CN111961111B - 一种美洲大蠊多肽提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于天然成分提取制备技术领域，涉及一种美洲大蠊多肽提取方法，本法采用溶剂极性递增萃取法去除绝大部分油脂，再通过树脂吸附法去除少量残留油脂、溶剂残留和色素，在所得到的多肽产品中，检测不到油脂残留以及工艺过程中使用的有机溶剂残留，也消除了产品中的腥臭味，提高了产品含量，产品质量得到极大提高。本发明具有较好的市场应用前景和经济效益。

Description

一种美洲大蠊多肽提取方法

技术领域

本发明属于天然成分提取制备技术领域，涉及一种美洲大蠊多肽提取方法。

背景技术

美洲大蠊，又称蜚廉，在《神农本草经》中已有记载，现代研究表明，其主要活性成分为多肽和生物酶，具有明显的促进组织修复再生、抗肿瘤及抗肝炎作用。以美洲大蠊为主要原料的上市药物有康复新液、心脉隆、肝龙胶囊等，产生了良好的经济和社会效益。

目前美洲大蠊有效成分多肽的提取通常采用高浓度醇为溶媒介质进行提取，然后加入水相对体系进行分离，最后用活性炭、大孔树脂吸附剩余的油脂(中国专利CN102885858B)。该法的优点是高浓度醇能溶解其动物性药材富含的油脂，避免提取液乳化，保障工艺的顺畅性；而其缺点是：(1)大量油脂(脂溶性成分)与目标有效成分多肽(水溶性成分)均被提取出来，成为混合物浸膏，在后续的加入水分离多肽成分的工艺中，极易形成“水包油”或者“油包水”的乳化体系，难以进行有效分离，工艺顺畅性差；(2)含醇的提取液体系中或多或少均含有非活性成分油脂存在，难以彻底去除；(3)美洲大蠊腥臭味极大，患者服用过程中容易恶心反胃，影响服用顺应性，腥臭味物质在工艺前段残留太多，后续工艺通过活性炭和大孔吸附树脂均不能到达完全去除；(4)总氨基酸(目的成分)含量偏低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种美洲大蠊多肽提取方法，本提取方法采用极性递增萃取法去除绝大部分油脂，用以解决美洲大蠊提取工艺中提取液易发生乳化和工艺顺畅度差的技术问题。

为解决上述技术问题，本发明技术方案如下：

一种美洲大蠊多肽提取方法，包括以下依次进行的步骤：

S1提取步骤：使用醇溶液对美洲大蠊粗粉进行提取，获得粗提液；

S2萃取步骤：对粗提液进行共N级萃取，N≥2，N为整数；

在第1级萃取中，使用非极性有机溶剂对所述粗提液进行萃取，取醇层，获得1级提取液；在第n级萃取中，对应获取n级提取液，N≥n＞1，n为整数；

n级提取液的获取方法为：在第n级萃取中，用水稀释n-1级提取液，获得n-1级稀释提取液，使用非极性有机溶剂对n-1级稀释提取液进行萃取，取醇层，获得n级提取液。

采用上述技术方案，技术原理以及有益效果如下：本方案通过醇溶液对美洲大蠊粗粉进行有效成分提取。再在醇体系中逐渐提高水的比例，通过溶媒介质的极性逐渐增加，减小油脂成分在介质中的溶解度，并通过有机溶剂萃取及时清除体系中的油脂，避免油脂富集，避免水包油或者油包水的乳化现象的产生，进而避免了由上述现象导致的油脂分离失败。本方案可有效除去影响产品质量油脂杂质，消除产品腥臭味，提高产品质量。该法简便易操作，完全避免了提取体系的乳化，保证工艺顺畅性。

现有技术中，在完成提取(醇提)获得粗提液之后，直接在粗提液中加入水，进而分离获得多肽成分。粗提液中含有大量多肽和油脂成分，多肽成分可溶于水，而油脂不溶于水，从而将多肽和油脂分离。但是上述操作过程极易形成“水包油”或者“油包水”的乳化体系，难以进行有效分离，工艺顺畅性差。并且现有技术的分离过程无法将油脂(非活性成分)充分除去，油脂残留会导致美洲大蠊多肽提取物中的多肽含量难以提升，且油脂具有腥臭味，患者服用过程中容易恶心反胃，影响服用顺应性。

在本方案中，发明人使用了非极性有机溶剂进行萃取操作，可除去粗提液中的大量油脂。虽然使用非极性有机溶剂萃取，可以除去粗提液中的油脂。但是，含油脂的非极性有机溶剂萃取剂(如石油醚等)和极性有机相(乙醇)共存时，乳化现象不可避免，严重影响工艺顺畅性，且获得的产品存在油脂残留量高的问题。所以，本方案采用溶剂极性递增萃取法去除绝大部分油脂，通过采取逐渐增加极性有机相(醇)中水的含量的方式，可以防止油脂大量析出导致的乳化现象的发生。在萃取的过程中，极性有机相中逐渐加入水，在保证不乳化的前提下，把油脂通过非极性溶剂萃取分离出来，体系不会因过多油脂析出导致乳化。

综上所述，本方案的有益效果在于：(1)可充分除去美洲大蠊多肽提取物中的油脂，提高提取物中多肽的含量；(2)防止在萃取分离过程中发生乳化现象，提高工艺顺畅度；(3)充分除去美洲大蠊多肽提取物中的腥臭味，提高患者的服用顺应性；(4)采用溶剂极性递增萃取法不但能够有效地除去油脂，还可以一定程度上提高最终产物中氨基酸和蛋白质的含量(目的功效成分)以及产品得率；(5)不使用大量石油醚等非极性有机溶剂对药材进行直接提取，节约了成本和避免了生产中的潜在的安全隐患。

进一步，在S2萃取步骤中，在第1级萃取和第n级萃取中，非极性有机溶剂的用量均为粗提液体积的三分之一；在第n次萃取中，水的用量为粗提液的体积的10×2^(n-2)％。

采用上述技术方案，在萃取步骤中逐级提高含目的成分的液相(又称极性有机相)中的水含量，可以防止油脂大量析出导致的乳化现象的发生。

进一步，在S2萃取步骤中，N＝4。

采用上述技术方案，4级萃取步骤可将粗提液中的大量油脂除去。第1级萃取步骤中，使用有机溶剂对粗提液进行萃取，取醇层，获得1级提取液；在1级提取液中加入水，得1级稀释提取液，使用有机溶剂对1级稀释提取液进行第2级萃取，取醇层，获得2级提取液；在2级提取液中加入水，得2级稀释提取液，使用有机溶剂对2级稀释提取液进行第3级萃取，取醇层，获得3级提取液；在3级提取液中加入水，得3级稀释提取液，使用有机溶剂对3级稀释提取液进行第4级萃取，取醇层，获得4级提取液，4级提取液即为纯化提取液。4级萃取为优化方案，工艺成本适中，油脂去除的效果好，性价比最高。

进一步，在S2萃取步骤中，所述非极性有机溶剂为戊烷、己烷、庚烷或石油醚中的一种。

采用上述技术方案，戊烷、己烷、庚烷和石油醚均为极性较低的有机溶剂，可以将体系中的油脂成分溶出，达到萃取除油脂的功效。

进一步，在S1提取步骤中，所述醇溶液为90％～95％的乙醇溶液或者95％～100％的甲醇溶液；所述醇溶液的用量为每1kg美洲大蠊粗粉使用5～10L的醇溶液。

采用上述技术方案，醇溶液可将美洲大蠊粗粉中的多肽等目的成分溶出，每1kg美洲大蠊粗粉使用5～10L的醇溶液可保证有效成分的充分溶出。在本方案中使用了高浓度的乙醇溶液或甲醇溶液，对油脂有较好的溶解作用，同时对水也有很好的共溶性，因此保证大量油脂溶解，是不产生乳化的前提。90％～95％的乙醇溶液是指乙醇在溶液中的体积百分数为90％～95％；95％～100％的甲醇溶液是指甲醇在溶液中的体积百分数为95％～100％。

进一步，在S1提取步骤中，美洲大蠊粗粉的制备方法为：先将美洲大蠊药材原料冷冻，然后在低于0℃的环境中对冷冻后的美洲大蠊药材原料进行粉碎处理，获得美洲大蠊粉。

采用上述技术方案，先将美洲大蠊药材原料冷冻，然后在低于0℃的环境中，对冷冻后的美洲大蠊药材原料进行粉碎处理，可避免因药材富含油脂而造成的结团。

进一步，在S2萃取步骤之后设有S3精制步骤：当n＝N时，n级提取液为纯化提取液；使用吸附物质处理所述纯化提取液，获得精制提取液。

采用上述技术方案，可吸附微量油脂残留和部分脂溶性色素残留。

进一步，在S3精制步骤中，所述吸附物质为非极性树脂。

采用上述技术方案，非极性树脂可对残留油脂进行有效吸附，除油脂和色素的效果比活性炭等物质的效果更好。

进一步，在S3精制步骤中，经减压浓缩除去纯化提取液中的醇，获得除醇提取液；将除醇提取液加入含有非极性树脂的层析柱，然后用水洗脱，收集洗脱液。

采用上述技术方案，萃取完成后的提取液减压浓缩除去醇(此时基本去除了油脂，体系不会再乳化)，通过精制步骤除去纯化提取液中的微量油脂残留和部分脂溶性色素残留，以水为洗脱剂洗脱，收集含有多肽的洗脱液，可获得含有目的成分的溶液。

萃取过程中物质在两相中的分配原理决定了使用两相萃取的方法不能完全去除油脂残留，萃取的次数和成本也限制了工艺实现上的可操作性。去除少量或者微量油脂、挥发油成分等脂溶性成分较好的方法是使用非极性吸附树脂，在控制好物料与树脂比例的前提下，可达到完全吸附上述杂质。多肽完全溶于水，不被非极性吸附树脂吸附，几乎可以完全回收。少量或者微量石油醚、己烷等非极性有机溶剂也可在非极性树脂上吸附完全，达到控制溶剂残留的目的。部分非极性或弱极性色素也会被非极性吸附树脂吸附，达到纯化多肽目的。

进一步，在S3精制步骤之后设有S4干燥步骤：干燥处理所述洗脱液，获得美洲大蠊多肽提取物。

采用上述技术方案，通过干燥除水获得美洲大蠊多肽提取物干物质。

具体实施方式

实施例1

S1提取步骤：取美洲大蠊药材原料5kg，0℃以下粉碎成粗粉(过20目筛)，获得美洲大蠊粗粉。在美洲大蠊粗粉中加入体积分数为90％的乙醇溶液浸泡四次，每次浸泡使用25L乙醇溶液，浸泡24h，每次浸泡结束后过滤取滤液，将四次浸泡获得的滤液合并，然后使用旋转蒸发仪将合并后的滤液浓缩至原体积的二分之一，获得粗提液(体积约为45L)。

S2萃取步骤：对粗提液进行共N级萃取，N≥2，N为整数；

在第1级萃取中，使用非极性有机溶剂对所述粗提液进行萃取，取醇层，获得1级提取液；在第n级萃取中，对应获取n级提取液，N≥n＞1，n为整数；

n级提取液的获取方法为：在第n级萃取中，在n-1级提取液加入水，获得n-1级稀释提取液，使用非极性有机溶剂对n-1级稀释提取液进行萃取，取醇层，获得n级提取液。

在本实施例中，萃取步骤包括第1级萃取至第4级萃取，具体如下：

第1级萃取：用正己烷萃取粗提液两次，每次使用正己烷15L，更具体地为：在粗提液中加入15L的正己烷，充分混合然后静置分层后，取醇层溶液(下层)，然后在醇层溶液中又加入正己烷15L，充分混合然后静置分层后，取醇层溶液(下层)，获得1级提取液(约45L)。

第2级萃取：在1级提取液中加入纯水，纯水的加入量为4.5L，获得1级稀释提取液。使用正己烷对1级稀释提取液进行两次萃取，具体为：在1级稀释提取液中加入15L正己烷，充分混合然后静置分层后，取醇层溶液(下层)，然后使用15L正己烷再次萃取刚获得的醇层溶液，获得2级提取液。

第3级萃取：在2级提取液中加入纯水，水的加入量为9L，获得2级稀释提取液，再使用正己烷萃取2级稀释提取液两次，每次使用15L正己烷，取醇层溶液，获得3级提取液。

第4级萃取：在3级提取液中加入纯水，水的加入量为18L，获得3级稀释提取液，再使用正己烷萃取3级稀释提取液两次，每次使用15L正己烷，取醇层溶液，获得4级提取液。4级提取液即为本实施例中的纯化提取液。

S3精制步骤：70℃减压浓缩纯化提取液，除去纯化提取液中的醇，获得除醇提取液，将除醇提取液放置至室温，用吸附树脂(非极性树脂，MCI GEL CHP20)装层析柱，MCIGEL CHP20的用量为每1kg美洲大蠊药材原料使用MCI GEL CHP20 0.5～1.5L，在本实施例中具体使用7.5L MCI GEL CHP20树脂。将除醇提取液加入层析柱中，静置2h后，然后用2倍量柱体积(吸附树脂体积)的水洗脱，收集洗脱液，洗脱液中含有大量的高纯度的美洲大蠊多肽。

S4干燥步骤：将洗脱液70℃减压浓缩至小体积(约3.3L)，然后冷冻干燥，得淡黄色蜡状美洲大蠊多肽提取物(920g)。

另外，在S1提取步骤中，使用醇溶液对美洲大蠊粗粉进行提取，醇溶液为体积百分数为90％～95％的乙醇溶液或者体积百分数为95％～100％的甲醇溶液；醇溶液的用量为每1kg美洲大蠊粗粉使用5～10L的醇溶液。上述参数均为根据公知常识和实验可以获知的，在此不再一一列举实施例来分别证明，上述参数均可保证充分将美洲大蠊中的多肽成分充分提取。在S2萃取步骤中，萃取使用的有机溶剂具体为正己烷，实际上可以采用戊烷、己烷、庚烷或石油醚中的一种。有机溶剂的用量是粗提液的体积的三分之一。在第n级萃取步骤中，水的加入量为粗提液的体积的10×2^(n-2)％，在本方案中具体为：在第2级萃取、第3级萃取和第4级萃取中，加入纯水的量分别为4.5L、9L、18L。

实施例2

本实施例基本同实施例1，不同点在于：

S1提取步骤：取美洲大蠊药材原料10kg，冷冻至-10℃，研磨机研磨成20目粉(研磨过程中保持0℃以下)，获得美洲大蠊粗粉。使用的提取溶剂为甲醇(纯)，浸泡提取四次，每次浸泡的甲醇的用量为100L，每次浸泡时均搅拌浸泡体系，每次提取的时长为2h。合并滤液之后，将合并后的滤液的体积浓缩为原体积的二分之一，获得粗提液(体积约为200L)。

S2萃取步骤：使用的有机溶剂为石油醚，在第1级萃取-第4级萃取中，每次萃取使用的石油醚的量均为约70L。在第2级萃取、第3级萃取和第4级萃取中，加入纯水的量分别为20L、40L、80L。

S3精制步骤：70℃减压浓缩纯化提取液，除去纯化提取液中的醇，获得除醇提取液，将除醇提取液放置至室温，用吸附树脂(非极性树脂，MCI GEL CHP20)装层析柱，MCIGEL CHP20的用量为10L。

S4干燥步骤：将洗脱液70℃减压浓缩至小体积(约6L)，70℃真空干燥，得美洲大蠊多肽提取物(1.91kg)。

实施例3

本实施例基本同实施例1，不同点在于：

S1提取步骤：取美洲大蠊药材原料20kg，使用的提取溶剂为体积分数为95％的甲醇溶液，在50℃的条件下进行浸泡提取四次，每次浸泡提取使用的甲醇溶液(95％)的量为120L，每次浸泡提取的时间为4h。合并滤液之后，将合并后的滤液的体积浓缩为原体积的二分之一，获得粗提液(体积约为240L)。

S2萃取步骤：使用的有机溶剂为戊烷，只含有三级萃取，在第1级萃取至第3级萃取中，每次萃取使用的戊烷的量均为80L。在第2级萃取和第3级萃取，加入纯水的量分别为24L和48L。

S4干燥步骤：将洗脱液70℃减压浓缩至小体积(约10L)，70℃真空干燥，得美洲大蠊多肽提取物(3.58kg)。

综合实施例1至实施例3，本发明的技术方案总结为：使用有机溶剂(乙醇、甲醇)对药材粉末进行提取，提取完成后在含有药材各种成分的提取液中逐渐加入水，增加溶媒介质极性，用有机溶媒(戊烷、己烷、石油醚等)萃取其中的油脂，萃取完成后的提取液减压浓缩除去醇(此时基本去除了油脂，体系不会再乳化)，剩余水溶液用非极性树脂MCI GELCHP20吸附微量油脂残留和部分脂溶性色素残留，以水为洗脱剂洗脱，收集含有多肽的洗脱液，减压浓缩，干燥，即得美洲大蠊多肽提取物。本方法在保留现有工艺优点基础上，采用溶剂极性递增萃取法去除绝大部分油脂，再通过树脂吸附法去除少量残留油脂、溶剂残留和色素，所得到的多肽产品检测不出原料药材中的油脂及工艺过程中使用的有机溶剂，也消除了产品中的腥臭味，提高了产品含量，产品质量得到极大提高。本发明具有较好的市场应用前景和经济效益。

对比例1：现行工艺

取美洲大蠊药材原料5kg，0℃以下粉碎成粗粉(过20目筛)，获得美洲大蠊粗粉。在美洲大蠊粗粉中加入体积分数为90％的乙醇溶液浸泡四次，每次浸泡使用25L乙醇溶液，每次浸泡24h，每次浸泡结束后过滤取滤液，将四次浸泡获得的滤液合并，然后使用旋转蒸发仪将合并后的滤液浓缩获得粗浸膏(半固态物质)。在粗浸膏中加入18L水，搅拌混悬，放置分层(24小时以上)，取水层，精制、浓缩以及干燥，得美洲大蠊提取物。精制、浓缩以及干燥回收的水层的方法如实施例1的S3精制步骤和S4干燥步骤。

对比例2：现行工艺

取美洲大蠊药材原料5kg，0℃以下粉碎成粗粉(过20目筛)，获得美洲大蠊粗粉。用石油醚浸泡提取美洲大蠊药材原料，使用25L石油醚。然后过滤取药渣，药渣干燥，再加90％乙醇25L浸泡提取，每次浸泡使用25L乙醇溶液，浸泡24h，每次浸泡结束后过滤取滤液，将四次浸泡获得的滤液合并。将合并后的滤液精制、浓缩以及干燥后，获得美洲大蠊提取物，精制、浓缩以及干燥的方法见实施例1的S3精制步骤和S4干燥步骤。

对比例3：现行工艺

取美洲大蠊药材原料5kg，0℃以下粉碎成粗粉(过20目筛)，获得美洲大蠊粗粉。在美洲大蠊粗粉中加入体积分数为90％的乙醇溶液浸泡四次，每次浸泡使用25L乙醇溶液，浸泡24h，每次浸泡结束后过滤取滤液，将四次浸泡获得的滤液合并，然后使用旋转蒸发仪将合并后的滤液浓缩获得粗浸膏(半固态物质)。在粗浸膏中加入18L水，搅拌混悬，用正己烷萃取脱脂，正己烷的用量为20L，共萃取4次，获得萃取后的水层，即纯化提取液。对纯化提取液进行如实施例1的S3精制步骤和S4干燥步骤，获得美洲大蠊多肽提取物。

实验例

对实施例1～3以及对比例1～3的美洲大蠊多肽提取物进行检测，检测项以及检测结果如表1所示。本实验例的检测方法如下：GB/T5009.124-2003(食品中氨基酸的测定)和GB5009.5-2010(食品安全国家标准食品中蛋白质的测定)，数据表示形式为每100g检测物(美洲大蠊多肽提取物)中含有检测目的物的质量(g/100g)；GB 5009.6-2016(食品安全国家标准食品中脂肪的测定)，数据表示形式为每100g检测物(美洲大蠊多肽提取物)中含有检测目的物的质量(g/100g)；GB 5009.262-2016(食品安全国家标准食品中溶剂残留量的测定)；产品得率为美洲大蠊多肽提取物的质量除以美洲大蠊药材原料的质量再乘以100％。

从表1中可以看出，本发明工艺(实施例1-实施例3)明显优于现有产品及文献工艺(对比例1-3)，获得的产物不管在得率、外观、目的成分含量，还是在油脂残留上，其检出数据都是非常理想的。基于乙醇等有机溶剂提取美洲大蠊，一方面大量油脂的分离是工艺的难点，在向乙醇提取物中加水来分离油脂的过程中，很容易形成油包水或者水包油乳化体系，分离工艺顺畅性差、不能达到油脂成分的有效分离；另一方面乙醇等有机溶剂对多肽溶解性差，特别是高分子量多肽，因此提取不完全，产品得率偏低。虽然对比例1和对比例3使用了水来处理乙醇提取物，虽然一定程度上可避免乙醇等有机溶剂对多肽溶解性差的问题，但是仍然不能避免乳化现象的产生，导致多肽提取物的得率和目的成分的含量均低。而本方案(实施例1～实施例3)中，采用溶剂极性递增萃取法不但能够有效地除去油脂，还可以一定程度上提高最终产物中氨基酸和蛋白质的含量(目的功效成分)以及产品得率。对比例2将有机溶剂处理步骤前置于乙醇提取之前，虽然除去了一定的油脂，但是有机溶剂用量过大，且油脂残留不能充分除去。对比例3在醇提获得的提取物中直接加入大量的水，然后再加入有机溶剂萃取，极易出现乳化现象，导致油脂不能有效除去。

表1：实验例检测结果

以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

Claims (5)

1.一种美洲大蠊多肽提取方法，其特征在于，包括以下依次进行的步骤：

S1提取步骤：使用醇溶液对美洲大蠊粗粉进行提取，获得粗提液；所述醇溶液为90％～95％的乙醇溶液或者95％～100％的甲醇溶液；所述醇溶液的用量为每1kg美洲大蠊粗粉使用5～10L的醇溶液；美洲大蠊粗粉的制备方法为：先将美洲大蠊药材原料冷冻，然后在低于0℃的环境中对冷冻后的美洲大蠊药材原料进行粉碎处理，获得美洲大蠊粗粉；

S2萃取步骤：对粗提液进行共4级萃取；

在第1级萃取中，使用非极性有机溶剂对所述粗提液进行萃取，取醇层，获得1级提取液；在第n级萃取中，对应获取n级提取液，4≥n＞1，n为整数；

n级提取液的获取方法为：在第n级萃取中，用水稀释n-1级提取液，获得n-1级稀释提取液，使用非极性有机溶剂对n-1级稀释提取液进行萃取，取醇层，获得n级提取液；在第1级萃取和第n级萃取中，非极性有机溶剂的用量均为粗提液体积的三分之一；在第n次萃取中，水的用量为粗提液的体积的10×2^(n-2)％；

所述非极性有机溶剂为戊烷、己烷、庚烷或石油醚中的一种。

2.根据权利要求1所述的一种美洲大蠊多肽提取方法，其特征在于，在S2萃取步骤之后设有S3精制步骤：当n＝4时，n级提取液为纯化提取液；使用吸附物质处理所述纯化提取液，获得精制提取液。

3.根据权利要求2所述的一种美洲大蠊多肽提取方法，其特征在于，在S3精制步骤中，所述吸附物质为非极性树脂。

4.根据权利要求3所述的一种美洲大蠊多肽提取方法，其特征在于，在S3精制步骤中，经减压浓缩除去纯化提取液中的醇，获得除醇提取液；将除醇提取液加入含有非极性树脂的层析柱，然后用水洗脱，收集洗脱液。

5.根据权利要求4所述的一种美洲大蠊多肽提取方法，其特征在于，在S3精制步骤之后设有S4干燥步骤：干燥处理所述洗脱液，获得美洲大蠊多肽提取物。