或有毒溶剂，工艺更为环保。为克服乙醇对干燥露水草中的蜕皮甾酮提取效果不好的缺点，本发明针对浸提环节设计了多次浸提，且各环节间相互独立，更加符合工业连续化生产要求。本申请还利用超声提取法提高乙醇对干燥露水草原料的提取效率。同时，由于避免使用了水分和有毒溶剂，使得提取液的后续处理更为便捷，简化了后处理要求。
（2）本发明将Fe3O4磁性纳米粒子引入蜕皮甾酮粗品向纯品的纯化工艺，经实验对比发现，该工艺可将蜕皮甾酮的纯度提升至98%以上，水分含量不超过2%；而在对照工艺中，所得蜕皮甾酮的纯度均不超过90%。此方案能够将粗品中蜕皮甾酮的纯度提高8-15%，使产品生产成本降低20-30%，效益明显，大大增加了原料的利用率，拓宽了应用范围，降低成本，提高了经济效益。
（3）采用乙醇对干燥露水草原料浸提时，得到的乙醇提取液在后续处理中可以用乙醇与乙酸乙酯的混合溶剂进行溶解，溶解后的产品可通过Fe3O4磁性纳米粒子吸附纯化和层析柱层析，最后层析液减压浓缩，层析液中的有机溶剂可有效回收。
（4）本发明在蜕皮甾酮的提纯过程中加入ZTC1+1澄清剂，实现了对固型物的有效沉淀和对蜕皮甾酮的有效保留。
（5）处理主峰前后的几个杂质，根据杂质出峰时间的不同的，通过使用往粗品中加入乙醇：乙酸乙酯（1：4）溶解萃取，加热溶解冷却过滤，用Fe3O4磁性纳米粒子吸附纯化，过层析柱，浓缩，得98%含量以上蜕皮甾酮的方法，有针对性的纯化精制，去除杂质，最后只剩蜕皮甾酮主峰，从而使其纯度变高，色谱峰面积明显扩大。
附图说明
图1为本发明工艺的工艺流程图；
图2为蜕皮甾酮HPLC标准图谱；
图3为本发明工艺实施得到的蜕皮甾酮的HPLC图谱，含量为97.42%；
图4为本发明工艺得到的粗品中的杂质峰的HPLC图谱，杂质峰出峰保留时间1.970min、2.404min、2.860min、4.616min、6.246min时间出现较大面积杂质峰。
具体实施方式
仪器与试剂
高效液相色谱仪(岛津10A，工作站，LCsolution,日本岛津公司，日本)
电子分析天平(AL204,瑞土梅特勒托利多，瑞士)
超声仪(KQ3200B,昆山市超声仪器有限公司，江苏)
微量进样器(上海高鸽工贸有限公司，上海)
电动搅拌器(D-8401WZ,天津市华兴科学仪器厂，天津)
高速离心机(TG16G,湖南凯达科学仪器有限公司，长沙)
粉碎机、蒸馏瓶、加热套、60目筛、容量瓶（25ml/250ml）、半透膜
色谱纯乙腈，50%乙醇溶液、超纯水为MilliporeMilli-Q超纯水纯化系统制备(MilliporeCorp.,Bedford,MA)FeCh-6H2O,FeCl-4H,O,NaOH,盐酸，无水乙醇均为分析纯
HPLC条件
在岛津SCL10Ap液相系统(东京，日本)条件下实现液相色谱的分离，主要的系统配制有SPD-20ADvp紫外检测器，两台LC-10ADvp高压泵，SIL-10ADvp自动进样器，LC-solution软件完成对数据采集及处理。
色谱柱:SpherigelC18柱(200mm4.6mm,Sum江申，大连):流动相A:
纯水，流动相B:乙腈;总流速:ImL/min;梯度条件:0-2min, 10%B; 2-30min 80%B;30-35min, 80%B: 进样体积10L; 检测波长:243nm; 每个样重复进3次。
实施例1
在传统的干燥露水草提取蜕皮甾酮的工艺中，通常以水为溶剂进行提取，因为水对蜕皮甾酮的溶解性较好，可有效将露水草中的蜕皮甾酮提取出来，得到粗品。但如背景技术所述，由于水的沸点较高，此方案浓缩粗品时容易因长时间的高温浓缩破坏蜕皮甾酮的生物活性。除此之外，本领域还采用甲醇或丙酮等有毒溶剂提取蜕皮甾酮。当前，对于利用乙醇直接提取干燥露水草中蜕皮甾酮的工艺并不多见。
本例讨论超声波浸提法能否有效替代加热回流浸提工艺。
将干燥露水草粉碎，过60目筛，取6g分为两份，每份3g，一份置于蒸馏烧瓶中加180g的50%乙醇溶液，煮沸加热回流20min，冷却后过滤；另一份至于烧杯中加180g的50%乙醇溶液，用超声仪超声20min，取出后过滤，将两份滤液各取5ml在离心机上离心，转速10000r/min，离心10min，将两者上清液过膜，将上清液各取1ml于25ml容量瓶中，用50%乙醇溶液定容至刻度，各取10微升进样到高效液相色谱仪中，检测波长243nm，通过色谱图面积的大小比较两种液体中蜕皮甾酮的含量。
结果显示，采用超声仪辅助浸提得到的提取液不仅能够成功实现对露水草中蜕皮甾酮的提取，且提取液中蜕皮甾酮的谱图面积大，表明超声提取法得到的提取液中得到了更多的蜕皮甾酮。
实施例2
本例主要探讨不同浓度的乙醇对露水草中蜕皮甾酮的提取效率。
将干燥露水草粉碎，过60目筛，取份3g，置于蒸馏烧瓶中加180g的乙醇或者不同浓度的乙醇/水溶液，用超声仪超声20min，取出后过滤，取少量滤液在离心机上离心，转速10000r/min，离心10min，将两者上清液过膜，将上清液各取1ml于25ml容量瓶中，用50%乙醇定容至刻度，各取10微升进样到高效液相色谱仪中，检测波长243nm,通过色谱图面积的大小比较两种液体中蜕皮甾酮的含量。
通过比较可以看出，当采用浓度为65%~70%的乙醇时，溶剂对露水草的提取效果较好。其余浓度的乙醇虽然能通过浸提得到蜕皮甾醇提取液，但其提取得到的蜕皮甾酮峰面积较低，且杂质峰面积相对较大，可能增加后续提纯难度。因此，65%~70%的乙醇是较佳的实施范围。
实施例3
在实施例2的基础上，为进一步提升露水草原料的利用率，本例对是否有必要进行2次、3次浸提进行讨论。
实验操作如实施例2，本例采用浓度为70%的乙醇对经过不同浸提次数的滤渣进行浸提。
结果显示，2-3次是较为合理的提取次数。仅进行一次浸提时，滤渣中仍含有较多的蜕皮甾酮残留，露水草的利用率不高。而当浸提次数超过4次后，提取液中的蜕皮甾酮峰面积变化不明显，综合考虑经济性及杂质对后续蜕皮甾酮提纯的影响，已无必要对滤渣进行再次提取。
实施例4
本发明将ZTC1+1澄清剂引入蜕皮甾酮提取液的提纯工艺中，尽管ZTC1+1澄清剂在其他中医药提取物的提取工艺中多有应用，但其是否适合蜕皮甾酮提取液除杂，目前尚未有所讨论。本例重点讨论ZTC1+1澄清剂能否使用及用量范围。
取露水草提取液，依提取液质量加入不同百分比的ZTC1+1澄清剂。首先加入B组份，搅拌，每隔30min搅拌1次；2h后，再加入澄清剂A组份并搅拌，每隔30min搅拌1次；2h后，吸取上清液，沉淀部分滤除；把上清液加热到50～80℃后，加入B组份，2h后再加入A组份，方法同第1次。
本例研究显示，澄清剂的最佳用量为15%，此时杂质去除率约20.3%，蜕皮甾酮保留率约95.2%。低于15%时，杂质去除率和蜕皮甾酮保留率均随澄清剂增加而提升；继续增加澄清剂加入量，杂质去除率和蜕皮甾酮保留率略有下降。此外，即使仅加入少量的澄清剂（如2wt%），产品的杂质去除率也有显著提升。
实施例5
本发明引入Fe3O4磁性纳米粒子处理蜕皮甾醇粗品得到蜕皮甾酮纯品，Fe3O4磁性纳米粒子具有良好的生物相容性，且对重金属有吸附效果，亦可对含有羧基或者邻位酚羟基结构的黄酮类化合物进行选择性吸附。本发明引入Fe3O4磁性纳米粒子处理蜕皮甾酮粗品，目前未有相关报道。
本例实验方法如下：首先，取10mg粗样品与250ml容量瓶中，用乙醇溶液定容至刻度。然后取1.9gFe3O4磁性纳米粒子澄清剂加入到100mL乙醇水溶解液中，进行吸附澄清处理，离心后吸取上清液，将上清液高速离心，去除残留的少量Fe3O4磁性纳米粒子，再次移取上清液，加入400ml乙酸乙酯进行诱导相分离，得到的含有大量蜕皮甾酮的乙醇相氮气吹干，称得固体用乙醇复溶，定容至100ml，取10微升进样分析。另外取10微升粗品的乙醇溶解液进样分析，通过色谱面积比较两者的纯度。
初步结果显示，Fe3O4磁性纳米粒子可有效降低蜕皮甾酮粗品中的杂质含量，所得到的样品中蜕皮甾酮色谱峰面积占比大于粗品。
实施例6
为进一步验证Fe3O4磁性纳米粒子处理蜕皮甾醇粗品的有效性，本例以较为完整的蜕皮甾醇粗品处理方案进行验证。
在实验验证前，对粗品进行HPLC测定，以获取粗品中的杂质峰情况。测定结果如图4所示，下表为对应峰表：
表中，杂质峰出峰保留时间1.970min、2.404min、2.860 min、4.616 min、6.246min时间出现较大面积杂质峰。此外，粗品的HPLC图谱还显示，粗品中蜕皮甾酮含量为70-80%。
为实现蜕皮甾酮粗品的提纯，本例采用的方法是向粗品中加入乙醇：乙酸乙酯（体积比1：4）溶解萃取，加热溶解，冷却过滤，用Fe3O4磁性纳米粒子吸附纯化，过层析柱，浓缩，得蜕皮甾酮纯品。经检验，产品中蜕皮甾酮纯度可达98%，水分含量不超过2%。
相对的，本例还提供以下对照组进行比对：
对照组一：未采用Fe3O4磁性纳米粒子吸附纯化，产品蜕皮甾酮纯度为70%，水分含量为8%。
对照组二：以脱色树脂替代Fe3O4磁性纳米粒子吸附纯化工艺，产品纯度为80%，水分含量为6%。
对照组三：以硅胶作为吸附剂替代Fe3O4磁性纳米粒子吸附纯化工艺，产品纯度为88%，水分含量为3%。
对照组四：以活性炭粉和硅藻土替代Fe3O4磁性纳米粒子吸附纯化工艺，产品纯度为80%，水分含量为7%。
上述生产工艺虽然也可将蜕皮甾酮做成白色，但是产品纯度较低，水分高，且含有未除尽的杂质。
实施例7
下面结合优选实施方式对本发明蜕皮甾酮提取工艺进行综合说明：
（1）10kg干燥露水草粉碎：将干燥的露水草在粉碎机上粉碎，颗粒大小为能过60目筛左右，注意不要太碎，避免影响过滤。
（2）浸提：将粉碎的原料放入浸提池中，按料液比为1：60加入70%的工业乙醇，投入超声波震板，超声20-40min，最少不能低于20min，提取2-3次，合并滤液。
（3）过滤：将滤液放入减压浓缩池中浓缩静置过夜，再过滤除去残渣，将残渣再次浸提一次，过滤后与之前的滤液合并。
（4）趁热加入澄清剂B组份，搅拌，每隔30min搅拌1次，2h后，再加入澄清剂A组份，并搅拌，每隔30min搅拌1次，2h后，吸取上清液，沉淀部分滤除，把上清液加热到50～80℃后，加入B组份，2h后再加入A组份，方法同第1次。
（5）将第二次滤液通过大孔树脂柱进行纯化。
（6）粗品：将大孔树脂的流出液进行浓缩可得粗品浓缩液。
（7）向粗品浓缩液中按乙醇：乙酸乙酯=1：4加入，加热使其溶解，冷却后过滤。
（8）吸附纯化：用Fe3O4磁性纳米粒子吸附纯化。
（9）层析：将过滤后的滤液通过中性氧化铝层析柱。
（10）浓缩干燥：将层析液减压浓缩，真空冷冻干燥，干燥后可得到纯的蜕皮甾酮。
Claims (4)
1.一种提取精制蜕皮甾酮的方法，其特征在于，包括如下步骤：
干燥露水草粉碎后，在乙醇中按照露水草：乙醇质量比1：60，超声辅助浸提20-40 min，过滤；重复浸提滤饼2次，合并滤液；所述乙醇的体积浓度为70%；
向露水草提取液加入ZTC1+1澄清剂，ZTC1+1澄清剂的用量为露水草提取液的15wt%，搅拌沉淀后保留清液部分；
将经ZTC1+1澄清剂处理得到的清液经大孔树脂柱纯化；
对大孔树脂柱流出液浓缩得到粗品浓缩液；
粗品浓缩液稀释后通过Fe3O4磁性纳米粒子吸附纯化，将蜕皮甾酮粗品浓缩液在乙醇：乙酸乙酯混合溶剂中溶解，然后加入Fe3O4磁性纳米粒子对杂质吸附，吸附完成后去除Fe3O4磁性纳米粒子得到澄清液；
过层析柱层析，减压浓缩，真空冷冻干燥，干燥后得到纯的蜕皮甾酮。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Fe3O4磁性纳米粒子吸附纯化包括如下步骤：取10 ml 蜕皮甾酮粗品浓缩液在250 ml容量瓶中用乙醇定容至刻度；取100 ml蜕皮甾酮粗品的乙醇溶液加入1.9 g Fe3O4磁性纳米粒子进行吸附；吸附完成后高速离心得到上清液，向上清液中加入400 ml乙酸乙酯诱导相分离，所得乙醇相中含有大量的蜕皮甾酮。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述干燥露水草粉碎后在乙醇中超声辅助浸提包括如下步骤：将干燥露水草粉碎，过60目筛，取3 g干燥露水草粉末，加180 g乙醇，用超声仪超声20-40 min，取出后过滤，在离心机上10000 r/min离心10min，取上清液过膜得提取液。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）取10kg干燥露水草在粉碎机上粉碎；
2）将粉碎的干燥露水草放入浸提池中，按露水草：乙醇质量比1：60加入70%的工业乙醇，投入超声波震板，超声20-40min，过滤；重复浸提滤饼2次，合并滤液；
3）将步骤2）所得滤液放入减压浓缩池中浓缩静置过夜，再过滤除去残渣，将残渣再次浸提一次，合并滤液；
4）趁热加入ZTC1+1澄清剂B组份，搅拌，每隔30min搅拌1次；2h后，再加入ZTC1+1澄清剂A组份并搅拌，每隔30min搅拌1次；2h后，吸取上清液，沉淀部分滤除，把上清液加热到50-80℃后，按前述方法再次加入ZTC1+1澄清剂B、A组份，滤除沉淀；
5）将步骤4）所得滤液通过大孔树脂柱进行纯化；
6）将步骤5）得到的大孔树脂的流出液进行浓缩，得粗品浓缩液；
7）向粗品浓缩液加入体积比为1：4的乙醇：乙酸乙酯混合溶剂，加热使其溶解，冷却后过滤；
8）用Fe3O4磁性纳米粒子对步骤7）稀释后的粗品吸附纯化，留清液部分；
9）将步骤8）吸附纯化后的清液通过中性氧化铝层析柱；
10）将步骤9）得到的层析液减压浓缩，真空冷冻干燥，干燥后得到纯的蜕皮甾酮。
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