CN116098930B - 一种制取高纯度杜仲叶总黄酮的分离富集方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种制取高纯度杜仲叶总黄酮的分离富集方法及应用，分离富集方法的步骤包括：(1)干燥粉碎杜仲叶；(2)用有机溶剂浸泡回流提取两次得到杜仲叶总浸膏；(3)用AB‑8大孔树脂层析柱初步纯化；(4)干燥磨粉；(5)用SephadexLH‑20葡聚糖凝胶层析柱最终纯化；(6)再次干燥制粉即得到高纯度杜仲叶总黄酮。采用本发明的分离富集方法进行分离富集杜仲叶中的总黄酮，纯度高，回收率高，且操作简便和成本低；此外，本发明制取的杜仲叶总黄酮能有效治疗缺血性卒中，通过抑制活性氧(ROS)的积累，减轻ROS对细胞的损伤，从而增加神经细胞的存活率或保护神经元免受缺血性损伤，最终达到治疗缺血性卒中的目的。

Description

一种制取高纯度杜仲叶总黄酮的分离富集方法及应用

技术领域

本发明涉及天然产物与医药技术领域，尤其涉及一种制取高纯度杜仲叶总黄酮的分离富集方法及应用。

背景技术

导致残疾和认知缺陷的中风约占全世界死亡人数的5.2％，其中，以短暂或永久性脑血管闭塞导致的缺血性中风占据多数。缺血性中风或将引起脑梗塞、脑组织死亡以及局灶性神经元损伤，常表现出患有阿尔兹海默病、运动功能缺陷和智力受损等症状。缺血性中风和脑梗塞引起的神经元损伤包括三种机制，首先是神经元丢失，这是最直接的原因；其次，缺血导致的血管阻塞产生过度的活性氧(ROS)，加剧神经元损伤，从而导致功能缺陷；最后，缺血引起的炎症反应也是神经元损伤的一大诱因。治疗缺血性卒中的化学药物众多，例如组织型纤溶酶原激活剂(tPA)、阿司匹林、依达拉奉、西洛他唑，但患者却苦于与之伴随的副作用。近年来，芍药苷、落新妇苷、青蒿琥酯、异槲皮素等天然产物渐渐被研究用于治疗缺血性卒中。天然产物在治疗缺血性卒中表现出了巨大的潜力。

植物源黄酮类化合物具有许多健康特性，研究表明其在细菌和病毒性传染病以及心血管疾病、癌症等退行性疾病中均具有保护作用。此外，与黄酮结构息息相关的抗氧化、肝保护活性、抗炎活性等也均已存在大量研究。杜仲黄酮类化合物在降“三高”、对抗炎症、病毒和癌症等方面也发挥了重要作用。杜仲叶中富含有的黄酮类成分已证明在抗氧化方面具有显著作用，可以作为大多数氧自由基的清除剂。杜仲是中国特有的杜仲属物种，自古以来，其药用价值引起了人们的广泛关注，杜仲的提取物或单体化合物例如环烯醚萜类、木脂素、绿原酸、酚类等已被应用于治疗高血压、高脂血症、糖尿病、抗衰老、免疫调节等方面；其叶子、树皮、茎和雄花皆可入药，杜仲树皮是常用于炮制中药的主要部位，但杜仲叶的研究与利用更利于杜仲资源的可持续发展。

目前没有任何有关杜仲叶黄酮在缺血性卒中应用的相关报道。

此外，杜仲资源的综合利用率低，长期以来，人们常以树皮作为主要药用部位。而传统的剥皮做法对杜仲树的损害极大，一定程度造成了杜仲资源的浪费。有研究表明杜仲叶中含有和杜仲皮相似的成分。对杜仲叶成分的活性研究是提高杜仲资源的利用率的必要途径。目前，杜仲叶总黄酮在抗氧化、抗菌方面均存在大量研究，但在缺血性卒中的报道鲜有报道。

氧化还原信号在病理过程和维持细胞内稳态至关重要。活性氧(ROS)可以激活蛋白激酶：CaMKII、PKG、PKA、ERK、PI3K、Akt、PKC、PDK、JNK、p38，生理水平控制细胞增殖和血管生成。适量的ROS对缺血后细胞生存有益，而进一步的增加将通过凋亡和自噬机制触发程序性死亡。

鉴于以上杜仲资源的利用现状，ROS信号分子在缺血性卒中的传导调控作用，本申请研究了如何提取获得高纯度、高回收率的杜仲叶总黄酮提取物，拓宽杜仲叶资源的利用率，并为治疗缺血性卒中提供新方案。

发明内容

本发明的目的是提供一种制取高纯度杜仲叶总黄酮的分离富集方法及应用，通过天然产物的色谱分离手段提取杜仲叶总黄酮提取物，可以抑制缺血后细胞中ROS积累，具有广泛的药用和保健价值，同时也可用于新的医学领域研究。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种制取高纯度杜仲叶总黄酮的分离富集方法，包括以下步骤：

(1)将干燥后的杜仲叶粉碎制成粗粉；

(2)取适量粗粉加入第一溶剂后于80℃回流提取两次，每次提取1.5h，合并两次提取液，回收第一溶剂后得到杜仲叶总浸膏；

(3)分离：取杜仲叶总浸膏用适量蒸馏水溶解混匀，过滤除去不溶物，加入到AB-8大孔树脂层析柱中，先用蒸馏水洗去杂质，以70％～100％浓度的乙醇为流动相洗脱，收集醇洗脱液；

(4)回收乙醇后，于鼓风干燥箱中干燥，研磨制成粉末Ⅰ；

(5)富集：取少量粉末Ⅰ溶解于第二溶剂中，加入Sephadex LH-20葡聚糖凝胶层析柱中，以55％～90％浓度的乙醇为流动相进行洗脱，每1/10柱体积收集一管洗脱液；

(6)将洗脱液在鼓风干燥箱中分别干燥制成粉末，筛选其中纯度为70％以上的粉末进行合并，得到粉末Ⅱ，即为高纯度杜仲叶总黄酮。

在一些具体的技术方案中，在步骤(2)中，第一溶剂为60％浓度的乙醇溶液。

在一些具体的技术方案中，在步骤(2)中，按照料液比1g：10ml的比例加入第一溶剂。

在一些具体的技术方案中，在步骤(3)中，流动相采用90％浓度的乙醇。

在一些具体的技术方案中，在步骤(4)中，干燥温度为60℃。

在一些具体的技术方案中，在步骤(5)中，第二溶剂为70％浓度的乙醇溶液。

在一些具体的技术方案中，在步骤(5)中，柱层析分离纯化时的上样浓度为20～30mg/ml。

在一些具体的技术方案中，在步骤(5)中，流动相采用70％浓度的乙醇。

在一些具体的技术方案中，在步骤(6)中，干燥温度为60℃。

第二方面，本发明提供了由上述分离富集方法制取得到的高纯度杜仲叶总黄酮在治疗缺血性卒中的用途。

第三方面，本发明提供了由上述分离富集方法制取得到的高纯度杜仲叶总黄酮在制备治疗缺血性脑卒中药物或在制备抑制ROS积累的药物中的用途。

在一些具体的技术方案中，杜仲叶总黄酮的药物浓度为0.3～5μg/ml。

优选的，杜仲叶总黄酮的药物浓度为1μg/ml。

与现有技术相比，本发明提供了一种制取高纯度杜仲叶总黄酮的分离富集方法及应用，具备以下有益效果：

(1)本申请通过研究杜仲叶黄酮具有的活性需要并制取高纯度的黄酮成分；大孔树脂是一种高效的有机高分子聚合物吸附脱附技术，具有吸附容量大、吸附剂易再生的优点，因其固有的方便、低操作成本、溶剂消耗以及产品中不存在化学残留的特点，在天然产物分离过程中已得到广泛应用；Sephadex LH-20葡聚糖凝胶树脂常被用于分离或纯化植物黄酮类化合物的最后一步，这是一种基于尺寸排阻色谱的分离纯化方法；本发明采用回流提取、AB-8大孔树脂和Sephadex LH-20葡聚糖凝胶层析法分离富集杜仲叶中的总黄酮，联用两种材料富集杜仲叶总黄酮的两步分离纯化操作可以得到高纯度、高回收率的黄酮产品，分离全程只使用无毒害的可供食品加工的乙醇作为有机溶剂流动相，其提取产物更具有药用价值和研究意义；并且，此种方法操作简便，成本低，在提取高纯度杜仲叶总黄酮方法中具有一定的推广价值，大大提高了杜仲叶资源的利用率，拓宽了杜仲资源利用新思路。

(2)本发明提取的杜仲叶总黄酮提取物能通过减少ROS的产生，减轻缺血损伤，有效治疗缺血性脑卒中的疾病，为治疗缺血性卒中提供了新方案，同时也可用于其他类似ROS致损的疾病，有深入研究的意义和利用价值。

(3)在治疗缺血性卒中的药物中，本发明首次提出了杜仲叶总黄酮提取物在治疗缺血性脑卒中的应用，因此，可为治疗此类疾病提供了新的药物选择。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为制取高纯度杜仲叶总黄酮的分离富集方法的流程图；

图2A为不同树脂对杜仲叶黄酮的吸附量及吸附率的情况；

图2B为不同树脂对杜仲叶黄酮的解吸率情况；

图2C为AB-8大孔树脂上样体积变化曲线；

图2D为洗脱溶剂对杜仲叶总黄酮回收率的影响；

图2E为AB-8大孔树脂水洗脱曲线；

图2F为AB-8大孔树脂醇洗脱曲线；

图3A为不同乙醇浓度下Sephadex LH-20的解吸率；

图3B为水-70％乙醇洗脱曲线；

图3C为70％乙醇洗脱曲线；

图3D为水-70％乙醇洗脱黄酮质量与粉末纯度的变化；

图3E为70％乙醇洗脱黄酮质量与粉末纯度的变化；

图3F为不同浓度上样量纯度和回收率的变化曲线；

图4A为杜仲叶总黄酮提取物以不同浓度(0.3μg/ml、1μg/ml、5μg/ml)处理24h对缺血再灌注PC12细胞损伤后细胞活力的影响；数据为平均值±标准差，图为三个独立实验的代表性数据；与对照组比较，##p<0.01；与缺血组(MI)比较，**p<0.01，*p<0.05；

图4B为杜仲叶总黄酮提取物对PC12缺血再灌注损伤的影响；

图5为Hoechst 33258染色细胞的荧光显微照片(100×)；

图6A为在不同杜仲叶总黄酮提取物浓度下对PC12缺血再灌注损伤ROS荧光强度变化(100×)；

图6B为在不同杜仲叶总黄酮提取物浓度下对PC12缺血再灌注损伤ROS荧光强度变化(40×)；

图6C为在不同杜仲叶总黄酮提取物浓度下对PC12缺血再灌注损伤ROS荧光强度分析，与对照组比较，##p<0.01；与心肌梗死组(MI)比较，**p<0.01。

具体实施方式

下面将通过详细的实施例并结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如无特别说明，本申请中的试剂浓度均为质量浓度。本发明所述的乙醇溶液或具有一定浓度的乙醇均指乙醇与水的混合液。

实施例1

如图1所示，本实施例提供了一种制取高纯度杜仲叶总黄酮的分离富集方法，具体的制备包括以下步骤：

(1)取干燥后的杜仲叶粉碎制成粗粉；

(2)取适量粗粉按照料液比1g：10ml的比例加入60％浓度的乙醇溶液后于80℃回流提取两次，每次提取1.5h，合并两次提取液，回收乙醇后得到杜仲叶总浸膏；

(3)分离：取适量的杜仲叶总浸膏用适量蒸馏水溶解混匀，过滤除去不溶物，然后加入到AB-8大孔树脂层析柱中，先用蒸馏水洗去杂质，以90％浓度的乙醇为流动相洗脱，收集醇洗脱液；

(4)回收乙醇后，置入鼓风干燥箱中于60℃干燥，研磨制成粉末Ⅰ；

(5)富集：取少量粉末Ⅰ溶解于70％浓度的乙醇溶液中，上样浓度为28.76mg/ml，加入Sephadex LH-20葡聚糖凝胶层析柱中，以70％浓度的乙醇为流动相进行洗脱，每1/10柱体积收集一管洗脱液；

(6)将洗脱液在鼓风干燥箱中分别于60℃干燥制成粉末，筛选其中纯度较高的粉末(纯度≥70％)进行合并，得到粉末Ⅱ，即为高纯度杜仲叶总黄酮，纯度为80.98％。

实施例2

如图1所示，本实施例提供了一种制取高纯度杜仲叶总黄酮的分离富集方法，具体的制备包括以下步骤：

(1)取干燥后的杜仲叶粉碎制成粗粉；

(2)取适量粗粉按照料液比1g：10ml的比例加入60％浓度的乙醇溶液后于80℃回流提取两次，每次提取1.5h，合并两次提取液，回收乙醇后得到杜仲叶总浸膏；

(3)分离：取适量的杜仲叶总浸膏用适量蒸馏水溶解混匀，过滤除去不溶物，然后加入到AB-8大孔树脂层析柱中，先用蒸馏水洗去杂质，以90％浓度的乙醇为流动相洗脱，收集醇洗脱液；

(4)回收乙醇后，置入鼓风干燥箱中于60℃干燥，研磨制成粉末Ⅰ；

(5)富集：取少量粉末Ⅰ溶解于70％浓度的乙醇溶液中，上样浓度为28.46mg/ml，加入Sephadex LH-20葡聚糖凝胶层析柱中，以70％浓度的乙醇为流动相进行洗脱，每1/10柱体积收集一管洗脱液；

(6)将洗脱液在鼓风干燥箱中分别于60℃干燥制成粉末，筛选其中纯度较高的粉末(纯度≥70％)进行合并，得到粉末Ⅱ，即为高纯度杜仲叶总黄酮，纯度为83.08％。

实验例1

参考本发明的分离富集方法，本实验例通过科学实验来说明本发明所述的高纯度杜仲叶总黄酮的提取过程中各项工艺的研究。

1.1、AB-8大孔树脂分离杜仲叶总黄酮工艺探究

先采用静态吸附筛选合适的层析材料。分别称重XDA-8、AB-8、D101湿大孔树脂1g，各加入50ml粗提液(初始浓度为0.153mg/ml，pH＝4.5)添加到每个带盖锥形瓶中，置于298K的振动筛(120rpm)上震荡24小时。在吸附系统达到平衡后，用去离子水将树脂在漏斗中分离。用可见分光光度计在510nm处分析吸附溶液。将相同重量吸附的树脂和40ml不同浓度的乙醇溶液(40％、70％、90％和100％)添加到每个带盖的烧瓶中，然后在298K下以100rpm的转速振荡24小时，并测量解吸溶液中的黄酮浓度。最后比较不同树脂的吸附率与解吸率，筛选出具有最佳性能的树脂用于后续实验。使用由静态吸附与解吸实验筛选出的理想树脂考察上样量、洗脱溶剂对杜仲叶黄酮回收率的影响，通过动态吸附与解吸确定水洗脱体积及醇洗脱体积。把预处理好的树脂装入15mm×300mm的玻璃色谱柱中(柱床体积约为40ml)，将杜仲叶总黄酮提取液上柱，洗脱，收集流出液，检测黄酮含量，计算回收率。

实验结果如图2A～图2F所示：(1)由图2A和图2B可以得出XDA-8树脂的吸附率较高，但其解吸效果不好，而弱极性的AB-8树脂的吸附率(80.2％)稍低于非极性的D101树脂(82.5％)和XDA-8树脂(86.2％)，但其解吸效率明显优于其他二者，故综合考虑选用AB-8树脂作为本实验杜仲叶总黄酮的初步纯化材料。AB-8大孔树脂对杜仲叶总黄酮的静态饱和吸附量为6.1mg/g，静态吸附率为80.2％，静态解吸率最高为98.2％。(2)图2C表明最佳上样量为10ml，当流出液达到10ml时，黄酮含量呈现增加的趋势，表明总黄酮开始泄露；当达到70ml时总黄酮不再增加，表明树脂对总黄酮的吸附已达到平衡。(3)图2D表明选用90％的乙醇作为洗脱溶剂，具有较好的回收效果和纯度，黄酮回收率85.2％，黄酮含量24.6％。(4)图2E的水洗脱曲线表明，当水洗脱体积达到50ml时，洗脱曲线趋于平缓，浓度接近0.0mg/g，水溶性杂质基本除去，故选用2BV作为水洗体积。(5)图2F的醇洗脱曲线表明，醇洗体积为80ml时，总黄酮已基本全部洗尽。

1.2、Sephadex LH-20富集纯化杜仲叶总黄酮工艺探究

平衡层析柱后，上样样品体积应约占柱体积的1％～2％。特别注意的是，样品溶液应在上样前离心或经过0.45μm去除不溶物，防止堵塞凝胶柱导致填料污染。洗脱过程中如更换洗脱液，则应注意凝胶在新溶剂的溶胀性质。用不同的洗脱溶剂及洗脱方式将得到不同的分离效果。洗脱溶剂的考察参照1.1中的静态解吸方法。洗脱方式则比较了水洗脱及70％乙醇单独洗脱。取适量已经过初步分离纯化后的粉末Ⅰ，用水或70％乙醇溶解样品、过滤，除去不溶物后上样，洗脱，以每管1/10柱体积收集，检测每管吸光度，计算黄酮浓度，以黄酮回收率和粉末黄酮含量为考察指标。

实验结果如图3A～图3F所示：(1)比较了用浓度分别为55％、70％、90％的乙醇溶液解吸Sephadex LH-20结果如图3A所示，可得最佳洗脱溶剂为70％浓度的乙醇溶液。Sephadex LH-20葡聚糖凝胶在浓度为55％、70％、90％的乙醇中溶胀系数依次减小，而70％浓度的乙醇溶剂对杜仲叶总黄酮的洗脱效果最好，可能是由于在该溶剂系统中，SephadexLH-20的溶胀程度对于杜仲叶的黄酮类化合物吸附能力最好，同时该溶剂系统也对杜仲叶的黄酮类化合物的解吸能力最强。(2)图3B为水-70％乙醇洗脱，图3C为单独70％乙醇洗脱，不同的洗脱方式导致每管黄酮的含量变化不同：动态解吸实验发现水-70％乙醇洗脱的黄酮含量基本在30％以上，然后急剧升高(图3D)，这表明杜仲叶中可能含有大量水溶性黄酮；而单独采用70％乙醇洗脱时黄酮含量达到峰值后便维持在65.0％以上(图3E)，合并黄酮含量为65％左右的收集管，回收溶剂，检测其黄酮含量为81.0％，回收率为48.7％。因此，选用70％乙醇直接洗脱的方式得到高回收率、高纯度杜仲叶总黄酮产品。(3)采用70％乙醇作为洗脱剂的动态洗脱效果如图3F所示：A的黄酮浓度为23.0mg/ml，B的黄酮浓度为57.1mg/ml，等体积上样；因为70％乙醇溶剂未完全溶解B中黄酮苷元，而能大部分溶解黄酮苷，黄酮苷在总黄酮中占比更大，因此需要更多溶剂洗脱黄酮苷，最后导致回收率曲线的“偏移”；综上，上样的浓度应充分考虑样品的溶解度，用适量的溶剂充分溶解，尽量不让黄酮达到溶解饱和状态，故上样浓度在20mg/ml左右为宜，这样可得到纯度较高的杜仲叶总黄酮提取物。

实验例2

本实验例通过科学实验来说明本发明所述的杜仲叶总黄酮提取物有效治疗缺血性脑卒中的效果。

1.1、杜仲叶总黄酮提取物对缺血再灌注诱导PC12损伤细胞存活率的影响

将细胞以1×10⁵个细胞/孔接种于96孔板中，每孔体积为100μL，每组由6个平行复孔组成，并在含有10％FBS+2％双抗的1640培养基中培养24h后，丢弃培养液。用PBS洗涤一次后，将细胞分为空白对照组、缺血组和缺血后给药组(0.3μg/ml、1μg/ml、5μg/ml)。除空白对照组添加正常培养液外，其余均添加相同体积的缺血溶液(含有20mM 2-DOG、20mM乳酸钠、2.5mM Na₂S₂O₄的缓冲液，均购自美国密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich公司)，处理20分钟得到缺血模型。加药处理24h后，向每孔中加入10μl的CCK-8溶液，并继续在培养箱中培养1小时，并于450nm吸光度下用微板读数仪测量。其中，实验用的细胞为来自中山大学附属第一医院惠赠的大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞，经培养后取处于对数生长期的细胞用于实验。

实验结果如图4A和图4B所示：CCK-8结果显示，缺血组细胞活力显著低于空白对照组(51.10％±3.11％)，设置了5个浓度组(0.3μg/ml、0.6μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml)，细胞活力随着药物剂量呈现浓度抑制趋势，随着药物浓度增加，细胞存活率先上升后降低。当药物浓度为1μg/ml(67.41％±1.94％)时，细胞达到最大存活率，差异具有统计学意义(P<0.05)。当浓度为10μg/ml时活性显著降低，说明10μg/ml对细胞有一定的毒性。因此，实验选取0.3μg/ml、1μg/ml、5μg/ml杜仲叶总黄酮作为后续实验浓度，进一步验证药物活性。

1.2、细胞形态学观察

将PC12细胞以1×10⁵个/孔的密度分至六孔板中，分为空白对照组、缺血组、缺血后杜仲叶总黄酮提取物处理组，37℃持续孵育24h后，缺血组和缺血后杜仲叶总黄酮提取物处理组中加入缺血液处理细胞20min后，缺血MTC后处理组分别加入最终浓度为0.3μg/ml、1μg/ml、5μg/ml的杜仲叶总黄酮提取物，24h后观察细胞形态变化。

实验结果如图4B所示，随着杜仲叶总黄酮提取物浓度的增加，和缺血组比较，细胞数量逐渐增加，当浓度为1μg/ml时，PC12细胞数量最多，存活率最大。

1.3、运用Hoechst 33258荧光染色法检测杜仲叶总黄酮提取物对缺血再灌注诱导PC12损伤细胞核型的影响

为了进一步验证杜仲叶总黄酮对PC12细胞的保护作用，评估杜仲叶总黄酮对PC12细胞凋亡的影响。采取Hoechst 33258染色法检测凋亡细胞核染色质形态学特征。将细胞以1×10⁵个细胞/孔接种于6孔板中，每孔体积为2ml。药物作用24h后，丢弃培养液，用PBS洗涤一次，再用4％的多聚甲醛固定细胞。20分钟后弃去每孔多聚甲醛，黑暗条件下加入0.5μg/ml的Hoechst 33258染色溶液。染色25分钟后，用PBS洗涤3次，在显微镜下放大100倍观察和拍照。

实验结果如图5所示：与空白对照组相比，缺血组细胞凋亡增多，核凝聚、破裂、细胞膜气泡，出现凋亡小体，呈现大量蓝色荧光(即图5中的白色光斑，照片已作黑白处理)。由杜仲叶总黄酮提取物处理后的细胞核凝聚减少，当杜仲叶总黄酮浓度为1μg/ml时，细胞核未见明显凝聚，蓝色荧光减弱。结果表明，1μg/ml的杜仲叶总黄酮可通过抑制细胞凋亡而达到保护作用。

1.4、杜仲叶总黄酮提取物对缺血再灌注诱导PC12损伤细胞ROS的影响

为探讨杜仲叶总黄酮对缺血细胞的保护途径，检测ROS含量变化。将细胞以1×10⁵个细胞/孔接种于96孔板中，每孔体积为2ml。药物作用24h后，丢弃培养液，用PBS洗涤一次。DCFH-DA用无血清培养液按照1000：1稀释，每孔加入1ml置于细胞培养箱中孵育20分钟，最终用无血清培养液洗涤细胞三次后在激光共聚焦显微镜下观察并拍照。

实验结果如图6A～图6C所示：ROS结果显示，缺血组绿色荧光强度明显高于空白对照组(即图6A和图6B中的白色光斑，已作黑白处理)，给药处理后，活性氧数量减少。图6A表明，当杜仲叶总黄酮提取物浓度提取物为1μg/ml时，荧光减弱，说明此时细胞内ROS含量最低，药物作用抑制了ROS积累。通过荧光强度分析图6B和图6C结果显示，药物浓度为1μg/ml时，对细胞中活性氧积累抑制效果最好。ROS是一种涉及氧化应激通路的信号分子，杜仲叶总黄酮作用后，ROS显著减少证实了杜仲叶总黄酮的强抗氧化性，同时在氧化应激通路对卒中的治疗保护作用。

综上，本发明探究了获得高纯度杜仲叶总黄酮提取物的工艺方法及流程，将杜仲叶总黄酮提取物进行体外细胞活性研究，细胞活性检测表明杜仲叶总黄酮对缺血神经元具有保护作用，且当药物浓度为1μg/ml时，对细胞具有更好的保护作用。杜仲叶总黄酮作用于缺血细胞，可抑制细胞凋亡，通过抑制ROS的积累来提高细胞存活率。

可见，本发明制取的杜仲叶总黄酮能有效治疗缺血性卒中，通过抑制活性氧(ROS)的积累，减轻ROS对细胞的损伤，从而增加神经细胞的存活率或保护神经元免受缺血性损伤，最终达到治疗缺血性卒中的目的。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (6)

1.一种制取高纯度杜仲叶总黄酮的分离富集方法，其特征在于，包括以下步骤；

（1）将干燥后的杜仲叶粉碎制成粗粉；

（2）取适量粗粉加入第一溶剂后于80℃回流提取两次，第一溶剂为60%浓度的乙醇溶液，每次提取1.5h，合并两次提取液，回收第一溶剂后得到杜仲叶总浸膏；

（3）分离：取杜仲叶总浸膏用适量蒸馏水溶解混匀，过滤除去不溶物，加入到AB-8大孔树脂层析柱中，先用蒸馏水洗去杂质，以90%浓度的乙醇为流动相洗脱，收集醇洗脱液；

（4）回收乙醇后，于鼓风干燥箱中干燥，研磨制成粉末Ⅰ；

（5）富集：取少量粉末Ⅰ溶解于第二溶剂中，第二溶剂为70%浓度的乙醇溶液，加入Sephadex LH-20葡聚糖凝胶层析柱中，以70%浓度的乙醇为流动相进行洗脱，每1/10柱体积收集一管洗脱液；

（6）将洗脱液在鼓风干燥箱中分别干燥制成粉末，筛选其中纯度为70%以上的粉末进行合并，得到粉末Ⅱ，即为高纯度杜仲叶总黄酮。

2.根据权利要求1所述的分离富集方法，其特征在于，在步骤（2）中，按照料液比1g：10ml的比例加入第一溶剂。

3.根据权利要求1所述的分离富集方法，其特征在于，在步骤（4）中，干燥温度为60℃；在步骤（6）中，干燥温度为60℃。

4.根据权利要求1所述的分离富集方法，其特征在于，在步骤（5）中，柱层析分离纯化时的上样浓度为20~30mg/ml。

5.如权利要求1~4中任一项所述的分离富集方法制取得到的高纯度杜仲叶总黄酮在制备治疗缺血性脑卒中药物的用途。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，杜仲叶总黄酮的药物浓度为0.3~5μg/ml。